Померанцева Екатерина Алексеевна. Кандидат биологических наук, Заведующая медико-генетической лаборатории "Genetico" ПГД-консультант, г. Москва.

1. Преимплантационная
генетическая диагностика:
результаты работы,
ПГД-консультирование
Е. Померанцева, Лаборатория Генетико
Тверь, 2017г.

2. Методы
Пробоподготовка:
•Для хромосомного скрининга: NGS (Veriseq, Illumina), aCGH (24sure, Illumina).
•Для диагностики несбалансированных транслокаций aCGH (24sure+, Illumina), ПЦР. В
процессе изучения – платформа Agilent.
•Для моногенной ПГД: гнездовая мультиплексная ПЦР, WGA+ПЦР (индивидуально
разработанные наборы).
Визуализация результатов:
•Сканирование микроматриц Tecan PowerScanner.
•Обработка данных – ПО BlueFuse.
•Фрагментный анализ на секвенаторе ABI 3130.
•Рестриктный анализ с визуализацией при помощи гель-электрофореза.

3. Наши результаты по ПГС методами aCGH & NGS

4. Результаты хромосомной ПГД: донорские циклы
Тип клеток
Средний возраст
матери
# эмбрионов
Доля
эуплоидных
эмбрионов
Донорские ооциты 531 60%
Донорская сперма 40 лет 105 40%
ДО+ДС 52 61%

5. < 35 лет (N=686) 59% эмбрионов эуплоидны
35-41 (N=883) 40%
>41 (N=323) 20%
Результаты хромосомной ПГД: влияние возраста матери

6. Ключевые факторы эффективности ПГД: опыт Генетико

7. СРАВНЕНИЕ КАЧЕСТВА БИОПСИЙ ДЛЯ ПГД И ТЕСТОВЫХ
БИОПСИЙ
Биопсии для ПГДТестовые биопсии
Изменение основных параметров качества
биопсии после dry run
#ТренируйтесьНаКошках

8. Биопсия
 Лучше трофэктодерма, чем бластомеры и морула.
 Лучше с лазером, чем без него.
 Начинающие эмбриологи часто стараются меньше повредить эмбрион,
взяв меньше клеток или сомнительный материал. Это приводит к
необходимости повторной биопсии и увеличивает травматизацию
эмбрионов.
 Необходима тестовая биопсия.
 Важен подробный эмбриорепорт (фертилизация и пометки о
необычных находках)

9. Биопсия: embryo correction

10. Чистая лаборатория
 Зонирование лаборатории – пре-ПЦР и пост-ПЦР комнаты, работа в
ламинарах, боксах и вытяжках
 Предотвращение контактной контаминации – частая смена перчаток,
DNA-off, одноразовые халаты
 Контролируемый воздухообмен
 Снижение уровня озона (фильтр в сканере, фильтр в пост-ПЦР)
Ультрафиолет
Моющие средства на основе активного кислорода
Чистота в генетической лаборатории требует совершенно других мер, чем
в культуральной!

11. Чистая лаборатория: кто работает чище?
1
2
3
4
5
6

12. Выбор метода
Привязка к платформе и производителю – зло.
У каждого метода есть ограничения.
Более «модный» метод может быть неприменим в конкретной ситуации, и
надо возвращаться к «старому» методу.
Примеры:
транслокации на NGS, aCGH, PCR, FISH
повторные случаи пузырного заноса
Ценовая политика фармкомпании и удобство логистики тоже должны быть
приняты во внимание. Какова ценность «наисовременнейшего метода»,
если у них перебои с реактивами, производственный брак и
запретительные цены?..
#ХватитЭтоТерпеть

13. Транслокации
Анализ лучше проводить на все хромосомы - помним про 60%.
Не все транслокации одинаковы:
Робертсоновская: NGS
Реципрокная с хорошей вероятностью
детекции на 24Sure+: NGS или aCGH
Реципрокная субтеломерная с нулевой вероятностью
детекции: ПЦР (STR) или FISH

14. Транслокации: чувствительности
полногеномных методов иногда не хватает
1,7 Mb
У плода микроделеция q-плеча 6 хромосомы, захватывающая регион 6q27, и
микродупликация q-плеча 9 хромосомы, захватывающая регионы 9q34.2-9q34.3
У супруга транслокация 46, XY ish t(6;9)(D6S2523,D9S1838+;D6S2523+, D9S1838-)
4,3 Mb
24sure+
24sure
Veriseq

15. Транслокации: случайные находки
У пациента в последующем подтвердилась транслокация46, XY t(3;5) (q25;q35)

16. Транслокации: важность разрешения метода
У Иллюмины есть специальная таблица для расчета вероятности детекции
на транслокационных чипах.
Разрешение Veriseq 20 Mb, 24Sure 20 Mb, 24Sure+ 10Mb. Agilent - ?
Иногда транслокация у родителей обнаруживается случайно при анализе
эмбрионов без специфических показаний.
Иногда транслокация это не транслокация.

17. Транслокации: клинический случай
При направлении: 46,ХХ,t(4;13)(p14;q34).
На самом деле: инсерция
части 4 хромосомы в 13 и
перицентрическая
инверсия 4
(подтверждено FISH)
Совершенно другой
прогноз по риску!

18. Заключение по результатам ПГД
 По одним и тем же образцам разные лаборатории могут дать разные
заключения.
 По одним и тем же сырым данным разные лаборатории могут дать
разные заключения.
 Вопрос, что включать в заключение, каждая лаборатория решает сама,
но внутри лаборатории должен быть прописан регламент, которому все
следуют.
 Необходима перепроверка результатов, включая этап проверки сырых
данных врачом лабораторным генетиком и рекомендаций по переносу
врачом клиническим генетиком.

19. Как повысить уровень экспертизы
и не впасть в шаманство?
 Сравнение межлабораторное – статьи, конференции, коллаборации.
 Сравнение платформ.
 Сравнение образцов от повторной биопсии.
 Отслеживание исходов – только с клиникой.
 Статистика по беременностям на начатый цикл – только с клиникой.
 Сравнение ЧНБ с ПГД и без – только с клиникой.

20. Сравнение результатов ПГД: 24sure& NGS
NGS-veriseq
aCGH-24Sure

21. Сравнение результатов ПГД: бластомеры и
трофэктодерма от одного эмбриона
№ образца
В-бластомер
Т-трофэктодерма
Результаты
тестирования
ISCN 2016 Клиническая интерпретация Перенос эмбриона
В1 46, XX, +10, −15 arr(10)х3,(15)x1 Анэуплоидный эмбрион
Не рекомендован
Т1 46, XX, +10, −15 arr(10)x3,(15)х1 Анэуплоидный эмбрион
В3 43, XY, -16, -17, -18 arr(16)x1,(17)x1,(18)x1 Анэуплоидный эмбрион
Не рекомендован
Т3 43, XY, -16, -17, -18 arr(16)x1,(17)х1,(18)х1 Анэуплоидный эмбрион
В6 45, XY, −15 arr(15)x1 Анэуплоидный эмбрион
Не рекомендован
Т6 45, XY, −15 arr(15)x1 Анэуплоидный эмбрион
В7 43, XY, -1, -2, -21 arr(1)x1,(2)x1,(21)x1 Анэуплоидный эмбрион
Не рекомендован
Т7 43, XY, -1, -2, -21 arr(1)x1,(2)х1,(21q22.11q22.3)х1
Анэуплоидный эмбрион,
сегментарная делеция хромосомы 21

22. № образца
В-бластомер
Т-трофэктодерма
Результаты тестирования ISCN 2016 Клиническая интерпретация Перенос эмбриона
В1
Неравномерная
амплификация
Клиническая интерпретация результатов
по предоставленному образцу невозможна Рекомендован
Т1 46, XX arr(1-22,X)x2 Норма
В2 46, XY, +19, -20 arr(19)x3,(20)х1 Анэуплоидный эмбрион Не рекомендован
В3 46, XY arr(1-22)x2,(X,Y)x1 Норма Рекомендован
В4
Неравномерная
амплификация
Клиническая интерпретация результатов
по предоставленному образцу невозможна Рекомендован
Т4 46, XY arr(1-22)x2,(X,Y)x1 Норма
В5 48, XXY, +19 arr(19)x3,(X)х2,(Y)x1 Анэуплоидный эмбрион Не рекомендован
Сравнение результатов ПГД: бластомеры и
трофэктодерма от одного эмбриона

23. Моногенная ПГД
 Анализ лучше дополнять скринингом на все хромосомы - помним про
60%
 Прямая (где возможно) и косвенная диагностика
 Больше маркеров! «Кровавый минимум» с учетом FA и ADO – по 2
полностью информативных или 3 частично информативных маркера с
каждой стороны от мутации
 Предварительное гаплотипирование при любой возможности

24. Моногенная ПГД
Важна двойная детекция мутации при ПЦР-ПДРФ (2 фермента, один из
которых выявляет норму, а второй мутацию)
Обязательная апробация тест-системы на единичных клетках
При мутациях de novo у пробанда - апробация тест-системы на единичных
клетках с мутацией!
Не надо экономить на качестве моногенной ПГД, ставки слишком высоки!
Уж лучше хромосомы смотреть FISH-ом…

25. Проверка de novo мутаций на единичных клетках
Гаплотипирование отцовской мутации на единичных сперматозоидах
Полученные данные молекулярно-генетического анализа мутации и сцепленных маркеров
D4S2936 D4S1.0
FGFR3
G1138C
ACH-TG ACHAC D4S412 D4S2957 D4S2375 Гаплотип
sp1 167 191 mut 225 172 243 106 287 Мутантный
Sp2 181 194 N 217 166 235 108 282 Нормальный
Sp3 167 191 mut/N 225/217 172/166 235 108 282 NA
Sp4 167 191 mut 225 172 243/229 106 287 Мутантный
Sp5 181 194 N 217 166 235 108 282 Нормальный
Sp6 181 194 N 217 166 235 108 282 Нормальный
Sp7 181 191/194 N 217 166 235 106/108 287/282 Нормальный
Sp8 167/181 191 mut 225 172 243 106 287/282 Мутантный
Sp9 181 194 N 217 166 235 108 282 Нормальный
Sp10 167/181 191 mut 225 172 243 106 287 Мутантный
Sp11 181 191/194 mut/N 225/217 172/166 243/235 106 287/282 NA
Sp12 181 194 N 217 166 235 108 282 Нормальный
Sp13 181 191/194 mut/N 225/217 172/166 243/235 106 287 NA
Sp14 167/181 191/194 mut/N 225/217 172/166 243/235 106/108 287/282 NA
Sp15 167/181 191 mut 225/217 172 243 106 287 Мутантный
Носитель мутации с.G1138C в гене FGFR3 с клиническими проявлениями ахондроплазии
167/181 191/194 mut/N 225/217 172/166 243/235 106/108 287/282 D0215 (партнер)
171/173 192/192 N/N 215/233 172/162 243/243 107/107 288/288 D0216 (пациент)

26. Проверка de novo мутаций на единичных клетках
При отсутствии мутации у обоих родителей – проверка на лимфоцитах способности
тест-системы различать норму и мутацию.

27. Моногенная ПГД
Разработаны диагностические наборы для ПГД заболеваний:

28. СЕМЬЯ 1

29. ПГД-консультирование
 Основные компетенции ПГД-консультанта: клиническая генетика,
лабораторная генетика, молекулярная генетика, психология, ВРТ.
 Задачи ПГД-консультанта разнообразны и нестандартны.
 Непредвзятость: очень важно, чтобы ПГД-консультант представлял
интересы в первую очередь пациента, а не клиники или лаборатории.
 Умение разруливать конфликты необходимо.
#КонтейнированиеиРезилентность

30. ПГД-консультирование: информированное согласие
Функции ИС: коррекция ожиданий, разделение ответственности.
ИС содержит:
Описание процедуры, методов. Перечень рисков, сопряженных с
процедурой. Альтернативы процедуре. Выдержки из документа,
регламентирующего соответствующий вид деятельности.
Что важно:
1.Дать время прочитать.
2.Уточнить, какие есть вопросы.
3.Разъяснить значение сложных для понимания моментов, «перевести с
юридического на человеческий».
Задача ИС – убедиться, что пациент понимает, что за услугу ему
предлагают, и осознанно считает, что она ему нужна. Избавиться от
нереалистичных ожиданий (100% точность, избавление от всех болезней,
можно не проходить пренатальный скрининг и проч.)
Консультирование по информированному согласию тем проще,
чем меньше развесистых маркетинговых обещаний.

31. ПГД-консультирование: анализ самой возможности ПГД
Достоверно ли подтверждена мутация, на которую семья хочет ПГД и ее
каузативность?
Есть ли Сэнгер?
Есть ли заключение врача-генетика о том, что эта мутация вызвала это заболевание у
этого человека?
Если на мутацию можно делать пренатальную – можно и ПГД
Насколько «прочно» сцеплена мутация с фенотипом?
Полигенные заболевания
Предрасположенности с низким риском
Заболевания с поздним началом
Нужно ли дополнительное обследование?
Какой метод нужен для диагностики?

32. Конфликт лояльностей и интересов
 У сотрудников лаборатории и врачей не должно быть финансовой
мотивации в зависимости от числа образцов. Наши KPI – качественные:
надежность, скорость анализа, расширение линейки тестов и др.
возможностей, качество интерпретации.
 Производственная и коммерческая части процесса должны быть
разделены.
 Врач не должен быть продавцом. У него должна быть возможность сказать
«я считаю, этот тест вам не нужен» даже, если пациент готов за тест
заплатить. Врач не должен получать «поощрения» за направление на ПГД.
 Выбор метода, технологической платформы и принятие клинических и
диагностических решений должны осуществляться в интересах пациента.
#БелоеПальто

33. Контакты нашего центра
8 800 250 90 75
Москва, ул. Губкина, 3, строение 1
www.genetico.ru
телефон
адрес
сайт

34. Мои контакты
89037140646
e.pomerantseva@gmail.com
Ekaterina Pomerantseva
телефон
почта
Facebook