Uji endotoksin dan pirogen menggunakan metode Limulus amebocyte lysate (LAL) untuk mendeteksi endotoksin bakteri gram negatif. LAL diperoleh dari darah kepiting landam kuda yang menggumpal saat terkena endotoksin. Metode utama LAL adalah gel clot dan kromogenik. Batas endotoksin ditentukan berdasarkan dosis obat maksimum untuk manusia.

1. KELOMPOK 9
Nama : Anggita Sarasati
Ina Hafityaningsih
Nurfadilla
PutriDewi Indayani
Siti FatimahNur Hikmah Y.
WiewikAmbarwati

2. Uji Endotoksin dan
Pirogen

3. EKSOTOKSIN
• Virulensi mikroorganisme ditentukanolehproduksi toksin,
yaitu substansiracun yang di hasilkan mikroorganisme
tertentu.
• Kemampuanmikroorganisme menghasilkantoksindi sebut
toksigenisitas.
• Istilahtoksemia menunjukkanadanya toksin dalam darah.
• Ada dua tipetoksinyaitu eksotoksin(toksin protein) dan
endotoksin(toksin lipopolisakarida).

4. • Eksotoksinyaitu protein toksin yang tidaktahan panas ,dan bersifat
antigenikyang menginduksi pembentukan antibodi.
• Antibodi yang terbentuk akibatinduksieksotoksin disebut antitoksin.
• Toksinini bekerja dengan cara menghancurkanbagian tertentu sel inang/
menghambat fungsi metabolik tertentu.
• Mayoritas bakteri penghasil eksotoksin adalah bakteri gram positif.
• Gen pengkode pada eksotoksin terdapat pada plasmid bakteri ataufag.
• Eksotoksinlarut dalam cairantubuh, sehingga eksotoksin mudah terdifusi
dalam darah dan dengan cepat diedarka ke seluruh tubuh.

5. Tiga tipe Eksotoksin berdasarkan
mekanisme aksinya:
1. Sitotoksin, membunuh sel inang atau
mempengaruhi fungsisel.
2. Neurotoksin, terlibatdalamtransmisinormal impuls
saraf.
3. Enterotoksin, mempengaruhisel – sel padasaluran
pecernaan.

6. • Daya racun eksotoksindpat diinaktivasi denganpemanasan
ataupaparan formaldehid, iodinataubahankimiawilain.
• Eksotoksin yang di inaktivasi tidak dapat lagi menyebabkan
penyakit, namuntetapdapat mengindukipembentukan
antitoksin.
• Eksotoksin yang di inaktivasi disebut toksoid.

7. • Endotoksin dihasilkanolehbakterigram negatifpatogen
ataupunnonpatogenselamamasa pertumbuhannyaatau
pada saat sellisis.
• Toksininimerupakan bagiandari membranluar bakterigram
negatifyang tersusunatas lapisanlipopolisakarida (LPS).
• Endotoksin bersifat tahan panas, merupakan antigenlemah,
dan tidakdapat di ubah menjaditoksoid.

8. ENDOTOKSIN
• Meskipunseluruh bakterigramnegatifmemilikiLPSpadadinding
selnya, LPStidakbersifattoksikhingga dilepaskandari membran
luar dindingsel.
• Padasatbakterigramnegatifmati,disintegrasidindingselnya
mengakibatkanpelepasantoksinLPS.
• Pelepasanendotoksindalamsistemperedaran darah dapat
menyebabkansyok akibatpenurunan tekanandarah dan
kegagalanfungsibanyakorgan.
• Semua endotoksinbersifatpirogen, tetapitidaksemuasenyawa
pirogen itu merupakanendotoksin.

9. Efek Endotoksin Bagi Tubuh
• demam
• aktivasisistem sitokin
• rusaknya sel-sel endotelial
• permeabilitas pembuluhdarahberubah sehingga
menyebabkan turunnya tekanan darah

10. Perbedaan endotoksindaneksotoksin
CIRI KHAS ENDOTOKSIN EKSOTOKSIN
Komposisi kimiawi Bagian lipid (lipid A)
pada LPS membran luar
Protein
Sumber Dinding sel bakteri
gram negatif, dihasilkan
pada saat kematian sel
atau otolisis bakteri
Mayoritas pada bakteri
gram positif, di
produksi selama
pertumbuhan sel, pada
beberapa kasus di
produksi setelah lisis
atau kematian sel
Farmakologi (efek pada
inang)
Tidak spesifik Pada jaringan tertentu
Ketahanan terhadap
panas
Tahan panas (heat –
stable), pada suhu 121°
C selama 1 jam
Tidak tahan panas (heat
– labile), inaktif pada
suhu 60 – 80° C, kecuali
toksi Staphlococcus

11. Imunologi Tidak mudah
dinetralisasi oleh
antitoksin sehingga
toksoid yang efektif
tidak dapat dibuat
sebagai imunisasi
terhadap toksin
Dapat di ubah menjadi
toksoid sebagai
imunitas terhadap
toksin, di netralisasi
oleh antitoksin
Dosis letal Besar Kecil
Toksisitas Rendah tinggi
Penyebab demam Ya tidak
Contoh penyakit Demam tifoid, ISK,
meningitis
Gas gangren,
tetanus,botulisme,
difteri
Perbedaanendotoksin daneksotoksin

12. LAL-(Limulus amebocytelysate)Test
• The Limulusamebocytelysate (LAL)test adalahujiin vitro
untukdeteksi dan analisis kuantitatifendotoksin bakteri.
• Metode analisis LAL yang dilakukanmencakup teknikgel-clot
dan turbidimetrikinetikdan kromogenik(kolorimetri).

13. • Lisat diperoleh dari amubosit kepiting landam kuda (Limulus
polyphemus).
• 1956: Penggunaan LAL untuk deteksi endotoksin berawal dari
pengamatan Bang bahwa infeksi bakteri gram negatif pada
Limulus polyphemus menyebabkan koagulasi intravaskular yang
parah.
• 1964: Levin and Bang kemudian menunjukkan bahwa
penggumpalan itu merupakan hasil reaksi antara endotoksin dan
protein yang dapat menggumpal dalam amubosit.
• Solum (1970, 1973) dan Young (1972), melakukan pemurnian dan
karaterisasi protein yang dapat bergumpal dari reaksi LAL dan
menunjukkan bahwa reaksi dengan endotoksin merupakan reaksi
enzimatik.

14. Limulus polyphemus
(horseshoecrab)

15. Cara Memperoleh Lysate
• Untuk memperoleh LAL, horseshoe crabs yang berukuran
besar ditangkap, cek kesehatannya,lalu darahnya diambil
denganmenggunakan jarumsuntik.Darah kepitinginilalu
disentrifuga untukmemisahkanamoebocytes dari plasma
cairnya.
• Amoebocyte lalu difreeze-dried dan diproses untuk
digunakan.

16. MetodeLAL yang direkomendasiolehFDA–
USA
• Metode Gel-Clot : prinsip bahwa LAL menggumpal dengan adanya
endotoksin
• Metode kinetik turbidimetri: menggunakan kecepatan pembentukan gel
untuk menentukan kandungan endotoksin
• Metode Kromogenik: menggunakan substrat kromogenik sintetik,
dengan adanya LAL danendotoksin, menghasilkan warna kuning dan
secara linier ekuivalen dengan konsentrasi endotoksin yang ada

17. Prinsip LAL Test
• Uji LAL memanfaatkan dasar responimun dari kepiting landam kuda terhadap invasi
bakteri gram negatif.
• Bahan-bahan yang terkandung dalam amubosit kepiting landam kuda terdiri dari berbagai
protein, faktor, kofaktor dan ion-ion yang berinteraksi menyebabkan koagulasi.
• EndotoksinGram negatif mengkatalisis aktivasi proenzim dalam lisat amubosit Limulus.
Kecepatan awal aktivasi ditentukan oleh konsentrasi endotoksin.
• Selanjutnya enzim yang diaktivasi (enzimkoagulase) menghidrolisis ikatan spesifik dalam
suatu protein penggumpal(koagulogen) yang juga terdapat pada lisat amubosit Limulus
menghasilkan koagulin.
• Sekali terhidrolisis, koagulin yang dihasilkan bergabung dengan sendirinya dan
membentuk suatu gumpalan/bekuan seperti gel.

18. Penetapan Batas Endotoksin
• 1983 : FDA menentukan batas endotoksin berdasarkan
dosis maksimum sediaan obat untuk manusia atau kelinci
• Dan penyesuaian batas endotoksin untuk semua obat
(kecuali intratekal) dari2,5 EU kg-1 sampai 5,0 EU kg-1
• EU = Endotoxin Unit
• Batas deteksi untuk beberapa produk diperoleh dari
monografi USP atau EP. Kalau tidak dinyatakan dalam
farmakope, batas endotoksin harus dihitung dari dosis
maksimum manusia

19. EL = K/M
• EL = endotoksin limit
• K = konstanta = 5 EU atau IU per kg
berat badan
• M = dosis maksimum untuk manusia per
kg per jam.

20. Batas EndotoksinDan VolumePer Jam
• Harus diperhatikanbahwabatasendotoksindinyatakanperjam.
Oleh karenaitu konsentrasiyang dibolehkan untukendotoksin
per mililiterinjeksiberagamtergantungpadavolume pemberian
dalamsatujam.
• Suatu dosis tunggalinjeksi1 mlsecara teoritismengandung349
EUper mldan masih diijinkanpadauji endotoksinbakteri,
sedangkaninfusdengan volume 1Lharus mengandungkurang
dari0,349EUperml.

21. Contoh Perhitungan
Potensi injeksi insulin 100 unit per ml, dosis maksimum 2 unit per
kg dan sensitivitas lisat 0,125 unit/ml, maka
C = 100 unit per ml
K = 0,5 EU per kg
λ = 0,125 unit per ml
M = 2 unit per kg
MVD = 100 x 5 = 1 : 2000
0,125 x 2
• Nilai MVD dapat diperoleh dari MVC
• MVD = potensi sediaan/MVC

22. LAL Test Untuk Alat Kesehatan
• Kadar endotoksin pada alatkesehatan diperoleh dengan prosedur
ekstraksi, yaitu dengan cara merendam sejumlah alatpada cairan
pengekstraksi biasanya pereaksi airLAL. Nilaibatas 20 EU per alat
dinyatakan dalam addendum USP 1997, jadibatas maksimum
konsentrasi endotoksin yang diijinkandalam cairanhasil ekstraksi (ERL)
dihitung dengan rumus:
• ERL = K x N/V
K = 20 EU
N = jumlah alat
V = total volume larutan ekstraksi

23. Kelebihan LAL-Test
• Limulus amebocyte lysate (LAL) test adalah metode
alternatifterhadap rabbit pyrogen test yang difokuskanpada
deteksisenyawa pirogen dalam produk, untukmenghindari
penggunaanhewandalam percobaan
• Metode lebih akurat

24. Metode Gel-Clot
• Pada metode ini, hasilakhir dapat dideteksiberupa spot pada
slide,ataumicroplate
• Perlupembanding,berupa control standard endotoxin(CSE)
• Peralatangelas yang digunakanharus di“de-pirogenasi”

25. Prinsip Uji Dan Prosedur
• 100 ul CSE dimasukkan ke dalam tabung gelas depirogen (positive control)
• LAL reagent water (negative control)
• Sampel jumlah sama
• + 100 ullysate
• Inkubasi 37°C di atas penangas air selama 1 jam
• Tabung lalu dibalik perlahan (180°) untuk melihat solid clot yang terjadi

26. Hal Yang Harus DiperhatikanDalam Metode Gel-
Clot
• Untukmembuatalat-alatdepirogen: pemanasanpada180°C,
selama4 jamatau250°Cselama30 menit
• Teknikpengerjaanpada saatmembaliktabungkira-kiraselama2
detik
• pH sampel7,0–8,0.Jika diperlukanpH diatur menggunakan
asamataubasadepirogen

27. Sensitivitas Lisat Pada Gel-Clot
• Diperlukan untuk menentukan konsentrasi minimum endotoksin yang
menyebabkan terjadinyagel
• Satuan dinyatakan dalam EU atauIU
• Dibuat 1 seri pengenceran endotoksin (dalamEU/mL) dan percobaan dilakukan
rangkap 4 (quadruplicate)
• Titikakhir pengenceran (end-point dilution)ditentukan pada pengenceran
terakhiryang masih memberikanreaksi positif

28. Metode Kromogenik
• MetodekromogenikmerupakanmetodeLALtestyang paling
banyak digunakansaatinikarena lebih mudahdan murah
• Sesuai untuk jumlahproduk yang diujitidakbanyak dan tidak
sering (infrequent)
• Digunakanuntuk ujisampelserum padauji klinis

29. Prinsip Uji Dan Prosedur
• Endotoksin akan mengkatalisis aktivasi suatu proenzim
• Enzim yang teraktivasiakanmengkatalisis terpecahnya PNA darisubstrat Ac-Ile-
Glu-Ala-Arg-PNA
• PNA yangdilepaskan diukur secara spektrofotometripada 405nm
• Nilaiabsorbans sebanding dengan jumlahendotoksin, dibandingkan terhadap
endotoksin standard menggunakan kurva standard

30. Penemuan Baru
• AlternatifterhadapLALsaatinitelahberhasilditelitidiIndia dan
China, yaitu pereaksiTAL,atauTachypleus amoebocytelysate,
fungsinya miripdengan LAL,juga untuk deteksigram-negative
bacteria.
• IlmuwandiSingapur tengahmeneliticloning genpendeteksitoxin
dalamdarah horseshoecrab. Jikagentersebutdapatdikloning,
derivat LALdapatdibuattanpaharus menggunakanhorseshoe
crabs untuk ekstraksidarahnya.

31. PerhitunganMVD Dan MVC
• MVD=MaximumValidDilution(pengenceran maksimum)
• MVC =MinimumValidConcentration(konsentrasi minimum)
• MVDdan MVCadalahperhitungan yang menunjukkanseberapa
banyak pengenceranyang harus dilakukanuntuk mengatasi
kemungkinaninterferensi,sebelumefekpengenceranmelampaui
kemampuanuji LALyang digunakanuntuk mendeteksi
endotoksindalamsediaanasli

32. PenggunaanIstilah MVD Dan MVC
• MVD biasanya digunakan untuk sediaan yang berbentuk cairan dimana
pemberiandinyatakan dalam per mililiter
Contoh: dosis tunggal injeksi2 ml dan batas endotoksin dinyatakan dalam EU per
mililiter
• MVC biasanya digunakan untuk sediaan dengan batas endotoksin dinyatakan
dengan EU per mg dan dosis dinyatakan dengan mg/ kg bb
• Penentuan MVD dan MVC tergantungpada sensitivitas lisatyang digunakan (λ)
• Semakinsensitif lisatatau metoda, semakin tinggiMVD atau semakin rendahMVC

33. Perhitungan MVD
MVD = C x K
λx M
• C = konsentrasi obat
• K = konstanta = 0,5 EU per kg
• M = dosis maksimum manusia

34. PerhitunganMVC
MVC = λM
K
• λ = sensitifitas dari lisat yaitu nilai terkecil
dari standar untuk pengujian kuantitatif
• K = konstanta = 0,5 EU per kg
• M = dosis maksimum manusia

35. • Pyro artinyakeadaanataubentuk yang berhubungan
denganpanas / api. Gen artinyamembentuk atau
menghasilkan,jadipyrogen artinya sesuatuyang dapat
menghasilkanpanas / demam.

36. • Pirogenadalahhasildari mikroorganismeberupa
kompleks lipopolisakarida proteinlipidyang
mengandung gugusanradikalnitrogendanfosfor,
merupakan endotoksindaribakter gram negative dan
jikadi suntikkanke dalamtubuhmanusia danhewan
dalamdosistertentu akan menyebabkan demam.
Pirogen

37. • Pirogen berasal dari macam – macam sumber, sehingga
susunankimiawinya berbeda – beda dan menyebabkan
aktivitasnya berbeda misalsifatfarmakologis, stabilitas dan
daya keracunannya.
• Gejalaumumyang timbuldenganadanya pirogen adalah
demam setelah beberapa saat penyuntikan,reaksi yang jelas
akan terlihatsetelah45 menitsampai 8 jam penyuntikan.

38. Sumber pirogen
• Air air yang sudah di simpan
• Peralatan
• Solute atau zat terlarut
• Proses produksi
• Udara kotor

39. Sifat – sifat pirogen
 kelarutan: larut dalam air, alkohol, tidak larut dalam pelarut
organiklain
 ukuran: 1 – 50 mµ
 stabilitas: dalam keadaankeringdan terlarut stabiltasnya t,
termostabil, dalamlarutansukar dihilangkan dengan
pemanasan , dalamkeadaankering pirogen dapat
dihilangkandenganpemanasantinggidan waktulama tinggi
 berat molekul: 15.000 – 4.000.000

40. Cara – cara pembebasan pirogen
A. Penyulingan:-penyulingan biasa
-penyulingan khusus
B. Pemanasan:-dalamlarutan
-dalamkeadaankering
C. Penyerapan
pirogendiserapa dengansecara kimia/fisikadenganadsorben
D. Depirogenase
E. Radiasisinargamma
F. Getaran ultrasonik

41. DAFTAR PUSTAKA
• Anonim,1995.Farmakope Indonesia edisi IV.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia.Jakarta
• Anonim,1997.Farmakope Indonesia edisi III.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia.Jakarta
• T.Pratiwi Sylvia,2008,Mikrobiologi Farmasi, Erlangga,
Jakarta
• http://download.fa.itb.ac.id/filenya/Handout%20Kukah/mi
krobiologi%20Analisis%20%28FK3207%29/Uji%20END
OTOKSIN.pdf