Download luận văn thạc sĩ ngành hóa phân tích với đề tài: Xác định cấu trúc của polysaccharide dạng agar chiết từ một số loài rong Đỏ, cho các bạn làm luận văn tham khảo Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620 Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://baocaothuctap.net

1. BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Bùi Thị Mỹ Trâm
XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE
DẠNG AGAR CHIẾT TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG ĐỎ
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Nha Trang - 2019

2. BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Bùi Thị Mỹ Trâm
XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE
DẠNG AGAR CHIẾT TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG ĐỎ
Chuyên ngành: Hóa Phân Tích
Mã số: 8440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
Hướng dẫn 1 Hướng dẫn 2
PGS. TS. Trần Thị Thanh Vân PGS. TS. Thành Thị Thu Thủy
Nha Trang – 2019

3. LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sĩ: “ Xác định cấu trúc của
polysaccharide dạng agar chiết từ một số loài rong Đỏ” là do tôi thực hiện với
sự hướng dẫn của PGS. TS Trần Thị Thanh Vân - Viện Nghiên cứu và Ứng
dụng Công nghệ Nha Trang và PGS. TS Thành Thị Thu Thủy – Viện Hóa
học. Đây không phải là bảng sao chép của bất kỳ một cá nhân, tổ chức nào.
Các kết quả thực nghiệm, số liệu, nguồn thông tin trong luận văn là do chúng
tôi tiến hành, trích dẫn, tính toán và đánh giá. Tôi xin hoàn toàn chịu trách
nhiệm về những nội dung mà tôi đã trình bày trong luận văn này.
Nha Trang, ngày 29 tháng 9 năm 2019
HỌC VIÊN
Bùi Thị Mỹ Trâm

4. LỜI CẢM ƠN
Hoàn thành luận văn “Xác định cấu trúc của polysaccharide dạng agar
chiết từ một số loài rong Đỏ”. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô
PGS.TS-Trần Thị Thanh Vân – Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ
Nha Trang và Cô PGS. TS – Thành Thị Thu Thủy – Viện Hóa học Việt Nam
đã hết lòng truyền đạt kiến thức khoa học và kinh nghiệm, hướng dẫn, giúp đỡ
và tạo mọi điều kiện cho tôi trên con đường nghiên cứu khoa học.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các cán bộ phòng Hóa
phân tích và Triển khai công nghệ - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công
nghệ Nha Trang đã giúp đỡ về cơ sở vật chất, thiết bị, dụng cụ thí nghiệm,
kiến thức thực nghiệm để tôi hoàn thành tốt đề tài của mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Học viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam, Ban Chủ nhiệm Khoa Hóa học và Phòng đào tạo đã giảng
dạy và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn và hoàn thành
mọi thủ tục cần thiết. Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn các bạn học cùng lớp
cao học đã luôn đồng hành với tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Xin cảm ơn gia đình, người thân, đặc biệt là các bạn đồng nghiệp đã
luôn ủng hộ, chia sẻ những khó khăn với tôi trong cuộc sống và trong công
việc.
Và cuối cùng, xin cảm ơn Sở Giáo dục và Đào tạo Khánh Hòa, trường
THPT Lý Tự Trọng - Nha Trang đã tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành
khóa học sau đại học tại Viện Hóa học này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, ngày 29 tháng 9 năm 2019
Bùi Thị Mỹ Trâm

5. 1
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................
MỤC LỤC.................................................................................................1
DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................4
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ...................................................6
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................. 10
1.1. RONG ĐỎ ...................................................................................10
1.1.1. Giới thiệu và phân loại rong Đỏ ...........................................10
1.1.2. Giới thiệu một số loài rong Đỏ ở Việt Nam: Gracilaria
Heteroclada và Gracilaria Salicornia...........................................12
1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ POLYSACCHARIDE DẠNG AGAR
.............................................................................................................15
1.2.1. Nguồn gốc, tính chất gel và ứng dụng.................................. 15
1.2.2. Đặc điểm cấu trúc .................................................................20
1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA
POLYSACCHARIDE ........................................................................22
1.3.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) .......................................24
1.3.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)..............25
1.3.3. Phương pháp phổ hai chiều HSQC, HMBC, COSY ............29
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU AGAR TRONG NƯỚC VÀ TRÊN
THẾ GIỚI ...........................................................................................30
1.4.1. Tình hình nghiên cứu agar trên thế giới ............................... 30
1.4.2. Tình hình nghiên cứu agar trong nước .................................37
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....39
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.....................................................39
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................................41
2.2.1. Phương pháp tách chiết polysaccharide dạng agar...............41

6. 2
2.2.2. Phương pháp xác định thành phần hóa học của
polysaccharide dạng agar................................................................ 42
2.2.2.1. Xác định hàm lượng Carbohidrate................................ 42
2.2.2.2. Xác định hàm lượng 3,6-anhydro-L-galactopyranose .. 42
2.2.2.3. Xác định độ ẩm của rong...............................................43
2.2.2.4. Xác định hàm lượng sulfate...........................................43
2.2.2.5. Xác định hàm lượng Agarose ........................................43
2.2.3. Phương pháp phân tích cấu trúc polysaccharide dạng agar .44
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................45
3.1. CHIẾT POLYSACCHARIDE VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN
HÓA HỌC CHÍNH.............................................................................45
3.1.1. Kết quả của việc chiết polysaccharide và phân tích thành
phần hóa học ...................................................................................45
3.1.2. Kết quả của tính chất gel.......................................................51
3.2. PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE TỪ 02
LOÀI RONG GRACILARIA SALICORNIA VÀ GRACILARIA
HETEROCLADA.................................................................................54
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..........................................81
4.1. KẾT LUẬN..................................................................................81
4.2. KIẾN NGHỊ.................................................................................82
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................83

7. 3
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
A : [→4)3,6-anhydro-α-L-galactose (1→]
A’ : [→4)2-O-Me-3,6-anhydro-α-L-galactose (1→]
AOAC : Association of Official Analytical Chemists
( Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống)
COSY : Corelation Spectroscopy
(phổ tương tác proton)
DEAE-C : Diethylaminoethyl cellulose
DG : β – D-galactose
DG6M : 6-O-Me-β-D-galactose
DMSO : Dimethyl sulfoxit (CH3)2SO
DSS : Acid 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic
FTIR : Fourier Transform Infrared spectroscopy
( quang phổ hồng ngoại biến đổi)
G : [→3) β-D-galactose (1→]
G’ : [→3)6-O-Me-β-D-galactose (1→]
HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation
(phổ tương tác dị nhân qua nhiều liên kết)
HSQC : Heteronuclear Single Quantum Correlation
(phổ tương tác dị nhân qua một liên kết)
LA : 3,6-anhydro-α-L-galactose
Me : Methyl
NMR : Nuclear Magnetic Resonance
( phổ cộng hưởng từ hạt nhân)
NOESY : Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy
( phổ hiệu ứng hạt nhân )
TMS : Tetramethylsilane (Si(CH3)4)
UV-VIS : Ultraviolet and Visible
( phổ tử ngoại và khả kiến)
2OMeA’ : nhóm methyl của 2-O-Me-3,6-anhydro-α-L-galactose
6OMeG’ : nhóm methyl của 6-O-Me-β-D-galactose

8. 4
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Số liệu từ quá trình chiết tách polysaccharide .......................45
Bảng 3.2. Giá trị mật độ quang tương ứng với nồng độ fructozo ..........47
Bảng 3.3. Thành phần hóa học của polysaccharide chiết từ loài rong Đỏ
Gracilaria Heteroclada và rong Gracilaria Salicornia.........................49
Bảng 3.4. Bảng thông số thể hiện khả năng tạo gel của hai loài rong
Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia.................................. 52
Bảng 3.5. Một số dao động đặc trưng của các nhóm nguyên tử và các
liên kết trong agar ..................................................................................54
Bảng 3.6. Một số số sóng đặc trưng trong phổ trong phổ hồng ngoại (IR)
của 02 mẫu agar chiết từ 02 loài rong Gracilaria Heteroclada và
Gracilaria Salicornia..............................................................................56
Bảng 3.7. Tỉ lệ các cường độ hấp thụ của các cặp tần số .......................57
Bảng 3.8. Tỉ lệ các cường độ hấp thụ của cặp tần số 930/2920 .............58
Bảng 3.9. Các dạng cấu trúc agar ...........................................................60
Bảng 3.10. Kết quả phân tích phổ 13
C NMR của polysaccharide chiết từ
loài rong Gracilaria Salicornia .............................................................. 61
Bảng 3.11. Kết quả phân tích phổ 1
H NMR của agar chiết có xử lý kiềm
từ rong Gracilaria Salicornia.................................................................62
Bảng 3.12. Tín hiệu phổ COSY của agar chiết có xử lý kiềm từ rong
Gracilaria Salicornia..............................................................................65
Bảng 3.13. Tín hiệu phổ HSQC của agar chiết kiềm từ rong Gracilaria
Salicornia................................................................................................ 65
Bảng 3.14. Tín hiệu phổ HMBC của agar chiết có xử lý kiềm từ rong
Gracilaria Salicornia..............................................................................66
Bảng 3.15. Kết quả phân tích phổ 13
C NMR của polysaccharide chiết từ
loài rong Gracilaria Heteroclada...........................................................71
Bảng 3.16. Kết quả phân tích phổ 1
H NMR của agar chiết có xử lý kiềm
từ rong Gracilaria Heteroclada.............................................................. 73

9. 5
Bảng 3.17. Tín hiệu phổ COSY của agar chiết có xử lý kiềm từ rong
Gracilaria Heteroclada ..........................................................................76
Bảng 3.18. Tín hiệu phổ HSQC của agar chiết kiềm từ rong Gracilaria
Heteroclada............................................................................................. 77
Bảng 3.19. Tín hiệu phổ HMBC của agar chiết có xử lý kiềm từ rong
Gracilaria Heteroclada ..........................................................................79

10. 6
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Biểu đồ so sánh các ngành rong trên Thế giới .......................10
Hình 1.2. Hình ảnh của rong Gracilaria Heteroclada ...........................13
Hình 1.3. Hình ảnh của rong Gracilaria Salicornia............................... 14
Hình 1.4. Cơ chế geling của agar ...........................................................18
Hình 1.5. Cấu trúc phân tử của Agarose ................................................21
Hình 1.6. Cấu trúc của phân tử Agaropectin .........................................22
Hình 2.1. Đầm Cù Mông – Xuân Đài – Phú Yên...................................39
Hình 2.2. Hình ảnh bản đồ Hòn Chồng – Nha Trang – Khánh Hòa ......39
Hình 2.3. Sơ đồ sơ chế rong và lưu giữ mẫu ..........................................40
Hình 2.4. Quy trình chiết tách agar cơ bản ............................................41
Hình 3.1. Hình ảnh nấu chiết agar từ rong Đỏ tại phòng thí nghiệm Hóa
phân tích – Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang .......45
Hình 3.2. Biểu đồ so sánh hàm lượng agar chiết theo phương pháp tự
nhiên và chiết xử lý kiềm của hai loài rong Gracilaria Heteroclada và
Gracilaria Salicornia..............................................................................46
Hình 3.3. Sự thay đổi màu sắc theo thời gian đun nóng - nước bắt đầu
đạt nhiệt độ 80o
C.....................................................................................48
Hình 3.4. Sự thay đổi màu sắc theo thời gian đun nóng – nhiệt độ cố
định 80o
C sau 5 phút...............................................................................48
Hình 3.5. Sự thay đổi màu sắc theo thời gian đun nóng – nhiệt độ cố
định 80o
C sau 10 phút.............................................................................48
Hình 3.6. Đồ thị đường chuẩn Nồng độ (µmol/mL) – Mật độ quang....47
Hình 3.7. Phản ứng chuyển hóa của porphyran sang agarose ..............50
Hình 3.8. Biểu đồ so sánh hiệu suất chiết agarose theo phương pháp tự
nhiên và chiết xử lý kiềm của hai loài rong Gracilaria Heteroclada và
Gracilaria Salicornia..............................................................................51
Hình 3.9. Biểu đồ so sánh sức đông của agar chiết theo phương pháp tự
nhiên và chiết xử lý kiềm của hai loài rong Gracilaria Heteroclada và
Gracilaria Salicornia..............................................................................52

11. 7
Hình 3.10. Phổ IR của agar từ Gracilaria Heteroclada.........................55
Hình 3.11. Phổ IR của agar từ Gracilaria Salicornia ............................ 56
Hình 3.12. Phổ 13
C NMR của rong Gracilaria Salicornia.....................61
Hình 3.13. Phổ 1
H NMR của agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria
Salicornia................................................................................................ 62
Hình 3.14. Phổ HSQC của agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria
Salicornia................................................................................................ 63
Hình 3.15. Phổ COSY của agar có xử lý kiềm từ rong Gracilaria
Salicornia................................................................................................ 64
Hình 3.16. Phổ 0 của agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria
Salicornia................................................................................................ 67
Hình 3.17. Cấu trúc phân đoạn agarose .................................................68
Hình 3.18. Phổ 13
C NMR của rong Gracilaria heteroclada ....................69
Hình 3.19. Phổ 13
C NMR mở rộng của rong Gracilaria Heteroclada...70
Hình 3.20. Phổ 1
H NMR của agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria
Heteroclada............................................................................................. 72
Hình 3.21. Phổ 1
H NMR mở rộng của agar chiết có xử lý kiềm từ rong
Gracilaria Heteroclada ..........................................................................72
Hình 3.22. Phổ HSQC của agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria
Heteroclada............................................................................................. 74
Hình 3.23. Phổ HSQC mở rộng của agar chiết có xử lý kiềm từ rong
Gracilaria Heteroclada ..........................................................................75
Hình 3.24. Phổ COSY của agar có xử lý kiềm từ rong Gracilaria
Heteroclada............................................................................................. 76
Hình 3.25. Phổ HMBC của agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria
Heteroclada............................................................................................. 78
Hình 3.26. Cấu trúc phân đoạn agarose .................................................80
Hình 3.27. Cấu trúc phân đoạn agaropectin ..........................................80

12. 8
MỞ ĐẦU
Rong biển là nguồn các hoạt chất sinh học bao gồm carotenoid, các acid
béo, vitamin, muối khoáng ….[1]. Trong số các hoạt chất sinh học trên thì
polysaccharide là chất thu hút các nhà nghiên cứu và nhà sản xuất thực phẩm
chức năng nhất do có cấu trúc đa dạng và hoạt tính sinh học phong phú.
Polysaccharide dạng agar được tách chiết từ các loài rong thuộc ngành
rong Đỏ (Agarophyte). Nhờ khả năng tạo gel đặc biệt và hoạt tính oxi hóa cao
mà nó được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực công nghệ chế biến thực
phẩm, nông nghiệp, y dược và công nghệ sinh học.
Nguyên liệu chủ yếu để chế biến agar trên thế giới là các loài rong thuộc
họ Gracilariales (Gracilaria và Hydropuntia) chiếm 60% sản lượng nguyên
liệu và họ Gelidiales (Gelidium và Pterocladia) chiếm 40% sản lượng nguyên
liệu [2]. Đã có nhiều công trình công bố về cấu trúc và hoạt tính sinh học của
một số loài rong Agarophytes tại các vùng biển khác nhau trên thế giới. Kết
quả cho thấy tùy theo loài và vị trí địa lý nơi rong sinh sống mà cấu trúc hóa
học, tính chất gel và hoạt tính sinh học của polysaccharide chiết từ các loài
rong là rất khác nhau. Tuy nhiên hầu như tất cả các polysaccharide dạng agar
đều thể hiện một số hoạt tính sinh học như kháng u, kháng khuẩn và chống
oxi hóa [3], [4], [5], [6].
Vùng biển nước ta có nguồn tài nguyên rong biển Agarophytes hết sức
phong phú. Chúng gồm tất cả các loài rong thuộc chi Gracilaria và một vài
loài thuộc chi Hydropuntia và Gelidiella. Đặc điểm hóa học, tính chất gel và
hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các polysaccharide chiết từ các loài rong
thuộc chi Hydropuntia , Gracilaria và Gelidiella đã được công bố [7], [8]
[9]. Tuy nhiên chưa có công trình nghiên cứu về polysaccharide từ rong
Gracilaria Heteroclada (rong câu cước) và Gracilaria Salicornia, mặc dù
đây là các loài rong phân bố rộng rãi ở vùng biển miền Trung và đã được dân
ven biển thương mại hóa để làm thực phẩm với các hình thức khác nhau.
Do vậy chúng tôi chọn đề tài “ Xác định cấu trúc của polysaccharide dạng
agar từ một số loài rong Đỏ”, với mục tiêu nghiên cứu chiết tách, xác định
đặc trưng cấu trúc, và hơn thế nữa là để góp phần định hướng cho việc sử

13. 9
dụng trong công nghiệp với những điều kiện như thế nào để đạt được hiệu quả
cao nhất từ 02 loài rong Gracilaria Heteroclada, và rong Gracilaria
Salicornia từ quá trình khảo sát tính chất gel của polysaccharide chiết tách từ
loài rong này.
Để đạt được mục tiêu nghiên cứu đặt ra, chúng tôi đặt ra các nội dung
nghiên cứu cụ thể là:
1. Thu thập và định danh rong Đỏ Gracilaria Salicornia và Gracilaria
Heteroclada.
2. Chiết tách, tinh chế polysaccharide từ các loài rong này.
3. Nghiên cứu đặc trưng cấu trúc của polysaccharide thu được.
4. Khảo sát tính chất gel của polysaccharide thu được.

14. 10
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. RONG ĐỎ
1.1.1. Giới thiệu và phân loại rong Đỏ
Rong biển là một nhóm thực vật thủy sinh bậc thấp, có kích thước và
hình dạng rất phong phú. Chúng còn được gọi là seaweed, marine algae hay
marine plant. Rong biển sống thành quần thể ở biển hoặc vùng nước lợ ven
biển, mọc trên các rạn san hô hoặc trên các vách đá, hoặc có thể mọc dưới
tầng nước sâu với điều kiện có ánh sáng mặt trời chiếu tới để quang hợp. Rất
đặc biệt so với nhóm thực vật bậc cao, toàn bộ cơ thể của rong có chung một
chức năng tự dưỡng, có khả năng quang hợp, hô hấp, trao đổi khí và hấp thụ
chất dinh dưỡng từ môi trường. Các bộ phận của rong biển như lá, thân và rễ
giả của chúng chưa có chức năng riêng biệt, ví dụ như rễ chỉ là một bộ phận tế
bào có nhiệm vụ đính cơ thể rong với vật bám, không hút được chất dinh
dưỡng ở vật bám, thân và lá có cùng chức năng tự dưỡng. Quá trình phát sinh
không có giai đoạn phôi thai mà chỉ có hợp tử, hợp tử có khả năng phát triển
độc lập với cơ thể mẹ [10]. Nhờ có chất diệp lục, rong biển thu nhận nguồn
năng lượng từ ánh sáng mặt trời, carbon dioxide (CO2) và nước (H2O) để tổng
hợp các chất hữu cơ thông qua quá trình quang hợp. Do có sinh khối lớn nên
rong biển đã tạo ra nguồn vật chất dồi dào cho hệ sinh thái biển và lượng lớn
oxygen cho sự hô hấp của con người và động vật trên cạn.
Qua quá trình nghiên cứu, các nhà thực vật học đã chia giới thực vật
này ra thành những bậc phân loại cơ bản sau: ngành, lớp, bộ, họ, chi, loài.
Trong tiến trình phát triển, phân loại học thực vật nói chung và phân loại rong
nói riêng liên tục được cải tiến để ngày càng hoàn thiện hơn các phương pháp
nghiên cứu và hoàn thiện dần các hệ thống phân loại [11].
Hình 1.1. Biểu đồ so sánh các ngành rong trên Thế giới

15. 11
Có nhiều quan điểm khác nhau về cách phân loại rong biển. Tùy thuộc
vào thành phần cấu tạo, thành phần sắc tố, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh
sản mà rong biển được chia thành nhiều ngành khác nhau. Trong đó, ba ngành
rong chính có giá trị kinh tế cao là rong Lục (Chlorophyta), rong Nâu
(Phaeophyta) và rong Đỏ (Rhodophyta) [10].
Rong Đỏ có mặt ở hầu hết các đại dương nhưng chỉ tập trung ở các
vùng biển ấm nhiệt đới. Rong Đỏ khi tươi thường có màu hồng lục, hồng tím,
hồng nâu, do có chứa các sắc tố phycoerythrin và phycocyanin, chlorophyll,
β-carotene và một số xanthophyll. Mức độ màu sắc của rong phụ thuộc vào sự
phối hợp về tỷ lệ và thành phần giữa các sắc tố này. Điểm khác biệt với hầu
hết các loài rong khác là rong Đỏ có sắc tố phycobilin gồm hai sắc tố
phycoerythrin và phycocyanin. Thường phycoerythrin chiếm ưu thế hơn
phycocyanin ở hầu hết các loài. Rong Đỏ thường có màu sắc rực rỡ ở những
loài sống ở vùng dưới triều hoặc ở vùng bị che bóng. Ngay trong một loài,
theo chiều phân bố thẳng đứng, rong cũng thay đổi màu tùy theo chất lượng
ánh sáng tới chúng [12]. Khi khô tùy theo phương pháp chế biến, rong chuyển
sang màu nâu hay nâu vàng đến vàng [13].
Ngành rong Đỏ có khoảng 2.500 loài, gồm 400 chi thuộc nhiều họ khác
nhau, phần lớn chúng được cấu tạo từ nhiều tế bào, còn lại được cấu tạo bởi
dạng một tế bào hay quần thể. Phần lớn rong Đỏ sống ở biển sâu, nơi có thủy
triều thấp [10], [13].
Trên thế giới, rong Đỏ được sử dụng với khối lượng lớn để phục vụ
cuộc sống con người tùy vào thành phần mà nó cung cấp. Cụ thể, một số loài
có hàm lượng cao về agar, carrageenan, furcellaran được sử dụng để chế biến
keo rong biển. Các loài rong Đỏ được chia thành các nhóm chính [13]:
- Nhóm rong cho agar (Agarophite): Bao gồm các chi như Gelidium,
Gracilaria, Gelidiella, ...
- Nhóm rong cho carrageenan (Carrageenophite): Bao gồm các chi như
Gigartina, Eucheuma, Chondrus, Iridaea...
Ngoài ra, còn có nhóm rong furcellaran (Gelan): điển hình của nhóm
này là Furcellaria.

16. 12
Tại Việt Nam, có khoảng 827 loài rong biển đã được báo cáo, trong đó,
ngành rong Đỏ Rhodophyta chiếm số loài cao nhất (412 loài), tiếp theo là
rong Lục (180 loài), rong Nâu Phaeophyceae (147 loài) và cuối cùng là vi tảo
Cyanobacteria (88 loài). Số loài này ít hơn so với Philippines (1011 loài),
nhưng nhiều hơn so với Đài Loan (288 loài), Thái Lan (182 loài) và Malaysia
(241 loài) [14].
Các loài rong Đỏ chứa agar hiện có ở Việt Nam khoảng 51 loài. Chúng
thuộc các chi Gracilaria (12 loài), Gracilariopsis (2 loài), Hydropuntia (6
loài), Gelidium (9 loài), Gelidiella (5 loài), Pterocladia (4 loài), Hypnea (13
loài) ... Trong đó, nhiều loài có tiềm năng khai thác và nuôi trồng [15].
Các tỉnh thuộc khu vực miền Trung Việt Nam như Quảng Ngãi, Bình
Định, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận ... có bờ biển dài với đa dạng các
kiểu thủy vực như đầm, phá, cửa sông, vũng, vịnh và các loài nền đáy khác
nhau như nền đáy cát, sỏi, đá tảng, san hô chết ... rất thuận lợi cho các loài
rong sinh trưởng và phát triển, đặc biệt là các loài rong Đỏ [14].
1.1.2. Giới thiệu một số loài rong Đỏ ở Việt Nam: Gracilaria
Heteroclada và Gracilaria Salicornia
Cả hai loại rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia đều
thuộc chi rong Câu – Gracilaria, họ Gracilariaceae, bộ Gracilariales, lớp
Florideophyceae, ngành rong Đỏ - Rhodophyta. Hai loại rong này được đánh
giá là có giá trị kinh tế lớn, đang được các ngành tập trung nghiên cứu để khai
thác tiềm năng. Chúng có thể được sử dụng ở cả hai dạng khô và tươi.
1.1.2.1. Gracilaria Heteroclada
Gracilaria Heteroclada có tên tiếng Việt là rong câu cước, được phát hiện bởi
J.F.Zhang và B.M.Xia năm 1988. Gracilaria Heteroclada phân bố ở vùng pH
trung tính (pH từ 7 -8). Các thủy vực nơi có xuất hiện của rong có độ mặn
dao động trong khoảng 20-27 ppt.
Rong Gracilaria Heteroclada có sinh khối lớn, sinh trưởng tốt vào giai
đoạn từ tháng 4 đến tháng 6, chúng có thể phát triển trong ao nước lợ và đầm
phá, cũng như ở các bãi dưới triều trên nền đất đá, phát triển tốt vào mùa đông
- xuân. Loài rong này được sử dụng dạng tươi lẫn dạng khô.

17. 13
Trồng Gracilaria Heteroclada bắt đầu ở Việt Nam vào cuối những năm 80
của thế kỷ trước. Rong này bắt gặp trong tự nhiên (miền Trung Việt Nam) ở
hai dạng: sinh sản hữu tính và vô tính, cũng như nhân bản vô tính. Dạng thứ
nhất của Gracilaria phát triển ở vùng biển, trên nền đáy cứng, trong vùng
triều, dạng thứ hai - trong các đầm phá nước lợ, trên đáy cát và bùn, thường ở
dạng không bám.
Hình 1.2. Hình ảnh của rong Gracilaria Heteroclada
Trồng Gracilaria Heteroclada tại các tỉnh miền Trung và miền Nam
chủ yếu ở các tỉnh Phú Yên và Bà Rịa Vũng Tàu. Những loài này của
Gracilaria không chỉ trồng thâm canh và bán thâm canh, mà còn nuôi ghép
với tôm. Rong giống rải trên đáy cát hay bùn. Rong phát triển nhanh nhất ở độ
mặn 25 - 30 ‰ và ở nhiệt độ 26 – 32o
C với tốc độ 5-7%/ngày. Độ mặn thấp
hơn 20‰ và nhiệt độ cao hơn 34o
C thì sự tăng trưởng bị kìm hãm (Phạm Văn
Huyên,1998). Nếu độ mặn ở các vùng đầm phá trong năm không giảm xuống
dưới 20 ‰, thì Gracilaria Heteroclada có thể trồng được quanh năm. Rong
được trồng trong ao nuôi tôm làm gia tăng thu hoạch cả tảo và động vật giáp
xác. Hiện nay, Gracilaria Heteroclada trồng khoảng 100 ha. Năng suất là 1,5
- 2,0 tấn khô/ ha. Rong biển này được trồng chủ yếu để sản xuất agar thực
phẩm chất lượng cao.

18. 14
1.1.2.2. Gracilaria Salicornia
Gracilaria Salicornia lần đầu tiên được phát hiện ở bến cảng Hawaii
và các khu vực lân cận (Smith Hunter và Smith 2002).
Hình 1.3. Hình ảnh của rong Gracilaria Salicornia
Gracilaria Salicornia thay đổi màu sắc từ màu vàng sáng ở đầu đến
màu cam, xanh lá cây hoặc nâu ở gốc. Thân có dạng hình trụ (đường kính 0,5
cm) và phân nhánh nhị phân với các co thắt ở đáy của mỗi nhị phân. Ở
Hawai, nó thường phát triển rất mạnh ở mọi địa hình, bám chặt vào lớp nền
cứng và có thể dày tới 25-40 cm; trong môi trường tĩnh, nó có thể phát triển ở
dạng thẳng đứng và phân nhánh dễ dàng hơn, phát triển khá tự do. Gracilaria
Salicornia sinh sản chủ yếu thông qua sự phân nhánh và nhân giống tự nhiên
(Smith Pers. Comm. 2003). Gracilaria Salicornia mọc trên đất đá, trên san hô
chết ở những khu vực bãi triều và dưới triều vào mùa xuân và đầu mùa hè.
Ở vùng nhiệt đới, Gracilaria Salicornia có thể gây ra mối đe dọa đối
với cả môi trường sống san hô và sinh vật biển (Smith Hunter và Smith 2002)
vì nó phát triển với quy mô rộng. Một vài nghiên cứu đã được thực hiện về hệ
sinh thái của Gracilaria Salicornia ở các phạm vi khác nhau. Và các nhà
nghiên cứu đã rút ra được rằng hình thái hình thành thảm độc đáo của
Gracilaria Salicornia dễ dàng thích nghi và chịu được nhiều điều kiện ánh
sáng khác nhau (Beach et al. 1997, trong Smith et al. 2004). Ngoài ra, nó cũng
thích nghi với những loại chất dinh dưỡng khác nhau (Larned 1998, trong
Smith et al. 2004). Dựa trên các thí nghiệm điều tra thì rong Gracilaria

19. 15
Salicornia có thể chịu đựng các môi trường sống vô cùng khắc nghiệt. Nếu
nhiệt độ nước biển hơn 41o
C cùng với dung dịch muối bão hòa 75% hay 50%,
Gracilaria Salicornia mới có thể chết (Smith et al. 2004). Khả năng chịu
đựng này cho phép Gracilaria Salicornia phát triển mạnh trong các điều kiện
từ nước ngọt đến nước biển, nhiệt độ chịu đựng được dao động từ dòng chảy
nước mát đến cả các khu vực ấm (Smith et al. 2004). Với sức sống mãnh liệt
như vậy, Gracilaria Salicornia thậm chí có thể đe dọa các rạn san hô và các
sinh vật đáy ở Hawaii cũng như các nơi khác. Bởi vì nó có thể làm giảm sự đa
dạng hoặc thay đổi cấu trúc các loài sinh vật biển. Trong nhiều trường hợp,
Gracilaria Salicornia trở nên chiếm ưu thế về mặt sinh thái và phát triển trên
các rạn san hô, làm giảm số lượng và giá trị của các rạn san hô (Hughes 1994,
trong Smith Hunter và Smith 2002). Ví dụ, tại các khu vực của Hawaii như
Waikiki, Gracilaria Salicornia đã trở thành loài sinh vật đáy chiếm phần diện
tích lớn nhất trong khi ở khu vực này, trước đây có hơn 60 loài tảo khác nhau
sinh sống (Doty 1969, trong Smith et al. 2004).
Gracilaria Salicornia sinh sản chủ yếu thông qua sự phân nhánh và
nhân giống tự nhiên (Smith Pers. Comm. 2003). Chính vì vậy, việc sử dụng
được loại rong này trong công nghệ thực phẩm sẽ phần nào giải quyết được
những vấn đề về môi trường mà các nhà khoa học quan tâm, đồng thời đem
lại những giá trị vô cùng to lớn về cả kinh tế và sức khỏe cộng đồng.
1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ POLYSACCHARIDE DẠNG AGAR
1.2.1. Nguồn gốc, tính chất gel và ứng dụng
1.2.1.1. Nguồn gốc
Agar là chất dinh dưỡng được rong Đỏ tích lũy theo thời gian sinh
trưởng, dưới dạng polymer phức tạp liên kết với các ion khoáng có trong cây
rong [13].
Agar hay còn gọi là agar-agar, là phycocolloid có nguồn gốc cổ xưa
nhất (giữa thế kỷ XVII). Tại Nhật Bản, agar được phát hiện bởi Minoya
Tarozaemon năm 1658 [16]. Tuy nhiên, tên agar-agar lại xuất phát tại
Malaysia. Ngoài ra, agar còn được gọi là kanten (Nhật Bản), dongfen (Trung
Quốc), gelose (các nước nói tiếng Pháp và Bồ Đào Nha) [17].

20. 16
Agar có thể được chiết xuất từ các loài rong nhóm Agarophyte thuộc
các chi khác nhau như: Gelidium (Gelidium sesquipedale, Gelidium amansii,
Gelidium robustum ...), Gracilaria (Gracilaria chilense, Gracilaria
tenuistipitata, Gracilaria edulis, Gracilaria acerosa ...), Gracilariopsis
(Gracilariopsis lamaneiformis, Gracilariopsis sjostedtii... [18].
1.2.1.2. Tính chất gel
Agar là một chất vô định hình, dạng gel không màu, không vị, dạng bột
hoặc dạng sợi có màu trắng hoặc trắng ngà. Agar không tan trong nước lạnh,
trương phồng đáng kể trong nước, hòa tan trong nước nóng và khi làm nguội
thì đông lại tạo thể gel khối có tính đàn hồi. Agar kết tủa trong ethanol, trong
acetone, amylic alcohol. Agar có khả năng tạo gel khi để nguội hay khi làm
lạnh dung dịch. Khác với carragenan và alginate, gel agar không cần dùng các
ion tạo gel [13], [17].
Một số tính chất đặc biệt của agar là có khả năng hình thành gel một
cách thuận nghịch với nhiệt độ (hình 1.4) và sự trễ nhiệt tạo gel (gelation
hysteresis) –sự khác biệt lớn giữa nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ tạo gel.
Agar từ các loài rong khác nhau thì tính chất gel chịu ảnh hưởng bởi những
nhiệt độ khác nhau. Agar từ Gelidium đông đặc khoảng từ 28o
C đến 31o
C và
nhiệt độ tan chảy từ 80o
C đến 90o
C. Agar từ Gracilaria đông đặc ở nhiệt độ
khoảng từ 29o
C đến 42o
C và tan chảy ở nhiệt độ từ 76o
C đến 92o
C. Hàm
lượng methoxy ảnh hưởng đến nhiệt độ tạo gel của agar. Khi hàm lượng
methoxy trong agarose Gracilaria tăng, nhiệt độ tạo gel tương ứng cũng tăng
lên [17].
Ở thể gel, agar có thể chịu lực (sức đông). Đây là một số thông số chất
lượng quan trọng của gel agar. Các yếu tố ảnh hưởng đến sức đông gel agar là
loài rong môi trường sinh thái, thời gian thu hoạch và phương pháp xử lý
rong. Agar có thể bị thủy phân cắt mạch khi gặp các yếu tố thủy phân như
acid, kiềm, enzyme. Từ tính chất này, cần đặc biệt lưu ý khi cho rong tiếp xúc
với môi trường acid hay kiềm, nhiệt độ cao trong quá trình gia công xử lý,
nấu chiết và tẩy trắng. Khi hòa tan, agar tạo dung dịch có độ nhớt cao, có tính
keo. Độ nhớt của các dung dịch agar thay đổi phụ thuộc vào nguồn nguyên
liệu và các điều kiện chiết xuất agar [13].

21. 17
Các tính chất gel agar không chỉ phụ thuộc vào thành phần hóa học của
chúng như agarose, sulfate, methoxy, pyruvic acid mà còn phụ thuộc vào vị
trí của nhóm thế [13], [17], [19]. Khi dung dịch nóng, agar ở dạng hòa tan,
các phân tử agar nằm ngẫu nhiên trong dung dịch. Khi nhiệt độ thấp dần, các
phân tử agar tiến đến gần nhau và bắt đầu cuộn xoắn vào nhau, quá trình tạo
gel bắt đầu. Cấu trúc gel của agar là giữa các phân tử trung tính hình thành
chuỗi xoắn kép do tương tác Van der Waals và liên kết hidrogen tạo thành,
sau đó nhiều mối liên kết hình thành nên mạng lưới vĩ mô tạo nên độ chắc của
gel. Vì vậy khi có mặt nhóm thế phân cực hay mang điện tích thì một mặt, nó
ảnh hưởng đến độ bền của liên kết hydrogen trong gel, mặt khác ảnh hưởng
đến trật tự cấu trúc nguyên tử trong mạng lưới gel của agar, ảnh hưởng đến
tính chất gel của agar. Bên cạnh đó, còn có yếu tố ảnh hưởng lớn đến đặc tính
gel của agar là hàm lượng LA cũng như độ lặp lại của các monomer DG và
LA. Gel agar có cấu trúc xoắn được xác định bằng phương pháp nhiễu xạ tia
X. Vì agar chứa LA, gel có cấu trúc xoắn trái. So với gel carrageenan, gel
agar có bước xoắn nhỏ hơn 26 Å vì chứa ít nhóm sulfate hơn. Khi chứa ít
nhóm sulfate, vòng xoắn của gel sẽ chặt hơn và gọn hơn [17].
Trong dung dịch nước, do các nhóm hydroxyl và nhóm sulfate trong
phân tử agar tạo thành các liên kết hydro với các phân tử nước, các vùng
tương tác giữa các phân tử và trong nội bộ phân tử hình thành hai loại phân tử
là loại kết hợp và loại không kết hợp. Trạng thái sol tồn tại hai loại hạt có kích
thước khác nhau là loại hạt đơn có kích thước từ 20-50nm và loại hạt kết hợp
có kích thước từ 200-700nm.
Khi hạ nhiệt độ đến khoảng 40o
C, bán kính thủy lực của các hạt tăng
dần lên và chuyển từ cấu trúc hạt sang cấu hình gậy, mạng lưới gel bắt đầu
được hình thành làm tăng tính dị thể của cấu trúc. Khi một mạng lưới gel nhỏ
được hình thành, nó sẽ nằm cân bằng động với cả mạng lưới, nghĩa là nó sẽ bị
xáo trộn và phục hồi thường xuyên sau một khoảng thời gian, sau đó khi các
phân tử agar tham gia vào mạng lưới nhiều hơn, nó sẽ dần dần đạt đến trạng
thái cân bằng bền hơn [17].
Agar thường tương thích với hầu hết các polysaccharide khác và với
protein gần như là vô điều kiện mà không có kết tủa hay dẫn đến sự thoái

22. 18
biến. Tuy nhiên, sự kết hợp của đường vào hệ agar có thể làm tăng sức đông
của gel. Các đường cạnh tranh nước với agar trong hệ, có hiệu lực làm tăng
nồng độ thạch agar. Các polyol, như ethylene glycol và glycerol, cũng gây
một tác dụng tương tự [17].
Hình 1.4. Cơ chế geling của agar [20]
Ngoài ra, một số polysaccharide dạng agar còn có hoạt tính sinh học đã
được nghiên cứu và ứng dụng trong lĩnh vực y-dược [16], [21], [22], [23].
1.2.1.3. Ứng dụng
Agar được sử dụng chủ yếu dựa vào khả năng tạo gel và những đặc tính
độc đáo của gel agar. Khoảng 60% tổng sản lượng agar được dùng cho mục
đích thực phẩm, còn lại 40% dùng cho các lĩnh vực khác như dược phẩm, y
học, công nghệ sinh học ...
Agar từ lâu đã được người dân chiết xuất từ các loài rong biển Đỏ quen
thuộc để chế biến thạch, đông sương, các món salad hoa quả. Agar cung cấp

23. 19
rất ít calorie nên đây là món ăn rất tốt dùng cho người ăn kiêng, giảm cân
[17].
Agar rất dễ sử dụng do có sự khác biệt lớn giữa nhiệt độ nóng chảy và
nhiệt độ tạo gel. Gel agar không tan chảy ở nhiệt độ thường mà chỉ tan chảy ở
nhiệt độ 80o
C trở lên. Bên cạnh đó, agar còn có khả năng cạnh tranh với các
chất tạo đông khác bởi chỉ cần hàm lượng khoảng 1% đã tạo cho thực phẩm
có sức đông khá cao [13].
Agar là loại keo rong biển được dùng trong thực phẩm sớm nhất, được
cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ, FDA xếp vào loại thực
phẩm an toàn, Bộ luật Vệ sinh thực phẩm của FAO/WHO đã cho phép dùng
agar trong thực phẩm [17]. Agar được xếp vào danh mục các chất phụ gia
thực phẩm của Bộ Y tế - E406 với vai trò chất làm đặc, chất nhũ hóa, chất ổn
định, chất độn trong thực phẩm.
Agar được sử dụng thay thế cho pectin trong sản phẩm mứt trái cây.
Agar là chất ổn định, tạo nhũ, ngăn ngừa mất nước trong kem, chocolate hoặc
làm tăng độ nhớt và độ bám dính của men với bánh, giảm sứt mẻ và nứt, ngăn
men tan chảy. Mặt khác, agar được tiêu hóa trong cơ thể người không hoàn
toàn, dưới 10% polysaccharide trong agar được đồng hóa, do đó agar được sử
dụng để sản xuất các loại bánh kẹo chứa ít năng lượng, các thực phẩm ăn
kiêng, như bánh mì calorie thấp với lượng agar dùng khoảng từ 0,1 đến 1,0%
[24].
Agar được sử dụng thay thế gelatin trong một số sản phẩm thịt và cá,
phụ gia thay cho borate trong giò lụa; làm tăng cường khả năng đông tụ, tạo
độ giòn, độ dai cho sản phẩm giò chả. Trong công nghiệp thịt đặc biệt là khi
sản xuất xúc xích dùng agar cho phép giảm chất béo, giảm cholesterol và đảm
bảo cho độ đông kết của xúc xích, giúp giữ màu sắc trong sản phẩm thịt [24].
Agar còn là phụ gia được dùng tạo môi trường có độ nhớt trong các sản phẩm
thạch giải khát, nước uống.
Trong y-dược học [13], agar được dùng làm thuốc nhuận tràng, điều trị
một số bệnh đường ruột, điều chỉnh rối loạn tiêu hóa. Agar còn được dùng
làm vỏ bao gói dược phẩm, tá dược điều chế thuốc viên, cao thuốc...

24. 20
Năm 1882, Walther Hess [24] đã sử dụng polysaccharide của rong biển
như một chất cố định vi sinh vật, một môi trường nuôi cấy và phân lập vi sinh
vật. Nhờ tính chất trung hòa điện học, ổn định nhiệt học và sức đông cao, agar
là môi trường được dùng phổ biến để nuôi cấy vi khuẩn, sử dụng trong kỹ
thuật nuôi cấy mô thực vật. Agar được dùng cho mục đích này phải có độ tinh
khiết cao, phải được điều chế một cách đặc biệt và kiểm tra nghiêm ngặt.
Agarose là một dạng gel lý tưởng cho sự khuếch tán và di chuyển động
lực điên di của các polymer sinh học. Vì vậy, gel agarose được sử dụng rộng
rãi trong ngành y học và công nghệ sinh học. Nó được sử dụng trong điện di
phân lập protein, acid nucleic, lipoprotein, glycoprotein, vi sinh vật; kỹ thuật
sắc ký, cố định enzyme và tế bào. Phương pháp điện di trên gel agarose có thể
được áp dụng trong xét nghiệm mô bệnh học để chẩn đoán và theo dõi điều trị
bệnh lý ung thư [13], [25].
Ngoài việc ứng dụng trong các lĩnh vực nêu trên, agar còn được ứng
dụng trong một số lĩnh vực khác như dùng trong mỹ phẩm, hồ tơ lụa, ...[13].
Nhìn chung công nghệ sản xuất agar ở Việt Nam còn ở quy mô nhỏ,
chưa đủ cung cấp cho nhu cầu ngày càng tăng về việc sử dụng agar hiện nay.
Mặt khác, chất lượng agar sản xuất còn nhược điểm là sức đông thấp, alkali
nhiều nên ít được sử dụng cho các ngành công nghệ cao, đặc biệt chưa có
nhiều sản phẩm agarose đạt chất lượng cao.
1.2.2. Đặc điểm cấu trúc
Agar có đặc điểm cấu trúc cơ bản được cấu tạo nên từ các thành phần
β-D-galactose, 3,6-α-anhydro-L-galactose, α-L-galactose. Việc thay đổi cấu
trúc khác nhau giữa các agar có thể được tìm thấy chủ yếu là do các nhóm thế
như sulfate, pyruvic acid ketal, methoxy hoặc xylose [13], [17]. Dựa vào khả
năng tạo gel, agar được chia thành hai loại chính là agarose và agaropectin.
Trong đó agarose là thành phần tạo gel chủ yếu của agar, còn agaropectin có
khả năng tạo gel rất thấp. Ngoài ra, agar còn chứa thành phần agaran không
có khả năng tạo gel [26].
Agarose là polymer mà trong phân tử của chúng gồm các đơn vị β-D-
galactose và 3,6-anhydro-α-L-galactose liên kết với nhau qua liên kết 1,4-
glycoside và giữa các dimer này lại liên kết với nhau qua liên kết 1,3-

25. 21
glycoside [28]. Agarose chưa thủy phân có khối lượng khoảng 120.000
Dalton tương ứng với khoảng 800 gốc đường hexose. Liên kết 1,4- và liên kết
1,3- dễ phân hủy cho sản phẩm tương ứng là neoagarobiose và agarobiose
[17].
Hình 1.5. Cấu trúc phân tử của Agarose [27]
Trong phân tử, mỗi dimer agarobiose có 4 nhóm hydroxyl (- OH) có
khả năng bị methyl hóa. Vị trí của nhóm - OH thường bị methyl hóa là nhóm
- OH ở các nguyên tử C4, C6 của monomer β-D-galactose (DG) và C2 của
monomer 3,6-anhydro-α-L-galactose (LA) [29].
Agaropectin cũng có cấu tạo chung như agarose, nhưng trong đó các
nhóm OH được thế bằng các nhóm mang điện tích, chủ yếu là sulfate hoặc
pyruvic acid. Agaropectin có trọng lượng phân tử trung bình thấp hơn agarose
(dưới 12.600 Dalton) [13].

26. 22
Các liên kết hemi-ester sulfate ở vị trí khác nhau thì có độ bền khác nhau.
Dựa vào độ bền của liên kết này có thể chia ra hai nhóm khác nhau: Một là
nhóm sulfate hemi-ester đính ở các nguyên tử carbon C4, C6 của DG, các
nhóm sulfate này rất bền khi phản ứng với kiềm. Hai là, nhóm sulfate hemi-
ester kém bền với kiềm khi đính ở các nguyên tử C6 của LA. Khi trong phân
đoạn agaropectin có chứa disaccharide gồm DG liên kết với α-L-galactose-6-
sulfate thì disaccharide này được gọi là porphyran. Trong quá trình đun nóng
với kiềm, porphyran sẽ phản ứng với kiềm tạo thành agarobiose, vì vậy
porphyran được gọi là tiền chất của agarobiose. Phản ứng này đã được các
nhà sản xuất agar ứng dụng trong sản xuất ở quy mô công nghiệp với một số
loài rong cụ thể nhằm làm tăng hàm lượng agarobiose và nâng cao chất lượng
của sản phẩm agar [13], [17], [30].
Hình 1.6. Cấu trúc của phân tử Agaropectin [27]
Ngoài các phân đoạn agarose và agaropectin, gần đây các nhà khoa học
đã xác định được thành phần agaran không có khả năng tạo gel nhưng có hoạt
tính sinh học quý trong rong Đỏ, Agaran có cấu tạo từ β-D-galactose và α-L-
galactose liên kết với nhau qua các liên kết 1,4- và 1,3-glycoside.
1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA
POLYSACCHARIDE
Trong nghiên cứu cấu trúc polysaccharide dạng agar các vấn đề sau đòi
hỏi cần được làm sáng tỏ:

27. 23
 Thành phần monosaccharide [định tính và định lượng, tức là loại và số
lượng monosaccharide, cấu hình tuyệt đối (D hoặc L) và loại vòng
(pyranoza hoặc furanoza)].
 Các liên kết glycoside (cấu hình  hoặc  và vị trí liên kết)
 Chuỗi liên kết (trật tự sắp xếp của dãy monosaccharide)
Kết hợp giữa các phương pháp hóa học với các phương pháp sử dụng
các thiết bị vật lý hiện đại trong nghiên cứu cấu trúc, việc phân tích cấu trúc
của các polysaccharide bao gồm 5 bước chủ yếu:
1. Xác định thành phần monosaccharide bằng cách thuỷ phân mạch
cacbohydrate để cắt các liên kết glycoside. Các nhóm thế có trong
mạch được xác định bằng phổ hồng ngoại (IR)
2. Methyl hoá bằng các phản ứng hoá học để thu được các dẫn xuất
monosaccharide, bằng cách nghiên cứu các dẫn xuất này có thể xác
định được kiểu liên kết.
3. Ghi dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
4. Xác định trật tự liên kết glycoside và các vị trí nhóm thế bằng phương
pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR và phổ hồng ngoại kết hợp với
phương pháp phân tích hóa học.
5. Nghiên cứu cấu trúc không gian dựa trên các số liệu phân tích phổ một
chiều và hai chiều: 1
H NMR, 13
C NMR, HSQC, HMBC, COSY.
Các phương pháp phân tích cấu trúc
Từ năm1960 đến năm 1980, áp dụng các kỹ thuật mới trong việc
nghiên cứu Agar như Fractionation, trong trao đổi Chromatography, Enzymic
thoái biến và đặc biệt là 13
C NMR quang phổ cho phép xác định chính xác
hơn việc nghiên cứu cấu trúc hóa học cơ bản và trình tự sắp xếp của các
nguyên tố trong các phân tử Agar.
Nghiên cứu gần đây của Yaphe (1971) trên DEAE-Sephadex chỉ ra
rằng Agar chứa polysaccharide không tạo gel có cấu trúc của Agarose, ngoài
ra, vẫn còn chứa đựng một lượng nhỏ Sulfate (0,1 đến 0,5%) và Pyruvic acid
(0,02%).

28. 24
Gần đây, 13
C NMR quang phổ đã được xác nhận là một công cụ mạnh
để làm sáng tỏ các Disaccharide lặp đi lặp lại của các đơn vị khác nhau trong
Agarose hiện diện trong phân tử Agar khác.
Bên cạnh nhiệm vụ của chất hóa học sự thay đổi về vị trí trong 13
C
NMR quang phổ của nguyên tử khi carbon trong Agaroses chứa trong Agar
cô lập từ nhiều loài Gracilaria, các cấu trúc và tính năng của Disaccharides
có thể dễ dàng xác định.
1.3.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)
Quang phổ hồng ngoại (gọi tắt là quang phổ IR) là quang phổ được
thực hiện ở vùng hồng ngoại của phổ bức xạ điện từ, ánh sáng vùng này có
bước sóng dài hơn và tần số thấp hơn so với vùng ánh sáng nhìn thấy. Nhiều
kỹ thuât về quang phổ hồng ngoại dựa trên tính chất này, mà hầu hết dựa trên
cơ sở của sự hấp thụ quang phổ. Cũng giống như tất cả phương pháp quang
phổ khác, quang phổ hồng ngoại có thể được sử dụng trong công tác xác định
và nghiên cứu các hợp chất hóa học.
Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) ngày nay là phương pháp vật lý
được sử dụng rộng rãi trong phân tích cấu trúc nói chung và và phân tích các
ionic polysaccharides nói riêng. Phương pháp này mang đến những thông tin
cấu trúc quan trọng để xác định vị trí nhóm chức trong phân tử
polysaccharides như pectin, hemicellulose, cellulose, tinh bột và các dẫn xuất
polysaccharide từ rong biển.
Bảng 1.1. Các nhóm đặc trưng của phổ FTIR trong phân tích polysaccharides
Tần số (cm-1
) Nhóm đặc trưng Liên kết Chất đặc trưng
1740 ν(C=O) Ester, pectin
1426 δ CH2 Cellulose
1371 δ CH2 Xyloglucan
1362, 1317 δ CH2 Cellulose
1243 ν(C-O) Pectin
1160 ν(C-O-C) Glicoside, vòng Pectin

29. 25
1146 ν(C-O-C) Glicoside, vòng Pectin
1130 ν(C-O-C) Glicoside, vòng Xyloglucan
1115 ν(C-O), ν(C-C) C-2-O-2 Cellulose
1100 ν(C-O), ν(C-C) Vòng Pectin
1075 ν(C-O), ν(C-C) Vòng Xyloglucan
1060 ν(C-O), ν(C-C) C-3-O-3
1042 ν(C-O), ν(C-C) Vòng
1030 ν(C-O), ν(C-C) C-6H-2-O-6
1015, 1000 ν(C-O), ν(C-C) C-6H-2-O-6 Cellulose
1019 ν(C-O), ν(C-C) C-2-C-3, C-2-O-2, C-1-
O-1
Pectin
960 δ(CO) Pectin
944 δ(C-1-H) Cellulose
Xyloglucan
895 Vòng Β-anomeric
833 Vòng Pectin
1.3.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Nguyên lý chung của phương pháp phổ NMR ( phổ proton và phổ
cacbon) là sự cộng hưởng các tần số khác nhau của các hạt nhân từ (1
H, 13
C)
dưới tác dụng của từ trường. Các tần số cộng hưởng khác nhau này được biểu
diễn bằng độ chuyển dịch hóa học.
Phổ 1
H NMR
Trong phổ 1
H NMR, độ chuyển dịch hoá học của các proton được xác
định trong thang ppm từ 0-14 ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên
tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử.
Mỗi proton cộng hưởng ở một trường khác nhau, vì vậy chúng được
biểu diễn một độ dịch chuyển hóa học khác nhau. Dựa vào những đặc trưng

30. 26
của độ chuyển dịch hoá học và tương tác spin giữa các hạt nhân với nhau mà
ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất.
Phổ 13
C NMR
Phổ 13
C NMR cho tín hiệu vạch phổ carbon. Mỗi nguyên tử carbon sẽ
cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo
của phổ 13
C NMR cũng được tính bằng ppm, với dãi thang đo rộng hơn so với
phổ proton ( từ 0-240 ppm).
Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân là phương pháp hữu hiệu để
nghiên cứu cấu trúc của các polysaccharides. Trong phương pháp nghiên cứu
cấu trúc của polysaccharides thì phổ 1
H và 13
C-NMR thường được sử dụng.
Trong một số trường hợp phổ 1
H NMR còn dùng để định lượng các
polysaccharides có trong mẫu phân tích.
Phổ NMR được tín hiệu thể hiện bằng độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm)
với chất nội chuẩn (TMS, DSS…). Trong phổ proton tất cả độ chuyển dịch
hóa học của carbonhydrate bao gồm monosaccharide, oligosaccharide và
polysaccharides có độ chuyển dịch hóa học từ 1-6ppm trong chất chuẩn TMS.
Độ chuyển dịch hóa học anomeric proton của mỗi monosaccharide đều được
nhận biết riêng phụ thuộc vào cấu hình α hay β. Như với α-anomeric proton
sẽ xuất hiện tại δ 5-6ppm trong khi đó với β-anomeric proton là tại vùng δ 4-
5ppm. Mặc dù phổ 13
C NMR thường có tín hiệu yếu hơn nhưng cũng có
những lợi thế so với phổ 1
H NMR trong phân tích cấu trúc polysaccharides
bởi vì độ chuyển dịch hóa học trong phổ 13
C NMR được trải rộng trên thang
đo. Các tín hiệu trên thang đo trên phổ 13
C NMR đã khắc phục được hiện
tượng chồng chéo trên phổ 1
H NMR. Trên phổ 13
C NMR các tín hiệu
anomeric carbon xuất hiện tại vùng δ 90-110ppm trong khi đó các tín hiệu của
nonamoreic carbon xuất hiện tại vùng δ 60 và 80ppm. Với polysaccharides
có nhóm deoxygen như nhóm –CH3 tín hiệu xuất hiện tại vùng trường cao
hơn (15-20ppm) [36]. Với hai loại anomeric proton, tín hiệu α-anomeric
carbon xuất hiện tại vùng δ 100-105ppm. Với polysaccharides có chứa nhóm
uronic acid, các tín hiệu của carbon trong nhóm carboxyl sẽ xuất hiện tại δ
170-180ppm. Các tín hiệu của carbon bậc một có chứa nhóm hydroxyl như
C6 trong pyranose và C5 trong furanose sẽ chuyển dịch về vùng cao (δ 60-

31. 27
64ppm), trong khi độ chuyển dịch hóa học của nguyên tử carbon bậc 2 có
chứa nhóm hydroxyl (C2, 3, 4 trong pyranoser và C2, 3 trong furanose) sẽ
xuất hiện tại vùng 65-85ppm. Với nguyên tử carbon alkoylate (C5 trong
pyranose và C4 trong furanose) độ chuyển dịch hóa học sẽ chuyển dịch về
phía trường yếu 5-10ppm.
Các tín hiệu thu được từ phổ NMR của polysaccharides chưa xác định
được ngay cấu trúc mà cần so sánh với các giá trị của phổ đặc trưng sau đó để
hoàn thiện cấu trúc phổ 2D NMR và một số kĩ thuật khác. Phổ 1
H-NMR có
thể được sử dụng để định lượng polysaccharides. Tuy nhiên xuất hiện hiện
tượng chồng chéo của các tín hiệu proton trong quá trình định lượng
polysaccharides. Do vậy phổ 13
C NMR cũng có thể dùng để định lượng
polysaccharides vì các tín hiệu anomeric của carbon được tách riêng trong
phổ. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton(1
H NMR) có thể khẳng định độ tinh
khiết của mẫu ( không có mặt các tín hiệu oligonucleotide, protein hay lipid).
Phổ cũng có thể cho biết số monosaccharide thực từ số các cộng hưởng
proton anomer thông qua các tín hiệu trong khoảng δ 4,4ppm đến 5,8ppm.
Như vậy dựa vào tỷ lệ tích phân tương đối của các cộng hưởng monomer
cũng có thể đánh giá tỷ lệ phân tử của các monosaccharide. Về mặt này kết
quả phân tích hóa học có thể phù hợp với kết quả phân tích 1
H NMR. Nhìn
chung kết quả phân tích NMR là chính xác hơn so với kết quả phân tích hóa
học.
Nhiều nhóm thế có thể được xác định hoặc sự có mặt của chúng được
dự đoán dựa vào phổ hai chiều đồng hạt nhân 1
H-1
H COSY. Tiếp theo, số
lượng chính xác của các monosaccharide có thể được khẳng định chính xác
nhờ việc khảo sát vùng anomer của phổ hai chiều dị hạt nhân 1
H-13
C HSQC.
Dạng vòng (hexose hay furanose) và các cấu hình được suy ra từ các
thông tin kết hợp có giá trị từ độ chuyển dịch hóa học 1
H-NMR với hằng số
tương tác vô hướng của C1, H1. Tương tác dị hạt nhân liên kết có thể thu
được từ phổ tương tác 1
H-13
C HSQC.
Bảng 1.2. Độ chuyển dịch hóa học δ (ppm) từ cơ sở dữ liêu sugabase của
dạng glucose, galactose và xylose dung môi D2O

32. 28
Monosaccharide H-1
C-1
H-2
C-2
H-3
C-3
H-4
C-4
H-5
C-5
H-6a
C-6
H-6b
C-6
α-D-Glcp 5.11
97.5
3.52
72.5
3.76
73.8
3.41
70.7
3.74
72.9
3.64
61.4
3.78
β-D-Glcp 4.84
102.9
3.31
74.1
3.55
76.3
3.51
70.4
3.55
76.0
3.77
61.5
3.94
α-D-Galp 5.16
99.1
3.89
68.9
3.93
70.2
4.12
68.6
4.11
71.0
3.73
61.7
3.73
β-D-Galp 4.68
103.5
3.53
71.7
3.80
73.5
4.08
67.9
3.74
75.5
3.74
61.8
3.74
α-D-Xylp 5.18
93.12
3.52
72.44
3.67
73.75
3.61
70.16
3.68(H5a)
3.60(H5b)
61.99
β-D-Xylp 4.57
97.53
3.22
75.090
3.43
76.77
3.62
70.27
3.31(H5a)
3.93(H5b)
66.05
Các vị trí được thế monosaccharides được gọi là vị trí aglycon tương
ứng với các nguyên tử C ở vị trí không phải là anomer của liên kết glycoside.
Từ dữ liệu NMR, vị trí của liên kết được suy ra dựa trên sự tăng mạnh (> +
3ppm) về độ dịch chuyển hóa học của 13
C so với độ chuyển dịch hóa học của
các monomer không thế.
Việc phân tích này cũng mang lại thông tin giống với những phân tích
khi methyl hóa. Trật tự các đơn phân trong mạch của polysaccharides được
xác định chính là chuỗi các liên kết glycoside, thể hiện thông tin cấu trúc
chính xác cần xác định thu được từ các loại phổ hai chiều như HSQC, HMBC
và COSY.

33. 29
1.3.3. Phương pháp phổ hai chiều HSQC, HMBC, COSY
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều sẽ cho ta thêm những thông tin
để xác định trình tự và vị trí của các liên kết trong phân tử polysaccharide
thông qua các tương tác giữa proton với proton và proton với carbon trong các
liên kết trực tiếp đồng hạt nhân hoặc các liên kết dị hạt nhân không trực tiếp.
Phổ HSQC
Phổ HSQC là phổ hai chiều dị hạt nhân 1
H – 13
C HSQC, cho biết sự
liên quan giữa các tín hiệu của 1
H (chiều w1) với các tín hiệu của 13
C (chiều
w2). Phổ HSQC có thể biểu diễn dưới dạng biểu đồ nổi hoặc biểu đồ đường
viền, biểu đồ đường viền có nhiều ưu điểm hơn. Bởi vì những thông tin về độ
dịch chuyển hóa học là khác nhau ở hai chiều cho nên phổ HSQC là không
đối xứng qua đường chéo.
Phổ HSQC cho biết thông tin về những proton 1
H đính trực tiếp với
nguyên tử 13
C. Ở các phổ HSQC, chỉ những tín hiệu của các nhóm CHn với
n≥ 1 mới thấy được. Điều đó có nghĩa là không có các thông tin về những
carbon bậc 4.
Phổ HMBC
Phổ HMBC là phổ hai chiều dị nhân 1
H – 13
C HMBC, thể hiện mối liên
quan của tín hiệu proton 1
H ở một nguyên tử 13
C với tín hiệu của nguyên tử
13
C khác ở cách nó 2, 3 liên kết do đó có tên là tương tác xa. Phổ HMBC thể
hiện mối tương tác của 1
H với nguyên tử 13
C bậc 2 và bậc 3, có thể dự đoán vị
trí các liên kết glycoside giữa các đơn vị đường trong polymer [36]. Nhờ vào
các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân
tử được xác định về cấu trúc. Từ đây, cho phép dự đoán liên kết glycoside tại
carbon anomer là liên kết kiểu α hay β.
Phổ 1
H-1
H COSY
Phổ COSY là phổ hai chiều đồng hạt nhân 1
H-1
H COSY, biểu diễn các
tương tác của H-H, chủ yếu là các proton đính với carbon liền kề nhau. Nhờ
phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau.

34. 30
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU AGAR TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ
GIỚI
1.4.1. Tình hình nghiên cứu agar trên thế giới
Những nghiên cứu về đặc điểm cấu trúc
Người đầu tiên nghiên cứu về agar là Payen từ năm 1859, từ loài rong
Đỏ Gelidium amansii. Những công trình nghiên cứu sau này xác định sự có
mặt của các đơn vị β-D-galactose, 3,6-α-anhydro-L-galactose, α-L-galactose
trong agar. Cấu trúc khác nhau giữa các agar được tìm thấy chủ yếu là do các
nhóm thế như sulfate, pyruvic acid ketal, methoxy hoặc xylose [13], [17]. Các
nghiên cứu về cấu trúc agar dựa trên việc thủy phân agar thành các phân đoạn
bằng phương pháp hóa học hoặc enzyme, sau đó các phân đoạn được phân
tích cấu trúc bằng các kỹ thuật phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân
... [13].
Trong quá trình nghiên cứu đặc điểm cấu trúc, thành phần hóa học của
các dạng agar, các nhà nghiên cứu thường quan tâm đến đặc điểm và vị trí các
nhóm thế đã tạo ra sự khác biệt trong cấu trúc giữa các phân đoạn agar. Một
số nhà nghiên cứu đã đưa ra kết luận rằng mức độ methyl hóa agar ở từng vị
trí khác nhau thì khác nhau và tùy thuộc vào các loài rong, chi rong cũng như
vị trí địa lý mà nó sinh sống. Năm 2006, Praiboon J. và cộng sự khi nghiên
cứu về agar trong một số loài rong Gracilaria ở Thái Lan và Nhật Bản đã
nhận thấy rằng agar chiết từ chi rong Gracilaria có mức độ methyl hóa ở vị trí
C6 của monomer DG lớn hơn vị trí C2 của monomer LA [31]. Trong công
trình nghiên cứu về cấu trúc hóa học và tính chất của agar chiết từ các loài
rong chi Gracilaria năm 1995, Murano E. đã tổng kết rằng agar chiết từ các
loài rong thuộc chi Gracilaria có hàm lượng methyl lớn hơn agar chiết từ chi
rong Gelidium và Pterocladia [29].
Khi nghiên cứu về nhóm sulfate trong các phân đoạn agar, các tác giả
đã cho rằng agar thường chứa hàm lượng sulfate nhất định, hàm lượng này ít
nhiều phụ thuộc vào chi rong, loài rong mà agar được tách chiết ra. Agar chiết
từ các loài rong thuộc chi Gracilaria có hàm lượng sulfate lớn hơn agar chiết
từ chi rong Gelidium và Pterocladia [29]. Nhóm sulfate của L-galactose-6-
sulfate có thể bị thủy phân trong kiềm tạo cầu nối 3,6-anhydro, làm tăng hàm

35. 31
lượng agarobiose, dẫn đến tăng khả năng tạo gel của sản phẩm agar thu được
[13]. Trong khi đó, nhóm thế pyruvic acid ketal trong agar tương ứng là 4.1%
và 2.92%. Với Gelidiella acerosa (Barbados) làm lượng agar khô là 8,5%,
hàm lượng sulfate và acid pyruvic trong agar tương ứng là 4,6% và 0,12%.
Còn hàm lượng agar khô trong Gelidium sesquipedale (Tây Ban Nha) là
28,5%, hàm lượng sulfate và acid pyruvic trong agar tương ứng là 3,2% và
0,04% [13].
Theo nghiên cứu của các nhà khoa học như Karamanos và cộng sự [32]
cũng như nhóm của Craigie [9] đã tìm thấy gốc 4-O-methyl-L-galactose tạo
mạch nhánh qua liên kết O-C6 của β-D-galactose trong mạch chính của agar,
trong các loài rong Gracilaria verrucosa và Gracilaria tikvahiae.
Đặc điểm agar trong rong Đỏ mang tính địa phương rõ rệt. Chúng phụ
thuộc vào các yếu tố của môi trường sinh thái mà rong sinh sống như mực
nước có ổn định không, nồng độ muối như thế nào, giàu hay nghèo chất dinh
dưỡng ... để rong phát triển với kích thước lớn, mật độ cao, quang hợp mạnh,
tạo nhiều sản phẩm hữu cơ...
Những nghiên cứu về quy trình tách Quy trình chiết – tách:
Agar được sản xuất trong công nghiệp đầu tiên tại Nhật Bản vào năm 1886.
Đến năm 1910, công nghệ lan sang Nam Phi, Đan Mạch, Chi Lê, Tây Ban
Nha, Pháp, Mỹ, Hàn Quốc ... Ngày nay, khoảng 53% nguyên liệu cho chế
biến agar là các loài rong thuộc chi Gracilaria, chi Gelidium khoảng 44% và
3% cho những loài rong Đỏ khác [13]. Trên thế giới, Gelidium là nguồn
nguyên liệu có chất lượng agar tốt nhất, trong khi đó nguồn rong Gracilaria
có hàm lượng agar cao nhưng sức đông lại thấp hơn, do có đặc điểm là chứa
hàm lượng sulfate cao và hàm lượng agarose thấp. Để cải thiện sức đông của
agar sản xuất từ rong chi Gracilaria người ta đã xử lý kiềm để loại bỏ bớt gốc
sulfate, tăng hàm lượng agarose từ đó nâng cao sức đông của agar [13], [17].
Để thu được nhiều agar từ cây rong thường phải xử lý rong trước khi
nấu chiết. Nhưng agar lại dễ bị thủy phân cắt mạch khi tiếp xúc với các điều
kiện như acid, kiềm, enzymn nên phải lưu ý điều kiện thích hợp khi xử lý và
nấu chiết rong.
Bảng 1.3. Điều kiện xử lý kiềm của rong Gracilaria ở một số quốc gia [33]

36. 32
Quốc gia Nồng độ NaOH
(%)
Nhiệt độ xử lý
(to
C)
Thời gian xử lý
(giờ)
Argentina 6,0 50-60 1,0
Chile 6,0 – 7,0 88 – 90 2,0
Mexico 6,0 90 0,5-1,0
Nam Phi 6,0 70 1,0-1,5
Ấn Độ 20,0 70 1,0
Đài Loan 10,0 85 – 90 1,0
Bồ Đào Nha 4,0 – 5,0 60 1,0
Mặc dù công nghệ sản xuất agar đã có lịch sử hơn 100 năm nhưng cho
đến ngày nay vẫn còn một số tác giả quan tâm nghiên cứu đưa ra các giải
pháp công nghệ cho từng giai đoạn công nghệ nhằm giảm chi phí sản xuất
hoặc thu được sản phẩm agar đạt chất lượng cao.
Vào năm 2015, nhóm tác giả Yarnpakdee Suthasinee và các cộng sự
[45] đã tiến hành công trình nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của việc xử lý
kiềm trước khi nấu chiết (sử dụng NaOH và KOH ở các nồng độ khác nhau)
đến hiệu suất thu hồi agar, tính chất hóa lý và tính chất gel của agar chiết từ
loài rong Gracilaria tenuistipitata tại Songkhla, Thái Lan. Quy trình được
thực hiện như sau: 30g rong khô được ngâm trong 1.500 mL dung dịch NaOH
hoặc KOH ở các nồng độ khác nhau (3%, 5% và 7%) trong 24 giờ ở nhiệt độ
phòng (27-30o
C). Các hỗn hợp này sau đó được gia nhiệt ở 90o
C trong bể ổn
nhiệt (Memmert, Schwabach, Đức) trong 3 giờ khuấy liên tục. Sau khi tiền xử
lý kiềm, rong được rửa dưới vòi nước chảy để loại bỏ các chất kiềm trong 2
giờ. Sau đó, các mẫu qua xử lý sơ bộ đã được trung hòa bởi dung dịch H2SO4
0,025% với tỷ lệ rong:dung dịch là 1:50, trong 1 giờ. Các mẫu rong sau đó
được rửa bằng nước cho đến khi đạt môi trường trung tính (pH = 6,8-7,0), tiếp
đó mẫu rong được nấu chiết tương tự như chiết agar không có xử lý kiềm
(chiết tự nhiên (xử lý cồn)). Các mẫu rong được trộn lẫn với 1.500 mL nước

37. 33
cất ở 95o
C, chiết trong 1,5 giờ khuấy liên tục. Hỗn hợp sau khi nấu sẽ được
lọc nóng, rồi tạo gel ở nhiệt độ phòng, đông lạnh trong 24 giờ và rã đông ở
nhiệt độ phòng trong khoảng 4 giờ. Sau đó, các bản gel tăng được sấy khô ở
55o
C cho đến khi trọng lượng thu được không đổi. Các thỏi agar khô được
nghiền thành bột. Hàm lượng của agar được tính toán dựa trên trọng lượng
khô của rong ban đầu. Kết quả cho thấy các tính chất hóa lý và tính chất gel
của agar được chiết xuất từ Gracilaria tenuistipitata bị ảnh hưởng bởi các
phương pháp xử lý bằng kiềm NaOH và KOH ở các mức độ khác nhau (3-
7o
C). Hàm lượng thu được của agar chiết tự nhiên (xử lý cồn) là 17,1%, trong
khi các loại agar được xử lý trước với NaOH và KOH dao động từ 23,6% đến
26,1%. Agar với tiền xử lý bằng dung dịch kiềm nói chung cho thấy tính gel
tốt hơn, minh chứng bởi sức đông gel, nhiệt độ nóng chảy và độ nhớt cao hơn
so với agar thương mại, với hàm lượng LA khá cao. Ngoài ra, agar chiết tự
nhiên (xử lý cồn) có hàm lượng sulfate cao hơn so với các chế phẩm tiền xử
lý kiềm. Bất kể nồng độ kiềm nào thì NaOH dùng cho tiền xử cũng làm cho
agar có chất lượng cao hơn so với KOH có nồng độ tương ứng. Agar được xử
lý với NaOH 5% có độ bền gel cao (482 g/cm2
) với hiệu suất thu hồi cao
(25,3%). Sự giảm tổng lượng sulfate và sự gia tăng hàm lượng LA đã được
phát hiện ở agar có xử lý bằng dung dịch 5% NaOH so với không xử lý
NaOH được xác định bởi quang phổ FTIR. Các tác giả đã chứng minh mạng
lưới gel agar chiết có xử lý kiềm NaOH 5% có vòng xoắn nhỏ gọn hơn các
trường hợp còn lại. Do đó, tiền xử lý thích hợp bằng cách sử dụng NaOH 5%
có thể làm tăng hàm lượng và cải thiện tính chất gel của agar từ Gracilaria
tenuistipitata thu được từ hồ Songkhla, Thái Lan.
Bên cạnh các nghiên cứu về thành phần có khả năng tạo gel của agar là
agarose và agaropectin thì thành phần không tạo gel agaran sulfate cũng đã
được quan tâm nghiên cứu trong công trình của các nhà khoa học Knudsen và
cộng sự [26]. Kết quả nghiên cứu đã khẳng định agaran là polymer dạng agar
mà trong phân tử của chúng không có sự thay thế gốc α-L-galactose bằng 3,6-
anhydro-α-L-galactose. Trong agaran này các nhóm OH ở các vị trí C4, C6
của gốc D-galactose và vị trí C2, C3 của gốc L-galactose có thể bị thế bởi
nhóm sulfate thì gọi là agaran sulfate.

38. 34
Agaran sulfate là thành phần có hoạt tính sinh học cũng đã được phát
hiện trong những năm gần đây. Tuy nhiên, số công trình được công bố không
nhiều và đối tượng nghiên cứu tập trung là sulfate agaran chiết từ các loài
rong như Acanthophora spicifera [22], Gracilaria corticata [23], Schizymenia
binderi [16] và Bostrychia montagnei [21]. Các tác giả đã dùng phương pháp
chiết lạnh để thu được agaran sulfate. Mẫu rong được xay ra dưới dạng bột,
ngâm trong cồn để loại màu, chất béo, carbohydrat có trọng lượng phân tử
thấp. Sau đó mẫu rong tiếp tục được chiết trong nước cất ở 25o
C, trong vòng
từ 15-18 giờ và khuấy liên tục. Polysaccharide được thu hồi bằng cách kết tủa
trong cồn, ly tâm thu lấy kết tủa và rửa cồn bằng cồn 3 lần. Sản phẩm được tái
hòa tan trong nước cất, lọc bỏ cặn và sấy khô. Các hợp chất agaran sulfate đã
được dùng để khảo sát một số hoạt tính sinh học. Nổi bật là nghiên cứu vào
năm 2001 của nhóm Duarte và cộng sự [21] phát hiện galactan sulfate được
chiết xuất từ rong Đỏ Bostrychia montagnei Brasil có hoạt tính chống lại
virus herpes simplex 1 và 2. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của cấu trúc lên hoạt
tính chống virus của polysaccharide dạng agaran, các nhà khoa học [22] đã
đưa ra kết luận là chỉ có agaran nào có hàm lượng nhóm thế lớn hơn một giá
trị xác định và ở vị trí nhất định mới có hoạt tính chống virus.
Quy trình chiết tách agar thường phải qua các giai đoạn cơ bản sau đây
[13]:
- Giai đoạn 1: Xử lý rong trước khi nấu chiết
Để thu được agar với hiệu suất chiết cao và chất lượng tốt, cần phải xử
lý rong trước khi nấu chiết. Công đoạn này nhằm tách và loại bỏ các chất
màu, tạp chất phi agar có trong cây rong, bào mòn lớp màng bao bên ngoài
cây rong để dễ chiết tách agar.
Xử lý rong trong môi trường acid: Môi trường acid có tác dụng thủy
phân bào mòn màng cellulose của cây rong đồng thời loại sắc tố ra khỏi cây
rong. Mặt khác, acid còn có tác dụng khử khoáng, do đó nâng cao hiệu suất
và giảm thời gian nấu chiết.
Xử lý rong trong môi trường kiềm NaOH, đun nóng: nhằm làm trương
nở tế bào, thủy phân và phá vỡ nhiều lớp tế bào sắc tố, loại lipid và một số
protein tan trong kiềm. Ngoài ra, xử lý kiềm thích hợp cho quá trình chiết

39. 35
agar còn nhằm loại bỏ gốc sulfate trong phân tử agar thông qua phản ứng
đóng vòng từ porphyran (tiền thân của agarobiose) thành 3,6-anhydro-α-L-
galactose, làm tăng độ bền gel [17] theo sơ đồ chuyển hóa được biểu diễn
trong hình 3.7.
Thông thường người sản xuất kết hợp phương pháp xử lý kiềm với xử
lý acid để hạn chế việc làm thất thoát agar và làm giảm sức đông [13].
- Giai đoạn 2: Quá trình nấu chiết
Agar không tan trong nước lạnh và tan được trong nước nóng. Nhưng
nếu phân tử quá dài, việc hòa tan sẽ lâu. Do đó, cần phải thủy phân một phần
để có các phân tử ngắn hơn để dễ tan trong dung dịch chiết. Tuy nhiên, nếu
phản ứng thủy phân xảy ra mạnh thì các phân tử agar mạch quá ngắn sẽ có
khả năng hòa tan trong nước lạnh khó thu hồi được [17].
Nhiệt độ nấu chiết là yếu tố ảnh hưởng lớn đến hiệu suất và sức đông
của agar. Nấu ở nhiệt độ thích hợp có thể phá vỡ được màng tế bào cây rong,
tăng khả năng hòa tan của agar, độ nhớt dịch lọc thấp để dễ lọc, tăng hiệu suất
chiết. Nếu nhiệt độ quá cao, thời gian nấu chiết giảm nhưng agar bị thủy phân
cắt mạch, sức đông giảm. Đồng thời, nhiều tạp chất do cellulose bị nhiệt phân
tạo thành hòa tan vào dịch chiết làm giảm chất lượng của agar. Nếu nhiệt độ
quá thấp thì thời gian nấu chiết kéo dài agar cũng bị thủy phân cắt mạch, sức
đông giảm. Mặt khác, mức độ hòa tan của agar giảm đi, hiệu suất chiết tách
kém.
Có thể sử dụng môi trường trung tính, môi trường kiềm loãng hoặc môi
trường acid loãng để nấu chiết. Khi chiết trong môi trường trung tính, tại nhiệt
độ cao các hợp phần polymer bị cắt mạch, agar sẽ được hòa tan vào nước
nóng tạo dung dịch keo nhớt. Nếu nấu trong môi trường acid loãng thì màng
cellulose bị cắt mạch, bị phân hủy trong môi trường acid nhanh nên giảm
được thời gian nấu và nhiệt độ nấu. Mặt khác, trong môi trường acid mức độ
phân tán các phân tử cao, độ nhớt thấp nên dễ lọc hơn. Môi trường acid có thể
khử khoáng nên khả năng hòa tan của agar cao, do đó hiệu suất cao và dịch
lọc trong hơn. Tuy nhiên, khi nấu trong môi trường acid loãng thì làm cho
agar càng bị cắt mạch mạnh, do đó sức đông giảm đi. Nếu chọn môi trường
kiềm loãng: Với những loài rong chứa nhiều gốc α-L-galactose-6-sulfate thì

40. 36
môi trường kiềm thúc đẩy phản ứng tạo cầu nối 3,6-anhydro-α-L-galactose
nên sức đông gel cao. Tuy nhiên, trước khi nấu chiết đã xử lý rong với kiềm,
nếu tiếp tục nấu chiết trong môi trường kiềm ở nhiệt độ cao thì agar sẽ bị cắt
mạch làm giảm hiệu suất chiết [13].
Thời gian nấu chiết là yếu tố phụ thuộc vào loài rong, phương pháp xử
lý rong trước khi nấu chiết, môi trường nấu chiết và nhiệt độ nấu chiết. Lúc
đầu khi mới nấu thì nồng độ agar thấp, độ chắc của thạch đông thấp. Sau đó
khi tăng thời gian nấu thì nồng độ agar tăng dần lên và độ chắc của thạch tăng
dần. Nếu thời gian nấu kéo dài thì agar dễ bị cắt mạch, do đó độ chắc của
thạch giảm [17].
Tỷ lệ nước nấu (module thủy áp) ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi và độ
chắc của thạch. Module thủy áp quá cao sẽ tạo dung dịch keo có nồng độ
thấp, độ chắc thạch yếu, khó thao tác được các công đoạn sau, nhất là khi cắt
sợi, cắt thỏi, ép, ... Thể tích chứa đựng lớn, cồng kềnh, gây tốn kém cho thao
tác tách nước sau này. Song nó có ưu điểm là dễ lọc, hiệu suất chiết cao. Còn
module thủy áp quá nhỏ thì thạch chắc nhưng nồng độ keo cao, độ nhớt rất
lớn nên rất khó lọc. Tốc độ hòa tan của agar từ nguyên liệu do độ nhớt cao
[13].
- Giai đoạn 3: Tách bã rong và các tạp chất cơ học
Sau khi nấu chiết, ta thu được một dịch nhớt bao gồm agar hòa tan và
một số thành phần phi agar như muối khoáng, sắc tố, cellulose và nhiều tạp
chất khác lẫn theo rong. Do đó, cần phải lọc để loại bỏ những tạp chất không
tan. Cần phải lọc nóng vì khi đó độ nhớ nhỏ và dễ lọc hơn.
- Giai đoạn 4: Tách nước và các tạp chất hòa tan
Agar hòa tan với nồng độ nhỏ trong dịch chiết, cần phải dùng một
lượng lớn nước để nấu chiết. Đây cũng chính là điều khó khăn cho công đoạn
tách nước sau này. Ngoài mục đích tách nước, các tạp chất hòa tan trong nước
cũng được loại ra khỏi agar. Có các phương pháp có thể dùng để tách nước:
bốc hơi, kết tủa, làm đông – tan và ép.
Từ việc phân tích một số quy trình chiết xuất agar trong nước và trên
thế giới cho thấy, để chiết xuất agar từ rong Đỏ có thể sử dụng hai phương
pháp chiết agar không qua giai đoạn xử lý kiềm (chiết tự nhiên (xử lý cồn)) và

41. 37
chiết agar có xử lý kiềm. Tuy nhiên, trong quá trình chiết xuất agar, các nhà
sản xuất thường chỉ quan tâm đến việc xử lý nguyên liệu Agarophite để chiết
thành phần agar có khả năng tạo gel cao, các dung dịch lọc khi xử lý rong ban
đầu thường bị loại bỏ. Trong khi đó, các dung dịch này có thể chứa các hợp
chất agaran sulfate [34] có hoạt tính sinh học. Vì vậy, cần thiết phải kết hợp
phương pháp chiết agar [35] và phương pháp thu hồi các polysaccharide
không tạo gel này trong quá trình xử lý rong [22] để tận dụng được nhiều
thành phần trong nguyên liệu.
1.4.2. Tình hình nghiên cứu agar trong nước
Ở Việt Nam, agar được sản xuất bắt đầu từ năm 1960. Sản xuất công nghiệp
agar bắt đầu tại miền Bắc Việt Nam (Hải Phòng). Nguyên liệu chủ yếu để sản
xuất agar ở Việt Nam là rong Gracilaria asiatica (rong câu chỉ vàng),
Gracilaria tenuistipitata (rong câu mảnh) và Gelidiella acerosa (rong rễ tre).
Gần đây, nhóm nghiên cứu của Phân Viện Vật liệu Nha Trang đã nghiên cứu
sử dụng Gracilaria Heteroclada làm nguyên liệu sản xuất agar [7]. Nhưng
nhìn chung sản lượng không cao và chất lượng agar chỉ đạt tiêu chuẩn thực
phẩm, không dùng trong lĩnh vực đòi hỏi chất lượng cao và chưa đủ khả năng
để cạnh tranh với agar nước ngoài.
Vào năm 1997, nhóm tác giả Masao Ohno, Huỳnh Quang Năng và
Susumu Hirase [35] đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học và chất lượng
agar trong một số loài rong câu Gracilaria tenuistipitata và Gracilaria
Heteroclada của Việt Nam, thu thập tại các vùng biển Hải Phòng, Sầm Sơn,
Huế, Đồng Xuân, Ninh Hải. Các tác giả đã thực hiện quy trình như sau: cân
40g rong khô, xử lý bằng 2 Lít dung dịch NaOH 6% ở nhiệt độ 70o
C và 80o
C
trong 3 giờ và rửa dưới vòi nước trong 30 phút. Sau đó rong được xử lý tiếp
bằng 2 lít dung dịch H2SO4 0,1 lít – 0,18% trong 1 giờ và rửa lại dưới vòi
nước trong 2 giờ. Mẫu rong sau khi xử lý đem chiết với 1,5 lít nước cất (pH =
7-8) ở nhiệt độ 100o
C trong 1 giờ để thu được dung dịch agar, lọc và lấy dung
dịch, loại nước khỏi dung dịch này bằng cách làm lạnh, xả đá, sấy khô thu
được agar thành phẩm. Trong quy trình trên, các tác giả đã tiến hành thực
hiện so sánh hàm lượng agar chiết được và chất lượng gel, trong đó có khảo
sát sức đông gel agar để tìm điều kiện thích hợp khi tách chiết agar từ các loài

42. 38
rong này. Yếu tố được thay đổi để khảo sát quy trình chiết đó là nhiệt độ xử lý
kiềm NaOH. Kết quả thu được là điều kiện thích hợp để chiết agar từ rong câu
mảnh Gracilaria Tenuistipitata ở Hải Phòng, Sầm Sơn, Huế là xử lý rong
trong kiềm NaOH 6% đun nóng đến 80o
C và acid H2SO4 dùng để xử lý thích
hợp ở pH = 2,5. Trong khi đó, điều kiện thích hợp để chiết agar từ rong câu
cước Gracilaria Heteroclada ở Đồng Xuân, Ninh Hải là xử lý rong trong
kiềm NaOH 6% đun nóng đến 70o
C, và acid H2SO4 dùng để xử lý thích hợp ở
pH = 2,5.
Như vậy, nguồn nguyên liệu Agarophite (chi Gracilaria) ở nước ta nói
chung có hàm lượng agar và chất lượng agar (sức đông) dao động tùy theo
chiết tự nhiên (xử lý cồn) hay có xử lý kiềm. Điều này được giải thích là do
đặc điểm của rong Gracilaria có hàm lượng agarose thấp, trong khi hàm
lượng sulfate lại cao. Công nghệ sản xuất agar tại Việt Nam về cơ bản không
khác với quy trình sản xuất agar của thế giới. Tuy nhiên do đặc tính nguyên
nguyên liệu rong đầu vào có chất lượng thấp nên trong quy trình sản xuất agar
từ rong câu Việt Nam buộc phải có công đoạn xử lý kiềm nhằm tăng sức đông
của agar. Nhưng biện pháp đó cũng có bất lợi bởi vì khi dùng kiềm mặc dù
hàm lượng LA có tăng lên nhiều nhưng hiệu suất thu hồi agar bị giảm, do các
phân tử polysaccharide mạch dài có thể bị bẽ gãy và tan vào dung dịch.

43. 39
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu về agar có trong 02
mẫu rong, là Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia. Trong đó:
- Gracilaria Heteroclada xuất xứ tại đầm Ô Loan - huyện Tuy An
và đầm Cù Mông, vịnh Xuân Đài, tỉnh Phú Yên
Hình 2.1. Đầm Cù Mông – Xuân Đài – Phú Yên
- Gracilaria Salicornia xuất xứ tại biển Hòn Chồng – Vĩnh Phước,
thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa
Hình 2.2. Hình ảnh bản đồ Hòn Chồng – Nha Trang – Khánh Hòa

44. 40
Các mẫu rong này được thu hái vào khoảng tháng 3 đến tháng 5 năm
2018, được giám định bởi TS. Võ Thành Trung (Viện nghiên cứu và ứng
dụng Công nghệ Nha Trang). Mẫu được lưu trữ tại phòng Hóa phân tích –
Viện nghiên cứu và ứng dụng Công nghệ Nha Trang – Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam.
Sau khi thu thập, rong được phơi trên cát ở bờ biển cho khô bớt, chính
vì vậy, rong còn chứa hàm lượng muối và cát lớn nên có thể bảo quản được
rất lâu. Sau đó, rong được rửa lại bằng nước ngọt nhiều lần để sạch hết cát, ốc
và muối còn lại, đem phơi âm can cho khô bớt rồi đem sấy khô. Cuối cùng,
rong được bảo quản nơi khô ráo và ít ánh sáng, trong túi bóng kín.
Hình 2.3. Sơ đồ sơ chế rong và lưu giữ mẫu

45. 41
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp tách chiết polysaccharide dạng agar
Nguyên liệu: Rong phơi khô, bảo quản nơi khô ráo
Hóa chất: Nước cất, dung dịch NaOH các nồng độ, dung dịch H2SO4 0,01% -
0,1%
Dụng cụ: Cốc thủy tinh (các thể tích khác nhau), que khuấy thủy tinh, túi lọc,
bếp điện...
Quy trình chiết tách agar cơ bản:
Hình 2.4. Quy trình chiết tách agar cơ bản [13]
Dựa trên cơ sở tham khảo các tài liệu liên quan, chúng tôi đưa ra quy
trình chiết sau:
 Chiết agar tự nhiên:
Mẫu rong khô (15g) được ngâm trong cồn khoảng 1giờ để khử màu,
sau đó được ngâm trong 400mL nước cất trong cốc thủy tinh để qua đêm.
Quá trình chiết được tiến hành bằng việc bổ sung thêm nước và đun sôi
hỗn hợp trong cốc thủy tinh trên bếp điện với nhiệt độ cố định ở 80o
C liên tục
trong 3 giờ. Sau đó lọc thu lấy dịch bằng vải lọc, vắt kiệt lượng lỏng còn lại

46. 42
trong rong và lọc lại lần hai thu được dịch lọc có màu vàng nâu và độ nhớt
lớn khi nguội dần.
Dịch lọc được để nguội hẳn và được kết tủa bằng cồn trên bếp khuấy từ
gia nhiệt. Kết tủa thu được là dạng keo sệt màu trắng hơi vàng đến vàng nâu.
Kết tủa được để qua đêm để kết khối, thuận lợi cho quá trình tách dung
môi. Kết tủa sau khi qua đêm sẽ kết khối lại và lơ lửng trong hỗn hợp. Dung
môi được loại bớt một phần bằng cách chắt bớt ra sau đó được loại hoàn toàn
bằng máy ly tâm cao tốc với tốc độ 6000 vòng/phút và được thực hiện trong ít
nhất 10 phút, thu được keo polysaccharide màu vàng nâu, giống thạch. Sau đó
được đem đông khô để loại hết dung môi thu được polysaccharide khô, giòn,
có màu trắng, vàng đến vàng nâu.
Tinh chế polysaccharide: Polysaccharide khô thu được sẽ được cho vào
lọ thủy tinh rồi đem đun cho nóng chảy trên bếp khuấy từ gia nhiệt (vừa
khuấy vừa đun) cho đến khi tan chảy hoàn toàn. Các cặn còn lại trong
polysaccharides sẽ tách ra và nổi lên trên bề mặt keo hay chìm xuống dưới.
Các cặn này được tách ra bằng cách cho ly tâm nóng keo tan chảy, khi đó cặn
sẽ được loại bỏ và thu được polysaccharide sạch.
 Chiết agar xử lý kiềm :
Quy trình chiết tương tự như chiết tự nhiên (xử lý cồn) nhưng thay thế quy
trình xử lý cồn bằng quy trình xử lý kiềm NaOH với nồng độ 6%.
2.2.2. Phương pháp xác định thành phần hóa học của polysaccharide
dạng agar
2.2.2.1. Xác định hàm lượng Carbohidrate
Bằng phương pháp Phenol-Sulfuric [37]:
Lấy 2 mL dung dịch cần xác định có nồng độ trong khoảng 40-100
µg/mL, thêm 0,1 mL dung dịch cồn phenol, lắc cho đến khi trong suốt. Thêm
10 mL acid sulfuric đậm đặc, lắc rồi để nguội, sau đó đun cách thủy ở nhiệt
độ 60o
C trong 10 phút, để nguội, đo trên UV ở bước sóng 484,5 nm.
2.2.2.2. Xác định hàm lượng 3,6-anhydro-L-galactopyranose
Bằng phương pháp Recorcinol [38], coi fructose như là chất chuẩn:
Lấy 1 mL dung dịch cần xác định có nồng độ từ 0 đến 0,25 µmol/mL.
Thêm 10 mL dung dịch thuốc thử Recorcinol – axetan ở nhiệt độ 20o
C, lắc

47. 43
trong 4 phút. Sau đó đun nóng đến 80o
C trong 10 phút, làm lạnh bằng nước đá
trong 1,5 phút, đo trên máy UV-VIS ở bước sóng 555 nm. Mẫu đo tránh tiếp
xúc với ánh sáng mạnh.
2.2.2.3. Xác định độ ẩm của rong
Theo phương pháp của Hiệp hội phân tích Mỹ AOAC.
Nguyên tắc của phương pháp xác định độ ẩm: dùng nhiệt để làm bay
hơi nước có trong mẫu. Từ chênh lệch khối lượng mẫu trước và sau khi sấy,
tính được độ ẩm của mẫu.
Thực nghiệm: Cân khoảng 5g mẫu trong đĩa đáy bằng, sấy ở nhiệt độ
100º-1100
C tại áp suất khí quyển và sấy đến khối lượng không đổi. Độ ẩm của
mẫu được tính theo công thức:
Độ ẩm (%) = *100%
2.2.2.4. Xác định hàm lượng sulfate
Bằng phương pháp khối lượng [18]. ẫu được thủy phân hoàn toàn bằng
dung dịch HCl 1M ở nhiệt độ 100°C trong 8 giờ. Dung dịch BaCl2 1M
được thêm dư vào dung dịch thủy phân để tạo kết tủa BaSO4, ly tâm lấy
tủa, sấy tủa ở 80ºC đến khối lượng không đổi. Sau đó định lượng
BaSO4. Hàm lượng sulfate có trong mẫu được tính theo công thức sau:
DS(%) =
DS: hàm lượng sulfate (%);
mBaSO4: khối lượng của BaSO4 (g);
m: khối lượng mẫu thử nghiệm (g).
2.2.2.5. Xác định hàm lượng Agarose
Hòa tan polysacchaide dạng agar trong nước nóng có nồng độ 1mg/ml,
sau đó lấy 1 ml dung dịch này cho vào 2 ml nhựa p-Sephadex A50. Sau đó
khuấy nhẹ, để qua đêm và đem ly tâm lấy dung dịch nước có chứa agarose
đem phân tích định lượng carbohydrate.

48. 44
2.2.3. Phương pháp phân tích cấu trúc polysaccharide dạng agar
Phổ hồng ngoại (IR) được đo trên máy FT-IR Affinity-1S SHIMADZU
tại Bộ môn Hóa vô cơ – Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Hà Nội.
Đối với phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Mẫu nghiên cứu được hòa
tan trong dung môi D2O và được đo phổ NMR ở nhiệt độ 70ºC với chế độ đo
khử tín hiệu của nước, trên máy Bruker AVANCE 500MHz tại Viện Hóa học
– Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, DSS (acid 4,4-dimethyl-
4-silapentane-1-sulfonic) được dùng làm chất chuẩn nội.
2.2.4. Phương pháp khảo sát tính chất gel
Sức đông (hay độ bền khả năng chịu đựng của gel) là trọng lực tối đa
gel chịu được không bị rạn vỡ (g/cm2
). Để xác định sức đông gel agar, trước
hết phải điều chế dung dịch agar có nồng độ 1,5%. Đổ dung dịch vào ống
khuôn, để yên 30 phút cho đông lại. Sau đó, gel được giữ ở 20o
C qua đêm.
Các thông số sức đông, nhiệt độ đông, nhiệt độ tan đông, độ nhớt của
dung dịch polysaccharide 1% trên máy Rheo Meter model CR-500DX. Sức
đông của gel (g/cm2
) được xác định bằng cách sử dụng thiết bị kiểm tra Gel
Colloid Marine với đường kính 1,05 cm và tốc độ từ 16 – 18cm/phút. Nhiệt
độ nóng chảy được xác định bằng cách đun trong nồi cách thủy cho đến khi
polysaccharide tan chảy trong các ống chứa 10ml sol agar 1,5%. Điểm nóng
chảy là nhiệt độ mà tại đó các hạt thủy tinh màu (rơi trên bề mặt gel trước khi
các ống nghiệm được đặt trong nồi cách thủy) chạm vào đáy ống nghiệm.

49. 45
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. CHIẾT POLYSACCHARIDE VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA
HỌC CHÍNH
3.1.1. Kết quả của việc chiết polysaccharide và phân tích thành
phần hóa học
Hình 3.1. Hình ảnh nấu chiết agar từ rong Đỏ tại phòng thí nghiệm Hóa phân
tích – Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang
Đối tượng: rong Đỏ Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia
Quy trình tìm hiệu suất Agar- Agarose – Agaropectin
Hiệu suất chiết polysaccharide: được tính với công thức
Hiệu suất chiết =
Trong đó, khối lượng polysaccharide và rong khô ban đầu có cùng đơn vị
khối lượng.
Bảng 3.1. Số liệu từ quá trình chiết tách polysaccharide
Gracilaria Salicornia Gracilaria Heteroclada
Khối lượng rong khô đem
chiết
10 gram 10 gram
Khối lượng polysaccharides
chiết tự nhiên (xử lý cồn)
2,76 gram 2,85 gram

50. 46
Hiệu suất chiết
polysaccharides
27,6% 28,5%
Khối lượng polysaccharides
chiết xử lý kiềm
1,89 gram 2,19 gram
Hiệu suất chiết
polysaccharides
18,9% 21,9%
Sự so sánh cụ thể được biểu diễn trong giãn đồ cột
28.5
27.6
21.9
18.9
0
5
10
15
20
25
30
Gra. Heteroclada Gra. Salicornia
%
Hiệu suất chiết Polysaccharide
Chiết tựnhiên Chiết có xửlýkiềm
Hình 3.2. Biểu đồ so sánh hàm lượng agar chiết theo phương
pháp tự nhiên và chiết xử lý kiềm của hai loài rong Gracilaria
Heteroclada và Gracilaria Salicornia
Từ số liệu bảng 3.1 và hình 3.2, hiệu suất chiết tự nhiên (xử lý cồn) của 2 loài
rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia tương ứng là 28,5% và
27,6% và hiệu suất chiết xử lý kiềm tương ứng là 21,9% và 18,9%. Trong đó
chiết tự nhiên (xử lý cồn) có hiệu suất chiết cao hơn chiết có xử lý kiềm.
Nguyên nhân của điều này là do việc nấu chiết trong môi trường kiềm ở nhiệt
độ cao sẽ khiến agar bị cắt mạch mạnh và tan ra trong nước rửa nguyên liệu,
làm giảm hiệu suất nấu chiết [13]. Theo một số tài liệu tham khảo thì hiệu
suất chiết tự nhiên (xử lý cồn) của rong biển Việt Nam tương đương với rong
biển vùng lân cận, nhưng lại thấp hơn so với rong biển ở vùng ôn đới. Gần

51. 47
đây, nhóm nghiên cứu của Phân viện Vật liệu Nha Trang đã nghiên cứu sử
dụng một số loài rong Gracilaria làm nguyên liệu sản xuất agar [7]. Nhưng
nhìn chung, sản lượng không cao và chất lượng agar chỉ đạt tiêu chuẩn thực
phẩm, không dùng được trong các lĩnh vực đòi hỏi chất lượng cao và chưa đủ
khả năng để cạnh tranh với agar nước ngoài.
Để xác định loại cấu trúc chung của polysaccharide và lựa chọn các
phương pháp thích hợp để nghiên cứu cấu trúc định lượng cũng như định
hướng trong việc xác định tính chất gel và hoạt tính sinh học của
polysaccharide chiết ở nhiệt độ khác nhau, chúng tôi tiến hành phân tích
thành phần hóa học chính (agarose, sulfate, 3,6-anhydro-α-L-galactose và các
dẫn xuất của chúng) của polysaccharide bằng phương pháp truyền thống là
dựng đường chuẩn galactose bằng phương pháp đo mật độ quang. Kết quả đo
mật độ quang được thể hiện qua bảng 3.2. và đường chuẩn hình 3.6.
Bảng 3.2. Giá trị mật độ quang tương ứng với nồng độ fructozo
Nồng độ
fructozo
(µmol/mL)
0,05 0,1 0,2 0,25
Mật độ quang 0,241 0,282 0,367 0,409
Hình 3.3. Đồ thị đường chuẩn Nồng độ (µmol/mL) – Mật độ quang.
Sử dụng phần mềm Excel, chúng ta nhập số liệu để có được phương
trình đường chuẩn như hình 3.6. Phương trình có dạng: D = 0,84C + 0,199 ,
trong đó C: nồng độ (µmol/mL) và D: mật độ quang