Il documento discute la regolazione dell'espressione genica negli eucarioti a vari livelli, inclusi i meccanismi di trascrizione, regolazione post-trascrizionale tramite microRNA e si occupa delle modifiche epigenetiche come la metilazione del DNA. Esamina inoltre il ruolo dei fattori di trascrizione, attivatori, repressori e l'importanza delle sequenze regolatrici nel controllo dell'attivazione genica. Infine, si analizzano le differenze nell'espressione genica tra le popolazioni umane e quelle di altri primati in relazione a tratti come il linguaggio.

1. Capitolo 18
La regolazione dell’espressione
genica negli eucarioti
Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
http://web.unife.it/progetti/genetica/Guido/index.php?lng=it&p=4

2. Domande 18
1. Ancora più che nei procarioti, negli Eucarioti molti geni
devono rispondere (attivandosi o disattivandosi) e in
modo coordinato a variazioni ambientali: come viene
regolata l’espressione genica?
2. Cosa succede ai geni che, in certi tessuti, non si
esprimono mai?
3. A che livelli può essere controllata l’espressione
genica?
4. Che cosa sono i piccoli RNA, e che ruolo hanno nel
controllo dell’espressione genica?

3. Figura 18.1
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Negli Eucarioti l’espressione
genica può essere controllata a
molti livelli
1
2
3
4 5
6

4. Il controllo della trascrizione può
essere positivo o negativo

5. Meccanismi di
controllo a livello
di inizio della
trascrizione

6. Regolazione della trascrizione negli
Eucarioti
A: Fattori trascrizionali (proteine)
Operano in trans: sono molecole diffusibili
1.Fattori generali di trascrizione o GTF
Si legano al promotore  bassi livelli di trascrizione
2.Attivatori
Si legano al DNA. Due domini: di legame e di attivazione
 alti livelli di trascrizione
3. Coattivatori
Si legano ai GTF o agli attivatori  alti livelli di trascrizione
4.Repressori
Si legano al DNA. Due domini: di legame e di repressione
Mai legati a siti analoghi all’operatore  inibizione della trascrizione
5. Corepressori
Si legano ai GTF o agli attivatori  inibizione della trascrizione

7. B: Sequenze regolatrici (siti del DNA)
Attive solo in cis: sono siti del DNA
Promotori (vicini), enhancer, silencer (lontani)
Gli elementi del promotore hanno un ruolo nel determinare se avviene
o meno trascrizione al gene
Gli enhancer e i silencers determinano, legando specifiche proteine
regolatrici, quanto alti saranno i livelli di trascrizione al gene
N.B. Non c’è una proteina regolatrice per ogni gene (altrimenti, metà
del genoma produrrebbe proteine regolatrici per l’altra metà). Ogni
gene è regolato da uno specifico complesso di proteine regolatrici: la
stessa proteina regolatrice regola, in combinazione con altre proteine
regolatrici, la trascrizione di diversi geni

8. Figura 18.8
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9. Figura 18.2
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Dominio C-Terminale della RNA P II
Proteina che si lega al TATA-box
Meccanismo generale
di attivazione della
trascrizione

10. Una malattia genetica: Intolleranza al lattosio
(da Jobling et al, 2004)

11. FOETUS
Low expression
INFANT
High expression
ADULT
High expression
“lactase persistence”
ADULT
Low expression
“lactase non-persistence”
Livelli di espressione della lattasi (LPH) a diversi
stadi di sviluppo (gene LCT)

13. Frequenza di individui in grado di digerire il
latte (fenotipo persistenza della lattasi)

14. 1. Forti differenze fra popolazioni
2. Conservato un lungo aplotipo ad alta frequenza

15. Enattah et al. Nature Genetics 30:233-237 (2002)
Lattosio glucosio + galattosio
LPH
Analisi del gene LCT (2q21) : nessuna variabilità associata all’intolleranza

16. Cromosoma 2
Localizzazione dei siti regolatori che determinano
la persistenza della lattasi

17. Regioni con la massima diversità ai
geni per le proteine del latte bovine
Regioni con la massima frequenza di
persistenza della lattasi

18. Figura 18.3
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Domini proteici che si legano al DNA

19. Tipico degli Homeo-box

20. Zinc-finger: struttura (C2H2)
Ci sono zinc-fingers con struttura C4 (4 cisteine) e C6 (6 cisteine)

21. Zinc-finger: Il recettore dell’estrogeno, ER
Un dimero di ER si inserisce nel solco maggiore del DNA,
provocando l’apertura della doppia elica

22. Leucine-zipper
Due eliche (Jun e Fos), tenute insieme da legami
idrofobici fra leucine

23. Figura 18.4
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Esempio 1: metabolismo del galattosio in lievito
Ci sono tre geni strutturali adiacenti e due Upstream Activating Sequences (UASG)
Questi geni non formano un operone, e hanno ciascuno il proprio promotore
Ci sono inoltre, a distanza:
GAL3: produce un enzima, Gal3p, che converte il galattosio in induttore
GAL4: gene regolatore; solo in assenza di glucosio produce il fattore di trascrizione Gal4p
GAL80: gene repressore, il cui prodotto Gal80p, si lega a Gal4p e ne blocca l’attività

24. Figura 18.4
Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
Esempio 1: metabolismo del galattosio in lievito
In assenza di glucosio, Gal4p forma dimeri che si legano alle UASG. Se però non c’è
galattosio, Gal80p si lega ai dimeri e impedisce loro di attivare la trascrizione

25. Figura 18.4
Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
Esempio 1: metabolismo del galattosio in lievito
In assenza di glucosio e in presenza di galattosio, Gal3p converte il galattosio in un
induttore che si lega a Gal80p, permettendo così a Gal4p di attivare la trascrizione (NB in
due direzioni diverse)

26. Figura 18.5
Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
Esempio 2: regolazione della trascrizione tramite
ormoni steroidei
Solo gli ormoni steroidei
entrano nella cellula e
intervengono direttamente
sul DNA, regolando la
trascrizione

27. Figura 18.6
Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
Gli ormoni steroidei si legano a
specifici SHR, Steroid
Hormone Receptors, e questo
complesso si lega alle
sequenze di regolazione dei
geni controllati dall’ormone
Esempio 2: regolazione della trascrizione tramite ormoni
steroidei
ER: recettore dell’estrogeno

28. Figura 18.7
Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
Esempio 2: regolazione della trascrizione tramite ormoni
steroidei
Le Chaperonine, fra cui
Hsp90, sono normalmente
legate agli SHR, ma se ne
staccano in presenza di
ormoni steroidei. Legato al
recettore, l’ormone entra nel
nucleo, dove attiva la
trascrizione.
Tutti i geni-bersaglio regolati
dallo stesso ormone hanno
una sequenza di legame in
comune.

29. RODOPSINA
OPN1
MELANOPSINA
OPN4
GLOBINA α
HBA
GLOBINA β
HBB
No No Sì Sì
Sì Sì No No
In ciascun tessuto, alcuni geni non
vengono mai trascritti
Come avviene tutto ciò?

30. a. Ci sono enhancers
tessuto-specifici

31. Figura 18.12
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b. Geni inattivi sono metilati
Contengono residui di 5-metil-citosina
Il contenuto di 5-metil-citosina è inversamente correlato al livello di
espressione genica
Sostituendo alla citosina un suo analogo non metilabile, la 5-azacitidina, si
attivano geni normalmente inattivi

32. La metil-transferasi lega gruppi metilici alle
citosine nei dinucleotidi CG; regioni del genoma
ricche di questi dinucleotidi si chiamano isole CpG
Regioni metilate possono essere evidenziate
perché la metilazione protegge dal taglio con MspI
le sequenze bersaglio dell’enzima di restrizione,
CCGG
Metilazione della
citosina nelle isole CpG
di mammifero

33. Il DNA non metilato scorre sul nucleosoma,
rendendo disponibili promotore e siti di
regolazione

34. Cromatina chiusa,
cromatina aperta
Il complesso SWI/SNF (switch
sniff) è costituito da un numero
variabile di proteine (da 8 a 18)
che allontanano i nucleosomi

35. La metilazione è una forma di cambiamento ereditabile
dell’espressione genica, che non altera la sequenza del
DNA
Un altro esempio di fenomeno epigenetico è rappresentato
dall’inattivazione del cromosoma X nei mammiferi
Fenomeni di questo tipo sono detti epigenetici.

36. Figura 18.14
Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
Regolazione a livello di maturazione dell’RNA: splicing alternativi

37. Lo strano caso delle petunie
I fiori di petunia selvatici hanno colore
uniforme per l’espressione di un gene
cromosomico che codifica per il pigmento.
Inserendo una seconda copia del gene,
Jorgensen e colleghi contavano di ottenere
una colorazione più intensa
Le petunie transgeniche così ottenute hanno
invece regioni non pigmentate; questo
fenomeno è stato chiamato co-soppressione
La co-soppressione è dovuta all’intervento di corti RNA con funzione di
regolazione, che inattivano entrambe le copie del gene per il pigemento: sia
quella portata sul cromosoma, sia quella transgenica:
Silenziamento genico

38. RNA interference
Lavorando su Caenorhabditis elegans, Fire e Mello dimostrano che gli mRNA
possono essere distrutti da piccole molecole di RNA a doppia elica: miRNA
(microRNA) e siRNA (short interfering RNA). (A. Fire et al., 1998, Nature
391:806-811)
miRNA e siRNA sono prodotti da tratti di genoma che non codificano per
proteine.
In natura, l’RNA interference porta al silenziamento genico, ed è utilizzato
da diversi organismi come difesa contro l’espressione di DNA virali

39. RNA interference

40. RNA interference
Nella regione UTR in 3’

41. Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
RNA interference 1: miRNA
I miRNA sono codificati da geni (oltre 500 nell’uomo) presenti nel genoma di tutti gli
Eucarioti multicellulari e di alcuni Eucarioti unicellulari
I geni per i miRNA sono in parte localizzati nelle regioni intrageniche, e in
parte all’interno di introni
I miRNA vengono trascritti dalla RNA P II in un trascritto primario (Pre-miRNA o shRNA:
Short Hairpin RNA) contenente un tratto di circa 70 nt che si ripiega a forcina
Un’endonucleasi (Drosha) taglia il Pre-miRNA lasciando un’estremità di 2nt
sporgente all’estremo 3’

42. Figura 18.15
Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
RNA interference 2: miRNA
Nel citoplasma, i Pre-miRNA vengono ulteriormente tagliati da un’endonucleasi, Dicer,
formando filamenti in cui le due eliche sono imperfettamente appaiate
Delle due eliche, una (filamento guida) diventerà il miRNA, l’altra (filamento
passeggero, o RNA*) no
Il miRNA si lega con altre proteine (slicer o Ago1) formando un precursore del
complesso miRISC (RNA Induced Silencing Complex)

43. Figura 18.15
Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
RNA interference 3: miRNA
Il complesso miRISC matura grazie ad Ago1, che provoca il rilascio del filamento
passeggero
Il complesso miRISC riconosce l’mRNA bersaglio, vi si lega (nella 3’UTR) e ne provoca la
degradazione

44. RNA interference 4: siRNA
I siRNA non sono codificati dal genoma nucleare, ma si originano come RNA a doppia
elica di 19-21 nt
Attraverso passaggi analoghi a quelli visti per
miRNA (ma Slicer è rappresentato da una
proteina diversa, Ago2) si forma un precursore
del complesso RISC, e poi un siRISC
Il complesso siRISC riconosce l’mRNA bersaglio,
vi si lega e ne provoca la degradazione
Ma, se non sono codificati nel genoma, che
origine hanno gli shRNA in questo caso?

45. RNA interference 5: siRNA
Fra le molecole di shRNA non codificate dal genoma nucleare ci sono gli intermedi di
replicazione di genomi virali a RNA, o trascritti ad elica singola che contengono
inverted repeats e perciò possono ripiegarsi a forcina
I complessi siRISC riconoscono regioni
complementari negli RNA da cui sono derivati,
e portano alla loro inattivazione: sono
conservati perché proteggono dall’infezione
virale

46. In sintesi

47. GENE 5’ UTR3’ UTRSITI REGOLATORI
mRNA 3’ UTR5’ UTR AAAAA
Ci vogliono più fattori per iniziare la trascrizione di ogni gene
Ci vogliono più miRNA per silenziare ciascun mRNA

48. RNA interference: un film
http://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.html

49. Controllo dell’espressione genica attraverso meccanismi
che regolano il catabolismo di RNA e proteine
La degradazione degli mRNA può avvenire tramite meccanismi dipendenti
dall’adenilazione, cioè digerendo la coda di poliA fino a renderla non funzionale.
Segue la rimozione del cap, dopo di che l’mRNA viene degradato a partire
dall’estremità 5’.
La degradazione degli mRNA può avvenire anche tramite meccanismi
indipendenti dall’adenilazione, al momento non ben compresi.

50. Sintesi 18
1. Negli Eucarioti l’espressione genica può essere controllata a molti livelli
2. Nella regolazione della trascrizione intervengono sequenze regolatrici a
monte del gene (promotori, enhancers, silencers) e molecole diffusibili
(fattori di trascrizione, attivatori, coattivatori, repressori, corepressori)
3. Queste molecole sono proteine che stabiliscono contatti col DNA grazie a
domini funzionali del tipo helix-turn-helix, zinc finger e leucine zipper
4. In organismi complessi, molti geni sono disattivati tramite metilazione della
citosina e altri fenomeni epigenetici
5. Esistono varie forme di controllo post-trascrizionale, di cui il principale
richiede l’intervento di microRNA e siRNA: RNA interference
6. L’RNA interference causa un silenziamento post-trascrizionale dei geni,
attraverso un’accelerata degradazione dei loro messaggeri
7. Ci sono infine meccanismi che regolano il catabolismo di RNA e proteine,
agendo sulla loro velocità di degradazione

51. Looking for speech genes
Bishop (2002)
In the portions of the genome that differ between
chimpanzee and human, can we find a gene or genes
that are crucial for language?
Speech genes?

52. Famiglia KE con una grave forma di dislessia
(incapacità di sviluppare un discorso articolato)
Mutazione nel gene FOXP2

53. Risonanza magnetica in membri della famiglia KE

54. Sequenza della proteina nei Primati e nel topo

55. Albero evolutivo di FOXP2
Abbiamo trovato il gene per il linguaggio?

56. Gene expression comparisons

57. Looking for speech genes:
gene expression comparisons
Enard et al. (2002)

58. We have largely the same genes as chimpanzees, and these
genes do the same things in much of our bodies, but not in the
brain (Enard et al. 2002)
Species-specific gene expression patterns: Large
changes in gene expression in the human brain.

59. We have largely the same genes as chimpanzees, and these
genes do the same things in much of our bodies, but not in the
testis (Khaitovich et al. 2005)
Species-specific gene expression patterns: Small
changes in gene expression in the human brain.