More Related Content
Similar to Pewarnaan Bakteri
Pewarnaan Bakteri
- 2. MIKROBIOLOGI DAN PARASITOLOGI MODULIII “PANDUAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI” PENULIS Dr. Padoli, SKp,M.Kes PENDIDIKAN JARAK JAUH PENDIDIKAN TINGGI KESEHATAN PUSDIKLATNAKES, BADAN PPSDM KESEHATAN KEMENTRIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA 2013 WAT 2.05/2 SKS MODUL 1-4
- 3. Tujuan Pembelajaran Umum TujuanPembelajaran Khusus Kegiatan Praktikum 2 III Setelah menyelesaikan kegiatan praktikum 3, Anda diharapkan mampu menjelaskan prosedur pewarnaan bakteri TUJUANPembelajaran Umum TUJUANPembelajaran Khusus Setelah mengikuti Kegiatan Prakti- kum 3 , Anda diharapkan mampu : 1. Menjelaskan prosedur pewarnaan sederhana 2. Menjelaskan prosedur pewarnaan negatif 3. Menjelaskan prosedur pewarnaan differensiasi (gram) A. Materi Praktikum 1. Pewarnaan sederhana (pewarnaan positif) 2. Pewarnaan negatif 3. Pewarnaan differensiasi (gram) Pemeriksaan Mikroskopik Bakteri
- 4. Modul Pendidikan JarakJauh, Pendidikan Tinggi Kesehatan Prodi Keperawatan 3 Pendahuluan Pemeriksaan mikroskopik merupakan salah satu contoh pemeriksaan labora- torium mikrobiologi sederhana yang dapa digunakan untuk menunjang diagno- sis infeksi yang disebabkan oleh bakteri dan jamur . Visualisasi mikroorganisme dalam keadaan hidup sulit dilakukan , bukan han- ya karena ukurannya yang saat kecil namun juga karena mikroorganisme terse- but bersifat transparan dan tidak berwarna jika disuspensikan dalam medium cair. Oleh karena itu prosedur pewarnaan yang dikombinasi dengan pemeriksaan mikroskopik penting dilakukan untuk mengelompokkan mikroorganisme untuk kepentingan diagnostik . Berdasarkan tujuannya jenis pewarnaan dibedakan menjadi : pewarnaan seder- hana, pewarnaan negatif, pewarnaan diferensial , dan pewarnaan khusus . 1. Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif) a. Prinsip pemeriksaan Pada pewarnaan sederhana, apusan bakteri diwarnai dengan reagen tung- gal (satu jenis zat warna ) yang menghasilkan kontras antara organisme dan latar belakangnya . pada pewarnaan ini dipilih pewarnaan basa (basic stains) yang mengandung kromogen yang bermuatan positif, karena asam nukleat dan komponen tertentu pada dinding sel bakteri membawa muatan negatif yang akan berikatan dengan kuat terhadap kromogen kationik . tujuan dari pewarnaan sederhana adalah untuk melihat morfologi dan susunan sel bak- teri. zat warna yang paling banyak digunakan adalah methylene blue, crystal violet, dan carbol funchsin . Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya. Uraian Materi
- 5. 4 Modul Pendidikan JarakJauh, Pendidikan Tinggi Kesehatan Prodi Keperawatan b. Prosedur Pemeriksaan 1. Membersihkan gelas alas dengan kertas saring dan melewatkannya di api untuk menghilangkan kotoran dan lemak. 2. Membuat lingkaran kira-kira berdiameter 2-3 cm di bagian bawah gelas alas menggunakan pensil gelas dan beri label. 3. Membuat sediaan pada gelas alas, yaitu suspensi bakteri disebarkan di atas gelas alas sehingga merupakan lapisan tipis, keringkan, lalu sediaan ini direkatkan di atas nyala api dua atau tiga kali. 4. Menuangkan satu jenis zat warna pada satu gelas alas: carbol fuchsin 15- 30 detik atau crystal violet 20-60 detik atau methylene blue 1-2 menit. 5. Mencuci dengan air mengalir secara perlahan. 6. Mengeringkan dengan meletakkan gelas alas di atas kertas saring. 7. Meneteskan satu tetes minyak emersi, lalu lihat di bawah mikroskop de- nan pembesaran 10x100. Gambar 3.1 : Alur pemeriksaan Sederhana
- 6. 5 Modul Pendidikan JarakJauh, Pendidikan Tinggi Kesehatan Prodi Keperawatan c. Interprestasi Hasil Bakteri akan terlihat berwarna sesuai dengan pewarna yang digu- nakan. Misalnya berwarna merah dengan carbol fuchsin atau ungu dengan crystal violet atau biru dengan methylene blue
- 7. Modul Pendidikan JarakJauh, Pendidikan Tinggi Kesehatan Prodi Keperawatan 6 d. Tugas mahasiswa 1. Setiap mahasiswa mengerjakan pewarnaan sederhana untuk masing- masing biakan bakteri yang telah disediakan. 2. Melihat hasil pewarnaan tersebut dengan menggunakan mikroskop pada perbesaran lensa obyektif 100x. 3. Menggambar apa yang dilihat. e. Lembar kerja Praktikum Mikrobiologi Kegiatan 3a : Pewarnaan Sederhana Hari/tanggal : ………………… Nama : ………………… Kelompok : ………………… Mikroorganisme Methylen Blue Crystal Violet Carbol Fuchin Gambar hasil pengamatan Organisme Morfologi sel : • Bentuk • Susunan • warna ....................................... ....................................... ........................................ ....................................... ....................................... ...................................... ....................................... ...................................... .............................. ............................... .............................. ............................... Tugas
- 8. 7 Modul Pendidikan JarakJauh, Pendidikan Tinggi Kesehatan Prodi Keperawatan 2. Pewarnaan Negatif a. Prinsip pemeriksaan Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan me- warnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam. Pewarnaan negatif membutuhkan pewarnaan asam (acidic stain). Pewarnaan asam mengandung kromosom yang bermuatan negatif, se- hingga tidak akan berpenetrasi ke dalam sel karena permukaan bakteri ber- muatan negatif. Oleh karena itu sel yang tidak terwarnai akan jelas terlihat pada latar belakang yang telah terwarnai. Contoh zat warna yang sering di- gunakan adalah tinta India atau nigrosin . b. Alat dan bahan Bahan pemeriksaan a. Biakan bakteri 1. Klebsiella pneumoniae 2. Bacillus subtilis b. Zat warna : nigrosin atau tinta india Alat yang digunakan a. Gelas alas b. Sengkelit c. Kertas saring d. Pensil gelas e. Rak untuk pewarnaan f. Bunsen/lapu spiritus c. Prosedur Pemeriksaan 1. Meletakkan 1 tetes nigrosin/tinta india di dekat salah satu ujung gelas alas yang bersih
- 9. 8 Modul Pendidikan JarakJauh, Pendidikan Tinggi Kesehatan Prodi Keperawatan 2. Menggunakan teknik steril letakkan 1 inokulum bakteri pada tetesan ni- grosin tersebut lalu campurkan . 3. Ujung kaca slide yang lain di letakkan di depan suspensi bakteri pada sudut 45 dan campuran tersebut didorong untu membentuk pulasan yang tipis . 4. Pulasan di keringkan di udara ( jangan melakukan fiksasi dengan pema- nasan ) 5. Memeriksa di bawah mikroskop . Gambar 3.2 : Alur pemeriksaan Pewarnaan Negatif (mulai gambar 1 – 4) d. Interprestasi Hasil Sel bakteri atau jamur akan terlihat jernih/tidak berwarna dengan latar bela- kang hitam (tinta India ) Berikut merupakan berbagai bentuk sel bakteri: Tabel 2: Bentuk dan jenis bakteri Bentuk Contoh jenis Coccus (sphere) Neisseria, Veillonella, Enterococcus Coccobacilli Moraxella, Acinetobacter Bacilli, (rod), rounded ends Escherichia, Lactobacilus, clostridium Vibrio (curved) Vibrio, Bdellovibrio, Ancylobacter dll 21 43
- 10. 9 Modul Pendidikan JarakJauh, Pendidikan Tinggi Kesehatan Prodi Keperawatan Bacilli (Rod), blunt end Bacillus Helical (spirillum) Spirochaeta, Spirillum, campylobacter Diplococcus Neisseria, Moraxela Streptococcus Streptococcus Streptobacillus Bacillus Mycobacterium Staphylococcus Staphylococcus Tetrad (Gaffkya) Deinococci, pediococcus, micrococcus Sarcina (cuboid packets) Sarcina Gambar 3.3: a) Bacillus subtilis b) Staphylococcus aureus
- 11. Modul Pendidikan JarakJauh, Pendidikan Tinggi Kesehatan Prodi Keperawatan 10 e. Tugas Mahasiswa 1. Setiap kelompok mahasiswa mengamati hasil pewarnaan negatif dari peragaan yang telah disediakan 2. Melihat hasil pewarnaan tersebut dengan menggunakan mikroskop pada perbesaran lensa objektif 100x 3. Menggambar apa yang anda lihat f. Lembar kerja Praktikum Mikrobiologi Kegiatan 3b : Pewarnaan Negatif Hari/tanggal : ………………… Nama : ………………… Kelompok : ………………… Mikroorganisme Klebseilla Pneumonia Bacillus subtilis Gambar hasil pengama- tan Bentuk Susunan ......................................... ......................................... ........................................ ........................................ Tugas
- 12. 11 Modul Pendidikan JarakJauh, Pendidikan Tinggi Kesehatan Prodi Keperawatan 3. Pewarnaan Differensiasi (Gram) a. Prinsip Pemeriksaan Pewarnaan Gram merupakan suatu pewarnaan differensial, yang san- gat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobi- ologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi dalam membantu diagnosis infeksi yang disebabkan oleh bakteri dan ja- mur yang berbentuk ragi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipis- nya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri Gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel. Penggolongan berdasarkan kemamp- uannya mempertahankan primary stain yaitu zat warna crystal violet. Bak- teri yang mampu mempertahankan primary stain disebut Gram positif, sedangkan bakteri Gram negatif adalah bakteri yang melepaskan warna tersebut dan mengikat zat warna kedua (countre stain) yaitu Safranin. b. Bahan dan Alat Bahan pemeriksaan 1. Biakan bakteri : Streptococcus viridians, Vibrio parahaemolyticus, Staphylococcus epidermidis, Esghericia coli, Bacillus subtilis. 2. Biakan jamur : Candida albicans 3. Crystal violet 2% 4. Cairan Gram iodine (lugol) 5. Etil alkohol 95% 6. Safranin 0,25% 7. NaCl 0,9% Alat yang digunakan
- 13. 12 Modul Pendidikan JarakJauh, Pendidikan Tinggi Kesehatan Prodi Keperawatan a. Kaca obyek b. Sengkelit c. Kertas saring d. Pensil/pena penanda e. Rak slide dan penjepit slide f. Bunsen/lampu spiritus g. Mikroskop c. Prosedur pemeriksaan 1. Membersihkan kaca obyek dengan kertas saring dan melewatkannya di api untuk menghilangkan kotoran dan lemak 2. Membuat lingkaran kira-kira berdiameter 2-3 cm dibagian bawah kaca obyek menggunakan pensil penanda dan beri label 3. Membuat sediaan pada kaca obyek, yaitu suspensi bakteri disebarkan di atas kaca obyek sehingga merupakan lapisan tipis, keringkan, lalu sediaan ini direkatkan di atas nyala api dua atau tiga kali. 4. Menuang crystal violet dan dibiarkan selama 1 menit 5. Mencuci dengan air mengalir secara perlahan 6. Menuang cairan Gram’s iodine (lugol), dibiarkan selama 1 menit 7. Mencuci dengan air mengalir secara perlahan. 8. Mencelupkan ke dalam etil alkohol 95% beberapa detik sehingga tidak ada lagi zat warna ungu yang mengaliri sediaan. 9. Mencuci dengan air 10. Mewarnai dengan safranin selama 45 detik, mencuci dengan air dan dikeringkan di udara. 11. Meneteskan satu tetes minyak emersi, selanjutnya lihat di bawah mik- roskop dengan pembesaran10 x 100.
- 14. 13 Modul Pendidikan JarakJauh, Pendidikan Tinggi Kesehatan Prodi Keperawatan Prosedur pemeriksaan Gram Secara skematis sebagai berikut:
- 15. 14 Modul Pendidikan JarakJauh, Pendidikan Tinggi Kesehatan Prodi Keperawatan Gambar 3.4 : Alur pemeriksaan Differensial (Gram) d. Interpretasi hasil - Bakteri Gram positif akan berwarna UNGU - Bakteri gram negatif akan berwarna MERAH (dapat dilihat pada topik pemeriksaan mikroskopik bakteri dan jamur).
- 16. Modul Pendidikan JarakJauh, Pendidikan Tinggi Kesehatan Prodi Keperawatan 15 e. Tugas mahasiswa 1) Setiap mahasiswa mengerjakan pewarnaan Gram untuk masing-mas- ing biakan bakteri dan jamur yang telah disediakan 2) Melihat hasil pewarnaan Gram dengan menggunakan mikroskop lensa obyektif 100x 3) Menggambarkan hasil pewarnaan yang dilihat. f. Lembar kerja Praktikum Mikrobiologi Kegiatan 3c : Pewarnaan Gram Hari/tanggal : ………………… Nama : ………………… Kelompok : ………………… Tugas
- 17. 16 Modul Pendidikan JarakJauh, Pendidikan Tinggi Kesehatan Prodi Keperawatan Streptococcus viridans Bentuk : ..................... Sifat Gram : ..................... Vibrio parahaemolyticus Bentuk : ..................... Sifat Gram : ..................... Staphylococcus epi- dermidis Bentuk : ..................... SifatGram :..................... Escherichia coli Bentuk : ..................... Sifat Gram : ..................... Bacillus subtilis Bentuk : ..................... Sifat Gram : ..................... Candida Albicans Bentuk : ..................... SifatGram :..................... Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sbb: ·Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang men- gakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sem- purna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.
- 18. Modul Pendidikan JarakJauh, Pendidikan Tinggi Kesehatan Prodi Keperawatan 17 Untuk memperdalam pemahaman anda mengenai materi pewarnaan bakteri/ jamur, kerjakanlah latihan berikut, dengan memberikan penjelasan bebas dengan bahasa anda sendiri pada lembar kertas tersendiri. Anda dapat membandingkan jawaban dengan kunci jawaban yang terdapat pada akhir modul ini. Jawablah soal tugas di bawah ini dengan singkat dan jelas! 1. Apa tujuan pewarnaan apusan bakteri dan sebutkan pewarna yang sering digunakan dalam pemeriksaan? 2. Sebutkan jenis pewarnaan menurut tujuannya! 3. Jelaskan perbedaan pewarnaan positif dan pewarnaan negatif? 4. Jelaskan interpretasi pemeriksaan Gram! Tugas Mandiri