Phân lập và tuyển chọn các chủng bacillus spp.Có khả năng đối kháng sinh học với nấm colletotrichum spp. Gây bệnh thán thư trên cây ớt.docx

Viết đề tài giá sinh viên – ZALO:0973.287.149-TEAMLUANVAN.COM
Tải tài liệu tại kết bạn zalo : 0973.287.149
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
****************
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP.
CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM
COLLETOTRICHUM SPP. GÂY BỆNH
THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT
Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ THÚY HỒNG
Niên khóa: 2011 - 2015

iii
Tháng 7 năm 2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
****************
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP.
CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH HỌC VỚI NẤM
COLLETOTRICHUM SPP. GÂY BỆNH
THÁN THƯTRÊN CÂY ỚT
Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

iii
ThS. NGUYỄN TẤN ĐỨC NGUYỄN THỊ THÚY HỒNG
KS. TRẦN THÙY TRANG
Tháng 07 năm 2015
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên con xin cảm ơn ba mẹ đã sinh thành và dạy dỗ con nên người, cảm ơn
gia đình vẫn luôn bên con và ủng hộ con trong suốt những năm qua.
Cảm ơn các thầy, cô trong bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đại học Nông
Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ bảo và truyền thụ cho em những tri thức
quý báu trong thời gian em học tại trường.
Cảm ơn ban Giám đốc Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh,
phòng Công nghệ Vi sinh đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận này.
En xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Tấn Đức và chị Trần Thùy Trang đã
tận tình hướng dẫn và dìu dắt cho em trong suốt thời gian qua. Cảm ơn tất cả các anh,
chị và các bạn phòng Công nghệ vi sinh đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo cho em môi
trường làm việc tốt nhất trong thời gian thực hiện đề tài.

vi
TÓM TẮT
Bệnh thán thư trên ớt gây ra bởi nấm Colletotrichum spp. là một trong những
nguyên nhân làm giảm nghiêm trọng cả về chất lượng và sản lượng ớt. Một số biện pháp
hóa học kết hợp với phương pháp canh tác đã được đưa ra nhưng chúng lại có ảnh hưởng
tiêu cực với môi trường cũng như làm giảm chất lượng nông sản do có dư lượng thuốc
BVTV. Các phương pháp sinh học, đặc biệt là sử dụng cơ chế đối kháng sinh học được
xem là phương pháp có nhiều tiềm năng to lớn và thân thiện với môi trường.
Chúng tôi tiến hành phân lập phân lập các mẫu nấm Colletotrichum spp. từ trái
ớt bệnh tại các vườn ớt ở xã An Nhơn Tây, huyện Củ Chi và phân lập các mẫu vi khuẩn
Bacillus spp. từ mẫu đất tại các vườn ớt ở huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang.
Sau phân lập đề tài thu được 28 chủng nấm và 19 chủng vi khuẩn, kết quả định
danh bằng sinh học phân tử xác định được có 28 chủng nấm thuộc loài C. acutatum và
17 chủng vi khuẩn thuộc loài B. subtilis hoặc B. amyloliquefaciens, 2 chủng vi khuẩn
thuộc loài B. licheniformis. Kết quả đối kháng in vitro theo phương pháp đồng nuôi cấy
trên đĩa petri cho thấy các chủng vi khuẩn CG9, CG8, CG10, CG5 và CG6 thuộc vào
nhóm đối kháng mạnh nhất với hiệu quả đối kháng đạt trên 60%, kế đó là các chủng
CG1, CG7, D3, D1, CG4, CG11, D4 và BA98 có hiệu quả đối kháng trên 50% và các
chủng còn lại thuộc vào nhóm thứ ba có hiệu quả đối kháng yếu dưới 50%.

vii
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. iii
TÓM TẮT .....................................................................................................................vi
MỤC LỤC ................................................................................................................... vii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .........................................................................x
DANH SÁCH CÁC BẢNG..........................................................................................xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH......................................................................................... xii
Chương 1 MỞ ĐẦU.......................................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề..................................................................................................................1
1.2. Mục tiêu của đề tài ...................................................................................................2
1.3. Nội dung thực hiện ...................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................3
2.1. Giới thiệu về cây ớt (Capsicum annuum).................................................................3
2.2. Bệnh thán thư trên cây ớt .........................................................................................5
2.3. Nấm Colletotrichum spp...........................................................................................7
2.4. Vi khuẩn Bacillus spp. ...........................................................................................12
2.5. Các nghiên cứu liên quan .......................................................................................19
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................20
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu..........................................................................20

viii
3.2. Vật liệu nghiên cứu.................................................................................................20
3.3. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................21
3.3.1. Phân lập Colletotrichum spp. ..............................................................................21
3.3.2. Phân lập các chủng Bacillus spp. ........................................................................22
3.3.3. Quan sát đại thể và vi thể các mẫu nấm bệnh phân lập được..............................23
3.3.3. Chủng bệnh nhân tạo các chủng nấm Colletotrichum spp. .................................23
3.3.4. Kiểm tra sinh hóa định danh các chủng Bacillus spp..........................................23
3.3.5. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử..................................................27
3.3.6. Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. với nấm
Colletotrichum spp. trong điều kiện in vitro. ................................................................31
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................................32
4.1. Kết quả....................................................................................................................32
4.1.1. Kết quả phân lập nấm Colletotrichum spp. .........................................................32
4.1.2. Đặc điểm đại thể và vi thể của các chủng nấm Colletotrichum spp....................33
4.1.3. Kết quả phân lập các chủng Bacillus spp............................................................39
4.1.4. Đặc điểm đại thể và vi thể của các chủng vi khuẩn Bacillus spp........................39
4.1.5. Chủng bệnh nhân tạo các chủng nấm Colletotrichum spp..................................43
4.1.6. Thử nghiệm sinh hóa định danh các chủng Bacillus spp. ...................................49
4.1.7. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử..................................................51
Colletotrichum spp. trong điều kiện in vitro. ................................................................55
4.2. Thảo luận................................................................................................................57
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................58
5.1. Kết luận...................................................................................................................58
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................58

ix
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................59

x
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
FAO: Food and Agriculture Organization
BVTV: Bảo vệ thực vật
TT CNSH TPHCM : Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh
NCBI: National Center for Biotechnology Information

xi
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các chất kháng sinh ở một số loài vi khuẩn Bacillus spp. ..........................11
Bảng 3.1. Trình tự mồi ITS5 và ITS4..........................................................................26
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR..........................................................................26
Bảng 3.3. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR..............................................................26
Bảng 3.4. Trình tự mồi 20F và 1500R .........................................................................27
Bảng 3.5. Thành phần phản ứng PCR..........................................................................27
Bảng 3.6. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR..............................................................28
Bảng 4.1 Đặc điểm đại thể và vi thể của các chủng nấm Colletotrichum spp.............30
Bảng 12 Đặc điểm đại thể và vi thể các chủng vi khuẩn Bacillus spp. .......................37
Bảng 4.3 Lây nhiễm bệnh nhân tạo các chủng nấm đã phân lập sau 7 ngày...............41
Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa Bacillus spp.........................................46
Bảng 4.4 Kết quả định danh nấm Colletotrichum phân lập từ Củ Chi ........................49
Bảng 4.5 Kết quả định danh sinh học phân tử Bacillus spp. .......................................50

xii
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1. Capsicum annuum .........................................................................................3
Hình 2.2. Triệu chứng bệnh thán thư trên quả ớt...........................................................5
Hình 2.3. Triệu chứng bệnh thán thư trên lá ớt..............................................................5
Hình 2.4. Chu kỳ gây bệnh của nấm Colletotrichum spp..............................................8
Hình 2.5. Phát sinh loài và phân bố của các chi Bacillus ............................................12
Hình 3.1 Sơ đồ tổng quát phương háp nghiên cứu ......................................................20
Hình 3.2 Sơ đồ định danh vi khuẩn B. subtilis và B. licheniformis.............................23
Hình 3.3. Quy trình định danh nấm Colletotrichum spp. bằng sinh học phân tử........25
Hình 3.4. Quy trình định danh vi khuẩn Bacillus spp. bằng sinh học phân tử............27
Hình 1.5 Phương pháp đồng nuôi cấy kiểm tra hiệu quả đối kháng............................29
Hình 4.1 Triệu chứng bệnh thán thư trên quả ớt..........................................................30
Hình 4.2 Kết quả một số phản ứng sinh hóa đã thực hiện...........................................47
Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR của một số dòng nấm..................................48
Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR của một số dòng vi khuẩn Bacillus spp......48
Hình 4.5 Biểu đồ hiệu quả đối kháng của vi khuẩn với nấm.......................................52
Hình 4.6 Đối kháng của các chủng Bacillus spp. với nấm C. acutatum .....................53

1
Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Cây ớt (Capsicum annuum) là một loại cây gia vị có nguồn gốc từ rất lâu đời
khoảng 7500 năm trước Công nguyên hoặc sớm hơn. Có những bằng chứng khảo cổ ở
các khu vực ở tây nam Ecuador cho thấy ớt đã được thuần hóa hơn 6000 năm về trước.
Cho đến ngày nay thì ớt đã được trồng ở rất nhiều nơi trên thế giới và xuất hiện thường
trực trên bàn cơm của mọi người. Theo báo cáo của FAO năm 2003 cây ớt được xem là
một trong những cây trồng quan trọng ở vùng nhiệt đới. Diện tích đất trồng ớt trên thế
giới vào khoảng 1.700.000 ha cho mục đích lấy quả tươi và khoảng 1.800.000 ha để làm
ớt bột. Tổng diện tích 3.729.900 ha cho tổng sản lượng 20 triệu tấn.
Tuy nhiên ngoài vấn đề giá cả và thời tiết không ổn định thì vấn đề bệnh hại cây
trồng cũng là một nguyên nhân quan trọng gây nên nhiều khó khăn cho người trồng ớt.
Theo Po Po Than, 2008 bệnh thán thư gây ra bởi loài nấm Colletotrichum spp., bệnh héo
xanh gây ra bởi vi khuẩn Pseudomonas solanacearum, và bệnh khảm gây ra bởi virus
chilli veinal mottle (CVMV) hoặc virus khảm dưa chuột (CMV) là những loại bệnh phá
hoại nghiêm trọng nhất ở ớt. Bệnh thán thư có mức gây hại nghiêm trọng nhất có thể
làm giảm từ 10 – 80 % sản lượng ớt thu hoạch ở các quốc gia đang phát triển (Poonpolgul
và Kumphai, 2007).
Ở Việt Nam diện tích trồng ớt ở các vùng chuyên canh ớt vào khoảng 3000 ha,
năm cao nhất (1998) lên tới 5700 ha. Theo báo cáo của chi cục BVTV TP.HCM trong
năm 2013 thì diện tích canh tác rau bị bệnh thán thư là 178,76 ha, chiếm 15% trên tổng
diện tích ở thành phố Hồ Chí Minh.
Do đó vấn đề đối phó với bệnh thán thư là vô cùng quan trọng. Hiện nay tại các
vùng trồng ớt phương pháp đối phó chủ yếu là phương pháp canh tác như luân canh với
cây không thuộc họ cà, tiêu hủy phế phẩm, lên luống, tưới rửa cây sau mưa, bón vôi vào
đất diệ mầm bệnh, xử lí hạt giống trước gieo trồng.
Tuy có giảm được một phần nào dịch bệnh những chủ yếu là để phòng bệnh còn
lúc ruộng ớt đã bị bệnh thì phải sử dụng phương pháp hóa học bằng cách phun một số
thuốc trừ nấm như Amista, Loverice, Melody duo 66, Ringo-L 20SC, Amistar 250SC,

2
Plant 50WP, Antracol 70WP, Polyram 80DF, Daconil 500SC,Score 250EC, Ridomil 68
WP, Bavistin 68 FL, Carbenzim 50 WP,…có khả năng kiểm soát bệnh hại nhanh.
Nhưng việc sử dụng thuốc không phù hợp có thể để có thể để lại dư lượng thuốc
bảo vệ thực vật quá giới hạn trên nông sản gây độc cho sản phẩm, làm giảm uy tín và
giá trị sản phẩm cũng như gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự ổn
định và bền vững của hệ sinh thái.
Trong những năm gần đây xu thế tất yếu trong lĩnh vực bảo vệ thực vật ở Việt
Nam nói riêng và trên thế giới nói chung là hướng tới sử dụng các phương pháp sinh
học thân thiện với môi trường đưa nền nông nghiệp tiến tới nền nông nghiệp hữu cơ.
Đặc biệt là việc ứng dụng các vi sinh vật thiên địch trong việc sản xuất các chế phẩm
phòng trừ dịch bệnh cây trồng.
Một trong những vi sinh vật tiêu biểu được nghiên cứu trong sản xuất chế phẩm
sinh học là Bacillus subtilis và một số chủng khác như B.amyloliquefaciens và
B.licheniformis an toàn với người và động vật và có khả năng tổng hợp được nhiều loại
kháng sinh đối kháng được với nấm bệnh và một số vi khuẩn khác đã được nghiên cứu
thành công ở nhiều nước trên nhiều đối tượng khác nhau. Trên xu thế chung đó chúng
tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus spp.có khả
năng đối kháng sinh học với nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây ớt”
nhằm mục đích phát triển loại chế phẩm sinh học phòng bệnh thán thư.
Đồng thời đề tài cũng thuộc nhóm các đề tài nghiên cứu ứng dụng Công nghệ
sinh học vào nông nghiệp, nằm trong chương trình Công nghệ sinh học của thành phố
Hồ Chí Minh giai đoạn 2011 – 2015.
1.2. Mục tiêu của đề tài
Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus spp. có khả năng đối kháng mạnh với
nấm Colletotrichum spp. nhằm phục vụ cho nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học phòng
bệnh thán thư trên ớt.
1.3. Nội dung thực hiện
Nội dung 1: Phân lập và định danh các chủng Bacillus spp.
Nội dung 2: Phân lập và định danh các chủng nấm Colletotrichum spp.
Nội dung 3: Thử nghiệm khả năng đối kháng trong điều kiện in vitro.

3
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về cây ớt (Capsicum annuum)
2.1.1. Giới thiệu chung
Cây ớt thuộc họ Cà (Solanaceae) chi ớt (Capsicum ) là cây gia vị quan trọng có
xuất xứ từ Mehico, Goatemala và từ trung tâm khởi nguyên Đông Nam Á. Cho đến nay
ớt đã được trồng rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới bao gồm vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới
và các vùng có khí hậu ôn hòa (Ken Pernezny và Tim Momol ,2006).
Cây ớt (Capsicum annuum) có tên khoa học do chữ Capsa là túi, ý nói quả ớt
giống cái túi, annuum có nghĩa là hàng năm. (Đỗ Tất Lợi, 2004).
Chi Capsicum bao gồm khỏang 20 - 27 loài, 5 loài được thuần hóa và trồng ở
nhiều nơi trên thế giới là C. annuum, C. baccatum, C. chinense, C. frutescens, và C.
pubescens. Trong đó C. annuum là phổ biến hơn cả (Tong N và Bosland PW, 1999).
Phân loại
Giới Plantae
Ngành Magnoliophyta
Lớp Equisetopsida
Phân lớp Magnoliidae
Bộ Solanales
Họ Solanaceae
Chi Capsicum
Loài Capsicum annuum
2.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây ớt
Ớt thuộc loài thân thảo mọc tại những nước ôn đới, sống lâu năm và thân phía
dưới hóa gỗ ở những nước nhiệt đới. Cây có nhiều cành. Lá mọc so le, hình thuôn dài,
đầu nhọn, phía cuống cũng thuôn hẹp, có cuống, phiến lá dài 2 - 4 cm, rộng 1,5 – 2 cm.
Hình 2.1 Capsicum annuum

4
Quả mọc rũ xuống hay quay lên trời, hình dáng thay đổi, khi thì tròn, khi thì dài, đầu
nhọn. Quả chưa chín có màu xanh hoặc tim, quả chín màu vàng hay đỏ. Có loại rất cay,
có loại ít cay tùy theo giống và điều kiện canh tác (Đỗ Tất Lợi, 2004).
Theo Khóa phân loại chi Ớt (Capsicum L.) của Paul G. Smith, Capsicum annuum
có cánh hoa đồng màu, từ trắng đến xanh vàng sáp (không có đốm hay màu tương phản
khác). Bao phấn xanh tái đến tím. Hoa đơn độc (đôi khi 2 hoa trên mắt đầu tiên), tràng
hoa trắng hoặc trắng lẫn tím, đài hoa tách biệt ở cuối, có răng nhỏ ở mép.
Hạt ớt nhỏ dẹp, dạng thận, màu vàng rơm, chiều dài khoảng 3 – 5 mm. Cây
thường cao khoảng 0,5 – 1,5 m. Ớt có rễ cọc với nhiều rễ phụ nhưng trong gieo trồng
việc cấy chuyển cây làm rễ bị đứt và phát triển thành một hệ rễ chùm.
2.1.3. Giá trị của cây ớt
Giá trị dinh dưỡng: Ớt chứa một loại alkaloid là Capsicain (0,05 – 2%) tập trung
ở biểu bì của giá noãn, là chất gây nên vị cay của ớt và có hàm lượng vitamin C khoảng
0,8 – 1% (Đỗ Tất Lợi, 2004). Ngoài ra trong ớt còn có các chất carotenoid, capsorubin,
kryptoxanthin, zeaxanthin, lutein, α và β caroten, Capsicosid là một saponin steroid có
tác dụng kháng khuẩn, Flavonoid (apiin và luteolin - 7- glucosid), chất đường tới 7% và
một số acid hữu cơ như acid citric, acid malic.
Giá trị dược liệu: Chất có tác dụng trong ớt là capsaixin, nó có tác dụng gây tại
chỗ trên niêm mạc và trên da cảm giác nóng mạnh, có thể tăng đến cảm giác cháy rát,
nó gây đỏ mà không gây phồng da, là vị thuốc giúp sự tiêu hóa, làm ăn ngon, chóng tiêu.
Ớt hoặc capsaixin thường dùng ngoài để làm giảm đau các bệnh đau khớp, đau
dây thần kinh, dùng dưới dạng cồn, băng dán hoặc thuốc mỡ, dùng riêng hoặc phối hợp
với một số vị khác. Ngoài ra, người ta còn dùng lá ớt tươi chữa mụn nhọn, rắn, rết cắn.
2.1.4. Phân bố
Trên thế giới Có nhiều nước trồng ớt như Nhật Bản, Ấn Độ, Indonesia, Nam
Phi, Tây Ban Nha, Italia, Pháp đặc biệt ở Hungary người ta trồng hàng nghìn hecta, mỗi
năm xuất cảng từ 2500 đến 3000 tấn ớt khô.
Ở Việt Nam Quỳnh Phụ (Thái Bình) với diện tích 1200 ha, Đại Lộc (Quảng
Nam), Phù Mỹ (Bình Định), Phù Cát (Bình Định), Bố Trạch (Quảng Bình), Châu Đốc
(An Giang), Thanh Bình (Đồng Tháp), Củ Chi (TP.HCM) và một số tỉnh thành khác...

5
2.2. Bệnh thán thư trên cây ớt
Vào năm 1992 Isaac cho rằng tên bệnh thán thư (anthracnose) có nguồn từ tiếng
Hy Lạp có nghĩa ‘coal’, dựa vào việc mô tả đặc điểm vết bệnh có màu tối như than, vết
bệnh lõm xuống, chứa các khối bào tử. Nhìn chung bệnh thán thư do các loài
Colletotrichum spp. gây nên. Bệnh thán thư được Halsted (1890) báo cáo lần đầu tại
New Jersey, USA vào năm 1980, Halsted đã mô tả các tác nhân gây ra là Gloeopsorium
piperatum và Colletotrichum nigrum. Arx (1957) xem sự phân loại học đó là tương
đương với Colletotrichum gloeosporioides. Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp.
gây ra là một trong số những bệnh gây hại nghiêm trọng làm giảm năng suất từ 10 -
80%. Bệnh không chỉ gây hại trên cây ở giai đoạn đang thu hoạch quả mà còn gây hại ở
giai đoạn cây non và bảo quả quả sau thu hoạch.
Bệnh thán thư trên ớt đã được nghiên cứu là do nấm Colletotrichum spp. gây ra
bao gồm nấm C. acutatum (Simmonds), C. capsici (Syd.) Butler và Bisby, C.
gloeosporioides (Penz.) (Ken Pernezny and Tim Momol ,2006).
Nói chung trong điều kiện thời tiết ấm áp và ẩm ướt, nhiều mưa. Nhiệt độ khoảng
27 °C và độ ẩm cao (trung bình 80%) là tối ưu cho sự phát triển bệnh thán thư (Roberts
và cộng sự, 2001).
2.2.2. Triệu chứng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây ra trên ớt
Bệnh thán thư gây hại trên thân, lá, quả và hạt nhưng hại chủ yếu trên quả vào
giai đoạn quả chín.
Hình 2.2 Triệu chứng bệnh thán thư
trên quả ớt
Hình 2.3 Triệu chứng bệnh thán thư trên
lá ớt

6
Trên lá ban đầu là các đốm tròn màu xám, sau đó vết bệnh lớn dần tạo thành các
đốm màu nâu, khô, hình tròn hoặc bầu dục, vết bệnh phát triển lớn lên và liên kết nhau
làm khô cháy một mảng lá, lá vàng úa và rụng lá hàng loạt (QCVN 01 - 138 :
2013/BNNPTNT).
Trên quả chủ yếu xuất hiện ở giai đoạn quả chín. Ban đầu là những vết bệnh dạng
ngậm nước và sau đó trở nền mềm nhũn đồng thời xuất hiện những vết lõm, sạm lại (có
màu nâu vàng hay màu rám nắng). Sau 2 - 3 ngày kích thước vết bệnh có thể lên tới 1
cm đường kính. Vết bệnh có thể bao trùm hầu hết bề mặt quả và xuất hiện những tổn
thương phức tạp. Vết bệnh thường có hình thoi, vòng tròn đồng tâm, lõm, phân ranh
giới giữa mô bệnh là một đường màu đen chạy dọc theo vết bệnh. Bề mặt của vết bệnh
trở nên ẩm ướt, khi nhìn dưới kính lúp soi nổi có thể thấy đĩa cành với những lông gai
màu đen. Trong một số trường hợp xuất hiện vết bệnh màu nâu mà không phải là màu
da cam và sau đó cũng hình thành những lông cứng khi nhìn dưới kính lúp soi nổi. Các
vết bệnh có thể liên kết với nhau làm quả bị thối, vỏ khô có màu trắng vàng bẩn (QCVN
01 - 138 : 2013/BNNPTNT, 2013, Vũ Triệu Mân, 2007).
Nấm có thể gây hại trên một số chồi non, gây hiện tượng thối ngọn ớt. Chồi bệnh
có màu nâu đen, bệnh có thể phát triển nặng làm cây chết dần hoặc cây bệnh nhẹ cho
quả ít và chất lượng kém (Vũ Triệu Mân, 2007).
2.2.3. Cơ chế gây nhiễm của nấm bệnh thán thư
Mầm bệnh thán thư thường tồn tại trên phế phẩm cây trồng họ cà hoặc trên vỏ
hạt và lưu qua nhiều năm. Khi gặp điều kiện thuận lợi các mầm bệnh sẽ lây nhiễm vào
các kí chủ thuộc họ cà, gây nên các vết bệnh trên thân, lá, quả. Những bào tử mới sinh
ra trong mô bệnh sẽ nảy mầm, hình thành giác bám, rồi hình thành vòi hút xâm nhiễm
vào các mô lá quả. Sự lây nhiễm thường xảy ra trong suốt mùa mưa ẩm. Mưa nhiều và
tưới nước thường xuyên sẽ làm bệnh lây lan nhanh do bào tử được phát tán rộng.
(Melanie và Sally, 2004)
2.2.4. Một số biện pháp phòng bệnh thán thư
Chuẩn bị đất trước khi gieo trồng: dọn sạch tàn dư, tiêu hủy cây trồng vụ trước
và cỏ dại, bón vôi bổ sung để nâng pH lên 5,5 – 6,5 để tiêu diệt mầm bệnh trong đất,
bón lót, lên luống.

7
Xử lý hạt giống: ngâm hạt giống trong nước nóng (khoảng 500
C) trong 30 phút
hoặc sử dụng một số thuốc trừ nấm như KMnO4 (1%) ngâm trong 1 – 2 giờ hoặc Kasuran
hoà tan 5-7g/1 lít nước, ngâm hạt trong 1 giờ.
Phòng trừ bệnh trong quá trình trồng cây: bón phân đầy đủ, cắt bỏ, tiêu hủy các
cành, lá bị bệnh. Điều tra định kỳ, khi phát hiện có bệnh cần kịp thời xử lí.
Phòng trừ bệnh sau khi thu hoạch: thu gom và tiêu hủy triệt để toàn bộ các bộ
phận của cây, tiến hành luân canh với cây trồng khác không thuộc họ cà.
2.3. Nấm Colletotrichum spp.
Nấm Colletotrichum spp. được xác định là tác nhân chính gây bệnh thán thư trên
ớt và một số loại cây trồng khác như ngũ cốc, các cây họ đậu, rau cải, cây lâu năm và
cây ăn quả.
Theo Pring và các cộng sự, 1995 nhận định nấm Colletotrichum có thể ngủ đông
trên các cây kí chủ khác nhau thuộc họ cà hoặc họ đậu, chúng tồn tại trên các tàn dư
thực vật và các quả bị bỏ lại trên cánh đồng. Các loài nấm Colletotrichum sản sinh ra
các hạch nấm nhỏ để tồn tại ở rạng thái ngủ trong đất giữa mùa đông hoặc khi gặp các
điều kiện bất lợi và có thể sống sót qua nhiều năm.
Nấm Colletotrichum được xếp vào giới Fungi, thuộc ngành Ascomycota, lớp
Sordariomycetes, bộ Phyllachorales, họ Phyllachoraceae, giống Colletotrichum.
2.3.2. Đặc điểm hình thái nấm
Nấm Colletotrichum spp. có đặc điểm là sống nội sinh hay kí sinh bắt buộc, sợi
nấm mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào.
Nhiều hạt dầu được sản xuất trong tế bào của hệ sợi nấm, khi trưởng thành sợi nấm trở
nên sậm màu và bện xoắn thành dạng chất nền nhỏ dưới lớp ngoài cùng.
Colletotrichum spp. sinh sản bằng bào tử đính phát triển trên cuống bào tử trong
dạng quả thể là cụm cuống bào tử. Cụm cuống bào tử có dạng đĩa phẳng, mặt sau có cấu
trúc phấn mịn, mỗi cụm cuống bào tử gồm lớp chất nền, bề mặt sản sinh cuống bào tử
trong suốt. Cuống bào tử không có vách ngăn, kéo dài, đơn bào, dạng liềm, cong, bào
tử trong suốt Trên mỗi cụm cuống bào tử là các lông dài cứng, thuôn nhọn, không phân
nhánh. Đa bào và có cấu trúc như tơ cứng (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998).

8
Sự hình thành số lượng lớn bào tử có thể gây đứt gãy trên biểu bì vật chủ, gặp
điều kiện thuận lợi mỗi bào tử sẽ mọc một hoặc nhiều ống mầm để hình thành sợi nấm.
Sợi nấm già đôi khi hình thành vách dày, màu nâu sậm hình cầu hoặc không đều gọi là
hậu bào tử. Nó có thể ở tận cùng hoặc chen giữa sợi nấm và tồn tại trong thời gian dài
và khi tách ra chúng cũng mọc mầm để hình thành sợi nấm mới. Trên môi trường nuôi
cấy khuẩn lạc có dạng các vòng tròn đồng tâm, khuẩn ty màu trắng đến hơi nâu, không
có vách ngăn (Cao Ngọc Hải, 2012).
Nhiệt độ phát triển thích hợp để nấm nảy mầm và hình thành bào tử là 26 -32o
C,
tối ưu ở 28o
C, nhiệt độ trên 50o
C sẽ làm chết bào tử và khuẩn ty, độ ẩm tối ưu là 92%
(Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998).
2.3.3. Cơ chế gây bệnh của Colletotrichum spp.
Hình 2.4 Chu kỳ gây bệnh của nấm Colletotrichum spp.

9
Nấm Colletotrichum spp. tồn tại trong tàn dư thực vật, quả, hạt bị bỏ lại trên cánh
đồng khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ xâm nhập vào tế bào chủ bằng nhiều con đường khác
nhau như sản xuất một số cấu trúc gây nhiễm vào tế bào chủ: ống mầm, đĩa áp (tạo áp
lực), sợi nấm nội bào, sợi nấm sơ cấp, sợi nấm thứ cấp. Chúng xâm nhiễm dưới lớp biểu
bì của tế bào chủ hoặc trong tế bào. Đầu tiên, chúng bám và nảy mầm trên bề mặt tế bào
chủ, hình thành giác bám có vòi xâm nhiễm tạo áp lực xâm nhập vào tế bào chủ. Sau
khi xâm nhập, hình thành nên sợi nấm nội bào và sợi nấm sơ cấp. Từ sợi nấm sơ cấp
hình thành nên nhiều sợi nấm thứ cấp. Các sợi nấm này đâm xuyên hoặc len lỏi qua các
tế bào, xâm chiếm khắp vùng dưới lớp biểu bì và nhanh chóng lan rộng khắp các mô.
Các mô bị xâm nhiễm sẽ chết và hình thành các vùng lõm, các vết bệnh sẽ loang dần ra
và liên kết với nhau tạo thành các vết bệnh lớn, sau đó bào tử sẽ được phát tán nhờ gió
hay nước mưa làm phát tán bệnh sang các bộ phận khác của cây hoặc từ cây này sang
cây khác và lặp lại vòng tuần hoàn xâm nhiễm này.
2.3.5. Một số loài Colletotrichum spp. gây bệnh trên cây ớt.
2.3.5.1. Colletotrichum acutatum
Hình 2.5 Colletotrichum acutatum
Nấm Colletotrichum acutatum lây lan rất nhanh đến nỗi vào thời điểm phát hiện
triệu chứng thì tình trạng bệnh đã rất nghiêm trọng. Bệnh thường xuất hiện trên quả và
thỉnh thoảng bị thối cuống lá, với các triệu chứng như tạo vết trũng ngậm nước, sau đó
mở rộng dần và bao phủ hết bề mặt quả trong vòng 2-3 ngày, trên các cơ quan màu nâu

10
sẫm sẽ xuất hiện khối bào tử màu hồng. Đối với cây trồng khác như cỏ chân ngỗng và
cần tây, thối ngọn và xoắn lá là triệu chứng chính.
Khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy có màu trắng, xanh xám hoặc màu da cam
nhạt, đôi khi tạo ra sắc tố màu hồng tím đậm. Đĩa cành (Conidiomata) thường kém phát
triển, với ít hoặc không có lông cứng, đặc biệt là trong nuôi cấy. Tế bào Conidiogenous
hình trụ, đôi khi phát sinh thành các chùm nhỏ, và tạo bào tử đơn. Bào tử đính có kích
thước 8 - 16 mm x 2,5 - 4 mm, hình thoi, thành mỏng, có vách ngăn và trong suốt.
Appressoria rất ít về số lượng có kích thước 6,5 - 11 mm x 4,5 - 7,5 mm, Hình chùy
hoặc tròn và có màu nâu sáng đấn nâu sẫm (Mordue, 1979, Sutton, 1980, Baxter et
al.1983 và Gunnell & Gubler,1992).
2.3.5.2. Colletotrichum gloeosporioides
Hình 2.6 Colletotrichum gloeosporioides
Trong các tác nhân gây bệnh thán thư trên ớt thì nấm Colletotrichum
gloeosporioides là loài phổ biến nhất. Trên nhiều loại cây trồng nhiệt đới khi tiến hành
phân lập các dòng nấm bệnh, người ta thường bắt gặp loài nấm này tồn tại dưới hai dạng:
nội ký sinh và ngoại ký sinh trên bề mặt mô cây. Theo Lee và Chung, (1990) nấm
C. gloeosporioides được tìm thấy chiếm 41% trong vỏ hạt, 36% trong nội nhũ và 2%
trong phôi hạt ớt cay. Qua quan sát mô tế bào ở cây non cho thấy nấm có khả năng
truyền từ nội nhũ sang trụ dưới lá mầm rồi đến rễ mầm.

11
Trên môi trường PDA, tản nấm có màu trắng xám nhạt đến màu xám đậm. Ở một
số mẫu phân lập sợi nấm ký sinh chỉ hình thành những chòm liên quan đến sự hình thành
quả thể và đôi khi hình thành trên tản nấm non phổ biến hơn so với tản nấm già. Quả
thể mở hình thành trên các bộ phận khác nhau của cây trồng, mọc riêng rẽ hoặc từng
đám hình cầu hay hình quả lê, kích thước đường kính 85 - 350 µm. Bên trong quả thể
có các túi bào tử nằm rải rác, xen kẽ với các sợi nấm vô tính, thường có 8 bào tử túi hình
trụ hoặc hình chùy, kích thước 35 - 80 µm x 8 – 14 µm.
Đĩa cành hình thành trên các bộ phận của cây, có lông cứng dài, màu nâu, thuôn
về phía đỉnh, hơi phồng nhẹ ở phần gốc, kích thước chiều dài khoảng 500 µm, đường
kính 4 - 8 µm, có 1 - 4 vách ngăn.
Bào tử phân sinh hình thành trên cành bào tử ngắn, hẹp, trong suốt, hình trụ, đầu
hơi tù, đỉnh tròn, không có vách ngăn, kích thước 9 – 24 µm x 3 - 6 µm. Trên môi trường
PDA, khối bào tử màu hồng nhạt được hình thành trên cành bào tử phân sinh. Bào tử
nảy mầm và hình thành giác bám màu nâu, hình ô van hoặc hình quả đấm, kích thước
6 - 20 µm x 4 - 12 µm.
2.3.5.3. Colletotrichum capsici
Hình 2.7 Colletotrichum capsici
Theo Maiti và Sen (1982) nấm Colletotrichum capsici gây bệnh trên nhiều ký
chủ khác nhau như ớt (Capsicum annuum) và hồ tiêu. Colletotrichum capsici có đĩa
cành trên quả, lá và thân, tròn hoặc thon dài, kích thước khoảng 350µm. Lông gai màu

12
nâu, có 1 - 5 vách ngăn, cứng, phình to ở phía gốc, phía đỉnh nhọn, mảnh và màu sắc
nhạt dần, kích thước khoảng 250 x 6µm. Bào tử phân sinh hình lưỡi liềm, trong suốt,
đỉnh nhọn, đơn bào, không có vách ngăn, được hình thành từ cành bào tử hình trụ màu
nâu nhạt.
Tản nấm trên môi trường PDA đầu tiên có màu trắng sau chuyển dần thành màu
xám. Sợi nấm hình thành mịn, màu trắng đến xám tối trên bề mặt tản nấm. Lông gai
được hình thành trên những vùng mỏng hơn, hạch nấm hiếm gặp hoặc không có. Cụm
bào tử màu nâu sẩm đến màu da cam. Giác bám và các cấu trúc phụ của chúng hình
thành với số lượng lớn áp vào bề mặt đĩa petri.
2.4. Vi khuẩn Bacillus spp.
2.4.1 Giới thiệu chung về Bacillus spp.
Bacillus xuất phát từ tiếng Latin có nghĩa là hình que gồm gần 200 loài các vi
khuẩn hình que, Gam dương, hiếu khí thuộc 1 trong 5 chi có khả năng sinh bào tử trong
họ Bacillaceae. Theo Bergey, 1994, vi khuẩn Bacillus thuộc giới Bacteria, ngành
Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Eubacterriales, họ Bacillaceae, Giống Bacillus.
Hầu hết Vi khuẩn Bacillus là vi sinh vật ưa ấm phát triển ở nhiệt độ tối ưu là 30
- 45o
C, tuy nhiên cũng có những loài ưa nóng và một vài loài ưa lạnh. Khoảng pH tối
ưu cho Bacillus khá rộng, trong khoảng pH từ 2 – 11.
Bacillus có khả năng hình thành nội bào tử, đây là một trong những đặc điểm
quan trọng trong phân lập. Khi xử lý mẫu đất ở nhiệt độ cao tuy các tế bào vi khuẩn sẽ
chết nhưng vẫn còn tồn tại các bào tử nên khi cấy lên đĩa thạch thì sẽ thu được các khuẩn
lạc đa số là của loài Bacillus spp.
Vi khuẩn Bacillus spp. có thể tổng hợp được hơn 60 loại kháng sinh như: subtilin,
subtilosin, sublancin, TasA, surfactin, Gramicidin, bacitracin, chlorotetain,
mycobacillin, rhizocticins,…Hầu hết việc tạo kháng sinh có liên qua đến quá trình bào
tử hóa, kháng sinh được giải phóng khi tế bào bước vào pha ổn định sau khi chuyển sang
bào tử hóa (Hồ Văn Út Hậu, 2010).
Bảng 2.1 Các chất kháng sinh ở một số loài vi khuẩn Bacillus spp.

13
a
Đối kháng vi khuẩn Gram dương, b
Ức chế quá trình tạo sợi, c
Kháng sinh phổ
rộng, d
Đối kháng nấm, e
Đối kháng vi khuẩn Gram âm

14
Hình 2.5 Phát sinh loài và phân bố của các chi Bacillus (Alcaraz, 2010)
2.4.2. Một số kháng sinh do Bacillus spp. tổng hợp
Subtilin là bacteriocin thuộc nhóm lantibiotic, có tính kháng khuẩn mạnh đối với
vi khuẩn Gram dương như Propionibacterium acnes, staphylococci, streptococci và
clostridia. Subtilin có khả năng chịu nhiệt rất cao, không mất hoạt tính khi hấp autoclave
ở pH 2, tác động của subtilin là ức chế sự phát triển của vi sinh vật bằng cách gắn với
màng nguyên sinh chất bằng tương tác giữa điện tử tự do sinh ra bởi sự dehydrate với
các nhóm sulfhydryl trên màng nguyên sinh chất làm ảnh hưởng đến hệ thống vận

15
chuyển các chất có trọng lượng phân tử nhỏ và hệ thống trao đổi proton. Subtilin được
tổng hợp trong pha tăng trưởng và đạt nồng độ cao nhất ở đầu pha cân bằng (Yong Joon
Chung, 1992).
Sublancin thuộc nhóm AII lantibiotic, sublansin không tác động với vi khuẩn
Gram âm nhưng có khả năng ức chế mạnh đối với vi khuẩn Gram dương kể cả tế bào
dinh dưỡng lẫn bào tử. Sublancin là bacteriocin rất bền, bảo quản ở điều kiện bình
thường trong thời gian 2 năm không làm mất hoạt tính của sublancin (Sun H. Paik, 1998)
TasA là peptide kết hợp với bào tử của Bacillus subtilis, TasA có phổ kháng
khuẩn rộng được tổng hợp và tiết vào môi trường 30 phút sau khi quá trình tạo bào tử
được bắt đầu, đồng thời TasA cũng được chuyển vào giữa lớp màng kép của tiền bào tử
sau đó định vị trong lớp peptidoglycan vách của lõi bào tử, TasA giúp cho Bacillus
subtilis chiếm ưu thế trong quá trình tạo bào tử và nảy mầm (Axel G. Stöver, 1999).
Surfactin có hoạt tính bề mặt rất mạnh do đó nó có tính đối kháng mạnh đối với
vi khuẩn, virus và kháng lại các tế bào ung thư nhưng ít tác động đối với nấm. Tác động
của surfactin làm ức chế các kênh chuyển ion trên trong lớp màng lipid kép đồng thời
ức chế hoạt tính của enzyme cylic AMP phosphodiesterase (Dirk Vollenbroich,1997).
Fengycin là lipopeptide vòng có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm. Fengycin
được tổng hợp nhiều trong phag tăng trưởng và đạt nồng độ cực đại ở cuối phag tăng
trưởng, fengycin vẫn được duy trì ở nồng độ thấp với hàm lượng ổn định trong phag cân
bằng (Tsuey-Pin Lin,1999).
Mycosubtilin là lipopeptide có tính kháng sinh thuộc họ iturin. Các lipopeptide
thuộc họ iturin có tính đối kháng mạnh với nấm nhưng có tác động rất hạn chế với vi
khuẩn (Erwin H. Duitman,1999).
Bacilysocin là phospholipid có tính kháng khuẩn mạnh đối với nấm, được tổng
hợp khi bắt đầu phag cân bằng sau đó thì giảm dần. Bacilysocin là kháng sinh có bản
chất phospholipid được phát hiện đầu tiên trên Bacillus subtilis. Cấu trúc của bacilysocin
là 1-(12-methyltetradecanoyl)-3-phosphoglyceroglycerol. Bacilysocin được tổng hợp từ
tiền chất là phosphatidylglycerol, là một phospholipid chủ yếu của Bacillus subtilis. Quá
trình chuyển phosphatidylglycerol thành bacilysocin được thực hiện bởi enzyme
lysophospholypase được mã hóa bởi gene ytpA (Norimasa Tamehiro,2002)

16
2.4.3. Một số loài Bacillus spp.
2.4.3.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis
Bacillus subtilis là một trực khuẩn Gram dương, thường được tìm thấy trong
đất. Ban đầu nó được đặt tên là "Vibrio subtilis" khi nó được phát hiện vào năm 1835
bởi Christian Gottfried Ehrenberg. Vào năm 1872 được đổi tên thành "Bacillus subtilis"
bởi Ferdinand Cohn.
Bacillus subtilis có mặt ở khắp mọi nơi: không khí, đất và xác bã thực
vật. Bacillus subtilis cũng có thể được tìm thấy trong cơ thể con người, chủ yếu trên da
hoặc trong đường ruột.
Đặc điểm hình thái, sinh sản
B. subtilis là trực khuẩn có dạng que nhỏ, hai đầu tròn, Gram dương, kích thước
0,5 – 0,8 μm x 1,8 – 3 μm, tế bào vi khuẩn xếp thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, chúng có
khả năng di động vì có nhiều tiên mao. Khuẩn lạc B. subtilis trên môi trường TSA có
dạng hình tròn, rìa răng cưa không đều, đường kính 3 – 5 mm và bề mặt sẽ trở nên nhăn
nheo sau 1 – 4 ngày.
B. subtilis phát triển theo hình thức phân đôi hoặc nảy chồi do sự nứt của bào tử
được hình thành trong điều kiện khắc nghiệt giúp chúng tồn tại trong môi trường đến
khi điều kiện trở nên thuận lợi. Nội bào tử nằm giữa tế bào sinh dưỡng hoặc lệch tâm
với kích thước từ 0,8 – 1,8 μm. Có cấu tạo gồm 3 phần: áo bào tử, vỏ bào tử và lõi bào
tử. Áo ào tử có cấu tạo từ protein sừng không thấm nước, có khả năng chống chịu với
các điều kiện bất lợi như lyzozyme, protease, các tia bức xạ. Còn vỏ bào tử cấu tạo chủ
yếu từ peptodoglycan và chứa nhiều calcium dipicolinate giúp bảo vệ lõi bào tử.
Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
B. subtilis là vi khuẩn hiếu khí, phát triển tối ưu ở nhiệt độ 25 - 37 độ C và pH
thích hợp trong khoảng 7 – 7,4. Nồng độ muối là 10 – 15% (Lương Đức Phẩm, 2000).
B. subtilis có khả năng lên men không sinh hơi các loại đường như maltose,
glucose, saccharose, xylose, mannitol. Đồng thời có khả năng phân giải tinh bột, nitrate
và làm tan chảy gelatin.
Tính đối kháng của B. subtilis

17
B. subtilis đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh khác cũng như với đồng loại
(Khi môi trường cạn kiệt dinh dưỡng) chủ yếu theo hai con đường cạnh trnh dinh dưỡng
và tiết kháng sinh.
Trong môi trường khi có mặt B. subtilis và các vi sinh vật khác do chúng có tốc
độ phát triển nhanh hơn (24 giờ) nên chúng sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng
trong môi trường cũng như chiếm phần lớn không gian sống, đồng thời cũng tiết ra một
số loại kháng sinh làm ức chế, kìm hãm thậm chí giết chết các vi sinh vật khác cạnh
tranh với nó nhằm tìm kiếm thêm nguồn dinh dưỡng kéo dài thời gian sống (Nguyễn
Lân Dũng và Hoàng Đức Nhuận, 1967).
2.4.3.2. Vi khuẩn Bacillus Amyloliquefaciens
Bacillus Amyloliquefaciens được phát hiện bởi nhà khoa học Nhật Bản Fukumoto
năm 1943. Tuy nhiên cái tên "Bacillus Amyloliquefaciens" đã không xuất hiện trên
Approved Lists of Bacterial Names và chưa được công bố hợp lệ vào ngày 1 tháng 1
1980; do đó, nó không có chỗ đứng trong danh mục vi khuẩn.
"Bacillus amyloliquefaciens" có vai trò quan trọng trong ngành sản xuất enzyme
amylase và protease trên thê giới. Mối quan hệ chặt chẽ giữa nó với Bacillus subtilis từ
lâu đã được công nhận, và các sinh vật này đã được phân vào phân loài là “B. subtilis
subsp. amyloliquefuciens "hoặc đã được bao gồm trong B. subtilis là một dạng biến thể
có thể sản xuất với số lượng dồi dào của các enzyme ngoại bào.
B. Amyloliquefaciens có kiểu hình rất giống với B. subtilis do đó chúng không
thể phân biệt hoàn toàn nếu chỉ dựa trên cơ sở các phương pháp kiểm tra cổ điển. Vì lý
do này mà B. Amyloliquefaciens đã không được xem như là một loài riêng biệt trên
Approved Lists. Tuy nhiên, sau này có một số bằng chứng cho thấy rằng tên "B.
amyloliquefuciens nên được khôi phục. "B. amyloliquefaciens " và B. subtilis có thể
được phân biệt bằng cách sử dụng một số kỹ thuật. Hơn nữa, có một nhu cầu cho tên
này trong ngành công nghiệp enzyme để tránh nhầm lẫn với B. subtilis, là có sự khác
biệt trong trao đổi chất và tiết ra các enzym khác nhau (F. G. Priest, 1987).
DNA từ chủng "B. amyloliquefaciens '' có 5% tương đồng với DNA từ các
chủng B. subtilis, B. licheniformis, và B. pumilus. Hầu hết các nhà nghiên cứu đồng ý
rằng các chủng trong vòng một loài nên có ít nhất 50 - 60% DNA tương đồng. Như vậy,

18
mặc dù "B. amyloliquefaciens "có liên quan đến B. subtilis nhưng trên cơ sở dữ liệu di
truyền phân tử, mức độ tương đồng DNA là không đủ cao cho hai nhóm sinh vật này
được coi là một loài duy nhất (F. G. Priest, 1987).
Đặc điểm hình thái
Các mô tả về "B. amyloliquefaciens "được đưa ra dưới đây dựa trên các dữ liệu
của Welker và Campbell và Gordon và cộng sự.
B. amyloliquefaciens là trực khuẩn Gram dương có kích thước 0,7 - 0,9 μm x 1,8
- 3,0 μm, tế bào thường hình thành chuỗi và di động, với lông roi, bào tử hình oval (0,6
- 0,8μ và 1,0 - 1,4 μm) ở trung tâm hoặc gần trung tâm tế bào trong túi bào tử mà không
bị phình, nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là 30 - 40°C.
Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa
B. amyloliquefaciens không tăng trưởng ở nhiệt độ dưới 15°C hoặc trên 50°C, có
khả năng phân giải Casein, elastin, gelatin, tinh bột, tributyrin, Tween 20, Tween 40, và
Tween 60, nhưng không thể phân giải adenine, cellulose, guanine, hypoxanthine, pectin,
testosterone, tyrosine, và xanthine, (chỉ có một tỷ lệ nhỏ các chủng có khả năng phân
hủy DNA.) có khả năng tạo acetoin và phosphatase, chuyển hóa nitrate thành nitrit,
esculin và arbutin bị thủy phân, citrate được sử dụng như một nguồn carbon duy nhất,
và tăng trưởng xảy ra với nồng độ 5% NaCl, và cho hầu hết các chủng là 10% NaCl.
2.4.3.3. Vi khuẩn Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis là trực khuẩn Gram dương , hình que, ưa nhiệt, yếm khí
tùy nghi, phân bố rộng rãi như một sinh vật hoại sinh trong môi trường.
Các nhiễm sắc thể của B. licheniformis có một vùng rộng lớn tương tự như
Bacillus subtilis và Bacillus halodurans. Có khoảng 80% các trình tự mã hóa của B.
licheniformis có chứa trong B. subtilis, nó được coi là một phần của nhóm subtilis.
Nhưng, mặc dù tương tự như B. subtilis, chúng khác nhau về số lượng và vị trí của
prophages, yếu tố chuyển vị, các enzyme ngoại bào, và operon đường trao đổi chất thứ
cấp. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng phân loại B. licheniformis có liên quan chặt chẽ
đến B. subtilis và Bacillus amyloliquefaciens trên cơ sở so sánh 16S rDNA và 16S-23S
của chuỗi nucleotide.
Đặc điểm chung

19
Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu của Bacillus licheniformis khoảng 50°C, tuy nhiên
nó có thể tồn tại ở nhiệt độ cao hơn nhiều. Nhiệt độ tối ưu để sản sinh enzyme là 37°C.
Trong điều kiện môi trường khắc nghiệt, nghèo dinh dưỡng, đặc biệt là trong đất,
Bacillus licheniformis có khả năng tạo bào tử. Những bào tử này có thể chịu nhiệt, chịu
lạnh, bức xạ, và các áp lực môi trường khác cho đến khi gặp những điều kiện thuận lợi,
các bào tử sẽ nảy mầm trở thành những tế bào sinh dưỡng.
B. licheniformis cũng có khả năng sử dụng amino và imino nitơ từ arginine,
asparagine và glutamine qua arginine deiminase, arginase, asparaginase và hoạt động
glutaminase.
Một số ứng dụng của Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis được sử dụng để sản xuất các enzym, kháng sinh, và các
chất chuyển hóa nhỏ trong công nghiệp.
Đặc biệt chủng B. licheniformis để sản xuất thuốc kháng sinh peptide như
bacitracin và proticin, thêm vào một số hóa chất đặc biệt chẳng hạn như acid citric,
inosine, acid inosinic và acid poly-γ-glutamic (Gherna R,1989).
Các nhà khoa học cũng đã ứng dụng B. licheniformis lên men lông vũ để sản xuất
thức ăn giá rẻ nhằm bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi.
Một số chùng B. licheniformis phân lập được sử dụng trong đối kháng sinh học
có thể giảm thiểu những ảnh hưởng của nấm gây bệnh trên cây ngô, cỏ và các loại rau
(Neyra C, 1996).
2.5. Các nghiên cứu liên quan
Nghiên cứu của Yoo và cộng sự năm 2007 đã chứng minh chủng Bacillus subtilis
YJH-051 có khả năng kháng lại nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư
trên cây ớt.
Chủng Bacillus subtilis cũng được chứng minh có hiệu quả trong đối kháng
Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư trên ớt với khả năng ức chế nấm bệnh
là 56,86 % (Marinus Ngullie và cộng sự, 2010).
Chủng Bacillus subtilis GB03 có khả năng hạn chế sự phát triển của nấm
Fusarium solani gây bệnh thối rễ ở cây đậu (Esteves de Jensen và cộng sự, 2002).

20
Bacillus subtilis CE1 có khả năng làm giảm đáng kể sự xâm nhiễm của nấm
Fusarium vertisillioides gây bệnh thối thân ngô khi dùng với nồng độ 107
CFU/ml
(Cavaglieri và cộng sự, 2005).
Các chủng Bacillus subtilis 174 và Bacillus fortis 162 được dùng với nồng độ 103
CFU/ml cho thấy khả năng đối kháng kiểm soát bệnh lên tới 81,39% và 53,75%
(Waheed Akram và Tehmina Anjum, 2011).
Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ 09/2014 đến 06/2015 tại phòng Công nghệ Vi sinh,
Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu nghiên cứu
3.2.1. Dụng cụ và thiết bị
Dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh
Đĩa petri, ống nghiệm, và một số dụng cụ phòng thí nghiệm vi sinh cơ bản.
Kính hiển vi quang học, nồi hấp khử trùng, tủ cấy, tủ lạnh, microwave.
Dụng cụ, thiết bị dùng trong sinh học phân tử
Máy PCR, bồn điện di, tủ âm 20o
C, bồn ủ nhiệt, pipet các loại, tube các loại.
3.2.2. Hóa chất và môi trường
Môi trường TSA, TSB, Simmons citrate, PDA, Starch Agar, Water Agar, VP,
TE, Lysis buffer, Agarose, Dream Taq.
3.2.3. Vật liệu thí nghiệm
Các chủng vi khuẩn Bacillus spp. được phân lập từ các mẫu đất tại huyện Chợ
Gạo, Tiền Giang.
Các chủng nấm bệnh Colletotrichum spp. được phân lập từ các vườn ớt thuộc
huyện Củ Chi, Thành phố Hồ Chí Minh.

21
Ớt tươi hái tại vườn ớt thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí
Minh.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
Hình 3.1 Sơ đồ tổng quát phương háp nghiên cứu
3.3.1. Phân lập Colletotrichum spp.
Phương pháp phân lập nấm Colletotrichum spp. từ mẫu bệnh tham khảo theo
Lester W. Burgess, 2009, Cẩm nang chuẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam:
Thu mẫu ớt có có biểu hiện bệnh thán thư.
Rửa sạch với nước để loại bỏ đất bụi và các tạp chất khác.
Phân lập các chủng vi khuẩn
Bacillus spp. từ các mẫu đất.
Phân lập các chủng nấm
Colletotrichum spp. từ quả ớt
bệnh thán thư
Quan sát hình thái Kiểm tra sinh hóa
Định danh sinh học phân tử
Kiểm tra khả năng gây bệnh theo
quy tắc Koch
Định danh sinh học phân tử
Đối kháng in vitro trên đĩa petri
Tuyển chọn các chủng Bacillus spp.

22
Khử trùng bề mặt quả bằng ethanol 70% bằng cách nhúng nhanh quả ớt vào
ethanol 70% trong 5 giây, rửa lại bằng nước vô trùng và để khô trên giấy thấm vô trùng.
Dùng dao cấy đã khử trùng cắt những miếng nhỏ (2 x 2 mm) từ phần ranh giới
giữa mô khỏe và mô bệnh.
Cấy lên môi trường PDA hoặc water agar (WA) chứa chloramphenicol 100 ppm.
Ủ đĩa cấy ở nhiệt độ 28o
C.
Sau 24 – 48 giờ, các tản nấm phát triển từ những miếng cấy. Lựa chọn những
khuẩn lạc có hình thái đặc trưng của chủng Colletotrichum spp. ở giai đoạn đầu là khuẩn
lạc có màu ửng hồng ở tâm, sợi nấm phát triển sát dưới thạch agar, không bung sợi tơ
lên như các dòng nấm khác.
Cấy truyền những khuẩn lạc đặc trưng (cắt ở mép ngoài tản nấm) sang môi trường
PDA để tạo dòng thuần.
Khi nuôi từ ngày thứ 4 trở lên, khuẩn lạc nấm ban đầu có màu trắng, sẽ xuất hiện
một số vết đen ở mặt dưới thạch, đây là dấu hiệu đặc trưng cho các loài Colletotrichum
spp.
3.3.2. Phân lập các chủng Bacillus spp.
Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus spp. từ mẫu đất tham khảo theo Kok-
Gan Chan, 2007; Dworkin, Falkow, Rosenberg, Schleifer, & Stackebrandt, 2006:
Cân 10g mẫu đất vào 90 ml nước cất, lắc 250 vòng/phút ở nhiệt độ thường trong
5 phút tạo huyền phù.
Hấp huyền phù ở 80o
C trong 10 phút để loại phần lớn các dòng vi khuẩn gây
bệnh không tạo được bào tử chịu nhiệt. Các loài Bacillus spp. như B. subtilis, B.
amyloliquefaciens tạo bào tử có khả năng chịu nhiệt cao.
Pha loãng theo các nồng độ 10-2
, 10-4
, 10-6
nhằm sàng lọc các khuẩn lạc đặc trưng.
Trãi đĩa trên môi trường TSA, nuôi ở 28o
C trong 24 giờ.
Lựa chọn các khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng cho dòng Bacillus spp. với ưu
tiên là chủng B.subtilis, có đặc điểm khuẩn lạc sần sùi, màu trắng sữa. Sử dụng phương
pháp cấy ria để tách các dòng vi khuẩn, tạo dòng thuần sau khoảng 2 – 3 thế hệ.

23
3.3.3. Quan sát đại thể và vi thể các mẫu nấm bệnh phân lập được
Các chủng nấm đã được làm thuần bằng cách cấy chuyền dựa vào đặc điểm đại
thể sẽ được tiến hành quan sát vi thể dưới kính hiển vi theo phương pháp buồng giữ ẩm.
3.3.3. Chủng bệnh nhân tạo các chủng nấm Colletotrichum spp.
Phương pháp được thực hiện tham khảo theo P. Montri (2009) với một vài thay
đổi như sau:
Quả ớt thuộc giống ớt sừng trâu ở giai đoạn còn xanh được ngâm trong nước
Javen (NaClO) 1% (w/v) trong 5 phút để khử trùng và trung hòa các loại hóa chất và vi
sinh vật trên bề mặt vỏ quả. Sau đó rửa nhẹ bằng nước cất vô trùng hai lần.
Dùng phương pháp tạo vết thương trên vỏ quả hoặc tiêm trực tiếp 20 µl huyền
phù bào tử nấm bệnh vào quả ớt. Đặt mẫu ớt vào hộp nhựa, kích thước (20 x 30 x 10
cm) bên trong có lót giấy ẩm, sau đó được ủ ở 28o
C. Biểu hiện bệnh thán thư được khảo
sát sau 3, 5, 7, 9 ngày từ lúc tiêm chủng. Chỉ tiêu đo là phần trăm (%) kích thước vết
bệnh so với kích thước toàn bộ quả.
3.3.4. Kiểm tra sinh hóa định danh các chủng Bacillus spp.
Thực hiện các phản ứng kiểm tra sinh hóa định danh vi khuẩn Bacillus spp. theo
Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Bao gồm các phản ứng:

24
Hình 3.2 Sơ đồ định danh vi khuẩn Bacillus spp. theo Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology

25

26
Hình 3.2 Sơ đồ định danh vi khuẩn B. subtilis và B. licheniformis theo Bergey’s
Manual of Determinative Bacteriology
Trong đó các kỹ thuật sinh hóa đã được tiến hành như sau:
Nhuộm Gram
Lấy một ít sinh khối vi khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy đặt lên lame có nhỏ sẵn một giọt nước,
thấm khô.
Hơ qua ngọn lửa đèn cồn 2 đến 3 lần để tạo vết bôi.
Phủ vết bôi với crystal violet trong 1 phút, rửa nước.
Phủ vết bôi với lugol 1 phút, rửa nước.
Rửa bằng ethanol 90o
3 đến 5 giây sau đó rửa lại nhanh với nước.
Phủ vết bôi với safranin 5% trong 1 phút, rửa nước rồi thấm khô.
Quan sát dưới kính hiển vi.
Kết quả: tế bào vi khuẩn bắt màu tím là Gram (+), ngược lại bắt màu hồng là Gram (-).
Nhuộm bào tử
Làm vết bôi và cố định tế bào như đối với nhuộm Gram.
Nhuộm bằng dung dịch Lục Malachite trong 10 phút, rửa nước.
Nhuộm lại bằng dung dịch Safranine trong 30 giây, rửa nước, thấm khô.
Soi kính: dùng vật kính dầu 100×
Kết quả:
Bào tử có màu lục, tế bào có màu đỏ.
Khảo sát khả năng sống kỵ khí
Các chủng vi khuẩn được cấy ria trên đĩa petri và nuôi ủ trong điều kiện yếm khí
Quan sát sau 24 và 48 giờ.
Kết quả: nếu có khuẩn lạc phát triển thì vi khuẩn có khả năng sống kị khí, ngược lại là
vi khuẩn hiếu khí.
Phản ứng Catalase
Lấy một ít sinh khối vi khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy đặt lên lame có nhỏ sẵn một giọt nước.
Nhỏ 1 giọt dung dịch H2O2 lên bề mặt sinh khối vi khuẩn
Kết quả: có sinh bọt khí là catalase dương tính, ngược lại là catalase âm tính.
Khảo sát khả năng phân giải tinh bột

27
Cấy vi khuẩn trên môi trường starch agar sau 24 giờ.
Phủ glugol trên bề mặt đĩa môi trường starch agar đã cấy vi khuẩn 24 giờ.
Quan sát vòng phân giải trên đĩa.
Kết quả: có xuất hiện vòng phân giải là có khả năng phân giải dường, ngược lại là không.
Phản ứng MR-VP
Cấy vi khuẩn vào 5ml môi trường Buffered peptone-glucose broth
Ủ 35o
C trong 48 giờ.
Thêm 1,2 ml (hoặc 24 giọt) thuốc thử A.
Thêm 0,4 ml (hoặc 8 giọt) thuốc thử B.
Lắc ống trong 30 giây đến 1 phút
Để yên ít nhất 30 phút.
Quan sát kết quả trong 1 giờ nếu bề mặt chuyển màu đỏ là VP dương tính, ngược lại là
VP âm tính
Phản ứng Citrate
Cấy điểm vi khuẩn trên đĩa petri môi trường simmons citrate.
Quan sát sau 2, 4, 6, 8, 10 ngày, ghi nhận kết quả.
Kết quả: nếu môi trừng chuyển màu sang màu xanh dương là citrate dương tính, ngược
lại không đổi màu là âm tính.
Phát triển trên môi tường NaCl 6,5%
Cấy ria vi khuẩn trên môi trường TSA với NaCl là 6,5%, quan sát sau 1 ngày.
Kết quả: Nếu có khuẩn lạc phát triển là có khả năng phát triển ở nồng độ muối 6,5%
Phát triển ở nhiệt độ 55o
C
Cấy ria vi khuẩn trên môi trường TSA và ủ ở nhiệt độ 55o
C, quan sát sau 1 ngày.
Kết quả: Có khuẩn lạc phát triển tức là chủng có khả năng phát triển ở nhiệt độ 55o
C.
3.3.5. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử
3.3.5.1. Nấm Colletotrichum spp.
Bước 1: Tách DNA nấm bằng phương pháp sốc nhiệt: sử dụng tơ nấm đã nuôi
cấy khoảng 4 ngày cho vào tube 1,5 ml có chứa sẵn 100 𝜇𝑙 dung dịch TE, thực hiện tách
DNA tổng số bằng phương pháp sốc nhiệt bằng microwave (công suất = 750) 30s 
nghỉ 10s  làm nóng 30s nghỉ 60 – 70s làm nóng 30s  nghỉ 20s  làm nóng 30s

28
 cho ngay vào đá lạnh để sốc nhiệt. Mang mẫu giữ ở -20o
C trên 30 phút (có thể giữ
qua đêm).
Bước 2: Phản ứng PCR khuếch đại trình tự vùng ITS – rDNA sử dụng cặp mồi
ITS4 và ITS5.
Bảng 3.1 Trình tự mồi
Tên mồi Trình tự mồi (3’ – 5’)
ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC
Từ mẫu đã ly trích DNA, thực hiện ly tâm mẫu 10000 rpm ở 4o
C trong 7 phút
trước khi thu dịch nỗi cho phản ứng PCR. Sau đó mix mẫu và thực hiện phản ứng theo
bảng 3.2 và 3.3.
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tích
Dream Taq buffer 2,5 μl
dNTP (40mM) 0,5 μl
F_Primer (ITS5) 0,5 μl
R_Primer (ITS4) 0,5 μl
Dream Taq 0,25 μl
DNA (20ng/μl) 1 μl
H2O 19,75 μl
Tổng 25 μl
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
94o
C 4 phút 1
94 o
C 30s
35
56 o
C 35s
72 o
C 60s

29
72 o
C 10 phút 1
4o
C Trữ mẫu
Bước 3: Điện di kiểm tra kết quả phản ứng PCR, dùng gel 0,8 -1% agarose.
Bước 4: Tinh sạch sản phẩm PCR, các mẫu phản ứng PCR sau khi điện di kiểm
tra kết quả có xuất hiện bank của vùng ITS - rDNA (580 bp) thì thực hiện tinh sạch bằng
bộ kít ISOLATE II PCR and Gel Kit của Bioline.
Bước 5: Gửi mẫu đi giải trình tự cho công ty…..?
Bước 6: Sử dụng phần mềm ATGC để hiệu chỉnh lại các trình tự đã giả sau đó
load lên phần mềm Blast NCBI để đối chiếu với các trình tự có sẵn trên GenBank
từ đó định danh các loài nấm trên cơ sở sinh học phân tử.
3.3.5.2. Vi khuẩn Bacillus spp.
Hình 3.4. Quy trình định danh vi khuẩn Bacillus spp. bằng sinh học phân tử
Chuẩn bi mẫu lấy khuẩn lạc đơn vi khuẩn Bacillus ở 24h cho vào tube 1,5 ml
có chứa sẵn 100 𝜇𝑙 TE. Sau đó đem đi ủ nhiệt ở 95o
C trong 15 phút rồi chuyển ngay vào
đá để sốc nhiệt. Mang mẫu giữ ở -20o
C trên 30 phút (có thể giữ qua đêm).
Phản ứng PCR thực hiện ly tâm mẫu 10000 rpm ở 4o
C trong 7 phút trước khi
thu dịch nỗi cho phản ứng PCR.
Bảng 3.4. Trình tự mồi
Sử dụng khuẩn lạc đơn ở 24h
Tách DNA nấm bằng phương pháp sốc nhiệt
Phản ứng PCR khuếch đại trình tự vùng 16S rRNA sử dụng cặp mồi 20F và
1500R
Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
Tinh sạch sản phẩm PCR
Gửi mẫu đi giải trình tự
Sử dụng phần mềm ATGC và Blast NCBI để định danh nấm.

30
Tên mồi Trình tự mồi (5’ – 3’)
20F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
1500R GGTTACCTTGTTACGACTT
Bảng 3.5. Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tích
Dream Taq buffer 2,5 μl
dNTP (40mM) 0,5 μl
F_Primer (20F) 0,5 μl
R_Primer (1500R) 0,5 μl
Dream Taq 0,25 μl
DNA (20ng/μl) 1 μl
H2O 19,75 μl
Tổng 25 μl
Bảng 3.6. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
94o
C 4 phút 1
94 o
C 30s
35
56 o
C 35s
72 o
C 90s
72 o
C 10 phút 1
4o
C Trữ mẫu
Điện di kiểm tra kết quả phản ứng PCR dùng gel 0,8 -1% agarose.
Tinh sạch sản phẩm PCR các mẫu phản ứng PCR sau khi điện di kiểm tra kết
quả có xuất hiện bank của vùng 16S rRNA (1500 bp) thì thực hiện tinh sạch bằng bộ kít
ISOLATE II PCR and Gel Kit của Bioline.

31
Colletotrichum spp. trong điều kiện in vitro.
Các chủng nấm Colletotrichum spp. gây bệnh trên ớt được thử đối kháng sinh
học với các loài vi khuẩn Bacillus spp. Sử dụng phương pháp đồng nuôi cấy tham khảo
từ Ashwini Narasimhan (2012) và Lê Thị Mai Châm (2013).
Nuôi cấy nấm gây bệnh trên đĩa Petri chứa môi trường PDA [Potato Dextrose
Agar; 4g Potato extract (Sigma, Anh), 15g D-glucose (Merck, Đức), 15g agar (Difco,
Mỹ)] trong 7 ngày. Nuôi vi khuẩn trên môi trường TSA [Trypticase Soy Agar; 15g
Tryptone (Merck, Đức), 5g Soytone (Merck, Đức), 5g NaCl (Merck, Đức), 15g agar
(Difco, Mỹ)] trong 24 giờ. Dùng khoan thạch đường kính 5 mm ấn nhẹ lên bề mặt nuôi
cấy nấm gây bệnh rồi đặt mẫu cấy sang giữa đĩa Petri chứa môi trường PDA, tương tự
sau đó cấy vi khuẩn đối kháng hai bên mép đĩa Petri sao cho cách mép đĩa 1,5 cm. Ủ đĩa
đối kháng ở nhiệt độ phòng, và đánh giá kết quả sau 4, 6, 8 ngày nuôi cấy. Ứng với mỗi
chủng vi khuẩn đối kháng là một thí nghiệm, lặp lại 3 lần.
Số liệu được xử lý bằng phương pháp Anova 1 yếu tố, với tác nhân gây bệnh là
nấm Colletotrichum acutatum (chủng đã có trong bộ sưu tập) và các chủng vi khuẩn
Bacillus spp. nhằm xác định những chủng có khả năng đối kháng cao nhất.
Hình 2.5 Phương pháp đồng nuôi cấy kiểm tra hiệu quả đối kháng
Công thức tính:
H = ((A – R) / A ) x 100
H: Phần trăm ức chế nấm bệnh (%)
A: Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh trong công thức đối chứng (cm)
R: Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh khi được nuôi cùng với vi khuẩn (cm)

32
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả.
4.1.1. Kết quả phân lập nấm Colletotrichum spp.
Mẫu bệnh thán thư được thu thập từ các vườn ớt ở ấp Bàu Đưng, xã An Nhơn Tây,
huyện Củ Chi. Cách lấy mẫu:
Ở mỗi vườn ớt có cây bị bệnh thán thư, chọn ngẫu nhiên 2 – 3 luống. Trên mỗi
luống, chọn 3 - 6 cây, ở đầu, giữa và cuối luống để thu phần quả có những biểu hiện của
bệnh thán thư hại ớt gây ra bởi nấm Colletotrichum spp. như vết bệnh thường có hình
thoi, vòng tròn đồng tâm, lõm, phân ranh giới giữa mô bệnh là một đường màu đen chạy
dọc theo vết bệnh. Bề mặt của vết bệnh trở nên ẩm ướt, sạm lại (có màu nâu vàng hay
màu rám nắng).

33
Hình 4.1 Triệu chứng bệnh thán thư trên quả ớt do nấm Colletotrichum spp. gây ra.
Kết quả sau phân lập thu được 28 chủng nấm có những đặc điểm tương tự các chủng
nấm Colletotrichum spp. trên môi trường PDA.
4.1.2. Đặc điểm đại thể và vi thể của các chủng nấm Colletotrichum spp.
Bảng 4.1 Đặc điểm đại thể và vi thể của các chủng nấm Colletotrichum spp.
TT Chủng Đại thể Vi thể
1
C.
acutatum
2 C1.1
3 C1.2

34
4 C1.3
5 C1.4
6 C1.6
7 C1.7
8 C1.8

35
9 C1.9
10 C1.10
11 C2.1
12 C2.2
13 C2.3

36
14 C2.4
15 C2.5
16 C2.6
17 C3.2
18 C3.3

37
19 C3.4
20 C3.5
21 C3.6
22 C3.7
23 C3.8

38
24 C3.9
25 C4.3
26 C4.9
27 C5.1
28 C5.4
Tất cả các chủng được nuôi cấy trên môi trường PDA phát triển rất tốt, ban đầu
hệ sợi nấm có màu ửng hồng, sợi nấm phát triển lan ra trên bề mặt thạch tạo thành các
vòng tròn đồng tâm, ở mặt dưới môi trường chuyển màu cam tại vị trí cấy. Đến ngày

39
thứ 5 hoặc 7 tùy chủng bắt đầu có xuất hiện các điểm đen ở mặt dưới đĩa môi trường
và càng ngày càng nhiều, khi tản nấm lan hết đĩa nấm thì sợi nấm chuyển dần sang
màu xám đen.
Khi quan sát hệ sợi nấm dưới kính hiển vi các chủng nấm có dạng sợi phân
nhánh và có vách ngăn, bào tử có dạng hình bầu dục
4.1.3. Kết quả phân lập các chủng Bacillus spp.
Sau khi pha loãng và cấy trãi và ủ ở 35oC sau 24 giờ các mẫu đất thu được từ các
vườn ớt thuộc xã Bình Phan, huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang đã phân lập được 10
chủng vi khuẩn có những đặc điểm khuẩn lạc tạo hệ matrix sần sùi, màu trắng sữa giống
với loài mục tiêu là B. Subtilis được kí hiệu bắt đầu bằng ”CG” .
Nhận thêm 5 chủng Bacillus spp. phòng Công nghệ Vi sinh, TT CNSH TPHCM
phân lập ở khu vực trồng cải xanh, huyện Bình Chánh, tháng 4/2013 được kí hiệu bắt
đầu bằng ”BA” và 4 chủng Bacillus spp. từ tổ CNSH Môi trường-Thực phẩm, TT CNSH
TPHCM phân lập từ nước thải trại heo, tỉnh Đồng Tháp, tháng 6/2014 được kí hiệu bắt
đầu bằng “D”.
4.1.4. Đặc điểm đại thể và vi thể của các chủng vi khuẩn Bacillus spp.
Bảng 22 Đặc điểm đại thể và vi thể các chủng vi khuẩn Bacillus spp.
TT Chủng Đại thể Vi thể
1 BA10
2 BA88

40
3 BA92
4 BA98
5 BA99
6 CG1
7 CG4

41
8 CG5
9 CG6
10 CG7
11 CG8
12 CG9

42
13 CG10
14 CG11
15 CG12
16
D1
17
D2

43
18
D3
19
D4
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường TSA phát triển tạo khuẩn lạc dạng
hình tròn, rìa răng cưa không đều màu trắng sữa cho đến vàng nhạt, bề mặt nhăn nheo.
đường kính 3 – 5 mm. Khi quan sát dưới kính hiển vi, các chủng vi khuẩn đều có dạng
hình que, bắt màu Gram dương, đứng một mình hoặc kết thành chuỗi ngắn, có tạo bào
tử.
4.1.5. Chủng bệnh nhân tạo các chủng nấm Colletotrichum spp.
Sau khi phân lập các chủng nấm Colletotrichum spp. từ ớt bệnh dựa theo hình thái tản
nấm và sợi nấm, chúng tôi thực hiện chủng bệnh nhân tạo các chủng nấm trên trong
điều kiện invitro trên quả ớt tươi nhằm kiểm tra khả năng gây bệnh và triệu chứng
bệnh. Kết quả như sau:
Bảng 4.3 Lây nhiễm bệnh nhân tạo các chủng nấm đã phân lập sau 7 ngày.
TT Chủng Biểu hiện
1 Mẫu ớt tươi

44
2
Mẫu tiêm nước
(Đối chứng)
3 C. acutatum
4 C1.1
5 C1.2
6 C1.3

45
7 C1.4
8 C1.6
9 C1.7
10 C1.8
11 C1.9

46
12 C1.10
13 C2.1
14 C2.2
15 C2.3
16 C2.4

47
17 C2.6
18 C3.2
19 C3.3
20 C3.4
21 C3.5
22 C3.6

48
23 C3.7
24 C3.8
25 C3.9
26 C4.3
27 C4.9

49
28 C5.1
29 C5.4
Tất cả các chủng nấm đã phân lập đều gây bệnh cho ớt trong điều kiện in vitro sau 7
ngày với triệu chứng giống như các mẫu bệnh đã thu thập trước đó như vết bệnh có
dạng hình thoi, vết bệnh ẩm ướt, nhũn ra và lõm xuống, vết bệnh có màu cam hoặc
nâu. Một số chủng như 1.3, 1.10, 3.2 có mức độ gây bệnh yếu hơn các chủng còn lại.
4.1.6. Test sinh hóa định danh các chủng Bacillus spp.
Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa Bacillus spp.
TT Chủng Gram Bào
tử
Kỵ
khí
Tinh
bột
VP Methyl
Red
Citrate NaCl
6,5%
55o
C Catalase
1 BA10 + + - + + - + + - +
2 BA88 + + - + + - + + - +
3 BA92 + + - + + - + + - +
4 BA98 + + - + + - + + - +
5 BA99 + + - + + - + + - +
6 CG1 + + - + + - + + - +
7 CG4 + + - + + - + + - +
8 CG5 + + - + + - + + - +
9 CG6 + + - + + - + + - +
10 CG7 + + - + + - + + - +
11 CG8 + + - + + - + + - +
12 CG9 + + - + + - + + - +
13 CG10 + + - + + - + + - +

50
14 CG11 + + - + + - + + - +
15 CG12 + + - + + - + + + +
16 D1 + + - + + - + + - +
17 D2 + + - + + - + + + +
18 D3 + + - + + - + + - +
19 D4 + + - + + - + + - +
(+): là phản ứng dương tính, (-): là phản ứng âm tính
A
C
B
G
D
E F
-
-
-

51
Hình 4.2 Kết quả một số phản ứng sinh hóa đã thực hiện
A: Phản ứng phân giải tinh bột, B: Phản ứng catalase, C: Nhuộm bào tử, D: Phản ứng
citrate, E: Phản ứng methyl – red, F: Phát triển kỵ khí, G: Phản ứng VP
4.1.7. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử.
4.1.7.1. Kết quả PCR khuếch đại trình tự các vùng gen
4.1.7.1.1. Nấm Colletotrichum spp.
Các chủng nấm được ly trích DNA tổng số sau đó thực hiện PCR khuếch đại vùng gen
ITS – rDNA bởi cặp mồi ITS4 và ITS5.
Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR của một số dòng nấm Colletotrichum spp.
Khuếch đại vùng gen ITS – rDNA sử dụng cặp mồi ITS4 và ITS5 cho sản phẩm duy
nhất có kích thước khoảng 580 bp, kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của
Wipornpan và cs năm 2005
4.1.7.1.2. Vi khuẩn Bacillus spp.
Leader
1 Kb

52
Các chủng vi khuẩn được khuếch đại vùng gen 16S RNA bằng phương pháp PCR
khuần lạc với cặp mồi 20F và 1500R.
Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR của một số dòng vi khuẩn Bacillus spp.
Sau phản ứng PCR, sản phẩm được điện di cho thấy phản ứng chỉ tạo một sản phẩm
duy nhất có kích thước khoảng 1500 bp.
4.1.7.2. Kết quả định danh các dòng nấm Colletotrichum spp.
Các sản phẩm PCR sau quá trình tinh sạch được gửi đi giải trình tự. Kết quả sau khi đã
chỉnh sữa và load lên BLAST trên NCBI để so sánh với các trình tự có sẵn trên
GenBank thì có được kết quả như sau:
Bảng 4.4 Kết quả định danh nấm Colletotrichum phân lập từ Củ Chi
TT Chủng
Chủng tham khảo
Accession Identities Loài
1 C1.1 AJ301921.1 566/566 (100%) Colletotrichum acutatum
9 C2.1 AB697047.1 565/566 (99%) Colletotrichum scovillei
Leader
1 Kb

53
12 C2.4 LC011101.1 579/580 (99%) Colletotrichum acutatum
Vì chỉ sử dụng cặp mồi ITS4 và ITS5 có tính chuyên biệt chưa cao, đồng thời sản
phẩm tạo ra có kích thước tương đối ngắn cho nên khi so sánh trên GenBank hầu hết
các chủng đều có trình tự vùng ITS – rDNA khuếch đại bởi cặp mồi ITS4 và ITS5 tương
tự nhau hay thậm chí là trùng khớp với nhau và tương tự với trình tự cùa loài C.
acutatum. Trước đây thì loài này được xem là một loài tuy nhiên với sự phát triển của
khoa học người ta đã xác định được những loài cụ thể thuộc loài C. acutatum như
Colletotrichum scovillei là chủng C2.1 đã phân lập được.
Vậy kết luận có 27 chủng là C. acutatum và 1 chủng C2.1 là C. scovillei
4.1.7.3. Kết quả định danh các dòng vi khuẩn Bacillus spp.
Các sản phẩm PCR sau quá trình tinh sạch được gửi đi giải trình tự. Kết quả sau khi đã
chỉnh sữa và load lên BLAST trên NCBI để so sánh với các trình tự có sẵn trên
GenBank thì có được kết quả như sau:

54
Bảng 4.5 Kết quả định danh sinh học phân tử Bacillus spp.
TT Chủng
Chủng tham khảo
Accession Identities Loài
1 BA10
CP010556.1
GU826165.1
1473/1478 (99%)
1473/1478 (99%)
Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus subtilis
2 BA88
CP010556.1
GU826165.1
1471/1475 (99%)
1471/1475 (99%)
Bacillus subtilis
3 BA92
KP059106.1
KM892856.1
1153/1180 (98%)
1153/1180 (98%)
Bacillus subtilis
4 BA98
CP010556.1
GU826165.1
1476/1477 (99%)
1476/1477 (99%)
Bacillus subtilis
5 BA99
CP009748.1
KJ123715.1
1414/1420 (99%)
1414/1420 (99%)
Bacillus subtilis
6 CG1
KP059106.1
KJ721204.1
1448/1450 (99%)
1448/1450 (99%)
Bacillus subtilis
7 CG4
KP729134.1
CP009611.1
1435/1447 (99%)
1435/1447 (99%)
Bacillus subtilis
8 CG6
CP003838.1
DQ444283.1
1503/1511 (99%)
1504/1513 (99%)
Bacillus subtilis
9 CG7
KP059106.1
KJ721204.1
1462/1463 (99%)
1462/1463 (99%)
Bacillus subtilis
10 CG8
KP119809.1
CP009611.1
1476/1477 (99%)
1476/1477 (99%)
Bacillus subtilis
11 CG9
CP010556.1
GU826160.1
1446/1459 (99%)
1446/1459 (99%)
Bacillus subtilis
12 CG10
KP119809.1
CP009611.1
1478/1479 (99%)
1478/1479 (99%)
Bacillus subtilis
13 CG11
CP010556.1
CP009611.1
1446/1453 (99%)
1446/1453 (99%)
Bacillus subtilis
14 CG12 AY913755.1 1423/1432 (99%) Bacillus subtilis

55
EF656455.1 1424/1434 (99%) Bacillus licheniformis
15 D1
CP010556.1
CP009611.1
1444/1451 (99%)
1444/1451 (99%)
Bacillus subtilis
16 D2
AY913755.1
EF656455.1
1424/1434 (99%)
1423/1433 (99%)
Bacillus subtilis
Bacillus licheniformis
17 D3
CP010556.1
CP009611.1
1444/1451 (99%)
1444/1451 (99%)
Bacillus subtilis
18 D4
CP010556.1
CP009611.1
1453/1460 (99%)
1452/1459 (99%)
Bacillus subtilis
Hệ thống phân loại Bacillus dựa trên phân tích trình tự đoạn gen 16S rRNA bắt
đầu từ những năm 1990. Theo đó, B. subtilis Cohn 1872 và những loài có quan hệ gần
gũi như B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. megaterium, B. coagulans, B.
anthracis, B. cereus và B. thuringensis được xếp vào phân nhóm thứ nhất trong tổng
số 5 phân nhóm. Phương pháp phân loại truyền thống dựa trên hình thái tế bào, bào tử
cũng như các đặc tính sinh hóa không có khả năng phân tách các loài này. Hơn nữa,
hầu hết các loài này đều có mức độ tương đồng đoạn gen 16S rRNA rất cao (lớn hơn
99%) mặc dù kết quả lai DNA - DNA của từng loài với B. subtilis nhỏ hơn 70% (Trịnh
Thành Trung, 2013).
Do đó sau khi giải trình tự cũng như các thử nghiệm sinh hóa trước đó đều
không thể xác định các chủng trên là B. subtilis hay B. amyloliquefaciens, tuy nhiên 2
loài này chỉ khác nhau ở khả năng tạo enzym (F. G. Priest, 1987) nên dức theo yêu cầu
trong đề tài không đặc biệt phải tách riêng hai loài này. Riêng 2 chủng D2 và CG12 có
khả năng phát triển ở 55o
C nên được xác định là B. licheniformis.
Vậy kết luận có 17 chủng là B. subtilis hay B. amyloliquefaciens và 2 chủng D2, CG12
là B. licheniformis.
Colletotrichum spp. trong điều kiện in vitro.
Tiến hành đối kháng đồng nuôi cấy các chủng vi khuẩn với nấm C. acutatum kết quả
ghi nhận được như sau

56
Hình 4.5 Biểu đồ hiệu quả đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm C. acutatum
Kết quả thu được sau khi xử lí cho thấy tất cả các chủng đều có khả năng đối
kháng với nấm C. acutatum tuy nhiên mức độ đối kháng là khác nhau theo từng chủng.
Trong đó các chủng trong đó các chủng CG9, CG8, CG10, CG5 và CG6 thuộc vào nhóm
đối kháng mạnh nhất với hiệu quả đối kháng đạt trên 60%, kế đó là các chủng CG1,
CG4, CG7, D3, D1, CG11, D4 và BA98 có hiệu quả đối kháng trên 50% và các chủng
còn lại thuộc vào nhóm thứ ba có hiệu quả đối kháng yếu.

57
Hình 4.6 Đối kháng của các chủng Bacillus spp. với nấm C. acutatum
Ta có thể thấy khi đồng nuôi cấy các chủng Bacillus spp. với nấm C. acutatum thì
nấm bị ức chế sự phát triển một cách rõ ràng.
4.2. Thảo luận
Phần này em chưa hiểu lắm, không biết viết cái gì hết, anh chị để em nghiên cứu thêm
đã nha!

58
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Trên cơ sở những kết quả nghiên cứu chúng tôi rút ra được những kết luận sau:
Phân lập được 28 chủng nấm Colletotrichum spp. từ các mẫu ớt bệnh tại các vườn
ớt thuộc ấp Bàu Đưng, xã An Nhơn Tây, huyện Củ Chi.
Phân lập và thu thập được 19 chủng vi khuẩn Bacillus spp.
Sau khi định danh bằng sinh học phân tử thì xác định có 28 chủng thuộc loài C.
acutatum và 17 chủng vi khuẩn thuộc loài B. subtilis hoặc B. amyloliquefaciens, 2 chủng
thuộc loài B. licheniformis.
Kết quả đối kháng in vitro theo phương pháp đồng nuôi cấy trên đĩa petri cho
thấy các chủng vi khuẩn phân lập được có khả năng đối kháng với nấm loài C. acutatum
tương đối tốt, trong đó các chủng CG9, CG8, CG10, CG5 và CG6 thuộc vào nhóm đối
kháng mạnh nhất với hiệu quả đối kháng đạt trên 60%, kế đó là các chủng CG4, CG1,
CG7, D3, D1, CG11, D4 và BA98 có hiệu quả đối kháng trên 50% và các chủng còn lại
thuộc vào nhóm thứ ba có hiệu quả đối kháng yếu dưới 50%.
5.2. Đề nghị
Sau khi hoàn thành đề tài chúng tôi có một số đề nghị cải tiến từ đề tài như sau:
Cần phân lập thêm các mẫu nấm bệnh từ các vùng địa lí khác nhau để làm
phong phú thêm các loài nấm Colletotrichum spp.
Phân lập thêm các chủng Bacillus spp. trên môi trường thực vật để có thể phù
hợp cho việc tạo chế phẩm dạng phun trên cây.
Thực hiện giải trình tự các chủng nấm có thể sử dụng thêm một số cặp mồi
chuyên biệt hơn dành cho các loài Colletotrichum spp.
Có thể thực hiện thêm các thi nghiệm sâu hơn để tách rõ 2 loài B. subtilis va B.
amyloliquefaciens có quan hệ gần gủi với nhau.
Tiến hành các thí nghiệm nhằm tạo chế phẩm ứng dụng trong thực tế.

59
TÀI LIỆU THAM KHẢO
* Tài liệu tiếng việt
1. Lester W. Burgess, Timothy E. Knight, Len Tesoriero, Phan Thúy Hiền, Cẩm
nang chuẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam, 2009, Chuyên khảo ACIAR số 129a, 210
pp.
2. Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về quy trình phòng trừ bệnh thán thư
(Colletotrichum spp.) hại ớt trên đồng ruộng, 2013, QCVN 01- 138 :
2013/BNNPTNT.
3. Vũ Triệu Mân, 2007, Bệnh cây chuyên khoa. Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà
Nội.
* Tài liệu tiếng nước ngoài
4. Roberts PD, Pernezny K, Kucharek TA. Anthracnose caused
by Colletotrichum sp. on pepper. Journal of University of Florida/Institute of
Food and Agricultural Sciences. 2001.
5. P. Montri, P.W.J. Taylor, O. Mongkolporn, 2009. Pathotypes of Colletotrichum
capsici, the causal agent of chili anthracnose in Thailand, Am. Phytopathol. Soc.
93: 17–20.
6. Kok-Gan Chan, Siew-Zhen Tiew and Ching-Ching Ng. 2007. Rapid isolation
method of soil bacilli and screening of their quorum quenching activity. Asia
Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology, Vol. 15 (3) : 153-156.

60
7. Ken Pernezny and Tim Momol ,2006, Florida Plant Disease Management Guide:
Pepper.
8. Tong N, Bosland PW. 1999. Capsicum tovarii, a new member of the Capsicum
complex. Euphytica; 109(2):71–72. doi: 10.1023/A:1003421217077.
9. Alcaraz, L.; Moreno-Hagelsieb, G.; Eguiarte, L. E.; Souza, V.; Herrera-Estrella,
L.; Olmedo, G. 2010. Understanding the evolutionary relationships and major
traits of Bacillus through comparative genomics. BMC Genomics 11: 332.
10.M. Dworkin, The Prokaryotes - Vol. 4: Bacteria: Firmicutes, Cyanobacteria.
Springer Publisher. 2006.
11.Yong Joon Chung, Mark T. Steen, and J. Norman Hansen, 1992. The Subtilin
Gene of Bacillus subtilis ATCC 6633 Is Encoded in an Operon That Contains a
Homolog of the Hemolysin B Transport Protein, Journal of Bacteriology, o. 4,
21-9193/92/041417-06$02.00/0, Journal of Bacteriology. American Society for
Microbiology. American
12.Sun H. Paik, Anu Chakicherla, and J. Norman Hansen, 1998, Identification and
Characterization of the Structural and Transporter Genes for, and the Chemical
and Biological Properties of Sublancin 168, a Novel Lantibiotic Produced by
Bacillus subtilis 168, Journal of Biological Chemistry Vol 273 23134 – 23142.
13.Axel G. Stöver and Adam Driks, 1999. Regulation of Synthesis of the Bacillus
subtilis Transition-Phase, Spore-Associated Antibacterial Protein TasA. Journal
of Bacteriology. No. 17 0021-9193/99/$04.00+0. American Society for
Microbiology. American.
14.Dirk Vollenbroich,1 Georg Pauli,2 Muhsin Ozel,2 And Joachim Vater1, 1997.
Antimycoplasma Properties and Application in Cell Culture of Surfactin, a

61
Lipopeptide Antibiotic from Bacillus subtilis. Appied and enviromental
microbiology. No. 1 0099-2240/97/$04.0010. American Society for
Microbiology. American.
15.Tsuey-Pin Lin, Chyi-Liang Chen, Li-Kwan Chang, Johannes Scheng-Ming
Tschen, and Shih-Tung Liu, 1999. Functional and Transcriptional Analyses of a
Fengycin Synthetase Gene, fenC, from Bacillus subtilis. J Bacteriol, 181(16):
5060–5067. American society for microbiology.American .
16.Erwin H. Duitman, Leendert W. Hamoen, Martina Rembold, Gerard Venema,
Harald Seitz, Wolfram Saenger, Frank Bernhard, Richard Reinhardt, Manuel
Schmidt, Christian Ullrich, Torsten Stein, Frank Leenders, and Joachim Vater,
1999. The mycosubtilin synthetase of Bacillus subtilis ATCC6633: A
multifunctional hybrid between a peptide synthetase, an amino transferase, and a
fatty acid synthase. Proc Natl Acad Sci U S A, 9; 96(23): 13294–13299. The
National Academy of Sciences.
17.Norimasa Tamehiro, Yoshiko Okamoto-Hosoya, Susumu Okamoto, Makoto
Ubukata, Masa Hamada, Hiroshi Naganawa, and Kozo Ochi, 2002. Bacilysocin,
a Novel Phospholipid Antibiotic Produced by Bacillus subtilis 168. Antimicrob
Agents Chemother, 46(2): 315–320. American society for
microbiology.American.
18.FAO, 2003, FAO Production Yearbook 2001. FAO pusblisher.
19.Po Po Than, H. Prihastuti, S. Phoulivong, P.W.J. Tayler, K.D. Hyde, 2008, Chilli
anthracnose disease caused by Colletotrichum species, J. Zhejiang Univ. 9: 764–
778.

62
20.S. Poonpolgul, S. Kumphai, 2007, Chilli pepper anthracnose in Thailand, in: First
Int. Symp. Chill. Anthracnose, p. 23.
21.Isaac S. Fungal Plant Interaction. London: Chapman and Hall Press; 1992. p. 115.
22.F. G. Priest, M. Goodfellow,L. A. Shute, and R. C. W. Berkeley,1987. "Bacillus
amyloliquefaciens sp. nom., nom. rev." International Journal of Sytematic
Bacteriology. GY, p. 69-71.
23.Gherna R, Pienta P, Cote R: American Type Culture Collection Catalogue of
Bacteria and Phages . Rockville: American Type Culture Collection;1989.
24.Neyra C, Atkinson LA, Olubayi O, Sadasivan L, Zaurov D, Zappi E: Novel
microbial technologies for the enhancement of plant growth and biocontrol of
fungal diseases in crops. Cahiers Opt Méd 1996, 31 : 447-456.
* Tài liệu từ internet
25.http://www.duoclieu.org/2012/02/ot-capsicum-annuum-l-ho-ca-solanaceae.html
26.http://web.mst.edu/~microbio/BIO221_2009/B_subtilis.html
27.https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bacillus_subtilis
28.http://vi.wikipedia.org/wiki/%E1%BB%9At

Phân lập và tuyển chọn các chủng bacillus spp.Có khả năng đối kháng sinh học với nấm colletotrichum spp. Gây bệnh thán thư trên cây ớt.docx

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Phân lập và tuyển chọn các chủng bacillus spp.Có khả năng đối kháng sinh học với nấm colletotrichum spp. Gây bệnh thán thư trên cây ớt.docx

Similar to Phân lập và tuyển chọn các chủng bacillus spp.Có khả năng đối kháng sinh học với nấm colletotrichum spp. Gây bệnh thán thư trên cây ớt.docx (20)

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Phân lập và tuyển chọn các chủng bacillus spp.Có khả năng đối kháng sinh học với nấm colletotrichum spp. Gây bệnh thán thư trên cây ớt.docx