Endotoksin adalah lipopolisakarida (LPS) yang merupakan komponen membran sel bakteri Gram-negatif. Setiap molekul endotoksin memiliki bagian hidrofobik, hidrofilik, dan bermuatan yang memberikan karakteristik spesifik yang berkaitan dengan kemungkinan interaksi endotoksin dengan molekul lain. Saat bakteri mati, sebagian kecil dilepaskan ke lingkungan. Selama lisis sel bakteri dalam preparasi plasmid, endotoksin dilepaskan dalam lisat preparasi.

1. Eliminasi Endotoksin dalam Proses
Ekstraksi Plasmid
Endotoksin adalah lipopolisakarida (LPS) yang merupakan komponen membran sel bakteri
Gram-negatif. Setiap molekul endotoksin memiliki bagian hidrofobik, hidrofilik, dan
bermuatan yang memberikan karakteristik spesifik yang berkaitan dengan kemungkinan
interaksi endotoksin dengan molekul lain. Saat bakteri mati, sebagian kecil dilepaskan ke
lingkungan. Selama lisis sel bakteri dalam preparasi plasmid, endotoksin dilepaskan dalam
lisat preparasi.
Lapisan luar membran luar merupakan bagian lipid yang sepenuhnya terdiri dari molekul
endotoksin. Satu sel Escherichia coli dapat mengandung sekitar 2 juta molekul LPS yang
masing-masing mempunyai bagian lipid hidrofobik, kompleks residu gula dan gugus fosfat
bermuatan negatif.
Gambar 1. Bakteri negatif penghasil LPS
1. Kontaminasi Endotoksin dari Metode Preparasi Plasmid
Struktur kimia dan sifat molekul endotoksin menyebabkan molekul tersebut cenderung untuk
membentuk struktur misel. Struktur misel tersebut menyebabkan DNA plasmid seringkali
mengalami ko-purifikasi dengan endotoksin. Pada proses ultrasentrifugasi sesium klorida
(CsCl), DNA terikat-CsCl mudah terkontaminasi dengan molekul endotoksin yang memiliki
densitas hampir serupa dalam kompleks CsCl terhadap plasmid-etidium bromida.

2. Pada size exclusion- atau gel filtration chromatography resin, molekul endotoksin berukuran
besar dengan bentuk misel menyebabkan molekul menunjukkan respon seperti molekul DNA
berukuran besar, serta pada anion-exchange chromatography muatan negatif pada endotoksin
dapat berinteraksi dengan anion exchange resin sehingga menyebabkan ko-purifikasi
endotoksin dan DNA plasmid bersamaan. Metode purifikasi sangat menentukan tingkat
kontaminasi endotoksin pada DNA plasmid. MAGEN Ultra-low Endotoxin Plasmid DNA
Extraction Kit menghasilkan DNA dengan kemurnian tinggi dan tingkat endotoksin yang
relatif sangat rendah.
Tabel 1. MAGEN Endotoxin-Free Plasmid DNA Extraction KIts (Angen Biotech Co., Ltd)
Name of Product No. Catalouge
HiPure Plasmid EF Micro Kit (1~10ml) P1111
HiPure Plasmid EF Mini Kit (5~15ml) P1112
HiPure Plasmid EF Midi Kit (30~50ml) P1113
HiPure Plasmid EF Maxi Kit (50~200ml) P1114
HiPure Plasmid EF Mega Kit (500ml) P1116
HiPure Plasmid EF Giga Kit (1000ml) P1117
HiPure Plasmid EF 96 Kit (1~5ml) P1115
2. Pengukuran Endotoksin
Endotoksin awalnya diukur dalam reaksi penggumpalan antara endotoksin dan protein yang
menggumpal pada amoebosit horseshoe crab Limulus polyphemus. Seiring dengan
perkembangan teknologi dan sains, saat ini sebagian besar pengukuran endotoksin
menggunakan metode fotometri sensitif berdasarkan pada Limulus amoebocyte lysate (LAL)
dan substrat penghasil warna sintetis. Kontaminasi LPS biasanya dinyatakan dalam unit
endotoksin (EU) dan umumnya 1 ng LPS sebanding dengan 1–10 EU.
Tabel 2. Endotoxin LAL Assays
Brand No. Catalog Product Name Test
Lonza N294-03 PYROGENT™ Plus Gel Clot LAL Assay (with endotoxin) 200T
Lonza 192568 Endotoxin Challenge Vials, >1,000 EU/vial 25ea
Genscript L00351 ToxinSensor™ Gel Clot Endotoxin Assay Kit 40T
Charles River R11012 Gel-Clot LAL Reagent 50-test vial (5.2 mL) 50T
Charles River R13006 Gel-Clot LAL Single-Test Vial (0.2 mL) 1ea

3. 3. Dampak Adanya Endotoksin pada Aplikasi Biologis
Endotoksin dapat mempengaruhi transfeksi DNA ke dalam sel primer dan sel kultur yang
sensitif sehingga peningkatan kadar endotoksin menyebabkan penurunan efisiensi transfeksi
yang signifikan. Penggunaan DNA plasmid bebas endotoksin dalam terapi gen merupakan
hal yang sangat penting karena keberadaan endotoksin mampu menyebabkan berbagai
disrupsi fisiologis seperti munculnya demam, syok endotoksik, dan aktivasi kaskade
komplemen baik pada hewan dan manusia. Endotoksin juga mengganggu transfeksi in vitro
ke dalam sel imun seperti makrofag dan sel B dengan menyebabkan aktivasi nonspesifik dari
respon imun dan memicu sintesis mediator imun, seperti IL-1 dan prostaglandin. Penting
untuk memastikan bahwa semua peralatan plastik, media, serum, dan DNA plasmid bebas
dari kontaminasi LPS untuk menghindari berbagai efek samping terapi dan kesalahan
interpretasi hasil dalam riset.
4. Semua Alat dan Bahan Bebas Endotoksin
Untuk menghindari DNA plasmid terkontaminasi ulang setelah eliminasi endotoksin awal,
peralatan plasticware direkomendasikan untuk menggunakan peralatan baru yang disertifikasi
bebas pirogen/endotoksin. Pada perusahaan kami PT INDOGEN INTERTAMA, kebutuhan
plasticware bebas pirogen/endotoksin dapat ditelusuri pada katalog dari JET-BIOFIL.
Endotoksin akan melekat kuat pada glassware dan sulit dihilangkan selama pencucian. Proses
autoklaf standar juga tidak memiliki efisiensi eliminasi endotoksin sedikit atau tidak
berpengaruh sama sekali pada kadar endotoksin. Selain itu, jika alat yang diautoklaf
sebelumnya telah digunakan untuk bakteri, peralatan telah sangat terkontaminasi dengan
molekul endotoksin. Pemanasan glassware pada suhu 180 °C semalam diharapkan dapat
menghancurkan molekul endotoksin yang melekat pada alat kaca tersebut.
Untuk informasi lebih lanjut tentang penghapusan endotoksin, silakan merujuk ke literatur.
Penting juga diingat bahwa untuk selalu mencegah kontaminasi ulang DNA yang telah bebas
endotoksin dengan menggunakan reagen dan alat yang bebas endotoksin. Semua buffer dari
kit uji harus disertifikasi bebas endotoksin, seperti air yang digunakan untuk pembuatan
etanol 70% dan buffer TE untuk resuspensi.
DAFTAR PUSTAKA:
1. Wang X, Quinn PJ. 2010. Endotoxins: lipopolysaccharides of gram-negative bacteria.
Subcell Biochem 53:3-25.
2. Ma R, Zhao J, Du HC, Tian S, Li LW. 2012. Removing endotoxin from plasmid
samples by Triton X-114 isothermal extraction. Anal Biochem 424(2):124-126.

4. 3. Rozkov A, Larsson B, Gillström S, Björnestedt R, Schmidt SR. 2008. Large-scale
production of endotoxin-free plasmids for transient expression in mammalian cell
culture. Biotechnol Bioeng 99(3):557-566.
4. Butash KA, Natarajan P, Young A, Fox DK. 2000. Reexamination of the effect of
endotoxin on cell proliferation and transfection efficiency. Biotechniques 29(3):610-4,
616, 618-9.
Artikel terkait:
1. PCR Kit IVD untuk deteksi SARS-CoV-2 [link]
2. Wabah Monkeypox Non-Endemik Terbaru di Era Pasca Pandemi Covid-19: Definisi,
Diagnosis dan Manajemen [link]
3. Real Time PCR, Level Baru Amplifikasi DNA [link]
PT. INDOGEN INTERTAMA
Jl. Raya Cilangkap No. 111 RT 004/001
Cilangkap Cipayung Jakarta Timur 13870
Telp/Fax : 021-84310148
Mobile : +6281387927402
Email : marketing.indogen@gmail.com
Website : www.indogen.id