presentasi pewarnaan gram.pdf

1. PRACTIUM
GRAM STAIN

2. LEARNING OBJECTIVE
1. Prinsip dasar pewarnaan mikroskopik bakteri.
2. Prinsip dan Reagen – reagen yang diperlukan dalam pewarnaan
Gram
3. Prosedur pewarnaan Gram
4. Bentuk dan jenis berbagai bakteri berdasarkan pewarnaan Gram
5. Penamaan Bakteri

3. PRINSIP DASAR PEWARNAAN
MIKROSKOPIK BAKTERI
Tanpa pewarnaan, sel bakteri akan transparan pada
pemeriksaan mikroskopik, oleh karena itu diperlukan
zat warna untuk mewarnai bakteri

4. JENIS – JENIS PEWARNAAN MIKROSKOPIK
• Pewarnaan sederhana (methylene blue, crystal violet, dan carbol
fuchsin)
• Pewarnaan Negatif (tinta india)
• Pewarnaan Khusus (kapsul, spora, flagel, granula)
• Pewarnaan diferensial (Gram, ZN)

6. Simple staining: methylene
blue pada Escherichia coli
Negative staining: india ink
pada Klebsiella sp.
Gram staining: Staphylococcus
aureus dan Escherichia coli

7. Pewarnaan Flagel (metode Gray)
Peritrikh: Proteus mirabilis. Monotrikh: Vibrio cholerae Amphitrikh: Campylobacter jejuni

8. Pewarnaan Kapsul (metode Gins-Burri)
Klebsiella pneumoniae

9. Pewarnaan Spora (metode Klein)
Spora terminal: Clostridium tetani. Spora subterminal: Bacillus subtilis.
Spora sentral: Bacillus anthracis

10. Pewarnaan Granula (metode Albert)
Granula metakromatik: Corynebacterium
diphtheriae

11. GRAM STAIN

12. PRINCIPLE

13. Crystal Violet-Iodine=
Gram positive: strong bond
Gram negative: weak bond
Crystal Violet-Iodine in
gram negative washed
out

14. SPECIMENS AND REAGENS
Bahan
• Swab buchal.
• Swab permukaan kulit anus
Reagen
• Kristal violet
• Iodin
• etil alkohol 95%,
• safranin

15. TOOLS
• Flock swab
• Pembakar bunsen
• loop atau jarum inokulasi
• Rak dan Nampan pewarnaan,
• slide kaca / preparat
• kertas saring / tissue
• kertas lensa
• minyak Emersi
• mikroskop.

16. PROCEDURE
A. Persiapan Slide
1. Ambil 2 slide kaca bersih.
2. Bersihkan slide kaca menggunakan
tissue bersih.
3. Buat lingkaran kira – kira 2-3 cm di
bagian Tengah sisi bawah slide kaca.
Beri identitas pada pinggir slide kaca:
swab buchal/anus dan nomor kelompok.
Sisi slide yang memiliki pinggir yang
dapat ditulis adalah sisi atas, sedangkan
lingkaran disisi bawah. Gunakan pensil /
pulpen.
4. Letakkan slide ditempat yang aman.

17. PROCEDURE
B. Pengambilan spesimen
1. Swab buchal
a. Mahasiswa yang menjadi swabber,
pertama – tama membuka dan
mengeluarkan flock swab dari
wadahnya.
b. Minta teman yang menjadi subjek
untuk membuka mulut lebar – lebar.
c. Masukkan swab perlahan – lahan
dengan ujung cotton didepan.
arahkan ujung swab menempel pada
bagian permukaan dalam pipi kanan
(buchal) kemudian putar – putar
flockswab tersebut. Pindahkan ke
bagian permukaan dalam pipi kiri
(buchal) dan putar – putar flockswab
hingga seluruh permukaan cotton
swab dipenuhi oleh saliva.
d. masukkan Kembali flock swab
kedalam wadahnya. Tutup rapat.
e. cuci tangan.

18. PROCEDURE
2. Swab permukaan kulit
anus
a. Buka flockswab dari tempatnya. Berikan bbrp
tetes cairan NaCl 0,9% steril pada cotton swab.
Masukkan Kembali flockswab ketempatnya dan
tutup rapat.
b. mahasiswa membawa flockswab ke dalam
kamar mandi.
c. buka dan keluarkan flockswab dari wadahnya.
d. flock swab dihapuskan ke permukaan kulit
anus dan diputar.
e. flockswab kemudian dikembalikan ke
wadahnya. tutup hingga rapat.
f. cuci tangan

19. PROCEDURE
C. Apusan spesimen pada Slide
1. Dengan menggunakan teknik aseptik, siapkan
apusan masing-masing dari kedua swab. Lakukan ini
dengan menaruh setetes air pada kaca objek, lalu buka
flockswab dan hapuskan cotton swab pada tetesan air
tersebut, dengan gerakan memutar hingga merata.
kembalikan flockswab pada wadahnya. Tutup hingga
rapat.
2. buat slide apusan kedua dari sampel flockswab
kedua dengan cara yang sama.
3. Biarkan spesimen mengering.
4. Nyalakan Bunsen dengan korek api.
5. Fiksasi slide kaca dengan melewatkan slide kaca
diatas nyala api dua atau tiga kali. Permukaan slide
yang mengandung spesimen harus menghadap keatas.

20. PROCEDURE
D. Prosedur Pewarnaan Gram
1. Letakkan nampan dan rak pewarnaan pada salah satu sisi sink.
letakkan slide pada rak, dengan bagian atas slide (yang beris
spesimen) menghadap keatas.
2. Beri reagen Crystal Violet beberapa tetes hingga menutupi
apusan spesimen di slide kaca. biarkan selama 1 menit.
3. Buang zat warna ke nampan pewarnaan, kemudian cuci slide
dengan air mengalir secara perlahan.
4. Berikan lugol (Gram’s iodine) ke slide kaca, biarkan selama 1
menit.
5. Buang lugol ke nampan pewarnaan, kemudian cuci slide dengan
air mengalir secara perlahan.
6. Teteskan etil alcohol 95% ke slide kaca. biarkan selama
beberapa detik (5-15 detik).
7. Cuci slide dengan air mengalir secara perlahan.
8. Beri reagen Safranin beberapa tetes hingga menutupi apusan
spesimen di slide kaca. biarkan selama 45 detik.
9. Buang safranin ke nampan pewarnaan, kemudian cuci slide dengan
air mengalir secara perlahan.
10. Keringkan dengan menaruh slide kaca secara miring diatas tissue.
11. Baca slide dengan menggunakan mikroskop pada pembesaran
lensa objektif 100x. teteskan 1 tetes minyak emersi ke slide.

21. 60 sec 60 sec 5-15 sec 45 sec

22. PRECAUTIONS!!!
1. Fase paling kritis dari prosedur ini adalah langkah dekolorisasi, yang didasarkan pada kemudahan pelepasan
kompleks CV-I dari sel. Ingatlah bahwa dekolorisasi yang berlebihan akan menyebabkan organisme gram positif
tampak gram negatif. Sebaliknya, kurangnya dekolorisasi, menyebabkan gram negatif tampak seperti gram
positif
2. Di antara penggunaan reagen, slide harus dicuci bersih dengan air mengalir atau air yang diberikan dengan
pipet.
3. Sediaan pewarnaan Gram terbaik dibuat dari kultur segar (yaitu tidak lebih dari 24 jam). Seiring dengan
bertambahnya usia kultur, khususnya pada kasus sel gram positif, organisme cenderung kehilangan
kemampuannya untuk mempertahankan pewarnaan primer dan mungkin tampak sebagai gram variabel;
artinya, beberapa sel akan tampak ungu, sementara sel lainnya akan tampak merah muda.

23. Tugas Mahasiswa
1. Setiap mahasiswa harus melakukan prosedur pewarnaan gram.
2. Melihat hasil pewarnaan gram dari slide yang sudah dibuat dan buat laporannya.
3. Mahasiswa juga melihat dan mencatat bakteri – bakteri dari preparat yang sudah
disediakan oleh pengajar.
4. Laporan tertulis dibuat perkelompok.
Foto gambar – gambar bakteri yang ditemukan pada mikroskop, baik dari preparat
yang sudah dibuat maupun preparat yang diberikan oleh pengajar, dan berikan interpretasi
hasil

24. Laporkan
• Jenis bakteri sesuai pewarnaan gram: bakteri gram positif, atau bakteri gram
negatif.
• bentuk bakteri: kokus, batang, atau kokobasil.
• berikan panah penunjuk untuk setiap jenis bakteri.

25. Laporkan
• Contoh format penamaan:
• bakteri kokus gram positif
• bakteri kokus gram negaif
• bakteri batang gram negatif
• bakteri batang gram positif

26. batang gram positif: Bacillus subtilis
Kokus gram positif tersusun
seperti rantai: Streptococcus oralis
Kokus gram positif grape-like
cluster: Staphylococcus aureus
Kokus gram positif lancet shaped:
Streptococcus pneumoniae
batang gram positif besar: Lactobacillus
acidophilus
Gram positif filamentous bercabang:
Nocardia asteroides

27. Kokus gram negatif: Neisseria
gonorrhoeae
batang gram negatif coma
shaped: Vibrio cholerae
batang gram negatif: Klebsiella
pnemoniae
cocobacil gram negatif: Acinetobacter
baumannii

28. TATA CARA PENAMAAN
Staphylococcus aureus

29. TATA CARA PENAMAAN
Staphylococcus aureus
HURUF PERTAMA
DIKATA PERTAMA:
HURUF KAPITAL
GENUS
SPESIES
HURUF PERTAMA
DIKATA KEDUA:
HURUF KECIL
Nama bakteri:
huruf miring

30. TATA CARA PENAMAAN
Staphylococcus aureus
HURUF PERTAMA
DIKATA PERTAMA:
HURUF KAPITAL
GENUS
SPESIES
HURUF PERTAMA
DIKATA KEDUA:
HURUF KECIL
Nama bakteri:
tulis tangan:
diberi garis
bawah

31. TATA CARA PENAMAAN
Staphylococcus aureus. subsp aureus
GENUS
SPESIES
SUBSPESIES

32. •Staphylococcus sp. => sp. :”species”= merujuk spesies Tunggal / single
•Staphylococcus spp. => spp. :”species plural”= merujuk several species in same
genus

33. Naming Bacteria: Binomial Nomenclature