1. Министерство сельского хозяйства Республики Казахстан
Акционерное общество «КазАгроИнновация»
ТОО «КАЗАХСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ
ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ»
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по выделению, культивированию и поддержанию вирусов
оспы овец, коз и птицы
Астана 2010

2. УДК 616.912:578.821.21
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по выделению, культивированию
и поддержанию вирусов
оспы овец, коз и птицы
Автор: Кутумбетова Л.Б.
Для руководства при проведении научно-исследовательских,
производственных и музейно-коллекционных работ,
а также учебно-познавательных занятий для студентов ветеринарного
и вирусологического профилей.
Издано в рамках программы 056
«Повышение конкурентоспособности сельскохозяйственной продукции»
Рассмотрено и одобрено на заседании научно-технической комиссии АО
«КазАгроИнновация», 2 августа 2010 года.
2

3. ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
В настоящих методических указаниях использованы следующие
обозначения и сокращения:
РКЭ – развивающиеся куриные эмбрионы;
ФКЭ – фибробласты куриных эмбрионов;
РН – реакция нейтрализации;
АП – аллантоисная полость;
АЖ – аллантоисная жидкость;
ХАО – хорион-аллантоисная оболочка;
ПЯ – первичная культура клеток почки ягнят;
ТТ – перевиваемая линия клеток тестикул теленка;
ТЯ-КК49 – культура клеток тестикул ягнят с диплоидным набором
хромосом, поддерживаемая и производимая пересевами;
ПО – перевиваемая линия клеток почки овцы;
ОП – оспа птиц;
ВОП – вирус оспы птиц;
ИД50 – 50%-ая инфицирующая доза;
ЭИД50 – 50%-ая эмбриональная инфицирующая доза;
Gh-91 – перевиваемая культура клеток гонад 3-х дневной козы;
ТЦД50 – 50%-ая тканевая цитопатическая доза;
СПФ – свободные от патогенной микрофлоры;
КРС – крупный рогатый скот;
Игла – питательная среда для выращивания культур клеток, изготовленная
по рецептуре Eagle

4. ОПРЕДЕЛЕНИЯ
В настоящих методических указаниях применены следующие термины с
соответствующими определениями:
КУЛЬТУРА КЛЕТОК – клетки, способные в искусственных условиях in
vitro находиться в функционально активном состоянии.
ВИРУСЫ – автономные генетические структуры, способные
функционировать и репродуцироваться в восприимчивых к ним клетках
животных, растений, простейших, грибов, бактерий.
СЫВОРОТКА СПЕЦИФИЧЕСКАЯ – сыворотка крови животных,
полученная после иммунизации определенным видом микроорганизма (вируса)
и содержащая антитела специфические микроорганизму который использован
для иммунизации.
ОСВЕЖЕНИЕ – возвращение исходных биологических свойств
микроорганизма путем репродукции или культивирования в чувствительных
биологических моделях (субстратах) после консервирования.
РЕПРОДУКЦИЯ – продуктивный тип взаимодействия вируса с клеткой.
ПАССАЖ – культивирование вируса в культуре ткани, курином эмбрионе
или в организме восприимчивых животных путем последовательного переноса
вируссодержащего материала из одной популяции в другую.
СУБСТРАТ – см. Биологическая модель.
БИОЛОГИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ – культура клеток, развивающийся эмбрион
животных или птицы, животное и птица, чувствительные или восприимчивые к
испытуемому возбудителю болезни (вирусу), которые применяются для
репродукции и размножения микроорганизмов.
ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСА– изоляция из источника возбудителя болезни.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ – определение родовой, видовой и типовой
принадлежности вирусов, установление их сходства или различия при
сравнении с уже известными вирусами.
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ – размножение клеток вне организма.
КОНСЕРВИРОВАНИЕ – временное приостановление репродуктивности
вирусов, размножения микроорганизмов, в том числе культур клеток, с
сохранением их репродуктивности и жизнеспособности.
ПОДДЕРЖАНИЕ – сохранение репродуктивных свойств вирусов или
жизнеспособности культур клеток или других микроорганизмов в
биологически активном состоянии.
СТАБИЛИЗАТОР – см. Защитная среда.
ЗАЩИТНАЯ СРЕДА – раствор, содержащий в своем составе протективные
по отношению к микроорганизмам (вирусам) компоненты. Защитная среда
применяется для протекции биологической активности и морфологической
структуры микроорганизмов при лиофильной сушке.
ТИТР ВИРУСА – наименьшее количество вирионов, способных проявлять
биологическую активность и выражается в единицах активности:
4

5. бляшкообразующей (БОЕ), инфекционной (ИД50), цитотоксической (ТЦД50),
летальной (ЛД50) и определяется с помощью специальных методик.
ИММУНОГЕННОСТЬ – способность антигена индуцировать гуморальный
и клеточный иммунитет. Зависит от величины частиц, конформации,
конфигурации, химической структуры, степени чужеродности и
восприимчивости организма.
АНТИГЕННОСТЬ – мера антигенного качества. Определяется
способностью антигена вызывать специфический иммунный ответ и
взаимодействовать с продуктами иммунного ответа.
ПАТОГЕННОСТЬ – потенциальная способность вирусов и микробов в
естественных условиях вызывать заболевание.
ВИРУЛЕНТНОСТЬ – количественная характеристика патогенности
возбудителей инфекционных болезней. Выражают условными величинами -
минимальной летальной дозой (МЛД), 50%-й летальной дозой (ЛД50) или 50%-
й инфицирующей дозой (ИД50).
МОДИФИЦИРОВАННЫЙ – относится к популяции микроорганизмов
(вирусов), с полезными иммунобиологическими свойствами, полученная в
результате направленного воздействия с помощью определенных методов:
пассирование, клонирование или аттенуирование или данное понятие заменяет
слово аттенуированный.
АТТЕНУИРОВАННЫЙ – относится к популяции микроорганизмов
(вирусов), патогенные и вирулентные свойства которых ослаблены или
утрачены в результате направленных воздействий или впоследствии
природной селекции.
ИЗОЛЯТ ВИРУСА – популяция вируса, выделенная из организма хозяина
или переносчика.
ШТАММ ВИРУСА – однородная популяция вируса, происходящая из
одного вириона и у которой изучены биологические свойства.
ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА КЛЕТОК – клетки, полученные путем
ферментативного разделения из живой ткани макроорганизма и растущие вне
организма в специальных сосудах с помощью питательных сред до образования
монослоя. Для ее получения чаще используют клетки эмбриональных органов,
обладающих наибольшей потенцией к росту.
ПЕРЕВИВАЕМАЯ КУЛЬТУРА КЛЕТОК – клетки, способные к
размножению в искусственных условиях неопределенно долгое время. Ее
получают из первично-трипсинизированных культур клеток и поддерживают в
лабораторных условиях путем последовательных пересевов (пассажей) с
заменой питательной среды.
ПЕРЕСЕВАЕМАЯ ИЛИ ШТАММОВАЯ КУЛЬТУРА КЛЕТОК – культура
клеток с диплоидным набором хромосом, обладающая свойствами первичной.
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА – субстраты, поддерживающие
жизнедеятельность различных культур микроорганизмов и клеток. Содержат
неорганические соли, низкомолекулярные синтетические вещества и
сывороточные компоненты.
5

6. ВВЕДЕНИЕ
В природе широко распространены вирусные возбудители болезней,
которые ярко проявляют свое присутствие, вызывая специфические
заболевания среди восприимчивых животных. Для индикации и выделения
вирусов используются специальные средства и методы. Обнаружение
вирусного возбудителя дает возможность ставить соответствующий диагноз на
заболевания. Кроме того, вирусные возбудители сами по себе являются
основным источником для изготовления специфических диагностических и
профилактических препаратов. Используемые для таких целей вирусы в начале
выделяют (изолируют), подвергают идентификации и с помощью специальных
методов получают штаммовые популяции с направленными свойствами.
Штаммы вирусов по своим предназначениям имеют определенные
отличающиеся от других иммунобиологические свойства и распределяются на
основные три группы. Первую группу составляют штаммы вирусов,
предназначенные для референции и их биологические свойства, условно,
считают типичными для данного вида возбудителя. Во вторую группу входят
штаммы, обладающие биологическими свойствами, которые близки к
природным и пригодны для осуществления контроля иммуногенности
вакцинных препаратов. Из таких же штаммов можно готовить
инактивированные вакцины или диагностические препараты. Третью группу
представляют штаммы вирусов, которые претерпели определенные изменения
в условиях самой природы или с помощью исследовательских воздействий и не
обладают патогенностью по отношению к восприимчивым животным и птице,
но имеют иммуногенные свойства. Вирусы этой группы чаще используются в
изготовлении живых видов вакцинных препаратов. Их можно применять также
при получении диагностических средств.
Известно, что популяция микроорганизмов, в том числе вирусов в процессе
репродукции подвержена изменчивости, тогда как технологии изготовления
вакцинных и диагностических препаратов требуют применения вирусных
образцов со стабильными биологическими показателями. Поэтому, для
исключения вероятного изменения необходимых стандартизированных
биологических свойств популяцию штаммов вирусов поддерживают в
условиях, которые не стимулируют такие изменения или стимулируют в
наименьшей степени. К таким условиям относятся консервирование путем
сублимационного высушивания и хранение при температуре минус 20 оС и
ниже.
В настоящих методических указаниях приведены технологические
приемы, биологические объекты, физико-химические и биологические
параметры, используемые при выделении, культивировании и поддержании, а
также определении биологических параметров вирусов оспы овец, оспы коз и
оспы птицы.
6

7. 1 ОБЩАЯ ЧАСТЬ
Работу по подготовке лабораторной посуды, приготовлению культур
клеток и развивающихся куриных эмбрионов, выделению, культивированию и
поддержанию вирусов осуществляют лица, хорошо владеющие техникой
вирусологических исследований, предварительно прошедшие специальное
обучение, получившие инструктаж и владеющие техникой по получению
данного препарата.
Место проведения работ (лаборатория) должно располагать боксовыми
помещениями для раздельного проведения технологических манипуляций по
стерильной фильтрации питательных сред и растворов, получению культур
клеток и развивающихся куриных эмбрионов, выделению, культивированию,
консервированию и освежению вирусов. В боксах, используемых для
приготовления культур клеток и работы с вирусами, необходимо соблюдать
идеальную чистоту. Стены предбоксников и боксов должны быть облицованы
плиткой, а пол и потолок – иметь гладкую поверхность. Боксы оборудуются
бактерицидными лампами и принудительной вентиляцией с целью создания в
них более высокого давления воздуха по сравнению с другими помещениями.
Лабораторное помещение, в котором расположены боксы, должно быть
обеспечено также водопроводной и дистиллированной водой, паром, воздухом
с положительным и отрицательным давлением, углекислотой и азотом.
Персонал, работающий в боксах, должен иметь специальные комнаты для
переодевания и стерильную спецодежду (халаты, комбинезоны,
косынку/колпак) и тапочки. Лица, не имеющие отношения к процессам,
описанных в данных методических указаниях, на посещение место работы с
целью инспекции, обеспечиваются спецодеждой и тапочками. В лабораторных
помещениях, используемых для выделения, культивирования и поддержания
вируса оспы, работа с другими вирусами и микроорганизмами запрещается.
При работе с биологическими объектами соблюдают специальный
санитарный режим. Работу с культурами клеток и тканей, развивающимися
куриными эмбрионами и вирусами производят в стерильных условиях, поэтому
поддержанию чистоты и стерильности боксовых помещений предъявляются
повышенные требования. Перед началом работы, в обеденный перерыв и в
конце рабочего дня необходимо обязательно включать бактерицидные лампы
на 30 минут. При появлении массовых проростов в культуре клеток
бактериальной и грибковой микрофлоры бактерицидные лампы включают на
ночь в течение 2-3 дней подряд. Входить в бокс разрешается только в
специально предназначенной для этой цели одежде и обуви. Халаты, чепчики и
маски предварительно стерилизуют автоклавированием. Работа в боксе
проводится у пламени спиртовки или газовой горелки.
Резиновые пробки флаконов, бутылей матрасов с растворами, средами,
сывороткой или культурой клеток протирают тампонами, смоченными
спиртом, и фламбируют над пламенем спиртовки. Во время работы
своевременно убирают раздельно «стерильную и загрязненную» вирусом
посуду в специальные контейнеры. Обезвреживание посуды осуществляют
7

8. автоклавированием при 2,0 кг/см2 в течение 2 часов. В конце рабочего дня
проводят влажную уборку полов, стола, стульев и поверхности других
предметов 1,5-2,0% раствором хлорамина. Один раз в неделю проводят
санитарный день, во время которого моют полы, стены и окна с последующим
4-5-часовым облучением боксов ультрафиолетовыми лучами.
2 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Подготовка лабораторной посуды и резиновых изделий
В процессе приготовления культур клеток, выделения, культивирования и
поддержания вирусов используют бутыли, колбы, матрасы, пипетки, пробирки,
флаконы, воронки, резиновые пробки и трубки. Лабораторная посуда и
резиновые изделия должны быть тщательно вымыты и простерилизованы. В
качестве моющих средств применяют тринатрийфосфат, моющий порошок,
кальцинированную и двууглекислую соду, соляную и серную кислоты.
Стеклянную посуду (новую) ополаскивают в водопроводной воде,
заливают на 24 часа 25-30%-ым раствором серной кислоты (ГОСТ 4204-77),
ополаскивают 10 раз в водопроводной воде и помещают в ванну с моющим
раствором (150 г тринатрийфосфата на 100 л дистиллированной воды),
подогретым до 50-600С и моют с помощью ершей. Затем тщательно промывают
дистиллированной водой до полного удаления пены со стенок посуды,
помещают на 1-2 мин в 1%-ый раствор соляной кислоты (ГОСТ 3118-77) для
нейтрализации щелочи или 3-4 раза ополаскивают в этом же растворе и вновь
ополаскивают в 4-х сменах деминерализованной воды. Показателем того, что
посуда вымыта хорошо, является равномерное стекание со всей поверхности
сосудов и отсутствие капель воды на стенках. Если после ополаскивания
посуды видны капли на стенках, ее моют повторно по той же методике. При
этом обращают особое внимание на чистоту ванн, в которых моется и
ополаскивается посуда. Ванны и тазы должны быть обезжирены
кальцинированной содой или хромовой смесью. Вымытую посуду
устанавливают вниз горлышками, затем сушат в сухожаровом шкафу. Посуду,
бывшую в употреблении и не загрязненную парафином, воском или жиром,
ополаскивают холодной водой, моют по той же методике.
Посуду, загрязненную жиром, сначала необходимо прокипятить в растворе
тринатрийфосфата, затем промыть горячей водопроводной водой и вымыть, как
указано выше. Если при этом посуда остается «жирной», ее следует
дополнительно обработать серной кислотой и тщательно прополоскать
водопроводной водой, а затем в 3-х сменах деминерализованной воды. Пипетки
после работы, до мойки хранят в банке с деминерализованной водой, затем
обрабатывают серной кислотой, тщательно промывают сначала проточной
водопроводной, затем деминерализованной водой и высушивают в сушильном
шкафу. Высушенную стеклянную посуду монтируют и стерилизуют в
сушильном шкафу при температуре 1800С в течение 2-х часов. Контролем
стерильности посуды является почернение сахарозы, которую кладут на все
8

9. полки, где размещена посуда. Горячую посуду выгружать из сушильного
шкафа не рекомендуется, так как она при быстром остывании вне сушильного
шкафа отпотевает и в нее всасывается нестерильный воздух.
Новые, не бывшие в употреблении, резиновые трубки и пробки кипятят в
течение 30 минут двукратно в 5%-ом растворе двууглекислой соды (ГОСТ
2156-76). После каждого кипячения их тщательно отмывают водопроводной
водой до полного просветления промывной жидкости. После этого резиновые
пробки и трубки кипятят 10-15 минут в 2%-ом растворе соляной кислоты. Затем
промывают водопроводной и деминерализованной водой, кипятят 30 минут в
деминерализованной воде, промывают свежей деминерализованной водой,
высушивают на воздухе, монтируют, стерилизуют автоклавированием 2 часа
при 2 кг/см2. Не рекомендуется проводить одновременную обработку черных
резиновых пробок и резиновых трубок. Резиновые пробки и трубки, бывшие в
употреблении, промывают водопроводной, а затем деминерализованной водой,
кипятят 10 минут в деминерализованной воде, монтируют и стерилизуют
автоклавированием 2 часа при 2 кг/см2.
2.2 Приготовление солевых растворов, питательных и защитных сред.
2.2.1 Общие положения.
Для приготовления солевых растворов и питательных сред используют
деминерализованную воду, полученную на ионообменных установках.
Удельное сопротивление воды должно быть не менее 15х106 Ом и рН 5,7-7,0.
Допускается изготовление сред и растворов на дважды или трижды
дистиллированной воде. Воду получают в день приготовления растворов или
накануне. В последнем случае воду хранят в герметически закрытых емкостях
из нержавеющей стали или бутылях.
Среды и растворы готовят из солей квалификации «химически чистые» или
«чистые» для анализа. Соли растворяют в строгой последовательности,
указанной в прописях. Последующую соль добавляют только после полного
растворения предыдущей. Химические реактивы обязательно высушивают.
Параметры условий высушивания неорганических солей указаны в таблице 1.
Таблица 1 – Температурно-временной режим сушки неорганических солей.
№№ Формула соли Температура сушки, 0С Формула соли Примеча-
п/п до высушивания 37 50 80 180 после ние
высушивания
1 NaCl NaCl
2 KCl 5-8 KCl
3 KH2PO4 - суток - - KH2PO4 -
4 NaH2PO42H2O - 8-12 - - NaH2PO4 или Темп. не
суток NaH2PO4H2O выше 500С
5 Na2HPO4 12H2O 15-18 15-18 - - Na2HPO4 2H2O или
суток суток Na2HPO4H2O -
9

10. Для стерилизации питательных сред и растворов используют пластины
«СФ» или ЕКS-2, смонтированные на фильтре Сальникова. Рабочее давление
воздуха в системе 0,3-0,5 кг/см2. Пластины предварительно промывают
деминерализованной или бидистиллированной водой из расчета 2,0 л на одну
пластину. Первую порцию растворов в количестве 0,5-1,0 л на одну
фильтровальную пластину не используют. Нагрузка на одну пластину СФ до 10
л раствора, на пластину ЕКS-2 – до 30 л.
Готовые питательные среды, солевые растворы и сыворотку крови
крупного рогатого скота контролируют на стерильность согласно ГОСТ 28085.
Среды и растворы каждой серии выдерживают 5 суток при температуре 37 0С и
14 суток при комнатной температуре. При необходимости серию
расфасовывают в мелкую посуду и выдерживают дополнительно 14 суток при
комнатной температуре. Среды и растворы должны быть стерильными,
прозрачными, не иметь осадка. Растворы и среды, содержащие индикатор
феноловый красный, должны быть красно-оранжевого цвета. Среды с наличием
бактериального и грибкового загрязнения утилизируют.
Ростовые свойства питательных сред и сыворотки крови крупного рогатого
скота проверяют путем сравнения с заведомо качественными образцами сред и
сыворотки. Смесь заведомо известных сред и сыворотки с вновь
приготовленными используют для выращивания культур клеток. Среда Игла с
10% сыворотки крови должна обеспечить образование сплошного монослоя
клеток куриных эмбрионов в матрасах через 48 часов при посевной дозе 200
000 клеток/мл. Если в матрасах обнаруживается недостаточный рост культуры
и очаги дегенерации клеток, то проводят повторное испытание. При получении
отрицательных показателей серию среды бракуют.
2.2.2 Приготовление 10-кратного основного раствора Хенкса.
Вначале готовят отдельно раствор А по прописи, приведенной в таблице 2,
а затем раствор Б по прописи, указанной в таблице 3.
Таблица 2 - Пропись раствора А.
Компоненты Количество, г/л ГОСТ Марка
Натрий хлористый (NaCl) 80,0 4233-77 хч
Калий хлористый (КCl) 4,0 4234-77 хч
Магний сернокислый (MgSO4) 1,0 4523-77 хч
Магний хлористый (MgCl) 1,0 4209-77 хч
Кальций хлористый (CaCl2 6H2O)* 1,4 4151-77 хч
Примечание: * - навеску кальция хлористого берут в пересчете на безводный
Готовят точный 40%-ый раствор CaCl2 6H2O (плотность dn20 - 1,3957) и
20%-ый раствор MgCl2 6H2O (плотность dn20 - 1,175). Необходимую
количественную навеску каждой соли растворяют в 30-50 мл воды и
небольшими порциями добавляют к раствору остальных солей. Полученный
раствор А доводят водой до 500 мл.
Таблица 3 - Пропись раствора Б.
10

11. Компоненты Количество, г/л ГОСТ Марка
Натрий фосфорнокислый
однозамещенный (NaH2PO4 2H2O) 0,75 245-76 Хч
Натрий фосфорнокислый двузамещенный
(Na2HPO4 12H2O) 1,5 4172-76 Хч
Калий фосфорнокислый однозамещенный
(КH2PO4) 0,6 4198-75 Хч
Глюкоза кристаллическая гидратная 10,0 975-75 Хч
Феноловый красный 0,2 ГФХ с. 829
Фенол сульфофталеина аммонийная соль МРТУ 6-09-
0,2 1647-64 Хч
Конечный объем раствора Б доводят до 460 мл. Затем к раствору Б при
непрерывном перемешивании добавляют раствор А и после этого 20 мл 1%-го
раствора фенолового красного. Полученный основной раствор Хенкса
фильтруют через бумажный или ватно-марлевый фильтр и стерилизуют
фильтрацией через пластины «СФ» или ЕКS-2. Основной раствор Хенкса
хранят при температуре 40С в течение 6 месяцев.
2.2.3 Приготовление рабочего раствора Хенкса.
К одному литру основного раствора Хенкса добавляют 9 л
деминерализованной воды. Доводят рН до 7,2-7,4 с помощью 7,5%-ым
раствором двууглекислого натрия (NaHCO3, ГОСТ 2156-76). Стерилизуют
раствор фильтрованием через пластины «СФ» или ЕКS-2 и хранят при
комнатной температуре (18-200С) 3 месяца, без двууглекислого натрия – 6
месяцев. Рабочий раствор Хенкса без добавления хлористого кальция (CaCl2
6H2O) стерилизуют автоклавированием при 0,7 кг/см2 в течение 40 мин. После
автоклавирования в стерильных условиях устанавливают рН (7,2-7,4) 7,5%-ым
раствором двууглекислого натрия. Срок годности – 3 месяца.
2.2.4 Приготовление 7,5%-го раствора двууглекислого натрия.
Раствор двууглекислого натрия применяют для установки рН солевых
растворов и питательных сред. Навеску соды засыпают в бутыль, заливают
соответствующим количеством деминерализованной воды, закрывают пробкой
и помещают в термостат (37+0,50С) на 2-3 суток. После полного растворения
соды раствор стерилизуют фильтрованием через пластины «СФ» или ЕКS-2.
Стерильный раствор соды расфасовывают во флаконы, плотно закрывают
резиновыми пробками и хранят при температуре 4-60С в течение месяца.
2.2.5 Приготовление 20%-го раствора фосфатно-кислого однозамещенного
калия.
Раствор применяют для подкисления растворов и питательных сред. Для
его приготовления в 1 л деминерализованной воды растворяют 200 г КН 2РО4
(ГОСТ 4198-75, хч) и стерилизуют фильтрованием через пластины «СФ» или
ЕКS-2.
2.2.6 Приготовление 0,25%-го раствора трипсина.
Для трипсинизации ткани используют 0,25%-ый раствор трипсина
«Дифко» или другого производства с равными ферментативными свойствами в
11

12. солевом буферном растворе без ионов Са+ и Mg+. Состав этого солевого
буферного раствора приведен в таблице 4.
Таблица 4 - Пропись компонентов 0,25%-го раствора трипсина.
Компоненты Количество, г/л ГОСТ Марка
Натрий хлористый (NaCl) 8,0 4233-77 Хч
Калий хлористый (КCl) 0,2 4234-77 Хч
Натрий фосфорнокислый Xч
двузамещенный (Na2HPO4 2H2O) 1,447 4172-76
Калий фосфорнокислый Хч
однозамещенный (КH2PO4) 0,2 4198-75
Деминерализованная вода до 1 л
Навеску трипсина 2,5 г предварительно растворяют в небольшом объеме
воды (100-150 мл), перемешивают и ставят на ночь в холодильник. Критерием
растворения трипсина служит хорошая видимость контуров предметов через
бутыль с раствором. Растворенный трипсин при помешивании добавляют в
колбу. Полученный раствор доводят водой до 1 л. К общей смеси добавляют
пенициллин и стрептомицин по 100 000 ЕД. (антибиотики растворяют в
небольшом объеме раствора и наливают в колбу). Добавлением 1N раствора
едкого натрия – NaOH (ГОСТ 4328-77) устанавливают рН раствора, который до
фильтрации должен быть в пределах 7,2-7,3, после фильтрации 7,4-7,5.
Полученный раствор стерилизуют фильтрованием через пластины «СФ»
или ЕКS-2. Готовый раствор трипсина хранят в герметически закрытых
бутылях при температуре 4-6 оС не более 1 месяца, в замороженном виде при
температуре минус 30 оС до 1 года.
2.2.7 Приготовление 0,5%-го гидролизата лактальбумина.
Гидролизат лактальбумина в концентрации 0,5% растворяют на растворе
Хенкса и используют в качестве питательной среды для выращивания культур
клеток ПЯ, ТЯ-КК49, ФКЭ. Среду готовят по прописи, указанной в таблице 5.
Таблица 5 - Пропись компонентов для приготовления 0,5%-го раствора
гидролизата лактальбумина.
Компоненты Количество, г/л ГОСТ Марка
Натрий хлористый (NaCl) 8,0 4233-77 Хч
Калий хлористый (КCl) 0,4 4234-77 Хч
Магний сернокислый (MgSO46Н2О) 0,1 4523-77 Хч
или
Магний сернокислый безводный 0,053 - -
Магний хлористый (МgCl26Н2О) или 0,1 4209-77 Хч
Магний хлористый безводный
0,47 - хч
Натрий фосфорнокислый
двузамещенный (Na2HPO4 12H2O) 0,075 4172-76 Хч
12

13. Калий фосфорнокислый
однозамещенный (КH2PO4) 0,06 4198-75 Хч
Глюкоза кристаллическая гидратная 1,0 975-75 Хч
Кальций хлористый безводный (СаСl2)
0.2 4460-77 Хч
Феноловый красный 0,02 ГФХ с.829 Хч
Натрий двууглекислый (NaHCO3) 2156-76 Хч
Гидролизат лактальбумина 5
Пенициллин 100 тыс. ед. ГФХ с.521
Стрептомицин 100 тыс. ед. ГФХ с. 636
Вода деминерализованная до 1л.
Порядок растворения компонентов:
Раствор 1: натрий хлористый, калий хлористый, магний сернокислый,
глюкоза.
Раствор 2: натрий фосфорнокислый однозамещенный растворять в воде,
нагретой до температуры 90 оС.
Раствор 3: гидролизат лактальбумина растворять в воде, нагретой до 90 оС,
или автоклавировать при 0,7 кг/см2 в течение 10 минут.
Раствор 4: хлористый кальций, тщательно перемешивать.
Раствор 5: феноловый красный.
Раствор 6: натрий двууглекислый.
Газирование среды углекислым газом, подвести рН среды до 7,0-7,2.
Раствор 7: антибиотики.
Смешать растворы и стерилизовать фильтрованием через пластины «СФ»
или ЕКS-2. Среду хранят 3 месяца в герметически закрытых бутылях при
температуре 4-6 оС.
2.2.8 Приготовление питательной среды по рецептуре Игла
Таблица 6 - Пропись компонентов для приготовления питательной среды по
рецептуре Игла.
Компоненты Состав (мг в 1000,0 Состав (мг в 1000,0 мл
мл раствора) для L- раствора) для HeLa-
клеток клеток
л-аргинин 17,4 17,7
л-цистин 4,8 12,0
л-гистидин 3,1 7,8
л-изолейцин 26,2 26,2
л-лейцина 13,1 26,2
л-лизин 14,6 29,2
л-метионин 7,5 7,5
13

14. л-фенилаланин 8,3 16,5
л-треонин 11,9 23,8
л-триптофан 2,0 4,1
л-тирозин 18,1 18,1
л-валин 11,7 23,4
биотин 0,24 0,24
холин 0,12 0,12
холина-хлорид 0,14 0,14
витамин В12 (птероилглютаминовая 0,44 0,44
кислота)
никотинамид 0,12 0,12
пантотеновая кислота 0,22 0,22
пантотенат кальция 0,48 0,48
пиридоксаль (пиридоксин хлоргидрат) 0,20 0,20
тиамин-хлоргидрат 0,34 0,34
рибофлавин 0,04 0,04
хлористый натрий 5850,0 5850,0
хлористый калий 373,0 373,0
фосфат натрия однозамещенный 138,0 138,0
(NaH2PO4*1H2O)
кальций хлористый 111,0 111,0
двууглекислый натрий (NaHCO3) 1680,0 1680,0
магний хлористый (MgCl2*6H2O) 102,0 102,0
глюкоза 900,0 900,0
л-глютамин 146,2-292,3 146,2-292,3
пенициллин 50,0 50,0
стрептомицин 50,0 50,0
фенол красный 5,0 5,0
вода до 1000,0 до 1000,0
Раствор 1. В 500 мл воды, нагретой приблизительно до 80 оС, помешивая,
растворяют указанные выше количества аминокислот, после чего добавляют л-
глютамин и фенол-красный.
Раствор 2. В 100,0 мл воды растворяют неорганические соли, за
исключением двууглекислого натрия (NaHCO3), смешивают с предыдущим
раствором неорганических солей и добавляют биотин и птероилглютаминовую
кислоту (витамин В12).
Раствор 3. В 200,0 мл воды растворяют все витамины, кроме биотина и
птероилглютаминовой кислоты, и антибиотики – пенициллин и стрептомицин.
Все растворы стерилизуют фильтрованием через стеклянный фильтр-нутч
(Шотт, Иена, Германия) либо через асбестоцеллюлозные пластины Зейтца или
отечественные пластины СФ (стерилизующий фильтр) после предварительного
промывания водой, а затем – приготовленным раствором.
500 мл раствора 1 + 200 мл раствора 2 + 200 мл раствора 3 смешивают и
доводят стерильной водой до 1000,0 мл. Можно добавить 1мг инозита на1 л.
2.2.9 Получение сыворотки крови крупного рогатого скота.
14

15. В условиях относительной стерильности от клинически здоровых
животных 2-3 –летнего возраста берут кровь из яремной вены. Через
стерильный резиновый шланг кровь подается по стенке в бутыли вместимостью
10 л. В каждую бутыль берут до 5 л крови. Для полного отделения сыворотки
кровь выдерживают 48-72 часа при температуре 25 оС. Прозрачную сыворотку
отсасывают в бутыли через сифонное устройство и стерилизуют через
пластины «СФ» или ЕКS-2. Сыворотку проверяют на стерильность и ростовые
свойства. Допускается использование сыворотки без консерванта, выпускаемой
мясокомбинатами. Сыворотку хранят при температуре 4-6 оС в течение 6
месяцев. Сыворотка, имеющая хлопьевидный осадок фибрина, пригодна для
работы с культурами клеток и тканей.
2.2.10 Приготовление 0,01%-го раствора бромкрезола.
Для приготовления раствора в мерную посуду вносят 0,1 г
бромкрезолового красного и его растворяют в 100 мл 96о спирта ректификата.
Полученный раствор доводят деминерализованной водой до 1000 мл. Раствор
хранят при температуре 18-25 оС не более 1 месяца. Используют раствор для
проверки качества мойки и ополаскивания стеклянной посуды. В чистую
посуду добавляют 2-3 мл 0,01%-го раствора бромкрезола. Изменение цвета от
желтого к синему свидетельствует о низком качестве мойки (желтый-хорошая
мойка, синий-плохая).
2.2.11 Приготовление защитной среды для лиофилизации вируса.
В качестве защитной среды для вируса оспы при сублимационном
высушивании используют среду, состоящую из пептона или гидролизата
лактальбумина, сахарозы и желатина. Допускается использование в этих же
целях обезжиренного молока коров.
Защитную среду, состоящую из пептона или гидролизата лактальбумина,
сахарозы и желатина готовят следующим образом:
- для получения 12 л среды растворяют 2 кг пептона (ГОСТ 13805-76) или
столько же сухого гидролизата лактальбумина и 2 кг сахарозы (ТУ6-092293-77)
в 10 л калийфосфатного буферного раствора (52,8 г К2НРО4 и 10,9 г КН2РО4 на
10 л дистиллированной воды, используют соли предварительно
перекристализованные и высушенные), а также 0,2 кг желатина в 0,5 л
дистиллированной воды;
- растворение производят при нагревании до 70-800С и перемешивают до
полного растворения сахарозы;
- после растворения жидкости смешивают, охлаждают до комнатной
температуры и отделяют осадок в виде крупных, рыхлых серо-белых хлопьев,
пропуская раствор через ватно-марлевый фильтр;
- рН среды должен быть в пределах 6,8-7,2;
- затем среду стерилизуют фильтрацией через пластины типа ЕКS-2,
подавая жидкость на фильтр при избыточном давлении или «самотеком»,
пропускная способность одной пластины – 8 л жидкости;
- суммарные потери при фильтрации составляют 1,5-2,0 л на 12 л
первоначального объема среды. Стерилизующую фильтрацию среды проводят
в день ее изготовления.
15

16. Плотность среды после стерилизующей фильтрации должна быть не ниже
1,07 г/мл определяют с помощью ареометра (ГОСТ 18481-81Е).
Приготовленную защитную среду стерильно расфасовывают в стерильные
бутыли на 3-5-10 л, хранят при температуре 2-6 оС не более 30 суток и
используют для стабилизации вируса после получения положительных
результатов о ее стерильности.
Стерильность образцов защитной среды определяют по ГОСТ 28085.
Для приготовления защитной среды из молока берут свежее коровье
молоко, обезжиривают его сепарированием, фасуют в стеклянные колбы или
флаконы высотой столба жидкости (обрата) не выше 10 см, сосуды с
обезжиренным молоком закрывают ватно-марлевыми пробками и подвергают
двукратному автоклавированию текучим паром при 0,5 кг/см2 в течение 30 мин
с интервалом в 18-24 час.
Стерилизованное обезжиренное молоко проверяют на стерильность и
хранят до использования не более 10 сут.
2.3 Приготовление субстратов репродукции вирусов оспы.
В качестве субстрата для репродукции вируса оспы птицы используют 10-
12-суточные развивающиеся куриные эмбрионы и культуру фибробластов
развивающихся куриных эмбрионов, а для вирусов оспы овец и оспы коз –
культуру первичных клеток ПЯ, пересеваемых ТЯ-КК49 и перевиваемых линий
ПО и ТТ.
2.3.1 Приготовление развивающихся куриных эмбрионов.
Для получения развивающихся куриных эмбрионов закладывают на
инкубацию СПФ яйца кур, не имеющих трещин и загрязнений. Инкубацию яиц
проводят в течение 10-12 суток при температуре 37,5-38,00С в специальных
инкубаторах для вывода цыплят с обеспечением в камере влажности воздуха не
менее чем 60% и периодической вентиляции, а также переворачивания яиц на
полках. Для определения наличия и развития эмбрионов яйца овоскопируют на
5-7 сутки инкубации. Яйца без эмбрионов выбраковывают, а эмбрионы с
наличием кровеносных сосудов инкубируют до 10-12 суточного возраста и
используют в эти сроки для репродукции вируса или приготовления культуры
фибробластов.
2.3.2 Приготовление фибробластов куриных эмбрионов.
Для приготовления культуры фибробластов отбирают хорошо развитые
подвижные 10-11-суточные эмбрионы кур. Яйца с погибшими эмбрионами и не
оплодотворенные утилизируют. Отобранные для трипсинизации
инкубационные яйца с эмбрионами укладывают в специальные лотки пугой
вверх, двукратно, на 2-3 секунды погружают в 2%-ый раствор йодистого калия
на 960 этиловом спирте и подают в бокс.
В боксе поверхность яиц прожигают спиртом, а по окружности пуги
прожигают при помощи «устройства для электротермического вскрытия
эмбрионов птиц». Затем стерильным пинцетом снимают скорлупу, разрывают
хорион-аллантоисную оболочку (ХАО), извлекают эмбрионы и помещают их
16

17. по 50-60 или 100-120 штук в 2-х литровую колбу Эрленмейера, где трижды
отмывают рабочим раствором Хенкса (рН 7,2-7,4) с антибиотиками (по 100 ЕД
пенициллина и 100 мкг стрептомицина на 1 мл раствора). Затем эмбрионы
размельчают ножницами, заливают 0,25%-ым раствором трипсина, подогретого
до температуры 370С (в среднем по 75 мл трипсина на 8-10 куриных
эмбрионов), опускают в колбу с размельченными эмбрионами стерильный
магнитик, ставят колбу с содержимым на магнитную мешалку и проводят
трипсинизацию со средней скоростью вращения магнитика в течение 7-8 мин.
После чего суспензию клеток сливают через 4-х слойный марлевый фильтр во
флаконы. Во взвесь клеток добавляют 2-3% сыворотки крови крупного
рогатого скота и осаждают их центрифугированием при 1000 об/мин в течение
10 минут. Осадок ресуспендируют в питательной среде и диспергированные
клетки фильтруют через 4 слоя стерильной марли.
В камере Горяева под малым увеличением микроскопа (10х20)
подсчитывают концентрацию и жизнеспособность клеток в полученной
трипсинизацией суспензии.
Для выращивания монослойной культуры клеток фибробластов эмбрионов
используют суспензию, содержащую 90-95% жизнеспособных клеток. Процент
жизнеспособных клеток определяют по формуле: у = х/с ,100, где:
Х – количество жизнеспособных клеток в 1 мл суспензии (неокрашенные);
С – общее число (окрашенных и не окрашенных) клеток в 1 мл суспензии.
Для подсчета клеток пипеткой отбирают по 0,2 мл суспензии и сливают ее
в пробирку. В эту же пробирку вносят 0,8 мл краски (0,2%-ый раствор
трипанового синего на физиологическом растворе) и получают разведение
суспензии клеток в 5 раз. Содержимое пробирки тщательно перемешивают,
выдерживают 5 мин + 30 сек при температуре 37+0,50С и заполняют камеру
Горяева. Подсчитывают живые (неокрашенные клетки). Конгломераты считают
за одну клетку. Подсчет производят в 25 больших квадратах камеры.
Полученное количество клеток умножают на 5 (степень разведения суспензии
краской) и умножают на 10 000 (величина постоянная). Полученное
произведение означает общее количество клеток в 1 мл суспензии. Например, в
25 больших квадратах камеры Горяева насчитывается 100 клеток.
Следовательно, 100 х 5 х 10 000 = 5 000 000 клеток в 1 мл суспензии.
Для засева культуры клеток в матрасы вместимостью 1,5 л концентрация
клеток в суспензии должна быть 200-300 тыс. клеток в 1 мл, следовательно,
необходимо данный объем всей клеточной суспензии развести в 25 или 16 раз
питательной средой.
Для выращивания культуры клеток роллерным методом концентрация
клеток в суспензии должна быть 700-800 тыс. кл/мл.
Для получения культуры клеток, необходимой в определении числовых
значений вирусов, суспензию клеток высевают в пенициллиновые флаконы в
концентрациях 200-400 тыс. кл/мл.
Суспензию клеток разводят до необходимой концентрации питательной
средой с 5-10% сыворотки крови крупного рогатого скота. В общий объем
суспензии вносят по 1000 ЕД пенициллина и 1000 мкг стрептомицина на 1 л и
17

18. разливают суспензию по 180-200 мл в матрасы вместимостью 1,5 л или по 450-
500 мл в 5-литровые бутыли. Разлив суспензии производят в стерильном боксе
над пламенем горелки. Матрасы и бутыли плотно закрывают резиновыми
пробками. Матрасы размещают горизонтально, а бутыли – на роллерные
установки и инкубируют при температуре 37+0,50С в течение 24-48 часов.
Скорость вращения бутыли на роллерном аппарате устанавливают в пределах
10-15 оборотов в час. Через 24-48 часов все матрасы и бутыли с культурой
клеток просматривают под малым увеличением микроскопа и визуально.
Макроскопически – среда в матрасах и бутылях должна быть прозрачной.
Микроскопически – клетки должны покрывать всю поверхность стенки сосуда
сплошным слоем.
2.3.3 Приготовление первичной культуры клеток почек ягнят.
Для приготовления первичной культуры клеток ПЯ используют ягнят
доноров 1-2 месячного возраста, полученных от здоровых овцематок
благополучной по инфекционным заболеваниям отары.
Ягнят убивают, выпуская кровь из яремной вены и сонной артерии,
отделяют шкуру препарированием, вскрывают брюшную полость и открывают
доступ к почкам, раздвигая органы вскрытой полости.
Для убоя и вскрытия полости брюшины, а также других режущих
манипуляций используют остро заточный нож или скальпель.
С помощью карцанга и пинцета, не травмируя наружную оболочку, почки
освобождают от жирового слоя, фиксируют орган карцангом, захватывая
оболочку вместе с мочеточниками и сосудами, отделяют из туши, отрезая
ножом или ножницами. Почки переносят поочередно в эмалированный
металлический лоток, в который заранее наливают этиловый спирт ректификат.
Почку погружают в спирт на 2-3 секунды, захватив за сосуды, извлекают ее из
спирта и сразу же поджигают. В состоянии горения спирта почки быстро
переносят в банку с широким горлом, в которую заранее налит раствор Хенкса
с антибиотиками в дозе 200 ЕД/мл пенициллина и 200 мг/мл стрептомицина.
Банку закрывают стерильной крышкой и переносят в бокс в специальном биксе.
В боксе, строго соблюдая все правила асептики, почки переносят на
стерильный металлический с эмалированной поверхностью лоток или на чашку
Петри. Почки освобождают от наружной оболочки с помощью стерильных
ножниц, пинцетов и карцанга. Ополаскивают раствором Хенкса с
антибиотиками, удаляют ножницами корковый слой, а мозговой - помещают в
стерильную банку с широким горлом, в которой его тщательно размельчают на
мелкую гомогенную массу с размером частиц 2-4 мм. Размельченную массу
заливают раствором Хенкса (рН 7,2-7,4) с антибиотиками и прополаскивают
двух-трех кратно. Кусочки ткани почечного органа переносят в плоскодонную
колбу и заливают их 0,25%-ым раствором трипсина, подогретого до
температуры 370С (в среднем по 75 мл трипсина на тканевую массу одной
почки). В колбу с размельченными почками опускают стерильную магнитную
палочку, ставят колбу с содержимым на магнитную мешалку и проводят
трипсинизацию в течение 7-8 мин со средней скоростью вращения магнитика,
которая не допускает образования пены. По истечению времени трипсинизации
18

19. суспензию клеток сливают через 4-х слойный марлевый фильтр во флаконы.
Оставшиеся кусочки ткани почек повторно заливают раствором трипсина и
повторяют трипсинизацию в тех же режимах и продолжительности времени.
Трипсинизацию тканей повторяют трех и более кратно, до полного истощения
тканей от клеток. Во взвесь клеток добавляют 2-3% сыворотки крови крупного
рогатого скота и осаждают их центрифугированием при 1000 об/мин в течение
10 минут. Осадок ресуспендируют в питательной среде и диспергированные
клетки фильтруют через 4 слоя стерильной марли.
В камере Горяева под малым увеличением микроскопа (10х20)
подсчитывают концентрацию и жизнеспособность клеток в полученной
трипсинизацией суспензии.
Для выращивания монослойной культуры клеток почек ягнят используют
суспензию, содержащую 90-95% жизнеспособных клеток. Процент
жизнеспособных клеток определяют по формуле: у = х/с ,100, где:
х – количество жизнеспособных клеток в 1 мл суспензии (неокрашенные);
с – общее число (окрашенных и не окрашенных) клеток в 1 мл суспензии.
Для подсчета клеток пипеткой отбирают по 0,2 мл суспензии и сливают ее
в пробирку. В эту же пробирку вносят 0,8 мл краски (0,2%-ый раствор
трипанового синего на физиологическом растворе) и получают разведение
суспензии клеток в 5 раз. Содержимое пробирки тщательно перемешивают,
выдерживают 5 мин + 30 сек при температуре 37+0,50С и заполняют камеру
Горяева. Подсчитывают живые (неокрашенные клетки). Конгломераты считают
за одну клетку. Подсчет производят в 25 больших квадратах камеры.
Полученное количество клеток умножают на 5 (степень разведения суспензии
краской) и умножают на 10 000 (величина постоянная). Полученное
произведение означает общее количество клеток в 1 мл суспензии. Например, в
25 больших квадратах камеры Горяева насчитывается 100 клеток.
Следовательно, 100 х 5 х 10 000 = 5 000 000 клеток в 1 мл суспензии.
Для засева культуры клеток в матрасы вместимостью 1,5 л концентрация
клеток в суспензии должна быть 200-300 тыс. клеток в 1 мл, следовательно,
необходимо данный объем всей клеточной суспензии развести в 25 или 16 раз
питательной средой.
Для выращивания культуры клеток роллерным методом концентрация
клеток в суспензии должна быть 700-800 тыс. кл/мл.
Для получения культуры клеток, необходимой в определении числовых
значений вирусов, суспензию клеток высевают в пенициллиновые флаконы в
концентрациях 200-400 тыс. кл/мл.
Суспензию клеток разводят до необходимой концентрации питательной
средой с 5-10% сыворотки крови крупного рогатого скота. В общий объем
суспензии вносят по 1000 ЕД пенициллина и 1000 мкг стрептомицина на 1 л и
разливают суспензию по 180-200 мл в матрасы вместимостью 1,5 л или по 450-
500 мл в 5-литровые бутыли и по 1,0 мл в пенициллиновые флаконы. Разлив
суспензии производят в стерильном боксе над пламенем горелки. Матрасы и
бутыли плотно закрывают резиновыми пробками. Матрасы и пенициллиновые
флаконы размещают горизонтально, а бутыли – горизонтально в роллерные
19

20. аппараты и инкубируют при температуре 37+0,50С в течение 24-72 часов.
Скорость вращения бутыли в роллерном аппарате устанавливают в пределах
10-15 оборотов в час. Через каждые 24 часа все матрасы и бутыли с культурой
клеток просматривают визуально и под малым увеличением микроскопа.
Макроскопически – среда в матрасах и бутылях должна быть прозрачной.
Микроскопически – клетки должны покрывать всю поверхность стенки сосуда
сплошным слоем.
2.3.4 Приготовление пересеваемых клеток ТЯ-КК49.
Культуру клеток ТЯ-КК49 поддерживают непрерывными пассажами или в
замороженном состоянии в жидком азоте при температуре минус 196 оС.
Для сохранения клеток в жидком азоте клетки концентрируют до
концентрации 5х106 кл./см3, помещают в специальную защитную среду,
состоящую из диметилсульфоксида – 20%, питательной среды ИГЛА – 60% и
сыворотки крови крупного рогатого скота (фетальной или телячьей) – 20%, и
разливают в ампулы по 5 см3. Ампулы с клетками закрывают специальными
крышками или запаивают. Ампулы с клетками замораживают, вначале до
температуры минус 70 оС со скоростью охлаждения 1 оС/мин, а затем переносят
в жидкий азот в специальных металлических стаканах. Замороженные таким
образом клетки в ампулах или пробирках хранят в течение нескольких лет,
постоянно пополняя жидким азотом камеру сосуда Дъюара, где содержатся
ампулы с клетками.
Для приготовления монослойной культуры клеток, суспензию клеток в
ампулах, хранящуюся в жидком азоте, вынимают и размораживают, помещая в
воду с температурой 40 оС. Ампулу асептически вскрывают, содержимое
переносят в матрас с питательной средой, подсчитывают количество
жизнеспособных клеток, и помещают для культивирования в термостат с
температурой нагрева 37-38 оС. Количество жизнеспособных клеток должно
быть не менее 80%. Для восстановления исходных цитологических свойств
культуры клеток проводят 2-3 освежающих пассажа. В связи с этим посеянные
клетки выдерживают до образования монослоя на поверхности матраса, затем
ее пересевают двукратным индексом и дожидаются образования полной
монослойной культуры клеток. В следующей генерации культуру клеток
пересевают четырех кратным индексом, и после получения монослоя, культуру
клеток используют для производства и репродукции вируса.
Для поддержания клеток в растущем состоянии их культивируют в
матрасах при температуре 37-38 оС с индексом пересева 6-8, высевая в каждой
генерации по 100 тыс. кл./см3. Такая методика дает возможность более
длительному образованию монослоя и сравнительно длительному сохранению
клеток без пересева. Для культивирования клеток ТЯ-КК49 используют
питательную среду ИГЛА-МЕМ с содержанием 10% сыворотки крови крупного
рогатого скота и температуру инкубации 37-38 оС. Культуру клеток
поддерживают в той же среде, но с содержанием 5% и менее сыворотки крови
того же вида животного.
20

21. Клетки ТЯ-КК49 выращивают в матрасах и круговых сосудах различной
емкости, биологических пробирках и пенициллиновых флаконах. Культуру
клеток, выращенную в пробирках и пенициллиновых флаконах, используют для
первичного выделения вируса из патологических материалов, титрования
вируса и постановки реакции нейтрализации, а культуру клеток, выращенную в
матрасах и сосудах – для продукции биологической массы вируса.
2.3.5 Приготовление перевиваемых клеток ПО и ТТ.
Культуру клеток линий ПО и ТТ поддерживают также как и культуру
клеток ТЯ-КК49 непрерывными пассажами или в замороженном состоянии в
жидком азоте при температуре минус 196 оС. Методики их приготовления,
хранения и поддержания такая же, как и при использовании пересеваемых
клеток ТЯ-КК49 (п.п.2.3.4).
2.4 Подбор и подготовка экспериментальных животных.
Работы по выделению, идентификации и установлению биологических
свойств вирусов оспы животных и птицы требуют использования
экспериментальных животных и птицы. Такие животные и птица должны
отвечать требованиям, которые предусматривают использования животных и
птицы, свободных от возбудителей инфекционных заболеваний, имеющих
упитанность не ниже средней и интактных (не иммунных против оспы) от
возбудителей оспы и не содержащих в организме специфических антител
против вирусов оспы.
В экспериментальных работах с вирусом оспы овец используются овцы
различного возраста, а вирусом оспы коз – козы, также различного возраста.
Предпочтителен возраст этих животных от 6 месяцев до 2-х лет. Для работы с
вирусом оспы птицы используются молодые куры в возрасте 2-5 месяцев.
2.5 Выделение, идентификация и культивирование вирусов оспы.
2.5.1 Выделение, идентификация и культивирование вируса оспы овец.
Для выделения вируса оспы овец используют патологический материал,
собранный от больных и павших овец с клиническими признаками,
характерными для оспенной болезни. Такими признаками являются узелковые
поражения кожи, которые проявляются в виде розеолы, папулы, пустулы и
везикулы. Узелковые образования или экссудативное содержимое папул
собирают в стерильную посуду, доставляют в лабораторию и подвергают
двукратному замораживанию и размораживанию при температурных значениях
минус 40оС и плюс 20-25 оС. Из узелковых образований кожи готовят 20%
суспензию на растворе Хенкса или физиологическом растворе натрия хлорида,
растирая в фарфоровой ступке с песком нейтрального стекла. Гомогенат
очищают от грубых частиц центрифугированием при 3000 g в течение 30 мин.
В надосадочную жидкость добавляют антибиотики в дозе 200 ЕД/см3
пенициллина, 200 мг/см3 стрептомицина и 50 мг/см3 нистатина, выдерживают
при температуре 4-8 оС в течение 6 ч и затем используют для выделения вируса
21

22. заражением соответствующей чувствительной биологической модели. Такими
объектами для выделения вируса оспы овец служат овцы, подобранные
согласно требованиям п.п. 2.4., культура клеток ПЯ, ТЯ-КК49, ПО и ТТ.
При использовании для биологической пробы овец, суспензию
испытуемого патологического материала вводят этим животным внутрикожно в
бесшерстный участок кожи в дозе 0,5 см3. За зараженными животными ведут
клиническое наблюдение в течение не менее 17 суток с ежедневным
измерением температуры тела. В случае наличия вируса оспы овец у
зараженных животных через 3-7 суток проявляется гипертермия и кожные
поражения в виде папулезно-пустулезных образований в месте инокуляции
исследуемого патологического материала. Через 3-5 суток после проявления
гипертермии и кожных поражений в месте введения патологического
материала, в различных участках тела образуются вторичные кожные оспенные
узелки, которые свидетельствуют о генерализации оспенного процесса. В
качестве источника вируса служат оспенные узелки кожи, в которых обычно
накапливается вирус в титре до 106,5 ИД50/0,5см3.
При использовании для выделения вируса культуры клеток, суспензию
испытуемого патологического материала вводят на монослой клеток в
пробирках или пенициллиновых флаконах в дозе 0,1 см3. Зараженные клетки
выдерживают при температуре 37-38 оС в течение 60 мин, затем инокулят
сливают, монослой несколько кратно промывают раствором Хенкса,
содержащим антибиотики, вносят поддерживающую среду и культивируют при
температуре 37-38 оС в течение 10-12 суток. В течение указанного срока
ежедневно проводят микроскопию монослоя с целью выявления признаков
наличия оспенного вируса. О присутствии вируса свидетельствует
цитопатогенное действие, которое проявляется в монослое клеток с 4-7 суток
после инокуляции суспензии испытуемого патологического материала.
Цитопатогенное действие характеризуется округлением клеток,
формированием ими гроздевидных образований в монослое, в последующем -
разрывов между клетками, приводящих к полной деструкции монослоя клеток.
Цитопатогенное действие вируса оспы овец примерно одинаково
проявляется во всех чувствительных культурах клеток и накапливается в них от
105,0 до 107,5 ТЦД50/см3.
В случае отсутствия цитопатогенного действия вируса культуру клеток в
пробирках или флаконах подвергают двукратному замораживанию и
размораживанию, полученную культуральную суспензию вносят на монослой
свежей аналогичного вида культуры клеток. Также как и при заражении
патологическим материалом, свежую культуру клеток, инокулированную
исследуемой культуральной суспензией, выдерживают при температуре 37-38
о
С в течение 60 минут, инокулят заменяют на поддерживающую питательную
среду и продолжают культивирование при той же температуре до проявления
цитопатогенного действия. В случае отсутствия ЦПД и на втором пассаже
проводят аналогическим образом третий пассаж. Отсутствие ЦПД на третьем
«слепом» пассаже принимают за отсутствие репродуктивного вируса в
исследуемом образце патологического материала. При наличии
22

23. цитопатогенного действия, в каком либо пассаже, считают вирус выделенным и
проводят его идентификацию.
Идентификацию выделенного вируса проводят с помощью реакции
нейтрализации, поставленной на животных или в культуре клеток. Для этого
выделенный вирус в титре 1000 ИД50 в равных объемных соотношениях
смешивают со специфической на вирус оспы овец сывороткой, полученную
смесь выдерживают в течение 60 минут при температуре 37-38 оС и ею
инокулируют одну из культур клеток чувствительных к вирусу оспы овец или
овец, не иммунных к оспе. Параллельно вирусом в указанной дозе, но без
добавления сыворотки заражают культуру клеток и овец. За зараженной и
контрольной культурами клеток и овцами ведут ежедневное наблюдение,
выявляя цитопатогенное действие или кожные узелковые поражения.
Наблюдение за монослоем зараженной культуры клеток продолжают в течение
12 суток, а за овцами – 14 суток.
Вирус считают идентифицированным как вирус оспы овец в случае
отсутствия ЦПД в культуре клеток и оспенных узелков у животных,
зараженных смесью испытуемого вируса со специфической сывороткой на
вирус оспы овец, при развитии ЦПД в культуре клеток и оспенных узелков у
овец, инфицированных испытуемым вирусом без добавления специфической
сыворотки на вирус оспы овец.
Культивирование вируса оспы овец, в зависимости от его биологических
свойств и предназначения, проводят в организме овец и чувствительной
культуре клеток. Патогенные штаммы вируса оспы овец культивируют в
организме молодых интактных овец, а модифицированные - в одной из
чувствительных культур клеток.
Вирулентные штаммы вируса оспы овец, предназначенные для проверки
иммуногенности вакцинных препаратов, культивируют в организме овцы. Для
этого, вирус вводят овцам внутрикожно в дозе 0,5 см3 и наблюдают за
развитием кожного оспенного поражения. На 5-6 сутки на месте введения
возбудителя формируется отечность с покраснением, который в последующем
приобретает темно-красную окраску. За день до появления отека кожи у овцы
повышается температура тела. Для получения биомассы вирулентного вируса
на 6-7 сутки, в зависимости от развития местного воспаления и температуры
тела, животное убивают, участок воспаленной кожи срезают, которую очищают
от механических примесей, дезинфицируют этиловым спиртом и подвергают
гомогенизации растиранием в ступке в смеси с песком нейтрального стекла.
Гомогенат разводят до 20% физиологическим раствором хлорида натрия с рН
7,2-7,4, центрифугируют при 3000 g в течение 30 минут, осадок удаляют, а
оставшуюся жидкость используют в качестве вируссодержащего материала.
Модифицированные штаммы вируса, предназначенные для приготовления
живых вакцин культивируют в культуре первичных клеток, полученных из
почечной и тестикулярной клеток ягнят, а штамм «КазНИВИ» - в пересеваемой
культуре клеток ТЯ-КК49 и линии ПО. Для этого готовят монослойную
культуру клеток соответствующего вида, высевая клетки в концентрации 200-
300 тыс. клеток/см3 в матрасы и 600-800 тыс. клеток/см3 - в круговые сосуды,
23