Dokumen tersebut membahas tentang mata kuliah mikrobiologi dan menjelaskan beberapa konsep dasar seperti isolasi, identifikasi, dan pewarnaan mikroorganisme. Metode isolasi mikroba dijelaskan meliputi teknik cawan gores, cawan tuang, medium cair, dan sel tunggal. Identifikasi mikroba didasarkan pada morfologi, persyaratan lingkungan, dan karakteristik lainnya. Teknik pewarnaan menc

1. ASSALAMU’ALAIKUM. WR.
WB

2. MATA KULIAH MIKROBIOLOGI
Kelompok 5 :
1. Analistiana (0540017912)
2. Dedy maulana (0540017211 )
UNIVERSITAS PEKALONGAN
2013/2014

3. Pokok bahasan :
1. ISOLASI
2. IDENTIFIKASI
3. PEWARNAAN

4. ISOLASI
1. Pengertian
Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan
menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Proses pemisahan atau
pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua
pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme,
memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam
mikroorganisme saja.
2. Prinsip Isolasi Mikroba
Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba
dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran bermacam-macam
mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media
padat. sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada
tempatnya (Sutedjo, 1996).

5. 3. Beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam mengisolasi
mikroorganisme adalah sebagai berikut :
> Sifat dan jenis mikroorganisme
> Habitat mikroorganisme
> Medium pertumbuhan
> Cara menginokulasi dan inkubasi
> Cara mengidentifikasi
> Cara pemeliharaannya

6. 4. METODE UTK MELAKUKAN ISOLASI MIKROBA
Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba, yaitu:
A. Isolasi pada agar cawan
Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan
mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan
dari organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan
tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Terdapat beberapa
cara dalam metode isolasi pada cawan agar, yaitu: metode gores kuadrat dan
metode agar cawan tuang.
Metode gores kuadrat bila metode ini dilakukan dengan baik akan
menghasilkan terisolasinya mikroorganisme dimana setiap koloni barasal dari
satu sel. Metode agar cawan tuang berbeda dengan metode gores kuadrat,
cawan tuang menggunakan medium agar yang dicairkan dan didinginkan 50
oC, yang kemudian dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga
pada cawan yang terakhir mengandung koloni-koloni yang terpisah diatas
permukaan/ didalam cawan.

7. B. Isolasi pada medium cair
Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila
mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar cawan
(medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair.
Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa
serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang untuk
mendapatkan satu sel semakin besar.
C. Isolasi sel tunggal
Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel
mikroorganisme berukuran besar yang tidak dapat diisolasi
dengan metode agar cawan/medium cair. Sel mikroorganisme
dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali.
Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet
kapiler yang sangat halus ataupun micromanipulator, yang
dilakukan secara aseptis.

8. Metode Isolasi
Menurut Hadioetomo (1993), ada dua metode yang dilakukan untuk
memperoleh biakan murni yaitu :
1. Metode cawan gores
Metode ini mempunyai dua keuntungan, yaitu menghemat bahan dan
waktu. Metode cawan gores yang dilaksanakan dengan baik kebanyakan akan
menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan.
2. Metode cawan tuang
Cara lain untuk memperoleh koloni murni dari populasi campuran
mikroorganisme adalah dengan mengencerkan spesimen dalam medium agar
yang telah dicairkan dan didinginkan ( ±50oC ) yang kemudian dicawankan.
Karena konsentrasi sel-sel mikroba di dalam spesimen pada umumnya tidak
diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap
sehingga sekurang-kurangnya satu di antara cawan tersebut mengandung
koloni terpisah di atas permukaan ataupun di dalam agar. Metode ini
memboroskan bahan dan waktu namun tidak memerlukan keterampilan yang
tinggi.

9. 3. Teknik Sebar (spread plate)
Teknik isolasi dan mikroba dengan cara menyebarkan mikroba pada
permukaan media yang akan digunakan (Trianda, 2011).
4. Teknik Pengenceran (dilution method)
Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam- macam
spesies diencerkan dalam suatu tabung yang tersendiri. Dari hasil
pengenceran ini kemudian di ambil kira- kira 1 mL untuk diencerkan lebih
lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 mL untuk disebarkan
pada suatu medium padat, kemungkinan besar kita akan mendapatkan
beberapa koloni yang akan tumbuh dalam mdium tersebut, akan tetapi
mungkin juga kita hanya akan memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang
demikian ini dapat kita jadikan piaraan murni. Jika kita belum yakin, Bahwa
koloni tunggal yang kita peroleh tersebut merupakan koloni yang murni, maka
kita dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai
sampel (Trianda, 2011)
5. Teknik Micromanipulator
Mengambil satu bakteri dengan mikropipet yang ditempatkan dalam mikro
manupulator, kemudian ditempatkan dalam mikromanupulator. Kemudian
ditempatkan dalam medium encer untuk dibiakkan ( Trianda, 2011).

10. IDENTIFIKASI MIKROORGANISME
Metode untuk mengidentifikasi mikroorganisme ada
beberapa macam, di antaranya:
1. Morfologi Makroskopi :
dilakukan dengan mengamati karakteristik dari pola
pertumbuhan mikroorganisme pada media buatan yang
diamati dengan mata telanjang (tanpa alat bantu).
2.Morfologi Mikroskopi :
dilakukan dengan mengamati ukuran, bentuk, isi sel,
organel sel, dan susunan sel ketika diamati dengan
mikroskop pada perbesaran tertentu.
Karakteristik zat warna (pewarnaan) : kemampuan
mikroorganisme untuk biasanya digunakan dengan
pemeriksaan secara mikroskopi sebagai bagian dari
identifikasi bakteri.

11. 3.Persyaratan lingkungan :
kemampuan mikroorganisme untuk hidup pada berbagai suhu,
menggunakan oksigen atau gas lain, pada berbagai tingkat pH, atau pun
keberadaan ion dan garam lainnya seperti NaCl.
Persyaratan nutris : kemampuan mikroorganisme untuk menggunakan
berbagai macam sumber karbon dan nitrogen sebagai substrat bernutrisi
ketika tumbuh pada keadaan lingkungan tertentu.
4. Resistens :
menujukkan karakteristik resistensi terhadap antibiotik tertentu,
logam berat pada mikroorganisme tertentu
5. Antig :
menentukan karakteristik mikroorganisme dengan berbagai macam
metode serologi dan imunologi
6. Subseluler :
menentukan bagian – bagian molekuler sel yang menjadi tipe pada
beberapa takson, kelompok organisme, dengan menggunakan metode
analisis. Contohnya, komponen dinding sel, membran sel, dan komponen
dari enzim dari sel membrane

12. PEWARNAAN MIKROORGANISME
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai
morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, semisal bakteri.
Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras
dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan.
Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri
sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode
pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi
untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi
dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jimmo,
2008).

13. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat
dibedakan menjadi empat macam yaitu
1. pewarnaan sederhana
2. pewarnaan negatif
3. pewarnaan diferensial
4. pewarnaan struktural.

14. >>Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad
renik lain dengan menggunakan larutan tunggal
suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang
sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana.
>>Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan
di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel
microbe disebut teknik pewarnaan diferensial.
>>Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai
satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan
bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan
ini adalah pengecatan endospora, flagella dan
pengecatan kapsul.(waluyo,2010)

15. Tujuan pewarnaan terhadap mikroorganisme
ialah untuk :
1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun
fungi.
2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam
jasad.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan
sehingga sifat-sifat fisik dan kimia dapat diketahui.
Langkah-langkah utama teknik
pewarnaan
1. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu
tebal atau tipis
2. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan
aplikasi bahan kimia seperti sabun, formalin, fenol.
3. Aplikasi zat warna : tunggal, atau lebih dari 1 zat warna

16. • Teknik pewarnaan dikelompokkan menjadi beberapa tipe,
berdasarkan respon sel bakteri terhadap zat pewarna dan
sistem pewarnaan yang digunakan untuk pemisahan
kelompok bakteri digunakan pewarnaan Gram, dan
pewarnaan “acid-fast”(tahan asam) untuk genus
Mycobacterium.
• Untuk melihat struktur digunakan pewarnaan flagela,
pewarnaan kapsul, pewarnaan spora, dan pewarnaan
nukleus. Pewarnaan Neisser atau Albert digunakan untuk
melihat granula metakromatik (volutin bodies) pada
Corynebacterium diphtheriae. Untuk semua prosedur
pewarnaan mikrobiologi dibutuhkan pembuatan apusan
lebih dahulu sebelum melaksanakan beberapa teknik
pewarnaan yang spesifik (Pelezar,2008).

17. Macam-Macam Pewarnaan
Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat
dikategorikan sebagai berikut :
1. Pewarnaan sederhana
Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air
fukhsin) tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Pewarnaan
sederhana, merupakan pewarna yang paling umum
digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus,
basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan
menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel
bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja.
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-
pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik
(suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan
untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin
(komponen kromoforiknya bermuatan positif).

18. gambar pewarnaan sederhana

19. 2. Pewarnaan differensial
dibagi dua yaitu pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam
>>>Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif,
berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama
berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938)
yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara
pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua,
yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri
terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi
dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada
mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh
bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan
beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini
diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya
sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat
warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode
pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.

20. >>Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak
mempertahankan zat warna metil ungu pada metode
pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan
mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah
dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif
tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna
penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil
ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif
menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian
ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri
ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
>>Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu
1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet)
berwarna ungu.
2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan
mordan JKJ.
3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

21. Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
 Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau
multilayer.
 Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan
terdapat didalam
 lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat
kering, tidak mengandung asam tekoat.
 Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
 Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya
kristal violet.
 Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
 Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
 Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
 Peka terhadap streptomisin
 Toksin yang dibentuk Endotoksin

22. Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
 Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal
atau monolayer.
 Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%),
peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama
merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.
 Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
 Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti
ungu kristal.
 Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
 Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
 Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
 Tidak peka terhadap streptomisin
 Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

23. >>>Pewarnaan Tahan Asam
Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung
lemak dalam konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna,
namun jika bakteri diberi zat warna khusus misalnya karbolfukhsin
melalui proses pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan akan
tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat
sekalipun seperti asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri
tahan asam (BTA).
Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa
keberadaan bakteri penyebab tuberkulosis yaitu Mycobacterium
tuberculosis . Ada beberapa cara pewarnaan tahan asam, namun yang
paling banyak adalah cara menurut Ziehl-Neelsen.(anonymous,2009)
Bakteri Tahan Asam (pink) dan bakteri Tidak Tahan Asam (biru)

24. 3. Pewarnaan negatif
>>Tujuan
Mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk
mengamati morfologi organisme yang sukar diwarnai oleh
pewarna sederhana. Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar
belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti
spirochaeta
>>Cara pewarnaan negatif
- Sediaan hapus → teteskan imersi → lihat dimikroskop
Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai
bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap.
Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan
(tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan
morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak
mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-
bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk
agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih
tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.

25. • Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin
atau negrosin.pewarna asam memiliki negatif charge
kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam
sel karena negative charge pada permukaan bakteri. oleh
karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar
belakang berwarna.

26. TERIMAKASIH

27. Daftar pustaka
Sumber:
• http://id.wikipedia.org/wiki/Pewarnaan_Gram
• http://takdiralamsya.blogspot.com/2013/04/tekn
ik-isolasi-identifikasi-perbanyakan.html
•
• http://salzcha.wordpress.com/2012/12/23/isolasi
-mikroba/
•
• http://aguskrisnoblog.wordpress.com/2011/01/1
2/macam-macam-teknik-pewarnaan-bakteri/