Nghiên cứu nhân giống cây bưởi diễn (Citrus Grandis L.) bằng kỹ thuật nuôi cấu in vitro (Luận văn thạc sĩ).docx

THÁI NGUYÊN - 2017
Viết đề tài giá sinh viên – ZALO:0973.287.149-TEAMLUANVAN.COM
Tải tài liệu tại kết bạn zalo : 0973.287.149
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
HOÀNG THỊ XUÂN
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY BƯỞI DIỄN
(CITRUS GRANDIS L.) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY
IN VITRO
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2017
Tải tài liệu tại kết bạn zalo : 0973.287.149
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
HOÀNG THỊ XUÂN
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY BƯỞI DIỄN
(CITRUS GRANDIS L.) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY
IN VITRO
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.01.21
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Thu Ngà

i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Mọi trích dẫn
trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận
văn là trung thực và chưa được ai công bố.
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2017
Tác giả luận văn
Hoàng Thị Xuân

ii
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn
Thị Thu Ngà đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong
quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của kĩ thuật viên
Trần Thị Hồng (Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật - Khoa Sinh học
Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên). Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý
báu đó.
Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục sinh học
Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi học tập
và hoàn thành luận văn.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, cùng tất cả các thầy cô, bạn bè đã động
viên, khuyến khích và giúp đỡ tôi trong tiến trình học tập và hoàn thành
luận văn.
Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôi mong
nhận được sự đóng góp quý báu từ thầy cô và bạn bè để tôi có thể có được kết quả
tốt hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2017
Tác giả luận văn
Hoàng Thị Xuân

iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN.................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN......................................................................................................ii
MỤC LỤC ..........................................................................................................iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT.....................................iv
DANH MỤC BẢNG BIỂU.................................................................................v
DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................vi
MỞ ĐẦU.............................................................................................................1
1. Đặt vấn đề........................................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................2
Chương 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU........................................................3
1.1. Nguồn gốc và phân loại cây bưởi................................................................3
1.1.1. Nguồn gốc..................................................................................................3
1.1.2. Phân loại ....................................................................................................3
1.1.3. Đặc điểm hình thái.....................................................................................4
1.2.4. Cây bưởi Diễn............................................................................................5
1.2. Thành phần hóa học và giá trị sử dụng của cây bưởi ...................................7
1.2.1. Thành phần hóa học...................................................................................7
1.2.2. Giá trị sử dụng của cây bưởi......................................................................7
1.3. Một số giống bưởi chủ yếu trên thế giới và ở Việt Nam..............................8
1.3.1. Trên thế giới...............................................................................................8
1.3.2. Ở Việt Nam................................................................................................9
1.4. Tình hình sản xuất bưởi trên thế giới và Việt Nam....................................10
1.4.1 Tình hình sản xuất bưởi trên thế giới........................................................10
1.4.2. Tình hình sản xuất bưởi ở Việt Nam .......................................................11
1.5. Kĩ thuật nhân giống in vitro........................................................................13
1.6. Một số thành tựu trong nhân giống cây có múi..........................................19
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................22
2.1. Vật liệu và hóa chất ....................................................................................22

iv
iv
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu..................................................................................22
2.1.2. Hóa chất, thiết bị......................................................................................22
2.2. Địa điểm nghiên cứu...................................................................................23
2.3.Phương pháp nghiên cứu .............................................................................23
2.3.1. Phương pháp pha môi trường và nuôi cấy...............................................23
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy in vitro.................................................................23
2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu .......................................................................26
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................27
3.1. Kết quả khử trùng hạt cây bưởi Diễn .........................................................27
3.2. Kết quả tạo chồi in vitro cây bưởi Diễn......................................................28
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy..........29
3.2.2. Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy ....................32
3.2.3. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và kinetin đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy....34
3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến sự kéo dài chồi ở cây
bưởi Diễn ...........................................................................................................36
3.4. Kết quả tạo cây bưởi Diễn in vitro hoàn chỉnh...........................................39
3.4.1. Ảnh hưởng của IBA đến sự phát sinh rễ cây bưởi Diễn..........................39
3.4.2. Ảnh hưởng của α-NAA đến sự phát sinh rễ ở cây bưởi Diễn .................41
3.5. Kết quả ra cây ngoài vườn ươm .................................................................42
3.5.1. Giai đoạn bầu đất.....................................................................................42
3.5.2. Ra cây ngoài vườn ươm...........................................................................44
1. Kết luận..........................................................................................................46
2. Đề nghị...........................................................................................................46
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................47

iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D : 2,4D-Dichlorophenoxy Acetic Acid
BAP : 6-Benzyl Amino Purin
Cs : Cộng sự
ĐC : Đối chứng
MS : Murashige - Skoog (1962)
IAA : Indoly Acetic Acid
IBA : Indoly Butyric Acid
NAA : α - Napthalen Acetic Acid
GA3 : Gibberellin
Kinetin : 6-furturylamino purine

v
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Tình hình sản xuất cây ăn quả có múi ở Việt Nam giai đoạn
2010- 2014.......................................................................................12
Bảng 2.1. Thành phần cơ bản của môi trường MS............................................22
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng javen đến sự nảy mầm
của hạt cây bưởi Diễn (sau 4 tuần)..................................................27
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy .................30
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy của
mẫu cấy............................................................................................35
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của GA3 đến sự kéo dài chồi cây bưởi Diễn .................37
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của IBA đến sự phát sinh rễ cây bưởi Diễn (sau 8
tuần).................................................................................................40
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của α-NAA đến sự phát sinh rễ ở cây bưởi Diễn...........41
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sinh trưởng của cây bưởi
Diễn in vitro (sau 4 tuần).................................................................43
Bảng 3.9. Kết quả ra cây ngoài vườn ươm........................................................44

vi
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt cây
bưởi Diễn (sau 4 tuần).......................................................................28
Hình 3.2. Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi của mẫu cấy (sau 8
tuần)...................................................................................................31
Hình 3.3. Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy ..............34
Hình 3.4. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và kinetin đến sự phát sinh chồi của
mẫu cấy (sau 8 tuần)..........................................................................35
Hình 3.5. Ảnh hưởng của GA3 đến sự kéo dài chồi cây bưởi Diễn (sau 8
tuần)...................................................................................................38
Hình 3.6. Ảnh hưởng của IBA đến sự phát sinh chồi cây bưởi Diễn................40
Hình 3.7. Ảnh hưởng của α-NAA đến sự phát sinh rễ ở cây bưởi Diễn (sau
8 tuần)................................................................................................42
Hình 3.8. Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sinh trưởng cây bưởi
Diễn in vitro (sau 4 tuần)...................................................................43
Hình 3.9. Cây bưởi Diễn in vitro trồng ở vườn ươm.........................................44

1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây Bưởi (Citrus grandis L.) là một trong những loại cây ăn quả thương mại
chủ lực, có lịch sử phát triển lâu đời ở nước ta. Do có phổ thích nghi rộng nên được
trồng trên khắp các vùng sinh thái của cả nước từ Bắc vào Nam tạo nên những vùng
quả đặc sản nổi tiếng như: Bưởi Đoan Hùng (Phú Thọ), bưởi Diễn (Từ Liêm, Hà
Nội), bưởi Phúc Trạch (Hà Tĩnh), bưởi Da Xanh (Bến Tre), bưởi Đỏ (Thanh Hóa),
bưởi Năm Roi,…. Mỗi loại bưởi có hương vị đặc trưng riêng. Diện tích và sản
lượng cây bưởi tăng không chỉ tạo cảnh quan đẹp, góp phần bảo vệ môi trường sinh
thái bền vững, nâng cao hiệu quả kinh tế cho nông hộ mà còn đáp ứng nhu cầu xuất
khẩu, tạo điều kiện chuyển dịch cơ cấu kinh tế nông nghiệp, thực hiện công nghiệp
hóa, hiện đại hóa nông nghiệp nông thôn. Nhiều nhà vườn trồng bưởi sau 4 - 5 năm
có thể thu lãi 40 - 100 triệu đồng/ha, năng suất cao tới 250 quả/cây ở vườn có mật
độ khoảng 1000 - 1200 cây/ha [8].
Cây bưởi là loại cây ăn quả quý, có giá trị dinh dưỡng cao. Trong lá, hoa, và
vỏ quả chứa nhiều tinh dầu; trong vỏ quả bưởi còn có pectin, narigin, men tiêu hóa
peroxydaza, amilaza,… Quả bưởi có vị ngọt mát, chứa nhiều vitamin, chất khoáng
cần thiết cho cơ thể con người [23]. Chính vì vậy, cây bưởi còn là cây dược liệu
quan trọng có nhiều ứng dụng trong y học cổ truyền của dân tộc.
Bưởi thuộc loại cây ăn quả lâu năm chịu ảnh hưởng rất rõ bởi điều kiện ngoại
cảnh, biểu hiện qua sinh trưởng, phát triển, năng suất và phẩm chất của quả. Hiện
nay, Việt Nam cũng như nhiều nước trên thế giới đang rơi vào tình trạng nguồn gen
cây ăn quả đang dần suy giảm, đặc biệt là các loại cây ăn quả quý. Đứng trước việc
đô thị hóa, giới thiệu giống cây trồng mới và biến đổi khí hậu, nguy cơ xói mòn
nguồn gen đang diễn ra nhanh chóng. Diện tích cây ăn quả phá đi hàng năm cũng
không nhỏ do còn gặp rất nhiều khó khăn về dịch bệnh và chất lượng giống. Nhiều
nông trại sản xuất giống cây áp dụng phương pháp truyền thống như: chiết cành,
ghép cành, gieo hạt,...[3], [15]. Tuy nhiên cây giống được xuất vườn chưa cao, thời
gian sinh trưởng kéo dài, kết quả đạt được không ổn định, chất lượng quả không

2
đồng đều... Một số giải pháp trước mắt nhằm duy trì nguồn gen quý đã được triển
khai nhưng hiệu quả chưa cao, chưa đồng bộ.
Để giữ được và khai thác tốt hơn các vùng cây ăn quả truyền thống, đáp ứng
nhu cầu giống tốt cho thị trường trong nước và tiến tới xuất khẩu cần áp dụng các quy
trình kỹ thuật mới, dùng giống tốt, sạch bệnh. Nhân giống bằng các phương pháp
công nghệ tiên tiến có ý nghĩa vô cùng quan trọng và hết sức cần thiết.
Việc áp dụng các phương pháp kĩ thuật trong đó có phương pháp nhân giống
in vitro có nhiều ưu điểm: Đảm bảo được các đặc điểm di truyền tốt của cây mẹ, tạo
quần thể cây con đồng nhất, tỷ lệ nhân giống cao, số lượng giống lớn, tạo nguồn
giống sạch bệnh (nuôi cấy trong điều kiện vô trùng), tăng tuổi thọ cho cây, thời gian
nhân giống nhanh.
Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên
cứu nhân giống cây bưởi Diễn (Citrus grandis L.) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro”
nhằm tạo giống cây tốt, sạch bệnh phục vụ sản xuất và mở rộng diện tích cây có múi.
Kết quả nghiên cứu làm cơ sở duy trì phẩm chất tốt của cây mẹ để nhân giống ra sản
xuất đại trà, góp phần giữ vững thương hiệu bưởi Diễn. Đồng thời bổ sung thêm kiến
thức nhân giống về cây bưởi Diễn nói riêng và cây ăn quả nói chung.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được điều kiện khử trùng và môi trường nhân giống cây bưởi Diễn
trong ống nghiệm.
Xác định được giá thể phù hợp cho việc ra cây ngoài vườn ươm.
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Nghiên cứu phương pháp khử trùng hạt bưởi Diễn nhằm tạo nguồn mẫu
sạch trong ống nghiệm.
(2) Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của BAP, kinetin và phối hợp BAP +
kinetin đến sự phát sinh đa chồi cây bưởi Diễn trong ống nghiệm.
(3) Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến sự kéo dài chồi của cây bưởi Diễn
trong ống nghiệm.
(4) Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của α-NAA và IBA tới sự tạo cây bưởi
Diễn hoàn chỉnh trong ống nghiệm.
(5) Nghiên cứu quá trình ra cây ngoài vườn ươm.

3
Chương 1
TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU
1.1. Nguồn gốc và phân loại cây bưởi
1.1.1. Nguồn gốc
Cây có múi nói chung và cây bưởi nói riêng có lịch sử phát triển lâu đời. Có ý
kiến cho rằng: Bưởi (Citrus grandis L.) có nguồn gốc ở Malaysia, Ấn Độ. Thuyền
trưởng Shaddock (người Ấn Độ) đã mang giống bưởi tới trồng ở vùng biển Caribe,
sau đó theo gót các thủy thủ, cây bưởi được giới thiệu ở Palestin vào năm 900 sau
công nguyên và ở châu Âu sau thời gian đó. Sau đó được đem trồng ở rất nhiều nước
trên thế giới với mục đích thương mại. Đặc biệt ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới,
trải dài từ 40o
vĩ bắc xuống 40o
vĩ nam [31].
Tác giả Giucovki cho rằng nguồn gốc của bưởi có thể là ở quần đảo
Laxongdơ. Tác giả Chawalit Niyomdham cũng cho rằng bưởi có nguồn gốc ở
Malaysia, sau đó lan sang Indonesia, Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Địa Trung Hải
và Mỹ,... vùng sản xuất chính là ở các nước Phương Đông (Trung Quốc, Thái Lan,
Việt Nam,...) [40], [43].
Như vậy, cho đến nay nguồn gốc của cây bưởi vẫn chưa được thống nhất.
Bưởi có thể có nguồn gốc từ Ấn Độ, Trung Quốc, Malaysia,… Ngày nay bưởi được
trồng tập trung nhiều ở một số nước thuộc châu Á như: Ấn độ, Malaysia, Philippin,
Thái Lan, Việt Nam và miền Nam Trung Quốc. Khí hậu á nhiệt đới hạn chế được
nhiều loại sâu bệnh hại nên cây có múi ở những vùng này ngày càng có xu hướng
tăng nhanh, phát triển mạnh về diện tích, năng suất, sản lượng và chất lượng quả [39].
1.1.2. Phân loại
Sự phân loại cây có múi khá phức tạp vì có rất nhiều giống trong sản xuất và
các dạng con lai của các giống này, hiện tượng hạt đa phôi, đột biến và hiện tượng đa
bội thể cũng là những nhân tố gây khó khăn cho việc phân loại cam quýt. Hiện nay
tồn tại hai hệ thống phân loại cây có múi được nhiều người áp dụng: Tác giả Tanaka
cho rằng cam quýt gồm 160 - 162 loài, ông quan sát thực tiễn sản xuất và cho rằng
các giống cam quýt qua trồng trọt đã có nhiều biến dị trở thành giống mới. Tác giả
Swingle đã phân chia cam quýt ra thành 16 loài, bảng phân loại của Swingle đơn giản

4
hơn nên được sử dụng nhiều hơn, tuy nhiên các nhà khoa học vẫn phải dùng bảng
phân loại của Tanaka để gọi tên các giống cam quýt vì bảng phân loại này chi tiết đến
từng giống.
Cây bưởi (danh pháp khoa học: Citrus grandis L.) thuộc loài: Citrus Citrus
grandis, chi Citrus, họ Rutaceae, bộ Sapindales (tên khác: Citrus paradisi) [31], [59].
1.1.3. Đặc điểm hình thái
Bưởi thuộc cây thân gỗ gồm các bộ phận chính là: Rễ, thân, cành, lá, hoa, quả,
và hạt. Hình dạng ngoài của cây thường có hình chóp.
Rễ cây bưởi là rễ cọc. Cây mọc từ hạt, rễ chính ăn sâu xuống đất phân hóa
thành 2-3 rễ lớn khác có nhiều rễ phụ. Trồng bằng cành, cây không có rễ chính rõ,
nhiều rễ bên, rễ phát triển to nhưng không đâm thẳng xuống.
Thân cây bưởi thường có tiết diện tròn, vỏ cây có chứa nhiều túi tinh dầu
thơm,có gai, cao khoảng 3 - 5 m, có nhiều tán nhỏ. Ở nước ta cây bưởi chủ yếu trồng
bằng chiết ghép cành nên thường có nhiều cành gốc, có cây có tới 7- 8 cành hay 10
cành, đường kính tán 4 - 6 m.
Sinh trưởng cành của cây có múi nói chung và bưởi nói riêng phụ thuộc vào tuổi
cây, điều kiện môi trường và kỹ thuật chăm sóc. Nhìn chung cây ít tuổi chưa cho quả
sinh trưởng của cành. Sự phát sinh lộc thường xảy ra quanh năm, nghĩa là một năm
thường có nhiều đợt cành xuất hiện. Khi cây trưởng thành đã cho quả thì thường chỉ có
4 đợt lộc trong năm đó là lộc xuân, lộc hè, lộc thu và lộc đông. Ở những vùng khô hạn
hoặc rét sớm thì chỉ có 3 đợt lộc xuân, hè và thu không có lộc đông.
Lộc xuân: Xuất hiện từ tháng 2 đến tháng 4 hàng năm. Số lượng cành xuân
nhiều, cành ngắn. Cành xuân mang hoa gọi là cành quả.
Lộc hè: Xuất hiện từ tháng 5 đến tháng 7 hàng năm, sinh trưởng không đều,
cành thường to, dài, đốt thưa. Cành hè: là cành sinh dưỡng có nhiệm vụ cung cấp
dinh dưỡng cho cành quả và là cành mẹ của cành thu.
Lộc thu: Xuất hiện từ tháng 8 đến tháng 10 hàng năm, Cành không mang quả
và phần lớn từ cành hè, có vai trò quan trọng trong việc mở rộng tán,tăng cường khả
năng quang hợp của cây.
Lộc đông: Xuất hiện vào tháng 11 và tháng 12 hàng năm, đợt cành này ít, cành
ngắn, lá vàng xanh.

5
Cây bưởi có bộ lá xanh quanh năm, có cây lá sống đến 15 tháng, và có thể
sống tới 3 - 5 năm. Lá có màu xanh đậm, trong lá có nhiều tinh dầu, khi vò lá có mùi
thơm. Dạng lá đơn, eo lá khá lớn có hình tim bầu, đỉnh lá chia thuỳ rõ. Lá bưởi vừa là
cơ quan quang hợp, hô hấp, vừa là nơi dự trữ. Nhà trồng bưởi có thể nhìn bộ lá để
biết tình trạng của cây để có chế độ chăm sóc hợp lý giúp cây phát triển tốt nhất.
Hoa bưởi hình thành ở nách lá,thường có màu trắng và có mùi hương rất dễ
chịu. Cây bưởi thụ phấn nhờ côn trùng vì vậy cấu trúc hoa hoàn toàn thích ứng với sự
thụ phấn đó. Hoa bưởi mọc thành cụm, lưỡng tính, hoa đều, cánh hoa rời nhau và
mẫu bốn, bầu có từ 13 - 15 noãn, nhị hoa nhiều gấp 3 - 4 lần số cánh hoa. Có 2 loại
hoa: hoa đơn và hoa chùm (6 - 10 bông), cây có hoa đơn thường có tỉ lệ đậu quả cao
hơn. Trên một cây, cành ngọn thường nở hoa sớm hơn và có thể nở đến 60 nghìn hoa.
Theo Trần Văn Hâu (2009), khả năng cho trái của cây có múi tùy thuộc rất lớn vào lá
và diện tích lá được hình thành khi ra hoa và các đợt sinh trưởng [8].
Quả bưởi là loại quả to nhất trong họ cam quýt, là dạng quả mọng, mỗi quả
gồm có: Vỏ quả, thịt quả và hạt. Trọng lượng trung bình đạt từ 0,8 - 1,4kg tùy giống
bưởi. Quả hình cầu to, vỏ dầy, có nhiều túi dầu, màu sắc tùy theo giống. Thịt quả có
9- 13 múi dày, trong múi có các tép mọng nước có sắc tố tạo thành màu quả. Quả có
vị ngọt hoặc chua tùy loại, mỗi loại có hương thơm đặc trưng riêng rất dễ để phân
biệt với bất kì loại quả nào trong nhóm cây ăn quả có múi. Mỗi quả có 15 - 30 hạt tùy
giống, có 2 dạng hạt đa phôi hay đơn phôi. Hạt bưởi có 2 lá mầm. Hạt có 2 lớp: màng
ngoài cứng chứa nhiều lignin có màu vàng trắng, màng trong mỏng. Hạt thường chín
cùng quả, nảy mầm ở nhiệt độ từ 10o
C đến 30o
C, tốt nhất là 25- 30o
C [4], [7], [29].
1.2.4. Cây bưởi Diễn
Về nguồn gốc, bưởi Diễn có thể là một biến dị của bưởi Đoan Hùng. Khoảng
90 năm trước, cụ Lý Năm là người đầu tiên trồng giống bưởi này tại thôn Đức Diễn,
xã Phú Diễn, Phú Minh, huyện Từ Liêm, Hà Nội. Giờ đây, Phú Diễn - nơi trồng
giống bưởi này đã trở thành tên gọi riêng cho chính nó và bưởi Diễn đã trở thành một
loại quả đặc sản nổi tiếng của thủ đô Hà Nội. Ngày nay bưởi Diễn được trồng và phát
triển tốt tại một số vùng sinh thái khác nhau chủ yếu ở Hà Nội (Đan Phượng, Phúc
Thọ, Hoài Đức, Chương Mỹ, Quốc Oai,...), Bắc Giang (Hiệp Hoà, Tân Yên, Yên

6
Thế,...) Hưng Yên (Văn Giang, Tiên Lữ,...), Thái Nguyên (Đồng Hỷ) với diện tích
trên 1000 ha và đang tiếp tục được mở rộng [8].
Về mặt hình thái, bưởi Diễn thuộc cây thân gỗ gồm các bộ phận chính là: Rễ,
thân, lá, hoa, quả và hạt. Lá đơn, có màu xanh vàng. Quả bưởi tròn, vỏ quả nhẵn, khi
chín vỏ quả màu vàng sáng, trọng lượng trung bình từ 0,8 - 1kg, tỷ lệ phần ăn được từ
60 - 65%, múi và vách múi dễ tách rời nhau. Thịt quả màu vàng xanh, múi ráo, tép
mọng nước, ăn giòn, có vị ngọt mát, mùi thơm đặc trưng. Hạt bưởi ít, trung bình
khoảng 5 -10 hạt/quả. thông thường có từ 12-14 múi. Thời gian thu hoạch muộn hơn
bưởi Đoan Hùng, thường trước tết nguyên đán khoảng 15 - 20 ngày. Bưởi Diễn là
giống cây đặc thù, chất lượng quả phụ thuộc rất lớn vào độ tuổi của cây. Cây càng
cao tuổi càng cho quả chất lượng [1], [8].
Về tình hình sản xuất: Năm 2001, ba xã Phú Diễn, Minh Khai, Xuân Phương
có 151 ha bưởi, cho thu 2650 tấn quả, đến năm 2002 thu 2966 tấn quả trên diện tích
169 ha. Người ta tính được hiệu quả kinh tế của trồng bưởi gấp 4 - 5 lần so với trồng
lúa, 1 ha bưởi Diễn sau 5 năm tuổi có thể đạt năng suất 50 - 60 nghìn quả, tương
đương khoảng 800 triệu đồng. Tuy nhiên, vài năm gần đây, ở đa số các địa phương
trồng bưởi Diễn tại Hà Nội, năng suất và chất lượng bưởi có phần suy giảm, từ 15
tấn/ha năm 2006 - 2007, xuống còn 10,2 tấn/ha năm 2010. Hoa ra nhiều nhưng tỷ lệ
đậu quả thấp. Các nguyên nhân chưa đươc nghiên cứ u cụthể. Qua 6 năm liên tiếp đến
nay cây bưởi Diễn trên chính đất Phú Diễn (Từ Liêm) mất mùa không rõ nguyên
nhân cùng với việc thời tiết không thuận lợi, sâu bệnh hại ngày càng tăng làm ảnh
hưởng lớn đến chất lượng, năng suất cây bưởi Diễn, đồng thời tốc độ đô thị hóa
nhanh, một số nhà vườn phá vườn bưởi để xây dựng nhà trọ,…
Theo Hoàng Thị Hòa - Giám đốc Trung tâm Phát triển cây trồng Hà Nội cho
biết: Nhờ triển khai chương trình phát triển cây ăn quả giai đoạn 2011 - 2015 đã thay
đổi được tư tưởng sản xuất có tính tự cung tự cấp, chuyển đổi sang sản xuất hàng hóa
và hướng tới xuất khẩu. Diện tích bưởi Diễn đang tiếp tục được mở rộng, năng suất
các mô hình đã tăng đều qua các năm, đặc biệt năm 2016 năng suất đạt khoảng 20
tấn/ha/năm, tăng 5 tấn so với năm 2015. Hiệu quả kinh tế năm 2016 đạt 328 triệu
đồng/ha/năm, tăng 248 triệu đồng so với năm 2014 [45].

7
Theo Sở Nông nghiệp và phát triển nông thôn Hà Nội, hiện Sở đã hoàn thiện
chương trình "Phát triển sản xuất cây ăn quả ứng dụng công nghệ cao giai đoạn 2016
- 2020". Như vậy, đến hết năm 2020, thành phố sẽ có trên 3000 ha bưởi an toàn, chất
lượng cao. Đẩy mạnh ứng dụng kỹ thuật đồng bộ hóa, ứng dụng công nghệ cao trong
sản xuất bưởi,tăng cường công tác đào tạo, tập huấn về quản lý, kỹ thuật trồng, chăm
sóc, thu hoạch, bảo quản cho cán bộ, nông hộ các vùng trồng bưởivà xây dựng
thương hiệu, nhãn hiệu sản phẩm. Xây dựng mạng lưới quản lý chuỗi sản phẩm từ
khâu sản xuất đến khâu tiêu thụ. Tiếp tục khai thác tốt các thị trường tiêu thụ truyền
thống và xây dựng hệ thống phân phối chuyên nghiệp, hiệu quả, kết nối với các
doanh nghiệp, tiêu thụ lâu dài và ổn định cho giống bưởi Diễn [16].
1.2. Thành phần hóa học và giá trị sử dụng của cây bưởi
Bưởi là loại cây ăn quả quen thuộc với người Việt Nam, đặc biệt ở Nam Bộ.
Quả bưởi chín là loại trái cây giàu dinh dưỡng, là món ăn tráng miệng giàu vitamin,
hương hoa bưởi thơm thoang thoảng rất được nhiều người tiêu dùng ưa thích. Bưởi
không chỉ là loại cây ăn trái nhiều dinh dưỡng mà còn có nhiều ứng dụng trong y học
cổ truyền của dân tộc.
1.2.1. Thành phần hóa học
Trong nước bưởi có nhiều chất dinh dưỡng, vitamin và khoáng chất cần thiết
cho sức khỏe con người. Đặc biệt có chứa nhiều vitamin C giúp tăng cường sức đề
kháng cho cơ thể và làm đẹp. Trong 100g nước ép bưởi có thành phần dinh dưỡng
gồm: nước 89%, glucid 9%, protein 0,6%, lipid 0,1%. Đặc biệt rất giàu vitamin C: 90
- 100mg, axit hữu cơ 0,2 - 1%, chất đạm 0,9%, chất béo 0,1%, Fe 0,2 mg, P2O5 15 -
25mg, pectin 0,45 - 0,5% và các khoáng Ca 20%, P 20%, Mg 12%, S 7%.
Ngoài ra, trong thành phần vỏ quả chứa một lượng tinh dầu khoảng 0,8%-
0,84%. Tinh dầu vỏ quả chứa d-limonen, a-pinen, linadol, geranidol, citral, ancol,
acid citric. Vỏ bưởi còn chứa nhiều flavonoid như naringosid, hesperidin, diosmin,
diosmetin, hesperitin [32], [35].
1.2.2. Giá trị sử dụng của cây bưởi
Từ xưa tới nay, quả bưởi thường được dùng để ăn tráng miệng, làm nước giải
khát, làm mứt. Nhiều tác dụng của quả bưởi đối với cơ thể con người còn chưa được
hiểu rõ. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, mỗi bộ phận của cây bưởi đều có tác dụng

8
riêng: Dịch ép quả bưởi có tính thanh nhiệt và có chứa nhiều vitamin, khoáng chất rất
có lợi cho sức khoẻ con người. Từ lá bưởi cho đến hạt bưởi khi kết hợp với một số loại
thảo dược khác tạo nên các vị thuốc vô cùng hữu hiệu. Lá, hoa, quả non chứa nhiều
tinh dầu, dùng làm nguyên liệu chiết tinh dầu thơm, dùng trong công nghiệp sản xuất
bánh kẹo. Lá bưởi vị đắng, the, tính ấm, có tác dụng tán hàn, tán khí, thông kinh lạc,
giải cảm, trừ đờm, tiêu thực, hoạt huyết, tiêu sưng, tiêu viêm, được dùng nấu với các lá
thơm khác để xông. Vỏ ngoài quả bưởi chứa tinh dầu: có vị cay, đắng, tính ấm, có tác
dụng trị ho, lý khí, giảm đau, hỗ trợ tiêu hoá và trị cảm cúm, có thể trích lấy pectin làm
thuốc cầm máu và dùng như gôm chải tóc. Cơm bưởi vị ngọt, chua, tính mát, không
độc, có tác dụng kiện tỳ, trị ho, giải rượu (làm mứt, nấu chè, làm nem chay). Hạt bưởi
vị đắng, tính ấm, chứa chất béo, có tác dụng trị đau thoát vị bẹn, sa đì. Bột than hạt
bưởi có thể dùng chữa trốc đầu ở trẻ em; Dịch ép múi bưởi chứa một lượng lớn đường
tự nhiên,dùng làm nước giải khát tốt, giàu chất chống oxy hóa, chất xơ, vitamin A.
Hàm lượng vitamin C trong trái bưởi là chất hóa học của quả trong tự nhiên có thể làm
giảm hàm lượng cholesterol trong máu của cơ thể, đồng thời còn có lợi cho việc hấp
thụ canxi, sắt giúp tăng cường thể chất. Thường xuyên ăn bưởi có tác dụng hỗ trợ việc
trị liệu đối với các bệnh nhân cao huyết áp, bệnh tiểu đường, bệnh xơ cứng động mạch.
Ngoài ra bưởi còn có công dụng giúp giảm béo và làm đẹp [11].
Theo y học hiện đại, các nhà khoa học đã chứng minh rằng bưởi có khả năng
làm giảm nguy cơ ung thư tuyến tiền liệt, giúp sửa chữa hư hỏng DNA trong các tế
bào tuyến tiền liệt của con người. Kiểm chứng thực tế cho thấy, những bệnh nhân
đang trong quá trình uống thuốc hạ huyết áp hay thuốc giảm đau, nếu ăn bưởi sẽ giúp
làm tăng công dụng trị bệnh của thuốc [38].
1.3. Một số giống bưởi chủ yếu trên thế giới và ở Việt Nam
1.3.1. Trên thế giới
Trên thế giới, bưởi (Citrus grandis L.) được trồng chủ yếu ở các nước có khí
hậu nhiệt đới, đặc biệt là các quốc gia thuộc châu Á như: Trung Quốc, Ấn Độ, Thái
Lan, Lào, Philippine, Malaysia,… Mặc dù bưởi là loài có sự đa dạng di truyền rất lớn,
song trong sản xuất không phải tất cả các giống đều được trồng với mục đích để ăn
tươi hoặc trao đổi buôn bán, mà ở mỗi nước chỉ có 1 số giống phát triển mang tính
đặc sản địa phương.

9
Ở Thái Lan tập đoàn giống bưởi rất phong phú. Theo Prasert Anupunt - Viện
làm vườn Thái Lan, các giống phổ biến trong sản xuất trồng ở các tỉnh miền Trung
như Nakhon Pathom, Samut Sakhon, Samut songkhram, Ratchaburi và Nothaburi là:
Khao Tongdee, Khao Phuang, Khao Phan, Khao Hawm, Khao nhan phung, Khao
kheaw, Khao Jeeb, Khao Yai, Tubtim và Sai Nham Phung. Một số giống khác như:
Khao Tangkwa, Som Krun, Khao Udom Sook và Manorom được trồng ở Chai Nat và
Nakhon Sawan; giống Khao Uthai là giống đặc sản của tỉnh Uthai Thani; giống
Takhoi và Som Pol được trồng phổ biến ở Phichit; giống Pattavia chỉ trồng ở vùng
phía nam như ở tỉnh Surat Thani, Songkhla, Narathiwat và Pattani [39].
Ở Trung Quốc, bưởi trồng nhiều ở các tỉnh Quảng Đông, Quảng Tây, Tứ
Xuyên, Hồ Nam, Chiết Giang, Phúc Kiến và Đài Loan... Các giống bưởi nổi tiếng của
Trung Quốc được biết đến: bưởi Văn Đán, Sa Điền, bưởi ngọt Quan Khê,... Đây là
những giống đã được Bộ nông nghiệp Trung Quốc công nhận là hàng nông nghiệp
chất lượng cao và cấp huy chương vàng. Ở Đài Loan có giống bưởi nổi tiếng là bưởi
Văn Đán, do có đặc tính tự thụ, phôi không phát triển nên không có hạt, chất lượng
rất tốt được nhiều người ưa chuộng [2].
Ở Malaysia có 24 giống bưởi được trồng phổ biến trong sản suất, bao gồm cả
giống trong nước và nhập nội [39].
1.3.2. Ở Việt Nam
Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, điều kiện thuận lợi thích hợp với
nhiều loại cây. Cây bưởi ở nước ta rất phong phú, đa dạng và được trồng ở hầu khắp
các tỉnh thành, hình thành những vùng trồng bưởi lớn, đặc trưng mang tính đặc sản
địa phương. Một số giống nổi tiếng ở các địa phương được trồng với mục đích sản
xuất hàng hóa.
Bưởi Đoan Hùng được trồng nhiều ở huyện Đoan Hùng tỉnh Phú Thọ. Có
2 giống tốt đó là bưởi Tộc Sửu xã Chi Đám và bưởi Bằng Luân xã Bằng Luân.
Bưởi Diễn có nguồn gốc từ bưởi Đoan Hùng. Là loại quả đặc sản nổi tiếng của
đất Hà thành.
Bưởi Quế Dương còn được gọi là bưởi Ta, bưởi Tháp Thượng.
Bưởi Thanh Trà là một trong những đặc sản của tỉnh Thừa Thiên Huế được
trồng chủ yếu trên đất phù sa dọc theo sông Hương, sông Bồ, sông Ô Lâu, thuộc các

10
xã: Thuỷ Biều, Hương Long, Kim Long, Hương Hồ, Hương Thọ, Hương An, Hương
Vân, thị trấn Hương Trà và thị trấn Phong Điền.
Bưởi Da Xanh có nguồn gốc từ ấp Thanh Sơn, xã Thanh Tân, huyện Mỏ Cày,
tỉnh Bến Tre, được trồng nhiều nhất tại xã Mỹ Thạnh An, thị xã Bến Tre. Bưởi Năm
Roi được trồng nhiều trên đất phù sa ven sông Hậu ở huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh
Long và tỉnh Hậu Giang, Bến Tre, Tiền Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long [7], [24].
Trồng bưởi mang lại hiệu quả kinh tế cao,song sản xuất vẫn mang tính tự phát,
thiếu quy hoạch nên còn nhiều bất cập. Trong những năm gần đây hiện tượng mất
mùa liên tục xảy ra với một số giống bưởi đặc sản. Để nâng cao và ổn định năng suất,
phẩm chất các giống bưởi đặc sản cần có những nghiên cứu cơ bản cho từng giống, ở
mỗi vùng sinh thái khác nhau.
1.4. Tình hình sản xuất bưởi trên thế giới và Việt Nam
1.4.1 Tình hình sản xuất bưởi trên thế giới
Cây ăn quả có múi được trồng rộng khắp trên thế giới: châu Á, Bắc Mỹ, Nam
Mỹ, châu Âu, châu Phi, châu Úc. Ở châu Mỹ, châu Âu sản phẩm chủ yếu là sản xuất
bưởi chùm dùng cho chế biến nước quả. Châu Á là cái nôi của họ cam quýt, đây cũng
là khu vực sản xuất bưởi lớn trên thế giới được sử dụng để ăn tươi là chủ yếu.
Hàng năm, trên thế giới sản xuất khoảng 4 - 5 triệu tấn bưởi cả 2 loại bưởi
chùm (Citrus paradisi) và bưởi (Citrus grandis) chiếm 5,4 - 5,6% tổng sản lượng cây
có múi, Trong đó chủ yếu là bưởi chùm chiếm 2,8 - 3,5 triệu tấn, còn lại bưởi chiếm
một lượng rất ít khoảng 1,2 - 1,5 triệu tấn.Theo FAO, năm 2013 tổng sản lượng cam
quýt trên thế giới đạt 135,169 triệu tấn. Quốc gia có sản lượng lớn nhất trên thế giới
là Trung Quốc đạt 32,1 triệu tấn, Brazin 19,9 triệu tấn, Mỹ 10,3 triệu tấn, Ấn Độ 9
triệu tấn, Mehico 7,18 triệu tấn [44].
Ở Mỹ, việc chọn tạo giống cam quýt nói chung và giống bưởi nói riêng rất
được chú trọng. Vì vậy, đây là quốc gia có bộ giống bưởi đưa vào sản xuất tốt nhất
thế giới, với nhiều giống cho quả không hạt (thể bất dục đực, bất dục cái, thể tam
bội,…). Năm 2009, sản lượng quả bưởi của Mỹ đạt 1.182.970 tấn và là quốc gia xuất
khẩu bưởi chùm lớn nhất thế giới. Theo Mung (2008), hiện nay một số nước như
Trung Quốc, Thái Lan, Philippines cũng đang phát triển trồng bưởi theo hướng xuất

11
khẩu và nhiều giống bưởi đã được thị trường thế giới chấp nhận như bưởi Sa Điền
(Trung Quốc), bưởi Văn Đán (Đài Loan), bưởi KaoPhung (Thái Lan),… [38].
1.4.2. Tình hình sản xuất bưởi ở Việt Nam
Việt Nam được thiên nhiên ưu đãi về khí hậu, đất đai, nguồn nước. Đây là điều
kiện rất thuận lợi để phát triển các vùng chuyên canh cây ăn quả nhiệt đới với nhiều
chủng loại có giá trị kinh tế cao và có vai trò quan trọng trong mô hình vườn - ao -
chuồng cũng như sản xuất trang trại. Cây có múi được trồng khắp cả nước từ Bắc
vào Nam. Có 3 vùng trồng chủ yếu:
Vùng Đồng bằng sông Cửu Long: Cây có múi có tổng diện tích 74.400 ha,
chiếm 54% và sản lượng 880.800 tấn/năm, chiếm 65% so với cây có múi của cả
nước. Đặc biệt có các giống cây có múi đặc sản nổi tiếng được người tiêu dùng ưa
chuộng và mua với giá cao (bưởi Da Xanh của Bến Tre; bưởi Năm Roi của Vĩnh
Long, Hậu Giang; quýt Hồng của Đồng Tháp; quýt Đường của Trà Vinh,…)
Vùng Bắc Trung bộ: Theo thống kê năm 2009, diện tích cây có múi toàn vùng
là 16.550 ha, trong đó có 12.520 ha cho thu hoạch. Trong vùng này có hai vùng bưởi
đặc sản đó là bưởi Thanh Trà của Huế, bưởi Phúc Trạch của Hương Khê, Hà Tĩnh.
Với ưu việt của mình, diện tích bưởi Phúc Trạch ngày càng được mở rộng. Trong
năm 2008, diện tích bưởi Phúc Trạch lên đến 1600ha, trong đó có khoảng 1250 ha đã
cho quả, sản lượng quả bình quân những năm gần đây đạt 15-17 nghìn tấn/năm [6].
Vùng Trung du và miền núi phía Bắc: Cây có múi ở vùng này được trồng ở
những vùng đất ven sông, suối như sông Hồng, sông Lô, sông Gâm, sông Chảy. Hiện
chỉ còn một số vùng tương đối tập trung là Bắc Sơn, Bắc Quang có 474 ha chiếm
17,5% diện tích cây có múi với giống bưởi Đoan Hùng. Ở trung du và vùng núi phía
Bắc, được trồng nhiều ở Hà Nội, Bắc Giang, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Hà Giang;
Vùng Bắc Trung bộ: Huế, Hương Khê; Vùng đồng bằng sông Cửu Long. Với diện
tích hàng ngàn hecta, nghề trồng cam quýt đã vươn lên trở thành một nghề sản xuất -
xuất khẩu [1], [8].
Theo số liệu của Tổng cục Thống kê, đến năm 2014 cả nước có 56.600
nghìn ha cây có múi, sản lượng đạt 708,6 nghìn tấn. Như vậy, trong những năm vừa

12
qua trong khi diện tích hầu như không tăng thì năng suất đã tăng đáng kể, từ 113,620
tạ/ha năm 2010 lên 127,283 tạ/ha năm 2014.
Bảng 1.1. Tình hình sản xuất cây ăn quả có múi ở Việt Nam
giai đoạn 2010- 2014
Chỉ tiêu Diện tích(ha) Năng suất(tạ/ha) Sản lượng(tấn)
2010 64.124 113.620 728.600
2011 55.836 125.850 702.700
2012 55.600 126.640 704.100
2013 56.600 125.190 708.600
2014 56.925 127.283 705.200
(Nguồn: Niên giám thống kê 2014 [20])
Để đưa trái cây Việt Nam thâm nhập vào các thị trường khó tính, được thị
trường thế giới chấp nhận, đồng thời xây dựng chiến lược tiêu thụ sản phẩm, rút
ngắn thời gian giữa sản xuất và tiêu thụ - kế hoạch: "Phát triển sản xuất cây ăn quả
ứng dụng công nghệ cao giai đoạn 2016 - 2020" đã được đưa ra. Tăng cường công
tác đào tạo, tập huấn về quản lý, kỹ thuật trồng, chăm sóc, thu hoạch, sơ chế, bảo
quản và xây dựng thương hiệu, nhãn hiệu sản phẩm cho cán bộ, nông hộ các vùng
trồng bưởi. Xây dựng mạng lưới quản lý chuỗi sản phẩm từ khâu sản xuất đến khâu
tiêu thụ. Tiếp tục khai thác tốt các thị trường tiêu thụ truyền thống và xây dựng hệ
thống phân phối chuyên nghiệp, hiệu quả, kết nối với các doanh nghiệp, tiêu thụ lâu
dài và ổn định. Trái cây Việt Nam phải sản xuất theo tiêu chuẩn GAP. Do đó, công
tác xúc tiến thương mại, đặc biệt là việc chuyển giao tiến bộ kỹ thuật thâm canh cho
nông dân nhằm nâng cao năng suất, chất lượng theo hướng vệ sinh an toàn thực
phẩm là mục tiêu quan trọng hàng đầu [1], [16].
Một số nghiên cứu định hướng phát triển cây ăn quả ở Việt Nam đã khẳng
định: phát triển cây ăn quả là một hướng góp phần chuyển dịch cơ cấu nông nghiệp,
nông thôn.Về lâu dài, sản xuất cây ăn quả phải trở thành chính, phấn đấu tỉ trọng đạt
20 - 25% trong giá trị trồng trọt, đưa kim ngạch xuất khẩu đạt khoảng 15 - 18%
trong kim ngạch xuất khẩu nông sản vào những năm 2020 [26].

13
1.5. Kĩ thuật nhân giống in vitro
Theo Nguyễn Đức Thành (2000), nhân giống in vitro là một trong 4 lĩnh
vực ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật và mang lại hiệu quả kinh tế
lớn nhất [22].
Cơ sở tế bào học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Tất cả các tế bào của một cơ thể đều mang thông tin di truyền giống nhau. Do
đó chúng có tiềm năng tổng hợp nên các protein giống nhau. Các tế bào được lấy từ
bất kỳ mô sống nào của cơ thể thực vật (bao phấn, đỉnh sinh trưởng, lá mầm, đoạn
thân, rễ…) đều có thể được kích thích để tái sinh thành cây hoàn chỉnh đặc trưng cho
loài, phát triển và ra hoa kết quả bình thường. Quá trình này có thể thông qua phát
sinh cơ quan hoặc hình thành phôi vô tính và được nuôi cấy trong điều kiện dinh
dưỡng thích hợp có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng cần thiết. Các loại mô đã
phân hoá tách từ cơ thể thực vật có khả năng tái sinh trực tiếp thành cây hoàn chỉnh,
hoặc là phát triển thành tế bào mô sẹo. Đó là loại tế bào không phân hoá, phân chia
liên tục và có khả năng phân hoá thành phôi, chồi để tạo cây hoàn chỉnh. Khả năng đó
gọi là tính toàn năng của tế bào [22], [28].
Ưu điểm của kĩ thuật nhân giống invitro
Trong những năm gần đây, ngành công nghiệp nhân giống in vitro đang phát
triển và mở rộng mạnh mẽ trên toàn cầu. Nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của
con người về sản xuất lương thực, thực phẩm, phục tráng giống cây quý hiếm có
nguy cơ bị tuyệt chủng chất lượng cây giống phục vụ cho sản xuất nông nghiệp, lâm
nghiệp không ngừng tăng lên. Kĩ thuật nhân giống in vitro có ưu điểm nổi bật hơn
các phương pháp nhân giống cổ điển khác.
(1) Hệ số nhân giống cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất. Kĩ thuật
nhân giống invitro đảm bảo nhân nhanh, từ một cây trong vòng 1-2 năm có thể tạo ra
hàng triệu cây. Tốc độ này khoảng 36
-1012
/năm như ở khoai tây: từ 50 giống của ngân
hàng giống thế giới sau 6 tháng nhân giống được mười vạn cây khoai tây.
(2) Nhân được một số lượng lớn cây giống có sự đồng nhất về mặt di truyền trong
một diện tích nhỏ. Trong 1m2
diện tích có thể để được tới 18.000 cây.
(3) Làm sạch bệnh cây trồng và cách ly chúng với các nguồn bệnh. Vì vậy,
đảm bảo cây giống sạch bệnh, khỏe mạnh, có sức tăng trưởng nhanh.

14
(4) Thuận tiện và hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000 cây dâu tây chỉ
nặng đến 15kg). Giống cây dễ bảo quản, các cây giống giữ ở nhiệt độ 40
C trong hàng
tháng vẫn cho tỉ lệ sống trên 95%.
(5) Hoàn toàn chủ động được kế hoạch sản xuất cây trồng, quá trình sản xuất
có thể được vận chuyển ở bất kì thời gian nào trong năm.
(6) Trẻ hóa vật liệu giống [22], [24].
Các phương thức nhân giống in vitro
Trước đây, đối với các loại cây ăn quả có múi, người ta thường sử dụng
phương pháp nhân giống vô tính (giâm, chiết, ghép). Các biện pháp này có ưu điểm:
Cây giống đồng đều về mặt di truyền, cây sớm ra hoa kết quả,... Tuy nhiên, các
phương pháp này có hệ số nhân giống thấp, tốn thời gian đưa giống vào sản xuất, khả
năng nhiễm bệnh cao.
Ngày nay, kĩ thuật nhân giống in vitro đã được sử dụng phổ biến hơn bởi
những khả năng vượt trội hơn so với phương pháp nhân giống vô tính. Đối với cây ăn
quả có múi, có ba phương thức trong nhân giống invitro chủ yếu: Nuôi cấy mô phân
sinh hoặc đỉnh sinh trưởng; Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây;
Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo.
Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng:
Mô phân sinh đỉnh thường là các đỉnh chồi hoặc đỉnh cành có kích thước trong
vòng 0,1mm tính từ chóp của đỉnh sinh trưởng. Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy
thường tách từ các mầm non, chồi mới hình thành hoặc các cành non, vì thế khả năng
phân chia mạnh, không có virus xâm nhập. Đỉnh sinh trưởng bao gồm toàn bộ phần
mô phân sinh đỉnh có kích thước trong vòng 0,1mm tính từ chóp của tháp sinh trưởng
và một phần của mô xung quanh được bao bọc bởi lớp cutin, dài 0,25-0,30mm. Vì
mẫu đưa vào nuôi cấy nhỏ do đó đòi hỏi kỹ thuật lấy mẫu và môi trường nuôi cấy
phải phù hợp. Kích thước mẫu ảnh hưởng đến sự sống sót và tái sinh cây.
Xét về nguồn gốc cây tái sinh từ đỉnh sinh trưởng có 3 khả năng: (i) Cây phát
triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn); (ii) Cây phát triển từ chồi nách phá ngủ; (iii) Cây phát
triển từ chồi mới phát sinh. Tuy nhiên, khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi mới
phát sinh.

15
Xét về phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ đỉnh sinh trưởng có hai
phương thức:
(1) Phương thức phát triển trực tiếp: từ nuôi cấy chồi đỉnh hoặc chồi nách. Chủ
yếu ở các đối tượng 2 lá mầm như: khoai tây, thuốc lá, cam chanh, hoa cúc, nhưng có
cả ở cây một lá mầm như dứa sợi, mía,…
(2) Phát triển cây qua giai đoạn dẻ hành (protocorm): bằng cách nuôi cấy mầm
(đỉnh sinh trưởng) để tạo thành cây con. Chủ yếu gặp ở các đối tượng 1 lá mầm như:
phong lan, dứa, huệ. Cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocorm và các
protocorm có thể tiếp tục phân chia thành các protocorm mới hoặc phát triển thành
cây hoàn chỉnh. Bằng phương thứ này trong một thời gian ngắn người ta có thể thu
được hàng triệu cá thể. Gần đây phương thức này cũng đã bắt đầu được áp trong nhân
giống các cây ăn quả và cây lâm nghiệp như cà phê, táo, lê, cây thông, bồ đề,… cũng
bắt đầu có kết quả trên 30 chi khác nhau [17].
Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây
Tế bào thực vật có tính toàn năng nên các bộ phận của cơ thể thực vật đều có
thể sử dụng trong nhân giống in vitro như: đoạn thân: cam, chanh, bưởi,…; mảnh lá:
thuốc lá, cà chua, bắp cải,..; nhánh củ ở hành, tỏi,…
Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo
Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân
hóa của các tế bào đã phân hóa. Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường tạo mô
sẹo có sự hiện diện của auxin. Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh
trong môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo. Khối mô sẹo thu được có thể
đưa vào môi trường nhân sinh khối hoặc đem tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều
kiện nuôi cấy phù hợp. Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống cây mẹ và khá đồng
nhất về mặt di truyền. Nuôi cấy mô sẹo thường được thực hiện đối với các loại thực
vật không có khả năng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Từ một cụm tế bào mô sẹo có thể
tái sinh cùng lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ phát
sinh biến dị tế bào soma lại cao hơn. Vì vậy, cần phải sử dụng mô sẹo vừa mới phát
sinh (mô sẹo sơ cấp) để thu được cây tái sinh đồng nhất. Thông qua giai đoạn mô sẹo
có thể thu được cây giống sạch virus [17], [22].

16
Quy trình nhân giống in vitro
Để nhân giống in vitro cây trồng cần thực hiện tốt các kĩ thuật chủ yếu sau:
Giai đoạn 1: Lựa chọn mẫu từ vật liệu làm gốc nuôi cấy
Trong nuôi cấy in vitro cây con mang những đặc tính và tính trạng của cây mẹ
ban đầu nên giai đoạn này cần chọn cây mẹ cẩn thận, cây mẹ thường là cây ưu việt,
khỏe, có giá trị kinh tế cao. Sau đó chọn cơ quan để lấy mẫu thường là mô non, đoạn
thân có chồi ngủ, lá non, hoa non, hạt… Mô chọn để nuôi cấy thường là mô có khả
năng tái sinh cao trong môi trường nuôi cấy sạch bệnh, giữ được các đặc tính sinh học
quý của cây mẹ, ít nguy cơ biến dị.
Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống cấy vô trùng
Là giai đoạn chuyển mẫu vật từ ngoài vào môi trường nuôi cấy để tạo nguyên
liệu sạch bệnh cho nhân giống, giai đoạn này được tiến hành theo các bước:
(i) Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vô trùng.
(ii) Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị các môi trường nuôi cấy
(iii) Cấy mẫu vật đã khử trùng vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn môi
trường nhân tạo (giai đoạn này còn gọi là cấy mẫu in vitro).
Sau khi khử trùng (phần thích hợp của thực vật), mẫu cấy sẽ được chuyển vào
môi trường nuôi cấy trong điều kiện vô trùng và nuôi trong phòng nuôi cấy với điều
kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp.Những mẫu cấy còn sống sau khi khử trùng sẽ được
chuyển sang giai đoạn 3.
Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi
Ở giai đoạn này yêu cầu cần phải sử dụng các chất kích thích sinh trưởng để
thúc đẩy hình thành các cơ quan phụ hoặc cấu trúc khác mà từ đó có thể phát sinh
thành cây hoàn chỉnh trực tiếp qua nách hoặc đỉnh sinh trưởng. Hoặc chồi mới hình
thành gián tiếp qua giai đoạn mô sẹo. Giai đoạn nhân chồi quyết định hiệu quả của
quá trình nuôi cấy mô, cây được nhân nhanh theo nhu cầu của người nuôi cấy. Khi
mẫu cấy sạch đã tạo ra được các cụm chồi và các phôi vô tính sinh trưởng tốt, quá
trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn sản xuất. Thành phần và điều kiện môi trường
cần được tối ưu hóa nhằm đạt được mục tiêu nhân nhanh. Quy trình cấy chuyển để
nhân nhanh chồi thường trong khoảng 1-2 tháng tùy loài cây. Tỉ lệ nhân nhanh

17
khoảng 2 - 8 lần sau 1 lần cấy chuyển. Giai đoạn này thường kéo dài 10 - 36 tháng.
Giai đoạn 4: Tạo rễ (tạo cây hoàn chỉnh)
Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưng
thông thường các chồi này phải cấy chuyển sang một môi trường khác để kích thích
tạo rễ. Người ta thường sử dụng chất kích thích trưởng thuộc nhóm auxin như: IAA,
NAA, IBA. Thông thường giai đoạn này cần 2 - 8 tuần. Khi cây có đủ các bộ phận rễ,
thân, lá đảm bảo cây sinh trưởng, phát triển bình thường, tiến hành đưa cây ra ngoài
môi trường tự nhiên.
Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng
Đây là giai đoạn đầu, cây được chuyển từ điều kiện vô trùng của phòng thí
nghiệm ra ngoài môi trường tự nhiên. Giai đoạn này quyết định khả năng ứng dụng
của quy trình nhân giống in vitro. Đối với đa số các loài cây trồng thì chỉ sau khi chồi
đã ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh mới được chuyển ra ngoài vườn ươm. Quá trình thích
nghi với điều kiện bên ngoài của cây yêu cầu cần được chăm sóc đặc biệt. Vì cây
được chuyển từ môi trường bão hòa hơi nước sang vườn ươm với những điều kiện
khó khăn hơn, nên vườn ươm cần đáp ứng các yêu cầu: Che cây non bằng nilon bao
phủ và có hệ thống phun sương cung cấp độ ẩm và làm mát cây; giá thể cây trồng có
thể là đất mùn, hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển,…
Giai đoạn này thường đòi hỏi 4 - 16 tuần [10], [19].
Ảnh hưởng các chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Người ta đã phát hiện thấy 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng ở thực vật đó là
auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, axit absixic. Những chất này được phân thànhcác
nhóm dựa vào tính tương đồng về cấu trúc và chức năng sinh lý, tuy nhiên về chức năng
nhiều khi chúng có tác động chồng chéo và hỗ trợ nhau. Còn một số nhóm khác điều
khiển từng giai đoạn sinh trưởng nhất định. Trong nuôi cấy mô tế bào người ta thường sử
dụng ba nhóm chất điều tiết sinh trưởng là dẫn xuất của auxin, cytokinin và giberelin.
Nhóm auxin là nhóm kích thích sinh trưởng chính được các nhà sinh lý
học thực vật phát hiện và quan tâm sớm nhất. Auxin là những hoocmon thực vật có
tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hoá cơ quan, kiểu

18
tác động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hoá màng tế bào. Nhóm auxin
bao gồm các chất sau: 2,4 diclorophenoxy axetic axit (2,4D), α-naphtylaxetic
axit(NAA), indolaxetic axit (IAA), trong đó 2,4D dễ gây độc nhưng có tác dụng kích
quá trình phân chia tế bào và thường được sử dụng nhiều nhất, α-NAA có tác dụng
tạo rễ cho cây con.
Nhóm giberelin là nhóm được phát hiện qua nghiên cứu bệnh nấm lúa von.
Nhóm này tác động làm tế bào dãn ra và phân chia, làm cây lùn có thể cao lên như:
ngô lùn thành ngô cao, đậu dạng bụi thành dạng đứng. Đại diện cho nhóm này là axit
giberilic (GA3), được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp.
Nhóm cytokinin là nhóm chất hoá học có ảnh hưởng quyết định đến kích
thích phân chia tế bào. Đại diện cho nhóm cytokinin gồm: Kinetin; 6 - Benzyl
amino purine (BAP); 6- Dimethylalylamino purine (2iP); Zeatin. Hiện nay một thế hệ
mới của chất điều hòa sinh trưởng, như thidiazuron (TDZ) - một cytokinin thuộc các
phenylureas, đang nổi lên như là một thay thế thành công cho tái sinh trực tiếp với tần
số cao của phôi vô tính.
Trong nuôi cấy tùy từng loại mô và mục đích nuôi cấy có thể sử dụng riêng rẽ
từng nhóm auxin hoặc cytokinin hoặc sử dụng kết hợp cả 2 nhóm auxin và cytokinin
với hàm lượng khác nhau [17], [22], [40].
Các yếu tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Mô nuôi cấy
Tất cả các mô chưa hóa gỗ đang sinh trưởng mạnh như: Mô phân sinh ngọn,
tượng tầng, đầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quả non,… khi đặt vào môi trường có chứa
một lượng hoocmon thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo. Tuy nhiên, mỗi tế bào ở mỗi
mô khác nhau có khả năng tạo mô sẹo, phân hóa thành rễ, thân, cành, lá,… rất khác
nhau. Do đó việc chọn mẫu thực vật để sử dụng trong quá trình nuôi cấy có vai trò quyết
định. Các kết quả nghiên cứu cho thấy, để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một
cây nhất định, người ta chú trọng đến các chồi bên và mô phân sinh đỉnh [22].
Vô trùng trong nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy có chứa đường, muối khoáng và vitamin, thích hợp cho
các loài nấm, vi khuẩn phát triển. Để đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi

19
cấy đòi hỏi các yêu cầu sau: Vô trùng mô cấy, vô trùng dụng cụ thủy tinh, môi trường
và nút đậy. Trong thao tác cấy cần phải tránh làm rơi nấm, khuẩn lên bề mặt môi
trường nuôi cấy. Mô cấy có thể là các bộ phận khác nhau của thực vật, tùy theo sự
tiếp xúc với môi trường bên ngoài mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn,
nấm. Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các chất hóa học có
hoạt tính diệt nấm, khuẩn. Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào
thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng trên bề mặt mô cấy.Ngoài
ra, còn sử dụng các chất làm giảm sức căng bề mặt như: Tween 80, fotoflo, teepol
vào dung dịch diệt nấm, khuẩn [13], [28].
Ánh sáng và nhiệt độ
Ánh sáng là nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả năng
nuôi cấy in vitro ở những cây có diệp lục tố. Cường độ ánh sáng trên dàn nuôi cấy
phải là ánh sáng có phổ gần như ánh sáng tự nhiên (230 -780 nm). Nhiệt độ của
phòng nuôi cấy được duy trì từ 25 -28o
C [13].
Môi trường nuôi cấy
Tất cả các môi trường nuôi cấy đều gồm năm thành phần chính sau: các muối
khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, nguồn cacbon, các chất điều hòa sinh trưởng,
chất độn. Ngoài ra, người ta còn bổ sung thêm một số chất hữu cơ có thành phần xác
định như acid amin, hoặc không xác định như: nước dừa, dịch chiết nấm men,…vào
trong môi trường tùy theo nhu cầu riêng của từng đối tượng nuôi cấy. Trong những
năm 60 nhiều môi trường nuôi cấy đã được xây dựng và được sử dụng cho đến ngày
nay, đó là các môi trường: Môi trường nghèo chất dinh dưỡng White, Knop (1953),
Môi trường giàu chất dinh dưỡng Murashige - Skoog (1963); Môi trường có hàm
lượng chất dinh dưỡng trung bình Gamborg (1968) [17].
1.6. Một số thành tựu trong nhân giống cây có múi
Đã có nhiều công trình nghiên cứu khác nhau nhằm hoàn thiện quy trình nuôi
cấy in vitro cây có múi trên thế giới cũng như ở Việt Nam.
Trên thế giới
Trong nghiên cứu của Sunette L. (2004), khi nhân giống quýt Mega-loxycarpa
Lush ở Ấn Độ cho thấy, môi trường thuận lợi nhất cho sự tạo chồi từ đoạn thân làMS

20
cơ bản bổsung BAP 0,25mg/l + NAA 0,5mg/l, môi trường MS cơ bản bổsung BAP
1mg/l và kinetin 0,5mg/l cho hệ số nhân chồi lần lượt là 4,7 và 4,4. Chồi non ra rễ tốt
nhất trên môi trường MS bổ sung NAA 2mg/l, số rễ/chồi đạt 4,4 [43].
Theo nghiên cứu của Rezadost M.H. và cs (2013), khi nghiên cứu tái sinh in
vitro cây cam chua (Citrus aurantium L.) đã công bố, hạt cam chua nảy mầm tốt nhất
trên môi trường MS có bổ sung BAP 2mg/1 và NAA 0,1mg/l. Tỉ lệ tạo chồi từ đoạn
thân tốt nhất trên môi trường có BAP 2,5mg/l, kéo dài chồi đạt hiệu quả tối ưu trên
môi trường có GA3 0,5mg/l [37].
Tác giả Ehsan E. và cs đã nghiên cứu tái sinh in vitro từ mô trưởng thành của
cây cam ngọt Thomson. Kết quả cho thấy, chồi thí nghiệm phát triển tốt nhất trên môi
trường MS có bổ sung BAP 1mg/l,NAA 0,1mg/l (3,2chồi/mẫu). Khi cắt mẫu theo
chiều dọc hoặc chiều ngang đoạn thân có tỷ lệ phản ứng tạo chồi 56%. Rễ phát sinh
trên môi trường MS cơ bản có NAA ( 0,5 - 1mg/l). Tỉ lệ tạo rễ cao nhất đạt 76% [33].
Nghiên cứu môi trường nhân nhanh giống Cam ngọt (Citrus sinensis L.
Osbeck), tác giả Shahid A. K. và cs (2011) đã chỉ ra, môi trường tạo mô sẹo tốt nhất
là BAP 1mg/l và NAA 0,5mg/l (98%). Môi trường tạo đa chồi tối ưu là môi trường
MS cơ bản có bổ sung BAP 1,5mg/l và NAA 1mg/l, tỉ lệ mẫu tạo đa chồi khoảng
90% và đạt 10 chồi/mẫu sau 35 ngày nuôi cấy. Số rễ được tạo ra nhiều nhất trên môi
trường MS cơ bản có bổ sung IBA 2,5 mg/l (3,4 rễ/cây) [42].
Trong nghiên cứu nhân giống cây chanh từ lá mầm, Anna K. P. và cs (2015)
đã công bố, khi kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật cả auxin và cytokinin
trên môi trường MS cơ bản với nồng độ kinetin 0,2mg/l và NAA 1mg/l cho tỉ lệ mẫu
tạo đa chồi là 97%. Môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP 3,5mg/l cho tỉ lệ mẫu tạo
đa chồi đạt 85%. Các chồi tạo rễ tốt nhất trên môi trường MS cơ bản + BAP
5mg/l+NAA 1mg/l, tỉ lệ tạo rễ đạt 82% [30].
Trong nghiên cứu nhân giống cam ngọt Bahia, tác giả Rosely P. và cs (2006)
đã chỉ ra, hạt nảy mầm trên môi trường MS cơ bản có bổ sung đường 25g/l và agar
8g/l. Môi trường thuận lợi cho sự phát sinh chồi từ các đoạn thân mầm trên môi
trường MS cơ bản + BAP 3mg/l + NAA 0,5mg/l, tỉ lệ mẫu tạo đa chồi là 45,5%.Các
chồi tạo rễ trên môi trường MS cơ bản + IBA 1mg/l + NAA 0,5mg/l [41].

21
Tác giả Komal G. và cs (2013) khi nghiên cứu nhân giống tạo cây chanh
không hạt (Citrus limon) đã nhận thấy, môi trường tối ưu cho sự tái sinh chồi nách là
MS cơ bản +BAP 0,25mg/l+ kinetin 0,5mg/l + IBA 0,5mg/l (đạt 5,5chồi/mẫu). Khi
kết hợp 2 cytokinin trên môi trường MS cơ bản là BAP 0,25mg/l và kinetin 1mg/l, thí
nghiệm cho tỉ lệ mẫu phát sinh chồi là 75%, thu được nhiều nhất là 7chồi/mẫu [36].
Ở Việt Nam
Nghiên cứu nuôi cấy in vitro trên lá mầm giống cam Vinh (Citrus sinensis) và
quýt Đường Canh (Citrus reticulata), Phan Hữu Tôn và cs (2014) đã công bố xác
định được chất khử trùng tốt nhất là Johnson 10% lắc trong 15 phút. Tỉ lệ tái sinh
chồi tốt nhất đối với giống cam Vinh là môi trường MS cơ bản + đường 30g/l +
vitamin B5 5mg/l + agar 8g/l + BAP 1,5 mg/l, với quýt Đường Canh là môi
trườngMS cơ bản + đường 30g/l + agar 8,0g/l + vitamin B51,0mg/l + BAP 1,0mg/l,
số chồi/mẫu của giống cam Vinh đạt 4,7 và quýt Đường Canh là 5,5. Môi trường tốt
nhất cho sự tạo rễ của chồi cam Vinh là môi trường MS cơ bản + đường 30g/l +
vitamin B5 5mg/l + agar 8g/l + NAA 0,4mg/l + IAA 0,4mg/l. Tỉ lệ chồi phát sinh rễ
là 82,3%, số rễ/chồi là 3,5 và chiều dài rễ là 3,5cm. Với quýt Đường Canh là môi
trường MS cơ bản + đường 30g/l + agar 8,0g/l + vitamin B51,0mg/l + NAA 0,3mg/l
+ IAA 0,4mg/l cho tỉ lệ chồi phát sinh rễ là 86,3%, số rễ/chồi là 3,5 và chiều dài rễ là
3,2cm. Giá thể tốt nhất khi ra cây in vitro là cát vàng + trấu hun với tỷ lệ 1:1, sau 6
tuần tỉ lệ cây sống sót ở giống cam Vinh là 96% và quýt Đường Canh là 95% [19].
Năm 2007, Đỗ Tiến Phát và cs thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Trường Đại
học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nghiên cứu và xây dựng thành
công hệ thống tái sinh phục vụ công tác chuyển gen vào cây cam Sành bằng
Agrobacterium thông qua phương pháp tạo đa chồi trực tiếp từ thân mầm [14].

22
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu và hóa chất
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Đề tài sử dụng hạt cây bưởi Diễn có nguồn gốc tại Phú Diễn, Từ Liêm, Hà
Nội.Thời gian lấy mẫu: tháng 1 năm 2016.
2.1.2. Hóa chất, thiết bị
Hóa chất
Các hóa chất cơ bản và thông dụng trong nghiên cứu nuôi cấy: Cồn 700
, javen
60%, agar, đường, nước cất khử trùng, MS cơ bản (Murashige and Shoog, 1962). Các
chất kích thích sinh trưởng: BAP, kinetin, NAA, IBA, GA3 có nguồn gốc từ Trung
Quốc, Ấn Độ, Anh, Đức, Việt Nam.
Bảng 2.1. Thành phần cơ bản của môi trường MS
STT Thành phần
Nồng độ
(mg/l)
STT Thành phần Nồng độ (mg/l)
MS1 10 CoCl2.6H2O 0,025
1 CaCl2.2H2O 440,00 11 CuSO4.5H2O 0,025
MS 2 12 Na2MoO4.2H2O 0,25
2 KH2PO4 170,00 MS 4
3 KNO3 1900,00 13 FeSO4.7H2O 27,80
4 MgSO4.7H2O 370,00 14 Na2EDTA 37,30
5 NH4NO3 1650,00 MS5
MS 3 15 Glicine 2,00
6 H3BO3 6,20 16 Thiamine HCl 0,10
7 KI 0,83 17 Pyridoxine HCl 0,50
8 MnSO4.4H2O 22,30 18 Nicotinic Acid 0,50
9 ZnSO4.7H2O 8,60 19 Myo- inositol 100,00
(Murashige và Skoog, 1962)

23
Thiết bị
Các thiết bị chính dùng trong nghiên cứu gồm: Nồi hấp khử trùng (Tommy
Nhật Bản), tủ sấy (Đức), buồng cấy vô trùng (Boilogical Safety Cabinets - Mỹ), cân
điện tử (Đức)…
Bộ đồ cấy: Dao cấy, que cấy, đĩa cấy, bình tam giác 250ml, 500ml, pipet, ca
nhựa, bông, giấy làm nút, giấy thấm, phễu thủy tinh.
2.2. Địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 1 năm 2016 đến tháng 5 năm 2017 tại phòng
Công nghệ tế bào thực vật thuộc khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm - Đại học
Thái Nguyên.
2.3.Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp pha môi trường và nuôi cấy
Môi trường cơ bản được sử dụng trong nghiên cứu là môi trường MS
(Murashige và Skoog, 1962).
Nguyên tắc pha môi trường nuôi cấy: Pha môi trường đặc với thành phần và
hàm lượng các chất phù hợp. Môi trường cơ bản là MS, có đầy đủ muối khoáng,
các chất hữu cơ, vitamin,…Tất cả các hóa chất phải được tan đều, không kết tủa.
Môi trường có bổ sung chất độn là thạch làm giá đỡ không quá rắn hay quá mềm
để khi cấy mẫu được dễ dàng. Khử trùng ở nhiệt độ 120o
C, áp suất 0,7at - 1,2at.
Sau khi khử trùng để nguội, ổn định sau 2 - 3 ngày và tiến hành cấy mẫu trong
buồng cấy vô trùng [17].
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy in vitro
Các thí nghiệm được đặt trong phòng nuôi cấy ở nhiệt độ 25±2°C, cường độ
chiếu sáng 2000 lux, độ ẩm 60 - 80%, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày. Mỗi thí
nghiệm tạo mẫu in vitro cấy 30 mẫu, bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Thí
nghiệm ngoài vườn ươm được bố trí 3 lần lặp lại mỗi lần 35 mẫu.
(i) Tạo mẫu sạch in vitro từ hạt cây bưởi Diễn
Các bước thí nghiệm được tiến hành như sau:
Hạt bưởi ngâm xà phòng loãng trong 20 - 30 phút sau đó rửa sạch nhiều lần
dưới vòi nước máy.

24
(1) Đưa mẫu vào bình sạch, rửa lại mẫu bằng nước cất khử trùng.
(2) Khử trùng mẫu bằng cồn 70o
(1 phút). Rửa lại bằng nước cất khử trùng.
(3) Khử trùng mẫu với javen 60% (thời gian15, 20, 25, 30 phút).
(4) Rửa sạch mẫu bằng nước cất khử trùng 3 lần.
Hạt sau khi khử trùng tiến hành bóc vỏ và thấm khô trên giấy thấm. Ở mỗi
ngưỡng thời gian khử trùng cấy 30 hạt mẫu. Theo dõi các chỉ tiêu như: Tỉ lệ hạt
sạch nảy mầm (%), tỉ lệ hạt sạch không nảy mầm (%); chất lượng chồi từ các hạt
nảy mầm.
Các bước khử trùng thực hiện trong môi trường vô trùng.
(ii) Phương pháp tạo đa chồi từ nguồn mẫu sạch thu được
Nội dung 1: Ảnh hưởng riêng rẽ của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm
cytokinin đến khả năng phát sinh chồi
Để thăm dò ảnh hưởng riêng rẽ của chất kích thích sinh trưởng đến sự phát
sinh đa chồi cây bưởi Diễn, tất cả các công thức môi trường nuôi cấy đều sử dụng
môi trường MS cơ bản có bổ sung đường 30 g/l + agar 9,0g/l và các chất kích thích
sinh trưởng có hàm lượng thay đổi. Đối chứng sử dụng môi trường MS cơ bản +
đường 30 g/l + agar 9,0 g/l không bổ sung các chất kích thích sinh trưởng [17]. Ở mỗi
công thức nuôi cấy tiến hành trên 30 mẫu cấy.
(1) Các đoạn thân mầm được cấy trên môi trường MS cơ bản + đường 30g/l +
agar 9,0g/l + bổ sung BAP với nồng độ1 mg/l; 2 mg/l; 3 mg/l; 4 mg/l; 5 mg/l; 6 mg/l;
7 mg/l tương ứng với các công thức từ 1 - 7.
(2) Các đoạn thân mầm được cấy trên môi trường MS cơ bản + đường 30g/l+
agar 9,0g/l + bổ sung kinetin với nồng độ 0,3 mg/l; 0,5 mg/l; 0,7 mg/l; 0,9 mg/l tương
ứng với các công thức từ 1- 4.
Kết quả đánh giá khả năng sinh trưởng cây bưởi Diễn sau các thời gian: 4
tuần, 6 tuần, 8 tuần nuôi cấy qua các chỉ tiêu theo dõi sau: Số chồi/mẫu; Chiều cao
chồi (cm); Chất lượng chồi.
Chồi sinh trưởng tốt: Chồi mập, lá to màu xanh đậm (+++)
Chồi sinh trưởng trung bình: Chồi nhỏ, lá xanh (++)
Chồi sinh trưởng kém: Chồi nhỏ, lá nhỏ màu xanh nhạt (+)

25
Nội dung 2: Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm
cytokinin đến khả năng phát sinh chồi
Các đoạn thân mầm được cấy trên môi trường MS cơ bản + đường 30g/l +
agar 9g/l, sử dụng BAP nồng độ tối ưu trên môi trường tạo đa chồi kết hợp với
kinetin nồng độ 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 mg/l. Đối chứng sử dụng môi trường MS cơ bản +
đường 30g/l + agar 9,0g/l không bổ sung các chất kích thích sinh trưởng. Theo dõi và
đánh giá kết quả sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần.Các chỉ tiêu theo dõi như nội dung 1.
(iii) Phương pháp kéo dài chồi
Những chồi tạo ra trên môi trường nhân nhanh có kích thước đạt từ 1,5cm -
2,5cm được cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi. Sử dụng môi trường MS cơ
bản + đường 30g/l + agar 9g/l +GA3với nồng độ thay đổi (0,3; 0,5; 0,7; 0,9 mg/l). Đối
chứng sử dụng môi trường MS cơ bản + đường 30g/l + agar 9,0g/l không có các chất
kích thích sinh trưởng. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 35 mẫu. Đánh
giá kết quả sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần. Các chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao chồi (cm);
Chất lượng chồi.
Chồi tốt: Chồi mập, khỏe, cao, màu xanh đậm (+++)
Chồi trung bình: Chồi cao, màu xanh (++)
Chồi kém: Chồi nhỏ, ngắn, màu xanh nhạt (+)
(iv) Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh
Khi các chồi bưởi Diễn đạt chiều cao 3- 4cm và có 3-5 lá được cấy chuyển
sang môi trường ra rễ. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 35 mẫu. Môi
trường thí nghiệm thăm dò là MS cơ bản + đường 30g/l + aga 9g/l + α-NAA nồng độ
0,3; 0,5; 0,7; 0,9 mg/l hoặc IBA nồng độ 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 mg/l. Theo dõi, đánh giá
kết quả sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần.
Các chỉ tiêu theo dõi: Số rễ/chồi; Chiều dài rễ (cm); Chất lượng rễ
Rễ tốt: Rễ mập, khỏe, dài, màu trắng sữa hoặc trắng xanh (+++)
Rễ trung bình: Rễ khỏe, màu trắng xanh (++)
Rễ kém: Rễ nhỏ, ngắn, màu trắng (+)
(v) Đưa cây ra vườn ươm
Thí nghiệm ngoài vườn ươm được bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần 35 mẫu.
Giai đoạn bầu đất

26
Các chồi đơn đạt chiều cao 4-5cm, mọc 4- 5 lá, có 2-3 rễ, chiều dài rễ đạt 3-
4cm, rễ mập đủ tiêu chuẩn đưa cây ra ngoài vườn ươm.
Cách bố trí thí nghiệm: thăm dò trên 3 loại giá thể:
(1) Cát vàng + trấu hun (tỉ lệ 1:1);
(2) Đất thịt trung bình + trấu hun (tỉ lệ 6:4)
(3) Đất thịt trung bình
Tuần đầu tiên để cây ở điều kiện phòng. Tuần thứ hai đưa cây ra nhà lưới.
Tưới phun dưới dạng sương mù vào lúc sáng sớm. Theo dõi, đánh giá tỉ lệ sống sót
và chất lượng cây sau 4 tuần.
Giai đoạn vườn ươm
Những cây bưởi trong bầu đất đạt chiều cao hơn 5cm, hình thành thêm lá mới,
lá xanh, chiều dài rễ đạt 3-4cm, khỏe sẵn sàng chuyển cây ra ngoài môi trường tự
nhiên. Tiến hành bỏ vỏ bầu, trồng cây trên luống với mật độ 30cm. Tuần đầu tiên phủ
bằng ni lông. Tưới nước vào buổi chiều. Theo dõi, đánh giá kết quả sau 1 tháng, 2
tháng, 3 tháng. Chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao cây (cm), số lá, chất lượng cây.
Chất lượng cây: (+); Cây nhỏ, thấp, lá nhỏ, lá xanh nhạt; (++): cây thấp, lá
xanh đậm; (+++): cây to, cao, phiến lá rộng, lá xanh đậm
2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng toán thống kê để xác định các chỉ số thống kê như: Trung bình mẫu,
phương sai, độ lệch chuẩn và sai số trung bình với n ≥ 30, α = 0,05. Các số liệu
nghiên cứu được xử lý thống kê bằng phần mềm excel [12].

27
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả khử trùng hạt cây bưởi Diễn
Vô trùng mẫu cấy là bước đầu tiên đóng vai trò quyết định sự thành công của
quá trình nhân giống in vitro. Vì vậy, cần lựa chọn phương pháp khử trùng và loại
hóa chất thích hợp để loại bỏ hoàn toàn các nguồn nấm, vi khuẩn, virus khỏi mẫu
trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy. Có rất nhiều loại hóa chất được sử dụng để
khử trùng. Tuy nhiên, nồng độ khử trùng thích hợp cho các đối tượng khác nhau là
hoàn toàn khác nhau. Hạt bưởi Diễn có lớp vỏ ngoài cứng, chứa nhiều chất nhày có
thành phần peptin, ngoài ra còn chứa dầu, là điều kiện lý tưởng cho các loại vi sinh
vật, nấm mốc phát triển. Vì vậy, cần nghiên cứu để đưa ra công thức khử trùng tốt
nhất để hạt nảy mầm tốt nhất cũng như cho chất lượng thân mầm tốt nhất. Phương
pháp khử trùng thích hợp phải đảm bảo được các yêu cầu: Tỷ lệ hạt bị nhiễm thấp,
thân mầm to, mập và chồi sinh trưởng phát triển tốt.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng javen đến sự nảy mầm của
hạt cây bưởi Diễn (sau 4 tuần)
Công
thức
Thời gian khử
trùng (phút)
Tỉ lệ hạt sạch
nảy mầm (%)
Tỉ lệ hạt sạch
không nảy mầm
(%)
Chất lượng
chồi
CT1 15 26 0 ++
CT2 20 81 0 +++
CT3 25 91 9 +++
CT4 30 56 44 +
Ghi chú: Ghi chú: (+): cây nhỏ, lá màu xanh nhạt; (++) cây nhỏ, lá màu xanh
đậm; (+++) cây mập, lá to màu xanh đậm.
Dựa vào kết quả nghiên cứu của một số tác giả đã công bố trên đối tượng cam
quýt: Phan Hữu Tôn và cs (2014) [19], Rosely P. và cs (2006) [41], chúng tôi tiến
hành vô trùng sơ bộ hạt bằng cồn 70o
trong 1 phút và javen 60% ở các ngưỡng thời
gian khác nhau. Sau khi khử trùng, hạt được cấy vào môi trường MS cơ bản có bổ
sung đường 30g/l và agar 9g/l. Đánh giá khả năng thu được mẫu sạch và khả năng

28
nảy mầm của hạt là bước tiếp theo để tìm ra công thức khử trùng tốt nhất. Kết quả thí
nghiệm được thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.1.
25 phút 30 phút
Hình 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến sự nảy mầm
của hạt cây bưởi Diễn (sau 4 tuần)
Kết quả trên bảng 3.1 và hình 3.1 cho thấy, với thời gian khử trùng thay đổi
các chỉ tiêu nghiên cứu có sự khác nhau rõ rệt. Khử trùng hạt bằng javen 60% trong
thời gian 25 phút, tỉ lệ hạt sạch nảy mầm cao, hạt không bị nhiễm, đạt chất lượng chồi
tốt nhất. Khi tăng thời gian khử trùng lên 30 phút thì tỉ lệ hạt nảy mầm thấp hơn hẳn
(56%), đồng thời tăng tỉ lệ hạt chết là 44%, chất lượng chồi kém. Nguyên nhân có thể
do javen là chất độc, nếu kéo dài thời gian khử trùng, javen có thể xâm nhập vào
phôi, hạt bị độc nên không thể tái sinh được.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, thời gian khử trùng có ảnh hưởng
khá lớn tới tỷ lệ sống của hạt. Javen có hiệu quả diệt nấm và diệt khuẩn cao đối với
hạt của cây bưởi Diễn. Khi lắc nhẹ hạt 25 phút trong javen 60% là vừa đủ, vừa có khả
năng tiêu diệt mầm bệnh mà lại tác động nhẹ đến thành tế bào nên cho tỷ lệ sống cao
và kích thích mẫu tái sinh.
3.2. Kết quả tạo chồi in vitro cây bưởi Diễn
Trong nuôi cấy in vitro, môi trường nuôi cấy đóng vai trò rất quan trọng, vừa
cung cấp chất dinh dưỡng cho mẫu vừa biệt hoá mẫu theo những hướng xác định. Do
đó nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp nhất sẽ cho hệ số nhân đa chồi
cao, chất lượng chồi tốt.

29
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy
BAP thuộc nhóm kích thích sinh trưởng cytokinin được sử dụng phổ biến để
cảm ứng tạo chồi, kéo dài thời gian hoạt động của mô phân sinh, hạn chế sự già hóa
của tế bào đồng thời thúc đẩy sự phân hóa chồi, kích thích chồi phát triển ở nhiều loài
thực vật khác nhau. Theo nhiều nghiên cứu cho biết, BAP thường được sử dụng với
nồng độ thay đổi từ 1,0 - 3,0 mg/l là thích hợp cho nhiều loại mô nuôi cấy. Ở các nồng
độ cao hơn hoặc thấp hơn đều biểu hiện hiệu quả kích thích kém. Với nồng độ cao sẽ
hoạt hóa hình thành chồi bất định.
Qua tìm hiểu một số kết quả nghiên cứu trong nuôi cấy in vitro ở cam quýt cho
thấy, tác giả Phan Hữu Tôn (2014) [19] và tác giả Rezadost M (2013) [37] đã sử dụng
đoạn trụ trên lá mầm, tác giả Rosely P (2006) [41] sử dụng thân mầm mọc từ hạt đã
khử trùng để làm vật liệu mẫu ban đầu trong tạo đa chồi ở một số giống cam quýt.
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng các đoạn thân mầm của các cây nảy
mầm từ hạt đã khử trùng. Cây bưởi Diễn sử dụng trong thí nghiệm khoảng 15 - 20
ngày tuổi, trong giai đoạn này mô chưa hóa gỗ hoàn toàn, phần mô phân sinh sẽ tiếp
xúc với các chất kích thích sinh trưởng và biệt hóa tạo các chồi bất định. Thân mầm
cắt thành từng đoạn có chiều dài từ 0,8 - 1,0cm trước khi chuyển vào môi trường nuôi
cấy. Theo dõi thí nghiệm và đánh giá kết quả sau các khoảng thời gian nuôi cấy. Kết
quả theo dõi các chỉ tiêu thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.2.

30
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy
Công
thức
BAP
mg/l
Số chồi/mẫu
Chiều cao chồi
(cm)
Chất lượng chồi
Sau 4 tuần
ĐC 0 0,73±0,08 0,34±0,04 +
CT1 1 1,22±0,25 0,36±0,09 +
CT2 2 1,57±0,32 0,46±0,05 ++
CT3 3 1,81±0,12 0,48±0,07 ++
CT4 4 2,00±0,25 0,55±0,04 ++
CT5 5 2,83±0,28 0,58±0,00 ++
CT6 6 1,55±0,41 0,43±0,07 +
CT7 7 1,30±0,17 0,42±0,00 +
Sau 6 tuần
ĐC 0 1,07±0,12 0,62±0,09 +
CT1 1 1,95±0,17 0,67±0,06 ++
CT2 2 2,57±0,38 0,85±0,07 ++
CT3 3 2,60±0,40 0,99±0,13 +++
CT4 4 3,73±0,44 0,99±0,17 +++
CT5 5 4,22±0,18 1,08±0,07 +++
CT6 6 2,22±0,29 0,75±0,02 ++
CT7 7 2,08±0,17 0,71±0,12 ++
Sau 8 tuần
ĐC 0 2,07±0,04 0,91±0,08 ++
CT1 1 2,21±0,21 1,08±0,16 ++
CT2 2 3,68±0,28 1,40±0,11 +++
CT3 3 3,90±0,78 1,41±0,15 +++
CT4 4 4,73±0,57 1,56±0,20 +++
CT5 5 5,93±0,25 1,67±0,11 +++
CT6 6 3,56±0,56 1,32±0,11 ++
CT7 7 2,31±0,27 1,28±0,12 ++
Ghi chú: (+) chồi nhỏ, ngắn, lá xanh nhạt; (++) chồi nhỏ, ngắn, lá xanh; (+++)
chồi mập, lá to xanh đậm.

31
Đối chứng BAP 4,0mg/l
BAP 5,0mg/l BAP 6,0mg/l
Hình 3.2. Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi của mẫu cấy
(sau 8 tuần)
Kết quả thí nghiệm cho thấy, hầu hết các đoạn thân mầm bưởi Diễn có khả
năng tái sinh chồi trên các môi trường thí nghiệm. Khả năng tạo đa chồi có sự khác
biệt trên các môi trường khi thay đổi nồng độ BAP. Các công thức thí nghiệm đều có
khả năng tạo chồi cao hơn so với công thức đối chứng. Ở môi trường đối chứng, số
chồi/mẫu sau 4 tuần, 6 tuần, 8 tuần nuôi cấy đều thấp, lần lượt là 0,73; 1,07; 2,07
chồi/mẫu. Trên môi trường nuôi cấy có bổ sung BAP với nồng độ tăng dần từ 1,0mg/l
đến 5,0mg/l, quan sát thấy số chồi/mẫu tăng, tăng cao nhất là môi trường nuôi cấy có
bổ sung BAP 5mg/l, hiệu quả tạo đa chồi sau 4 tuần nuôi cấy đạt 2,83 chồi/mẫu (tăng
2,1 so với ĐC), sau 6 tuần mẫu nuôi cấy là 3,73 chồi/mẫu (tăng 3,15 so với ĐC), sau
8 tuần nuôi cấy số chồi trên mẫu cấy là 5,93. Các công thức thí nghiệm còn lại cho số
chồi/mẫu đạt từ 1,22 đến 2,00 (sau 4 tuần nuôi cấy), 1,95 đến 3,73 (sau 6 tuần nuôi
cấy) và 2,21 đến 4,73 (sau 8 tuần nuôi cấy).

32
Kết quả theo dõi chỉ tiêu về chiều cao chồi cho thấy, khi tăng nồng độ BAP
(1,0mg/l đến 5,0mg/l) thì chiều cao chồi tăng dần, tăng cao nhất là môi trường MS
có bổ sung BAP 5mg/l. Sau 4 tuần, chiều cao chồi tăng từ 0,36 -0,58cm; sau 6
tuần tăng từ 0,67-1,08cm; sau 8 tuần tăng từ 1,08- 1,67cm. Các môi trường thí
nghiệm đều thu được kết quả tốt hơn nhiều so với đối chứng.
Kết quả theo dõi về khả năng tạo đa chồi từ mẫu cấy cây bưởi Diễn của chúng
tôi cao hơn so với nghiên cứu của tác giả Ehsan E. và cs trên đối tượng cây có múi. Ở
công bố của nhóm tác giả này khi tái sinh in vitro từ mô trưởng thành của cây cam ngọt
Thomson, chồi phát triển tốt nhất trên môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP 1mg/l
chỉ thu được 3,2 chồi/mẫu [33]. Tùy từng giống nuôi cấy, sử dụng nồng độ các chất
kích thích sinh trưởng khác nhau để thu được hiệu quả tạo đa chồi tốt nhất.
Xét đồng thời các chỉ tiêu nghiên cứu trong giai đoạn tạo đa chồi cây bưởi Diễn
thì môi trường thích hợp nhất trong các nồng độ thăm dò, cho hiệu quả tạo chồi cao
nhất là MS cơ bản + đường 30mg/l + agar 9,0g/l có bổ sung BAP 5mg/l, cho hệ số tạo
chồi cao đạt 5,93, sự sinh trưởng phát triển của chồi khỏe, chất lượng chồi tốt. Môi
trường BAP nồng độ tối ưu thu được được sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2. Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy
Kinetin là kích thích sinh trưởng cùng nhóm với BAP, chất này cũng có khả
năng kích thích tế bào phân chia mạnh trong nuôi cấy mô.
Thí nghiệm thăm dò nồng độ kinetin đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy được
tiến hành với thời gian và các chỉ tiêu theo dõi như thí nghiệm thăm dò nồng độ BAP.
Chúng tôi thu được kết quả thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.3.
Ở môi trường thí nghiệm có bổ sung kinetin chúng tôi nhận thấy, khi nồng độ
kinetin tăng dần từ 0,3- 0,7mg/l cho chỉ tiêu theo dõi về số chồi/mẫu và chiều cao
chồi đều tốt hơn so với đối chứng. Kết quả thí nghiệm tốt nhất quan sát thấy trên môi
trường có bổ sung kinetin 0,7mg/l, sau 4 tuần nuôi cấy, số chồi/mẫu là 1,40, chiều
cao chồi là 0,43cm; sau 6 tuần nuôi cấy, số chồi/mẫu là 1,90, chiều cao chồi là
0,95cm; sau 8 tuần nuôi cấy, số chồi/mẫu đạt 3,00, chiều cao chồi là 1,17cm. Nếu tiếp
tục tăng nồng độ kinetin lên 0,9mg/l thì số chồi phát sinh và chiều cao chồi giảm. Sau
8 tuần nuôi cấy, số chồi/mẫu chỉ đạt 2,07, chiều cao chồi là 0,96cm.

33
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy
Công
thức
Kinetin
(mg/l)
Số chồi/mẫu
Chiều cao chồi
(cm)
Chất lượng
chồi
Sau 4 tuần
ĐC 0 0,73±0,08 0,34±0,05 +
CT1 0,3 0,75±0,11 0,35±0,09 +
CT2 0,5 1,37±0,16 0,40±0,06 ++
CT3 0,7 1,40±0,23 0,43±0,07 ++
CT4 0,9 0,90±0,32 0,36±0,12 +
Sau 6 tuần
ĐC 0 1,07±0,12 0,51±0,04 +
CT1 0,3 1,27±0,10 0,61±0,06 ++
CT2 0,5 1,64±0,19 0,78±0,09 ++
CT3 0,7 1,90±0,33 0,95±0,06 +++
CT4 0,9 1,37±0,24 0,68±0,16 ++
Sau 8 tuần
ĐC 0 1,60±0,04 0,61±0,06 +
CT1 0,3 1,73±0,24 0,95±0,03 ++
CT2 0,5 2,14±0,27 1,04±0,13 +++
CT3 0,7 3,00±0,27 1,17±0,12 +++
CT4 0,9 2,07±0,22 0,96±0,13 ++
Ghi chú: (+) chồi nhỏ, ngẵn, lá nhỏ, màu vàng nhạt; (++) chồi nhỏ, ngắn, lá nhỏ,
màu xanh nhạt; (+++) chồi mập, màu xanh nhat.
Quan sát hình 3.3 cho thấy, kinetin có ảnh hưởng đến sự tạo đa chồi ở cây
bưởi Diễn. Trên môi trường bổ sung kinetin các mẫu cấy đều có khả năng tạo đa chồi,
chủ yếu tạo chồi đơn, ít lá, lá nhỏ và nhọn, màu xanh nhạt.
Xét đồng thời các chỉ tiêu theo dõi về số chồi, chiều cao chồi, chất lượng chồi
khi thăm dò trên môi trường có bổ sung kinetin, kết quả thí nghiệm cho thấy, các chỉ
tiêu theo dõi đều cao hơn so với công thức đối chứng không bổ sung kinetin. Công
thức 3 là môi trường tối ưu nhất cho sự tạo đa chồi trong các công thức nghiên cứu.
So sánh hiệu quả trong tạo đa chồi của cây bưởi Diễn khi sử dụng BAP và
kinetin nhận thấy, môi trường có bổ sung BAP 5mg/l cho số chồi/mẫu, chiều cao chồi
và chất lượng chồi cao hơn hẳn trên môi trường bổ sung kinetin 0,7mg/l. Như vậy có

34
thể kết luận: Khi nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của BAP và kinetin lên hiệu quả tạo
đa chồi thì môi trường bổ sung BAP cho kết quả tốt hơn so với kinetin.
Đối chứng Kinetin 0,5mg/l
Kinetin 0,7mg/l Kinetin 0,9mg/l
Hình 3.3. Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy
3.2.3. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và kinetin đến sự phát sinh chồi của mẫu cấy
Để nghiên cứu ảnh hưởng khi phối hợp BAP và kinetin đến quá trình tạo đa
chồi của mẫu cấy, chúng tôi sử dụng nồng độ BAP tối ưu ở thí nghiệm trước kết hợp
với kinetin thay đổi nồng độ (0,3; 0,5; 0,7; 0,9mg/l). Các mẫu cấy là đoạn thân mầm
có kích thước 0,8-1cm. Môi trường đối chứ ng là MS cơ bản không bổ sung chất kích
thích sinh trưởng. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.4.

35
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và kinetin đến sự phát sinh chồi
của mẫu cấy
Công
thức
BAP
(mg/l)
Kinetin
(mg/l)
Số chồi/mẫu
Chiều cao
chồi (cm)
Chất lượng
chồi
Sau 4 tuần
ĐC 0 0 0,73±0,08 0,34±0,03 +
CT2
5,0
0,3 1,39 ±0,17 0,54±0,05 ++
CT3 0,5 1,72 ±0,08 0,69±0,03 ++
CT4 0,7 1,50 ±0,31 0,55±0,04 ++
CT5 0,9 1,30 ±0,08 0,49±0,04 +
Sau 6 tuần
ĐC 0 0 1,07 ±0,12 0,71±0,12 ++
CT1
5,0
0,3 2,24 ±0,14 0,87±0,08 ++
CT2 0,5 3,03 ±0,49 1,70±0,04 +++
CT3 0,7 2,52 ±0,14 0,92±0,04 ++
CT4 0,9 1,46 ±0,04 0,77±0,04 ++
Sau 8 tuần
ĐC 0 0 2,07 ±0,17 0,91±0,08 ++
CT1
5,0
0,3 2,84 ±0,10 1,19±0,07 +++
CT2 0,5 4,47 ±0,60 2,27±0,10 +++
CT3 0,7 3,19 ±0,30 1,48±0,08 +++
CT4 0,9 2,39 ±0,04 1,03±0,05 ++
Ghi chú: (+) chồi nhỏ, ngắn, màu xanh nhạt; (++) chồi ngắn, màu xanh nhạt;
(+++) chồi mập, lá to, màu xanh đậm.
ĐC BAP 5mg/l + kinetin 0,5mg/l
Hình 3.4. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và kinetin đến sự phát sinh chồi
của mẫu cấy (sau 8 tuần)

Nghiên cứu nhân giống cây bưởi diễn (Citrus Grandis L.) bằng kỹ thuật nuôi cấu in vitro (Luận văn thạc sĩ).docx

Nghiên cứu nhân giống cây bưởi diễn (Citrus Grandis L.) bằng kỹ thuật nuôi cấu in vitro (Luận văn thạc sĩ).docx

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Nghiên cứu nhân giống cây bưởi diễn (Citrus Grandis L.) bằng kỹ thuật nuôi cấu in vitro (Luận văn thạc sĩ).docx

Similar to Nghiên cứu nhân giống cây bưởi diễn (Citrus Grandis L.) bằng kỹ thuật nuôi cấu in vitro (Luận văn thạc sĩ).docx (20)

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Nghiên cứu nhân giống cây bưởi diễn (Citrus Grandis L.) bằng kỹ thuật nuôi cấu in vitro (Luận văn thạc sĩ).docx