Ứng dụng nhựa Macroporous trong làm giàu saponin từ rễ ngưu tất ( Achyranthes Bidentata Blume).docx

HÀ NỘI – 2017
Viết đề tài giá sinh viên – ZALO:0973.287.149-TEAMLUANVAN.COM
Tải tài liệu tại kết bạn zalo : 0973.287.149
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
HOÀNG THỊ HUYỀN TRANG
MSV: 1201629
ỨNG DỤNG NHỰA MACROPOROUS
TRONG LÀM GIÀU SAPONIN TỪ RỄ
NGƯU TẤT (ACHYRANTHES
BIDENTATA BLUME)
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
HOÀNG THỊ HUYỀN TRANG
MSV: 1201629
ỨNG DỤNG NHỰA MACROPOROUS
TRONG LÀM GIÀU SAPONIN TỪ RỄ
NGƯU TẤT (ACHYRANTHES
BIDENTATA BLUME)
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Nguyễn Văn Hân
2. TS. Nguyễn Tuấn Hiệp
Nơi thực hiện:
Viện Dược liệu

LỜI CẢM ƠN!
Lời đầu tiên em xin tỏ lòng biết ơn chân thành đối với thầy giáo TS.
Nguyễn Văn Hân, người thầy giàu kinh nghiệm và đầy nhiệt huyết đã tạo
điều kiện, giúp đỡ và chỉ bảo em trong quá trình thực hiện khóa luận này.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân
thành tới TS. Nguyễn Tuấn Hiệp đã định hướng, giúp đỡ và dạy dỗ em trong
suốt thời gian làm nghiên cứu.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới anh Đỗ Quang Thái cũng như
các anh chị khoa công nghệ chiết xuất- Viện Dược liệu đã trực tiếp hướng
dẫn, chỉ bảo em tận tình và giúp đỡ em hoàn thành khoá luận.
Tiếp theo em xin phép gửi lòng biết ơn tới Viện Dược liệu đã tạo điều
kiện thuận lợi và nhiều động lực để em có cơ hội được học hỏi nhiều hơn.
Và em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường Đại học
Dược Hà Nội, những người đã dạy dỗ và chỉ bảo em tận tình trong suốt
những tháng năm học tập tại trường.
Cuối cùng, với lòng biết ơn vô hạn, em xin phép được gửi lời cảm ơn
tới gia đình, người thân, bạn bè đã động viên và hỗ trợ em trong suốt thời
gian qua.
Do thời gian có hạn và trình độ bản thân còn hạn chế nên khóa luận
không thể tránh khỏi những thiếu sót. Vì vậy, em rất mong nhận được sự chỉ
bảo tận tình của các thầy cô và sự góp ý chân thành của bạn bè.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 04 năm 2017
Sinh viên
Hoàng Thị Huyền Trang

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN! .................................................................................................. 3
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT........................................ 8
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ 9
DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ ............................................................... 10
ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN............................................................................. 2
1.1. Tổng quan về Achyranthes bidentata Blume .......................................... 2
1.1.1. Về thực vật ........................................................................................ 2
1.1.1.1. Vị trí phân loại của Ngưu tất....................................................... 2
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật ...................................................................... 2
1.1.1.3. Phân bố, sinh thái........................................................................ 3
1.1.1.4. Bộ phận dùng.............................................................................. 4
1.1.2. Thành phần hóa học .......................................................................... 4
1.1.2.1. Saponin ....................................................................................... 4
1.1.2.2. Phytoecdysteroid......................................................................... 6
1.1.2.3. Polysacharid................................................................................ 6
1.1.3. Tác dụng sinh học ............................................................................. 7
1.2. Tổng quan về phương pháp tinh chế....................................................... 8
1.2.1. Phương pháp chiết pha rắn (SPE) ..................................................... 8
1.2.1.1 Khái niệm.................................................................................... 8
1.2.1.2 Nguyên tắc và cơ chế của SPE..................................................... 8
1.2.1.3. Ứng dụng..................................................................................... 9
1.2.2. Tổng quan về hạt nhựa macroporous.............................................. 10
1.2.2.1. Định nghĩa và phân loại ............................................................ 10
1.2.2.2. Đặc điểm hạt nhựa macroporous .............................................. 11
1.2.2.3. Tổng quan về hạt nhựa macroporous D101.............................. 11

1.2.2.3.1. Thông số vật lý ................................................................... 11
1.2.2.3.2. Cơ chế hấp phụ saponin của hạt nhựa D101....................... 12
1.2.2.3.3. Ứng dụng trong tách chiết saponin..................................... 12
1.2.2.4.4. Ứng dụng hạt nhựa trong nghiên cứu Ngưu tất.................. 13
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............... 15
2.1. Đối tượng, nguyên liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu....................... 15
2.1.1. Nguyên vật liệu ............................................................................... 15
2.1.2. Hoá chất, thiết bị, dụng cụ............................................................... 16
2.1.2.1. Hoá chất .................................................................................... 16
2.1.2.2. Dụng cụ..................................................................................... 16
2.1.2.3. Thiết bị...................................................................................... 16
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 17
2.2.1. Nghiên cứu cách xử lý hạt nhựa ban đầu........................................ 17
2.2.2. Nghiên cứu quá trình hấp phụ saponin từ dịch chiết lên hạt nhựa
macroporous D101.................................................................................... 17
2.2.3. Nghiên cứu quá trình giải hấp phụ saponin từ hạt nhựa
macroporous D101.................................................................................... 17
2.2.4. Đề xuất và ổn định quy trình trình làm giàu saponin ứng dụng hạt
nhựa macroporous D101........................................................................... 17
2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 17
2.3.1.Phương pháp định tính, định lượng.................................................. 17
2.3.1.1. Phương pháp thuỷ phân ............................................................ 17
2.3.1.2. Phương pháp định tính.............................................................. 18
2.3.1.3. Phương pháp định lượng........................................................... 18
2.3.2. Phương pháp chiết........................................................................... 19
2.3.3. Phương pháp xử lý dịch chiết.......................................................... 19
2.3.4. Phương pháp nghiên cứu xử lý hạt nhựa ban đầu........................... 19

2.3.5. Phương pháp nghiên cứu quá trình hấp phụ saponin từ dịch chiết
lên hạt nhựa macroporous D101............................................................... 21
2.3.5.1. Phương pháp khảo sát tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột ............ 21
2.3.5.2. Phương pháp xác định dung lượng hấp phụ của hạt nhựa trên
điều kiện động........................................................................................ 22
2.3.6. Phương pháp nghiên cứu quá trình giải hấp phụ saponin từ hạt nhựa
macroporous D101.................................................................................... 23
2.3.6.1. Khảo sát dung môi giải hấp phụ................................................ 23
2.3.6.2. Khảo sát thể tích rửa giải .......................................................... 24
2.3.7. Đề xuất và ổn định quy trình làm giàu saponin từ rễ Ngưu tất ứng
dụng hạt nhựa macroporous D101............................................................ 24
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN....................... 27
3.1. Nghiên cứu xử lý hạt nhựa ban đầu....................................................... 27
3.2. Khảo sát quá trình hấp phụ saponin lên hạt nhựa macroporous D101 ở
điều kiện động .............................................................................................. 28
3.2.1. Khảo sát tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột........................................ 28
3.2.2. Xác định dung lượng hấp phụ của hạt nhựa trên điều kiện động.... 29
3.3. Khảo sát quá trình giải hấp phụ saponin trên hạt nhựa macroporous
D101............................................................................................................. 30
3.3.1. Lựa chọn dung môi giải hấp phụ saponin ....................................... 30
3.3.2. Khảo sát thể tích rửa giải................................................................. 31
3.3.2.1. Quá trình rửa tạp chất................................................................ 31
3.3.2.2. Quá trình giải hấp phụ bằng ethanol 50%, 70%, 96%.............. 33
3.4 Đề xuất quy trình làm giàu saponin ứng dụng hạt nhựa macroporous
D101............................................................................................................. 35
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN.............................................................................. 37
4.1. Bàn luận về phương pháp nghiên cứu................................................... 37

4.1.1. Phương pháp chiết và xử lý dịch chiết............................................ 37
4.1.2. Bàn luận về phương pháp tinh chế saponin trong rễ Ngưu tất........ 37
4.2. Bàn luận về kết quả............................................................................... 39
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT............................................................................ 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................. 1
PHỤ LỤC .......................................................................................................... 7

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu Tên
Glc β-D-glucopyranosyl
Abp Achyranthes bidentata polysacharid
AbpS Achyranthes bidentata polysacharid sulfat
BV Bed volume
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
SKLM Sắc ký lớp mỏng
SPE Chiết pha rắn
Qe Dung lượng hấp phụ
EtOH Ethanol
v:v Thể tích: thể tích
kl:v Khối lượng/ thể tích

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Tên bảng Trang
1.1 Trình bày một số saponin oleanolic phân lập từ rễ Ngưu tất 5
1.2 Đặc tính vật lý một số loại hạt nhựa macroporous 10
1.3 Thông số vật lý của hạt nhựa D101 theo nhà sản xuất 11
2.1 Tên hoá chất và nguồn gốc 16
3.1
Ảnh hưởng của các tác nhân đến dung lượng hấp phụ của hạt
nhựa
27
3.2
Ảnh hưởng của tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột lên dung
lượng hấp phụ
38
3.3 Kết quả dung lượng hấp phụ của hạt nhựa 39
3.4 Khối lượng cắn loại được sau rửa tạp với nước và ethanol 33
3.5 Kết quả phân lập saponin Ngưu tất trên quy mô 170 g (n=3) 36

DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
Hình Tên hình Trang
1.1 Achyranthes bidentata 2
1.2 Axit oleanolic 4
1.3
Cấu trúc hóa học của β-ecdysterone (I), inokosterone (II),
rubrosterone (III)
6
2.1 Hình ảnh dược liệu Ngưu tất 15
2.2 Hình ảnh hạt nhựa macroporous D101 15
3.1
Ảnh hưởng của các tác nhân đến dung lượng hấp phụ của hạt
nhựa
27
3.2
Ảnh hưởng của tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột
lên hiệu suất giải hấp phụ
38
3.3 Hình ảnh sắc ký của dịch ra theo mỗi BV 39
3.4 So sánh khả năng rửa giải của các dung môi lựa chọn 30
3.5
Sắc ký đồ của dịch ra theo thứ tự dung môi rửa tạp là nước,
ethanol 10% và 20%
32
3.6 Hình ảnh sắc ký của dịch rửa giải với nước 32
3.7 Hình ảnh sắc ký của dịch rửa giải với ethanol 20% 33
3.8
(a) Hình ảnh sắc ký của dịch rửa giải ethanol 50% theo thứ tự
ở BV thứ 6 và 7 từ trái qua phải, (b) Hình ảnh sắc ký của dịch
rửa giải ethanol 70% theo thứ tự ở BV thứ 1, 2 và 3 từ trái
qua phải, (c) Hình ảnh sắc ký của dịch rửa giải ethanol 96%
34
3.9 Đường cong giải hấp phụ bằng ethanol 50% 35
3.10 Hình (a), (b) thứ tự là hình ảnh cao trước và sau tinh chế 36

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngưu tất là một trong những dược liệu có vai trò quan trọng trong y
học cổ truyền Trung Quốc [20], di thực vào nước ta từ năm 1960. Nhiều
nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhóm saponin trong Ngưu tất có nhiều tác dụng
sinh học đáng quý như: chống viêm [7] [22], hạ cholesterol máu [4] [7] [25],
hạ huyết áp [2] [7], kháng khuẩn [10], tăng cường miễn dịch, hạ đường huyết
[36], đã và đang được ứng dụng rộng rãi tạo ra nhiều sản phẩm đáp ứng nhu
cầu trong nước.
Sử dụng dung môi hữu cơ n-buthanol [44] để tinh chế saponin trong
cao Ngưu tất là phương pháp đang được áp dụng nhưng đồng thời đó cũng là
vấn đề độc hại đối với sức khoẻ con người và môi trường. Hiện nay có rất
nhiều công nghệ khác được ứng dụng trong lĩnh vực chiết phân lập và tinh
chế sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên. Trong đó sử dụng hạt nhựa
macroporous đã thu hút nhiều sự quan tâm vì tính chất hấp phụ và các ưu
điểm bao gồm: loại bỏ được lượng lớn tạp chất, chi phí vận hành thấp, tiêu
thụ dung môi ít hơn và lượng dư hóa chất không mong muốn trong sản phẩm
thấp [16].
Với những ưu điểm trên, nhóm tiến hành đề tài “Ứng dụng nhựa
macroporous trong làm giàu saponin từ rễ Ngưu tất (Achyranthes bidebtata
Blume)” với mục tiêu:
- Khảo sát một số điều kiện hấp phụ và giải hấp phụ saponin lên hạt
nhựa macroporous D101.
- Xây dựng quy trình ứng dụng hạt nhựa macroporous D101 để thu
được cao có hàm lượng saponin cao.

2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Achyranthes bidentata Blume
1.1.1. Về thực vật
1.1.1.1. Vị trí phân loại của Ngưu tất
Theo hệ thống phân loại thực vật có hoa của Takhtajan công bố năm 2009
thì Ngưu tất có tên khoa học là Achyranthes bidentata Blume có vị trí phân loại
như sau [29]:
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsid)
Phân lớp Cẩm chướng (Caryophyllidae)
Bộ Cẩm chướng (Caryophyllules)
Họ Rau dền (Amaranthacaceae)
Chi (Achyranthes)
Loài Bidentata
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật
Cây thảo, sống nhiều năm, cao
60- 80 cm hoặc hơn. Rễ củ hình trụ
dài, có nhiều rễ phụ to. Thân mảnh, có
cạnh, phình lên ở những đốt, màu lục
hoặc nâu tím và cành thường mọc
hướng lên gần như thẳng đứng. Lá
mọc đối, hình bầu dục hoặc hình móc,
dài 5- 10 cm, rộng 1- 4 cm, gốc thuôn
hẹp, đầu rất nhọn, hai mặt nhẵn, mép
nguyên đôi khi uốn lượn, gân lá mặt
trên màu nâu tía, gân phụ 5- 7 cặp,
Hình 1.1 Achyranthes bidentata [2]

3
cuống lá dài 1- 3 cm có lông [3] [4] [6] [20].
Cụm hoa mọc ở ngọn thân và kẽ lá đầu cành thành bông, dài 2- 5 cm,
hoa thường gập xuống, sát vào cụm hoa lá bắc hình trứng dài 3 mm [20], lá
bắc con có gai dài 0,25- 0,3 cm [20] lá đài 5, gần bằng nhau, nhị 5, chỉ nhị
dính với nhau và dính với cả nhị lép, nhị lép có răng rất nhỏ, bao phấn hình
mặt chim, bầu hình trứng [2] [3] [7].
Quả nang hình bầu dục, có 1 hạt [3] [4] [6].
Mùa hoa quả: tháng 5- 7 [6].
Cây dùng thay thế: ở Việt Nam, các thầy thuốc y học cổ truyền và nhân
dân ở nhiều nơi đã dùng rễ cây Cỏ xước (Achyranthes aspera L.) để thay thế
Ngưu tất với tên gọi là Ngưu tất nam [2].
1.1.1.3. Phân bố, sinh thái
Ngưu tất có nguồn gốc ở vùng Đông Bắc Trung Quốc hoặc Nhật Bản.
Ngưu tất được di thực từ Trung Quốc vào Việt Nam năm 1960. Ban đầu cây
được trồng để thuần hóa ở Sa Pa, sau đó chuyển sang Sìn Hồ (Lai Châu) rồi
về trại thuốc Tam Đảo (Vĩnh Phúc) và Văn Điền (Hà Nội). Cách đây khoảng
30 năm, cây đã được trồng dưới dạng sản xuất dược liệu ở vùng ngoại thành
Hà Nội và các tỉnh thuộc đồng bằng Bắc Bộ [7].
Có thể coi Ngưu tất là một ví dụ điển hình về một cây thuốc có nguồn
gốc ôn đới, qua quá trình nghiên cứu di thực đã có thể trồng thành công ở cả
vùng đồng bằng có khí hậu nhiệt đới gió mùa. Điều đó cho thấy Ngưu tất là
cây có biên độ sinh thái tương đối rộng. Mặc dù thời vụ trồng chủ yếu vẫn ở
thời kì có nhiệt độ thấp trong năm [7].
Ngưu tất là cây ưa sáng và ẩm. Cây ra hoa quả nhiều hàng năm, tái sinh
tự nhiên hạt [7].

4
1.1.1.4. Bộ phận dùng
Bộ phận dùng là rễ (Radix Achyranthes bidentatae) [3] [4].
Rễ thu hái khi phần trên mặt đất tàn lụi vào tháng 1- 2 ở vùng núi hoặc tháng
3- 4 ở đồng bằng. Loại bỏ rễ con, rửa sạch rồi phơi hay sấy khô. Rễ to, dài,
dẻo là loại tốt. Có thể dùng ở dạng sống (thường dùng cách này), hoặc tẩm
rượu hoặc muối tùy theo trường hợp rồi phơi hay sấy khô [4].
1.1.2. Thành phần hóa học
Các nghiên cứu chỉ ra rằng saponin, phytoecdysteroid và polysacharid
là 3 nhóm thành phần hóa học chính được phân lập từ rễ Ngưu tất [20].
1.1.2.1. Saponin
Saponin là một nhóm các glycosid có phần genin có cấu trúc triperten
hay steroid 27 carbon. Với saponin triterpenoid cấu trúc phần genin có 30
carbon cấu tạo bởi 6 đơn vị hemiterpen nối với nhau theo quy tắc đầu đuôi [4].
Saponin là thành phần quan trọng trong rễ Ngưu tất, có khoảng 38
saponin đã được phân lập và saponin triterpenoid là hoạt chất chính. Trong
đó, saponin toàn phần tính theo hàm axit oleanolic là 0,78%-1,42% [17] (hình
1.2). Hiện nay các nhà khoa học đã phân lập và xác định cấu trúc một số
saponin được trình bày chi tiết ở bảng dưới.
Hình 1.2 Axit oleanolic

5
Bảng 1.1 Trình bày một số saponin oleanolic phân lập từ rễ Ngưu tất [20]
Saponins R1 R2
Khung cấu trúc chung của một số saponin trong rễ Ngưu tất.
Achhybidensaponins I
α-L-rhamnopyranosyl(1→3)-β-D-
glucironopyranosyl
Glc
Achhybidensaponins II β-D-glucopyranosyl Glc
Bidentatoside I
3’-glycolyl-2,3-dioxopropionyl-β-D-
glucopyranosyl
Glc
Bidentatoside II 2’-(2”-O-glycolyl)-glyoxylyl Glc
Chikusetsusaponin V
methyl ester
Glc-(1→2)-6-Me-β-D-
glucironopyranosyl
Glc
Ginsenoside Ro Glc-(1→ 2)-β-D-glucironopyranosyl Glc
PJS- 1 H Glc
Aachyranthoside I
2’-O-Glc-3’-O-(2’-OH-1”-
carboxyethoxycarboxypropyl)-β-D-
glucironopyranosyl
Glc
Aachyranthoside II
Glc-3’-O-(2”-OH-1’-
carboxyethoxycarboxypropyl)-β-D-
glucopyranosyl
Glc
Aachyranthoside C
3-[2-Carboxy-1-(carboxymethoxy)-2-
hydroxyethyl]-β-D-glucopyranosyl
Glc
Aachyranthoside E
3-[1-Carboxy-1-(carboxymethoxy)
methyl]-β-D-glucopyranosyl
Glc

6
1.1.2.2. Phytoecdysteroid
Là những steroid tự nhiên với bộ khung là cholestane [17]. Hàm lượng
phytoecdysteroid trong rễ dược liệu là 0,037% [7]. Ba phytoecdysteroid được
phân lập chủ yếu là β-ecdysterone, inokosterone và rubrosterone (hình 1.4)
ngoài ra có polypodine B; (25S)-20,22-O-(R-ethylidene) inokosterone; 20,22-
O-(R-ethylidene)-20-hydroxyecdysone; 20,22-O-(R-3-methoxycarbonyl)
propylidene-20-hydroxyecdysone; 20-hydroxyecdysone-20,22-
monoacetonide, (25S)-inokosterone; (25R)-inokosterone-20,22-acetonide;
niuxixinsterone A- C; sefurosterone A [7] [4] [24] [26] [31].
(I) (II) (III)
Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của β-ecdysterone (I), inokosterone (II),
rubrosterone (III) lần lượt từ trái sang phải
1.1.2.3. Polysacharid
Nhóm Polysaccharid chế từ rễ Ngưu tất được công nhận trên nhiều
nghiên cứu là có hoạt tính tăng cường miễn dịch [18] [19] [36]. Trong một
nghiên cứu, polysacharid trong rễ Ngưu tất được phân tích cấu tạo bao gồm
fructose và glucose với tỷ lệ mol là 8:1 [9]. Một số tác giả tìm ra được một
polysacharid tan trong nước bao gồm 6 glucose và 3 mannose [20]. Hàm
lượng polysacharid là 5,68 mg/ 1 gam dược liệu [20].

7
1.1.3. Tác dụng sinh học
Cho đến nay Ngưu tất vẫn luôn được xem là cây thuốc quý, được chú
trong nghiên cứu và có nhiều ứng dụng trong chữa bệnh:
- Tác dụng chống viêm [7] [22]: trong mô hình viêm cấp, dịch chiết
ethanol Ngưu tất ức chế phù khoảng 63.52% và 79.73% sau 3 giờ với liều 375
và 500 mg/kg đối với nhóm thử (p< 0.001) so với đối chứng [30].
- Tác dụng hạ cholesterol máu [4] [25]: năm 2014 Sang Deog Oh
cùng với cộng sự đã nghiên cứu được ảnh hưởng của dịch chiết nước Ngưu
tất ức chế tế bào mỡ 3T3-L1 làm giảm trọng lượng cơ thể và triglycerid đáng
kể so với nhóm chứng [25].
- Tác dụng hạ huyết áp [2] [7] [41]: saponin trong Ngưu tất không chỉ
ngăn cản co mà còn có tác dụng giãn trực tiếp cơ trơn mạch máu dẫn đến hạ
huyết áp [41].
- Tác dụng kháng khuẩn: các loại dịch chiết đều nhạy cảm với
Proteus, Escherichia coli, Bacillus subtilin, Samonella typhy; nhạy cảm trung
bình và kém với Staphylococcus aureus và Pseudomonas [10].
- Tác dụng trên xương [13] [39]: nghiên cứu về tác động của dịch
chiết Ngưu tất trên bệnh loãng xương sau mãn kinh cho thấy sau 16 tuần điều
trị ngăn ngừa mất khối lượng xương do thay đổi tỷ lệ tái tạo xương [39].
- Tác dụng nuôi dưỡng thần kinh [11] [42]: tác dụng của dịch chiết
nước Ngưu tất về phục hồi dây thần kinh bị nghiền nát ở thỏ cho thấy dịch
chiết đẩy nhanh sự tái tạo dây thần kinh ngoại vi phụ thuộc liều [11].
- Tác dụng điều hòa miễn dịch [8] [18] [38]: nghiên cứu năm 2009
[8] tiến hành tìm hiểu ảnh hưởng polysaccharide Ngưu tất tới hoạt động của
các tế bào miễn dịch. Kết quả cho thấy các tế bào lympho hoạt động mạnh
hơn ở lợn con bổ sung polysacharide, cũng như nồng độ huyết thanh IgG,
IgA, IgM, C 3, C 4, IL (interleukin)-2 và IFN (interferon)–γ.

8
- Tác dụng hạ đường huyết: nghiên cứu năm 2009 cho thấy, AbpS có
tác dụng chống oxy hóa và giảm đường huyết của chuột bị tiểu đường rõ ràng
hơn Abp, có thể là do tác dụng chống oxy hóa của nó [36].
1.2. Tổng quan về phương pháp tinh chế
1.2.1. Phương pháp chiết pha rắn (SPE)
1.2.1.1 Khái niệm
SPE là quá trình phân bố các chất tan giữa hai pha lỏng và rắn. Trong
đó, chất tan ban đầu ở trong pha lỏng (nước hoặc dung môi hữu cơ), chất để
hấp phụ chất tan ở dạng rắn (dạng hạt, nhỏ và xốp) gọi là pha rắn [5].
1.2.1.2 Nguyên tắc và cơ chế của SPE
Dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật sắc ký: lựa chọn pha rắn thích hợp
phụ thuộc vào tương tác giữa pha rắn và pha lỏng [43].
Pha rắn là hạt nhỏ và xốp được nhồi vào cột sắc ký. Khi đổ pha lỏng
lên pha rắn trong cột sắc ký, pha tĩnh (pha rắn) sẽ tương tác với các chất và
giữ lại một số nhóm chất trên cột, còn các nhóm khác sẽ đi ra khỏi cột. Sau
đó dùng dung môi thích hợp để rửa giải và thu sản phẩm [5].
Pha rắn: thường là các hạt silica gel xốp trung tính, hạt oxit nhôm,
silica gel trung tính đã được ankyl hóa nhóm –OH bằng các gốc hydrocarbon
mạch thẳng –C2, -C4, -C8, -C18,… hay nhân phenyl, các polyme hữu cơ, các
loại nhựa hoặc than hoạt tính… Pha lỏng là pha chứa hợp chất nghiên cứu [5].
Các tương tác giữa pha tĩnh và pha động như sau:
- Pha đảo bao gồm pha động phân cực hoặc phân cực trung bình và pha
tĩnh không phân cực. Lực giữ các hợp chất hữu cơ từ pha lỏng phân cực (ví
dụ như nước) lên pha tĩnh chủ yếu là do lực liên kết giữa cacbon- hydro của
hợp chất đó và các nhóm chức năng của pha tĩnh. Lực liên kết giữa 2 chất
không phân cực này thường được gọi là lực Van der Waals hoặc lực phân tán.

9
Dung môi phân cực trung bình không phân cực có thể phá vỡ liên kết giữa
pha tĩnh và chất hoặc nhóm chất được hấp phụ lên. Pha tĩnh thường sử dụng
là silica liên kết với alkyl hoặc aryl.
- Pha thường gồm pha động phân cực, hoặc phân cực trung bình đến không
phân cực (ví dụ aceton, hexan) và một pha tĩnh phân cực. Lực giữ một chất là
do lực tương tác giữa các nhóm chất phân cực trên chất đó và nhóm chức trên
pha tĩnh: gồm liên kết hydro, tương tác л- л ... Dung môi phá vỡ lực này
thường là một dung môi có độ phân cực cao. Pha tĩnh thường là silica đính
các chuỗi alkyl ngắn với các nhóm chức phân cực được liên kết trên bề mặt
được sử dụng hấp phụ hợp chất từ phân cực đến không phân cực [43].
- SPE trao đổi ion sử dụng cho các hợp chất anion có thể được phân lập
trên bề mặt silica gắn nhóm amin bậc bốn. Các hợp chất cation được phân lập
bằng cách sử dụng silica gắn các nhóm axit sulfonic. Cơ chế chính giữ hợp
chất lên bề mặt chủ yếu dựa vào sự thu hút tĩnh điện của hai nhóm chức tích
điện [43].
1.2.1.3. Ứng dụng
Phân tích hợp chất hữu cơ: SPE được ứng dụng cho phân tích hợp chất
hữu cơ: tách và làm giàu dư lượng thuốc trừ sâu, các chất hoạt động bề mặt,
các hydrocacbon thơm mạch vòng khó phân hủy… trong các mẫu nước [5].
Phân tích các chất vô cơ: ngày nay, SPE được phát triển và ứng dụng
rộng rãi để làm giàu và tách các ion kim loại trong môi trường bằng phương
pháp trao đổi ion, chiết các hợp phức kim loại với thuốc thử hữu cơ, ứng dụng
các loại nhựa vòng càng [5].
Ngày nay, SPE được sử dụng rộng rãi như là một kỹ thuật chuẩn bị để
phân tích mẫu trong các lĩnh vực y học, khoa học và công nghệ thực phẩm…
Đây là kỹ thuật đang có tiềm năng rất lớn trong việc phân tích và phân lập các
sản phẩm tự nhiên [33].

10
1.2.2. Tổng quan về hạt nhựa macroporous
1.2.2.1. Định nghĩa và phân loại
Hạt macroporous là hạt polymer hình cầu, màu trắng, cấu trúc xốp với
các lỗ xốp tương đối rộng (đường kính lỗ xốp >50 Å) [16] có thể cho phân tử
lớn đi qua, hấp phụ nhờ lực liên kết tĩnh điện, liên kết hydro hoặc tạo phức.
Bảng 1.2: Đặc tính vật lý một số loại hạt nhựa macroporous [33]
Độ phân
cực
Loại hạt
nhựa
Cấu trúc
Kích thước
(mm)
Diện tích bề
mặt (m2
/g)
Độ ẩm
(%)
Không
phân cực
D1400
Styren 0,3- 1,2
≥ 550 55- 60
X-5 500- 600 50- 55
D4020 540- 580 60- 65
Phân cực
yếu
HP- 20
Polystyren
>0,25 600 65- 70
HP-20 0,3- 1,0 500- 650 55- 75
DM130 0,3- 1,2 500- 550 65- 75
Phân cực
trung bình
D302
Polystyren
0,3- 1,2
550- 600 55- 65
HPD-600 300 50- 55
XDA-8
Styren
divinyl-
benzen
≥ 1050 65- 75
Phân cực
FL-1 Polystyren 0,3- 1,0 100- 200 55- 70
ADS-11
Nhóm
sulfonic 0,3- 1,2
190- 220 60- 70
DA201 Styren ≥ 150 60- 65
Theo IUPAC, hạt nhựa macroporous có các lỗ xốp trong khoảng 50 nm
đến 1 μm. Tuy nhiên gần đây, do nhận được nhiều sự chú ý nên các vật liệu
có kích thước lỗ xốp từ 1 μm dến 100 μm và lớn hơn nữa cũng đã được sản
xuất. Có thể gọi đó là các polyme supermacroporous [23].

11
1.2.2.2. Đặc điểm hạt nhựa macroporous
Ba đặc tính quan trọng đặc trưng cho khả năng hấp phụ của các hạt
nhựa là: tổng diện tích bề mặt (trong và ngoài), đường kính lỗ xốp và độ phân
cực bề mặt. Diện tích bề mặt thường trong khoảng 100 đến 1000 m2
/g, đường
kính lỗ xốp khoảng từ 100 đến 300 Å, độ phân cực thì rải đều từ không phân
cực, phân cực yếu, trung bình và mạnh tùy theo monomer sử dụng trong hoặc
xử lý sau quá trình polymer hóa [15] [16] [27].
Đường kính lỗ xốp và diện tích bề mặt được quyết định bởi cấu trúc
của hạt nhựa, cấu trúc được kiểm soát dựa vào thành phần các chất hóa học sử
dụng trong hỗn hợp đem đi polymer hóa (ngoài các monomer thì để tạo ra các
lỗ xốp còn thêm các chất gọi là porogen trộn lẫn với hỗn hợp monomer,
không hòa tan được polymer, có khả năng bay hơi ở nhiệt độ nhất định sau
khi kết thúc polymer hóa để lại những lỗ hổng trong cấu trúc polymer) [16].
1.2.2.3. Tổng quan về hạt nhựa macroporous D101
1.2.2.3.1. Thông số vật lý
Bảng 1.3: Thông số vật lý của hạt nhựa D101 theo nhà sản xuất
Hình dạng Hạt hình cầu, màu trắng đục
Độ phân cực Không phân cực
Độ ẩm 65- 75%
Trọng lượng riêng bão hòa 1,00- 1,07 g/ml
Trọng lượng biểu kiến bão hòa 0,67- 0,73 g/ml
Diện tích bề mặt 500- 550 m2
/g
Đường kính lỗ xốp trung bình 9- 10 nm
Khoảng đường kính hạt nhựa 0,3- 1,25 mm
Thể tích lỗ xốp 1.18- 1.24 ml/g
Độ xốp 50- 60%

12
1.2.2.3.2. Cơ chế hấp phụ saponin của hạt nhựa D101
Hạt nhựa D101 bản chất là polymer styren divinylbenzen không phân
cực, tạo liên kết Van der Waals với saponin có phần sapogenin không phân
cực trong dịch chiết của Ngưu tất đã qua xử lý nên có khả năng hấp phụ
saponin [16].
Hơn nữa, các lỗ xốp trong hạt nhựa làm tăng diện tích tiếp xúc dẫn đến
tăng hiệu quả hấp phụ của hạt nhựa, tỷ lệ giữa đường kính lỗ xốp của hạt
nhựa macroporous với đường kính phân tử hấp phụ là trong khoảng 2 đến 6.
Nếu đường kính quá nhỏ thì chất hấp phụ đi vào trong lỗ xốp rất khó, còn quá
lớn thì chất hấp phụ dễ dàng đi qua lỗ và làm giảm diện tích bề mặt hấp phụ.
Đường kính của glycosid ước tính ít nhất là 1 nm, tùy thuộc vào loại và nhiều
nhóm chức được gắn vào khung của chúng. Trong thực tế các phân tử thường
lớn hơn đáng kể, đối với glycosid một số nhóm đường thường được gắn vào
phân tử, đường kính phân tử có thể được ước tính khoảng 2,0 nm [16]. D101
đường kính lỗ xốp trung bình 9-10 nm, gấp khoảng 5 lần so với đường kính
glycosid nên thích hợp cho việc sử dụng để tinh chế các glycosid.
1.2.2.3.3. Ứng dụng trong tách chiết saponin
Trong những thập kỉ gần đây, hạt nhựa D101 được phát triển và ứng
dụng rất rộng rãi trong chiết xuất, phân lập và tinh chế các chất có nguồn gốc
tự nhiên flavonoid, saponin, tách kim loại,… [28]. Trong đó saponin là nhóm
chất có nhiều nghiên cứu (khoảng 30 bài báo) sử dụng hạt nhựa D101 với
mục đích tinh chế, phân lập.
Năm 2013, Liu Z và cộng sự đã tinh chế saponin steroid từ thân rễ
của Paris Polyphylla var. yunnanensis để chọn loại hạt nhựa phù hợp nhất
nhằm thiết lập một phương pháp đơn giản, bảy loại hạt nhựa macroporous đã
được lựa chọn để khảo sát hấp phụ và giải hấp phụ. Kết quả hạt nhựa D101
được chứng minh là hấp phụ và giải hấp phụ tốt nhất cho saponin

13
steroid. Saponin steroid toàn phần trong sản phẩm tăng 4,83 lần với hàm
lượng thu hồi lên tới 85.47% [21].
Hấp phụ và giải hấp phụ flavonoid và saponin toàn phần của
Astragalus trên các hạt nhựa macroporous khác nhau bao gồm D101, AB-8,
XAD-1, HP-20, SP8-25, LSA-40, LX-18, XDA-5 và ADS-7 được so
sánh. Theo kết quả, XDA-5, D101 và AB-8 khả năng hấp phụ, giải hấp phụ
và tốc độ hấp phụ cao hơn flavonoid và saponin các loại hạt nhựa khác [34].
Một nghiên cứu khác sử dụng hạt nhựa macroporous D101 để làm sạch
gypenosid từ dịch chiết thô Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makino.
Theo điều kiện tối ưu được xác định như sau: nồng độ mẫu 6 mg/mL và giải
hấp phụ với dung dịch ethanol 50% , kết quả hàm lượng saponin thu được đạt
92,76% [14].
Tinh chế saponin toàn phần từ Gynostemma bằng cách chiết nước nóng
và sau đó tinh chế bằng hấp phụ lên hạt nhựa D101. Sau tinh chế bằng hạt
nhựa D101 kết quả cho thấy hàm lượng saponin toàn phần tăng từ 26,2% lên
83% [12].
Năm 2006, Xu Xianxiang, Xia Lunzhu thiết lập một phương pháp tách
và tinh chế saponin toàn phần từ Radix clematidis: chiết xuất với 70% ethanol
và sau đó được tinh sạch bằng hạt nhựa D101. Sau khi rửa với nước cất và
ethanol các nồng độ 30%, 50% và 70% thì so sánh bằng các chỉ số: tốc độ rửa
giải và tỷ lệ rửa giải. Kết quả saponin toàn phần được giải hấp phụ với ethanol
50%. Tỷ lệ rửa giải là 71,26% và khả năng hấp phụ là 53,36 mg/g [35].
1.2.2.4.4. Ứng dụng hạt nhựa trong nghiên cứu Ngưu tất
Cho đến nay, ứng dụng hạt nhựa macroporous trong nghiên cứu Ngưu
tất đã được chú ý rất nhiều, trong đó nhựa macropopous D101 đã được sử
dụng trong một số nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc của một số chất
trong Ngưu tất khi kết hợp với những phương pháp khác.

14
Năm 2007, với mục tiêu phân lập các thành phần từ Ngưu tất và làm
sáng tỏ cấu trúc của chúng Zhao Wan-ting và cộng sử đã sử dụng hạt nhựa
macroporous D101, sắc ký cột silica gel và HPLC, UV, 1
H-NMR và 13
C-
NMR để xác định cấu trúc. Kết quả cho 5 hợp chất đã được xác định là:
stachysteron A, podecdyson C, β-ecdysteron, 25-(R)-inokosteron, 25-(S)–
inokosteron [40].
Qiu-Hong Wang và cộng sự đã xác định được cấu trúc 3 hợp chất
phytoecdysteroid mới, có tên niuxixinsteron A, B và C. Các cấu trúc đã được
xác định là (20R,22R,24S)-20-O,22-O-(5′-hydroxymethyl)-furfuryliden-
2β,3β,14α,25-tetrahydroxy-5β-ergost-7-en-6-one, (20R,22R)-20-O,22-O-(5′-
hydroxymethyl)-furfuryliden-2β,3β,25-trihydroxy-14β-methyl-18-nor-5β-
cholesta-7,12-dien-6-one và (20R,22R,25R)-20-O,22-O-(5′-hydroxymethyl)-
furfuryliden-2β,3β,5β,14α,26-pentahydroxycholest-7-en-6-one) bằng chứng
quang phổ. Dịch chiết ban đầu được xử lý và phân lập bằng hạt nhựa
macroporous D101 và sắc ký cột silica gel [32].
Tiếp theo đó công bố năm 2012 đã thu được 2 glycosid tyramin
feruloyl và 7 saponin triterpenoid đã thu được, chúng xác định là N-trans-
feruloyl-3-methoxytyramin-4′-O-β-D-glucopyranosid, N-trans-feruloyl-3-
methoxytyra min-4-O-β-D-glucopyranosid, PJS-1, chikusetsusaponin IVa,
oleanolic acid 3-O-[β-D-glucuronopy ranosid-6-O-methyl ester]-28-O-β-D-
glucopyranosid (5), oleanolic acid 3-O-[β-D-glucuronopyran-osid-6-O-
ethylester]-28-O-β-D-glucopyranosid, oleanolic acid 3-O-[β-D-
glucuronopyranosid-6-O-butyl ester]-28-O-β-D-glucopyranosid, ginsenosid
Ro và hederagenin-28-O-β-D-glucopyranosyl ester. Các thành phần hóa học
trên được phân lập và tinh chế bằng hạt nhựa D101, silica gel và sắc ký điều
chế HPLC sử dụng cột ODS. Cấu trúc của chúng đã được làm sáng tỏ trên cơ
sở phân tích 1D và 2D- NMR [37].

15
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, nguyên liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên vật liệu
Rễ Ngưu tất đã được xông sinh nguồn gốc ở Thái Bình đạt tiêu chuẩn
hàm lượng saponin trong dược liệu khô >1% theo Dược điển Hong Kong.
Hình 2.1 Hình ảnh dược liệu Ngưu tất
Hạt nhựa D101 nguồn gốc từ Trung Quốc được mua của công ty Anhui
sanxing resin technology.
Hình 2.2 Hình ảnh hạt nhựa macroporous D101

16
2.1.2. Hoá chất, thiết bị, dụng cụ
2.1.2.1. Hoá chất
Bảng 2.1 Tên hoá chất và nguồn gốc
TT Tên hóa chất Tiêu chuẩn, nguồn gốc
1 Ethanol 96% Việt Nam
3 HCl Trung Quốc
4 NaOH Trung Quốc
5 Natri laurylsulfat Trung Quốc
6 Methanol Trung Quốc
7 Cloroform Trung Quốc
8 Vanillin Trung Quốc
9 H2SO4 đặc Trung Quốc
10 Aceton Trung Quốc
2.1.2.2. Dụng cụ
- Cột thuỷ tinh (đường kính trong: 1,5 cm; 2 cm; 2,5 cm; 4 cm )
- Pipet pasteur; pipet 1 ml, 5 ml, 10 ml.
- Phễu thuỷ tinh.
- Cốc thuỷ tinh.
- Ống đong 100 ml, 250 ml, 1000 ml, 2000 ml.
- Giấy lọc.
- Bình định mức 10 ml.
2.1.2.3. Thiết bị
- Máy cất quay Daihan scientific (Hàn Quốc).
- Cân phân tích Mettler Toledo AB204S (Thuỵ Sỹ).
- Máy đo hàm ẩm Ohaus (Thuỵ Sĩ).

17
- Cân phân tích Wisd (Đức).
- Máy đo quang Shimadzu.
- Tủ sấy Memmert (Đức).
- Hệ thống lọc hút Buchner.
- Máy siêu âm Daihan scientific (Hàn Quốc).
- Bể điều nhiệt.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu cách xử lý hạt nhựa ban đầu
2.2.2. Nghiên cứu quá trình hấp phụ saponin từ dịch chiết lên hạt nhựa
macroporous D101
- Khảo sát tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột.
- Xác định dung lượng hấp phụ của hạt nhựa.
2.2.3. Nghiên cứu quá trình giải hấp phụ saponin từ hạt nhựa
macroporous D101
- Khảo sát dung môi rửa giải.
- Khảo sát thể tích rửa giải.
2.2.4. Đề xuất và ổn định quy trình trình làm giàu saponin ứng dụng hạt
nhựa macroporous D101
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.Phương pháp định tính, định lượng
2.3.1.1. Phương pháp thuỷ phân
- Dịch được thuỷ phân trong môi trường axit HCl 10% với tỷ lệ dịch thuỷ
phân: axit là 2:1 (v:v).
- Điều kiện: nhiệt độ 85o
và trong thời gian 2,5 giờ.

18
2.3.1.2. Phương pháp định tính
Phương pháp: sắc ký lớp mỏng với các điều kiện như sau:
- Lựa chọn điều kiện pha động: cloroform: methanol (20:1) (v:v).
- Pha tĩnh: bản mỏng TLC silica gel 60 F254 (Merck).
- Mẫu thử: dịch được thuỷ phân như mục 2.3.1.1 và lấy phần tủa đem hoà với
1ml ethanol tuyêt đối.
- Chất đối chiếu: axit oleanolic.
- Thuốc thử hiện màu: bản mỏng được nhúng thuốc thử vanlin/ axit sulphuric
(pha theo DĐVN IV), sau đó sấy ở 100˚C và quan sát dưới ánh sáng thường.
Saponin cho vết màu tím trên bản mỏng.
2.3.1.3. Phương pháp định lượng
Định lượng bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 550 nm theo quy
trình sau:
- Chuẩn bị mẫu trắng:
+ Lấy chính xác 1ml methanol cho vào ống nghiệm và cô đến cắn rồi
thêm 0,3 ml vanillin trong axit acetic và 1 ml HClO4 đem ủ ở 75o
trong 15
phút sau đó định mức 10 ml bằng axit acetic.
- Chuẩn bị mẫu cần định lượng:
+ Hút chính xác vào ống nghiệm 2 ml dịch cần định lượng đem pha
loãng với 2 ml nước cất rồi tiến hành thuỷ phân như đã nêu ở mục 2.3.1.1.
Sau thuỷ phân, lọc lấy tủa hoà tan bằng methanol rồi định mức 10 ml bằng
methanol và lắc đều.
+ Lấy chính xác 1 ml dịch này cho vào ống nghiệm cô thành cắn rồi hoà
tan bằng 0,3 ml vanilin trong axit acetic và 1ml HClO4 đem ủ ở 75o
trong 15
phút. Sau đó định mức 10 ml bằng axit acetic. Lắc đều và đem đi đo quang.

19
 Nồng độ saponin trong mẫu được tính toán như sau:
Từ phương trình tuyến tính giữa giá trị mật độ quang đo được và nồng độ
axit oleanolic có dạng: A= aC+ b
Nồng độ saponin (mg/ml): C (mg/ml) =
Trong đó:
A- b
1000. a
C%: nồng độ saponin trong mẫu (mg/ml).
A: mật độ quang đo được của mẫu.
a, b: các hệ số của phương trình đường chuẩn.
2.3.2. Phương pháp chiết
Dược liệu sau khi được rửa sạch và cắt nhỏ đem chiết hồi lưu với
ethanol 50% với tỷ lệ dược liệu: dung môi (kl:v) là 1: 8.
Chiết ở điều kiện nhiệt độ 90o
trong 3 lần thứ tự 4 giờ, 3 giờ và 2 giờ.
Lọc dịch chiết, bỏ phần bã. Gộp dịch chiết ethanol 50% của 3 lần.
2.3.3. Phương pháp xử lý dịch chiết
- Dịch chiết ethanol 50% thu được đem cô quay dưới áp suất giảm đến cao
đặc.
- Hoà cao vào nước (tỷ lệ nước: dịch chiết ethanol là 1:1).
- Lọc dịch nước bằng phễu lọc Buchner được dịch trong đem chạy cột.
2.3.4. Phương pháp nghiên cứu xử lý hạt nhựa ban đầu
Dung lượng hấp phụ (Qe) là khả năng hấp phụ chất hoặc nhóm chất của
1 g hạt nhựa có thể hấp phụ được. Cách xử lý ban đầu ảnh hưởng rất lớn đến
thông số dung lượng hấp phụ của hạt. Tham khảo từ các tài liệu và thông tin
từ nhà sản xuất, xử lý hạt nhựa ban đầu có thể dùng các dung dịch a cid, ba zơ
và chủ yếu bằng ethanol tuyệt đối. Mục tiêu: xác định quá trình xử lý ban đầu
để loại hết tạp bám trên hạt nhựa trong quá trình sản xuất và hạt sau xử lý cho

20
kết quả dung lượng hấp phụ cao nhất đồng thời khảo sát sự ảnh hưởng của các
dung môi lên khả năng hấp phụ của hạt nhựa.
Tiến hành:
- Chuẩn bị dịch chạy cột như mục 2.3.2 và 2.3.3.
- Chuẩn bị hạt nhựa: ngâm 24 giờ trong ethanol 96% để loại hết tạp còn sót lại
trong hạt nhựa và làm hạt trương nở rồi rửa sạch ethanol bằng nước cất. Sau
đó cân 3 phần mỗi phần khoảng 1g cho vào bình nón đem xử lý tiếp như sau:
+ Mẫu 1: không xử lý gì thêm.
+ Mẫu 2: ngâm trong dung dịch axit HCl 4% trong 4 giờ.
+ Mẫu 3: ngâm trong dung dịch NaOH 4% trong 4 giờ.
- Rửa sạch mẫu 2 và 3 bằng nước cất đến pH trung tính.
- Hút chính xác 40 ml dịch chiết cho vào các bình nón, ngâm trong 24 giờ thi
thoảng lắc đều.
- Sau 24 giờ, lấy chính xác mỗi mẫu 6 ml cho vào ống nghiệm đem thuỷ phân
ở điều kiện như mục 2.3.1.1. Sau đó định lượng mẫu bằng phương pháp đo
quang.
 Đánh giá kết quả: chọn phương pháp xử lý cho hạt nhựa có dung lượng
hấp phụ cao nhất.
 Dung lượng hấp phụ của hạt nhựa được tính theo công thức sau:
Trong đó:
Q (mg/g) =
(Co- Cs)× V
e m
Qe: dung lượng hấp phụ của hạt nhựa (mg/g).
Co: nồng độ dịch chiết ban đầu (mg/ml).
Cs: nồng độ dịch chiết sau hấp phụ (mg/ml).
m: khối lượng hạt nhựa đem hấp phụ (g).
V: thể tích dich hấp phụ (ml).

21
- Sau khi có kết quả trong điều kiện tĩnh lựa chọn tác nhân thích hợp để
chuyển sang xác định Qe ở điều kiện động như mục 2.3.5.2.
2.3.5. Phương pháp nghiên cứu quá trình hấp phụ saponin từ dịch chiết
lên hạt nhựa macroporous D101
2.3.5.1. Phương pháp khảo sát tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột
Với mục tiêu xác định cột có tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột phù hợp.
Nghiên cứu đánh giá dựa trên dung lượng hấp phụ, hiệu suất giải hấp phụ và
hàm lượng saponin của cao tương ứng với mỗi cột sau tinh chế.
Tiến hành:
- Chuẩn bị hạt nhựa: xử lý hạt nhựa theo quy trình được kết luận ở mục 2.3.4.
- Chuẩn bị cột: 25 g hạt nhựa được đưa lên mỗi cột có đường kính thứ tự 1,5
cm (tỷ lệ 10), 2 cm (tỷ lệ 6) và 2,5 cm (tỷ lệ 4).
- Tiến hành hấp phụ 1000 ml dịch qua mỗi cột với vận tốc 2 BV/h sau đó rửa
giải với 300 ml ethanol 70% vận tốc 1,5 BV/h.
Tính toán:
 Dung lượng hấp phụ:
Trong đó:
Q (mg/g) =
Cv× Vv- Cr× Vr
e m
Cv: nồng độ saponin dịch nước được hấp phụ (mg/ml).
Vv: thể tích dịch nước được hấp phụ (ml).
Cr: nồng độ saponin của dịch rửa giải (mg/ml).
Vr: thể tích dịch rửa giải (ml).
m: khối lượng hạt nhựa lên cột (g).

22
 Hiệu suất giải hấp phụ:
Hghp (%) =
Cr× Vr× 100
Qe× m
Trong đó:
Qe: dung lượng hấp phụ (mg/g).
2.3.5.2. Phương pháp xác định dung lượng hấp phụ của hạt nhựa trên điều
kiện động
Có thể tính toán thông số Qe ở điều kiện động và điều kiện tĩnh. Do quá
trình hấp phụ thực hiện trên cột nên trong nghiên cứu tiến hành xác định Qe ở
điều kiện động. Từ đó làm cơ sở để ước tính lượng dịch chiết đưa hấp phụ
qua cột.
Tiến hành:
- Chuẩn bị hạt nhựa: xử lý hạt nhựa dựa vào kết quả đạt được sau khi tiến
hành quy trình ở mục 2.3.4.
- Cột thuỷ tinh (đường kính 4 cm) được nạp 180 g hạt nhựa (tỷ lệ chiều cao/
đường kính cột là 6, thể tích cột (BV) là 240 ml). Dịch được cho chảy qua cột
với vận tốc 2 BV/h.
- Dịch sau hấp phụ mỗi BV lấy 2 ml vào ống nghiệm đem đi định tính
saponin bằng SKLM. Khi sắc ký đồ dịch ra hiện vết saponin thì dừng lại.
 Dung lượng hấp phụ của hạt nhựa được tính toán theo công thức sau.
Q (mg/g)=
Co× Vv
e m

23
Trong đó:
Co: nồng độ dịch chạy cột (mg/ml).
Vv: thể tích dịch ra (ml).
2.3.6. Phương pháp nghiên cứu quá trình giải hấp phụ saponin từ hạt
nhựa macroporous D101
2.3.6.1. Khảo sát dung môi giải hấp phụ
Mục tiêu: khảo sát khả năng rửa giải của các dung môi từ đó tìm kiếm
dung môi thích hợp có sức rửa giải tốt để tiết kiệm thời gian và đạt được hiệu
suất cao. Tham khảo tài liệu [14] [23] [35] dung môi thường được sử dụng để
rửa giải là ethanol hoặc aceton vì vậy nhóm tiến hành nghiên cứu với các loại
dung môi này.
Tiến hành:
- Giai đoạn hấp phụ: ngâm 10 g hạt nhựa đã xử lý trong 400 ml dịch trên
trong 24 giờ thỉnh thoảng lắc đều. Hạt nhựa sau hấp phụ lọc và cân 1g vào
mỗi bình nón.
- Giai đoạn rửa giải: thêm vào mỗi bình nón 6 ml ethanol nồng độ 10%, 20%,
30%, 40%, 50%, 70%, 80%, 96% và aceton ngâm trong 4 giờ, thỉnh thoảng
lắc đều. Sau đó lấy 2 ml mỗi mẫu đi thuỷ phân trong điều kiện 2.3.1.1 để xác
định nồng độ saponin trong dịch giải hấp phụ bằng phương pháp đo quang.
 Đánh giá: nồng độ saponin thông qua nồng độ axit oleanolic trong dịch
sau rửa giải để lựa chọn dung môi rửa giải thích hợp. Nồng độ càng cao càng
chứng tỏ dung môi có sức rửa giải saponin tốt.

24
2.3.6.2. Khảo sát thể tích rửa giải
Mục tiêu: ước tính được thể tích dung môi cần dùng cho cả quá trình
rửa giải bao gồm giai đoạn loại tạp và giải hấp phụ.
Tiến hành:.
- Chuẩn bị hạt nhựa: cân 180 g hạt nhựa xử lý theo quy trình được kết luận ở
mục 2.3.4.
- Giai đoạn hấp phụ: hạt nhựa sau xử lý được nhồi lên cột (đường kính 4 cm,
tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột là 6) và cho dịch chạy qua cột với vận tốc 2
BV/h.
- Giai đoạn rửa giải:
+ Rửa loại tạp chất với vận tốc 4 BV/h:
Khảo sát với nước: hứng mỗi BV dịch rửa ra quan sát màu sắc dịch ra
và đồng thời kiểm tra bằng SKLM sau khi thuỷ phân.
Khảo sát với ethanol: từ kết quả của khảo sát dung môi rửa giải chọn ra
nồng độ ethanol thích hợp để khảo sát thể tích rửa giải và quan sát sắc ký đồ
để kết luận khả năng rửa loại tạp chất của nó.
+ Giải hấp phụ với vận tốc 1,5 BV/h: lựa chọn nồng độ ethanol thích hợp
từ kết quả khảo sát để ước tính thể tích rửa giải. Mỗi BV dịch rửa giải, lấy 2
ml đem thuỷ phân để chấm sắc ký. Theo dõi lượng saponin ra bằng SKLM và
định lượng bằng phương pháp đo quang. Dừng quá trình rửa giải khi vết
saponin trên sắc ký đồ mờ hẳn.
2.3.7. Đề xuất và ổn định quy trình làm giàu saponin từ rễ Ngưu tất ứng
dụng hạt nhựa macroporous D101
Chuẩn bị dịch chiết như mục 2.3.2 và 2.3.3 được dịch nước Ngưu tất để
đưa lên cột.

25
 Lượng dịch đưa lên cột:
Vv
(ml) =
Qe
× m
Cv
Trong đó:
Qe: dung lượng hấp phụ của hạt nhựa (mg/g).
Cv: Nồng độ dịch nước Ngưu tất được hấp phụ (mg/ml).
Chuẩn bị hạt nhựa: xử lý bằng ethanol trong 24 giờ, sau đó rửa sạch
ethanol và ngâm trong NaOH 4% trong 4 giờ và rửa bằng nước cất đến trung
tính, rồi đưa lên cột 180 g hạt nhựa (đường kính 4 cm, 1 BV= 240 ml).
Tiến hành tinh chế saponin từ rễ Ngưu tất bằng hạt nhựa macroporous
D101 theo những thông số đã lựa chọn:
- Giai đoạn hấp phụ: dịch được đưa qua cột hấp phụ với tốc độ 2 BV/h
chạy đến Vv ml dịch thì dừng lại.
- Giai đoạn rửa tạp: tiếp theo rửa cột với nước cất với vận tốc 4 BV/h.
Sau đó đưa lên ethanol để tiếp tục loại tạp chất cũng với vận tốc 4
BV/h.
- Giai đoạn giải hấp phụ bằng ethanol: hứng dịch rửa giải với vận tốc 1,5
BV/h.
 Lặp lại quy trình trên 3 lần.
 Đánh giá hàm lượng cao, hiệu suất giải hấp phụ, hiệu suất toàn bộ quá
trình và độ lặp lại của quy trình.
 Tính toán:
 Hiệu suất giải hấp phụ được tính toán như công thức mục
2.3.5.1.

26
 Hàm lượng saponin trong cao:
HL (%)=
Cr× Vr× 100
mcao
Trong đó:
mcao: khối lượng cao thu được (mg).
 Hiệu suất toàn bộ quy trình:
H (%) =
Cr× Vr× 1000
mdl× h× (100- W)
Trong đó:
mdl: khối lượng dược liệu đem chiết (g).
h: hàm lượng saponin trong dược liệu khô (%).
W: độ ẩm của dược liệu (%).

27
Qe
30
25
20
15
10
5
0
Ethanol 96⁰ HCl 4% NaOH 4%
Tác nhân
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Nghiên cứu xử lý hạt nhựa ban đầu
Tiến hành thực hiện như mô tả mục 2.3.4 và so sánh dung lượng hấp
phụ của hạt nhựa qua cách xử lý khác nhau kết quả trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của các tác nhân đến dung lượng hấp phụ của hạt nhựa
Tác nhân Ethanol 96o
Axit HCl 4% NaOH 4%
Dung lượng hấp
phụ (mg/g)
17,38 19.84 25.25
Hình 3.1 Ảnh hưởng của các tác nhân đến dung lượng hấp phụ của hạt nhựa
Nhận xét:
Dựa vào hình 3.1 cho thấy xử lý bằng NaOH 4% cho kết quả dung
lượng hấp phụ tốt nhất và vượt trội so với xử lý bằng ethanol và HCl 4%.
Việc xử lý bằng NaOH 4% làm tăng dung lượng hấp phụ saponin của hạt
nhựa gấp khoảng 1,5 lần so với việc chỉ xử lý bằng ethanol. Điều này rất có ý
nghĩa trong áp dụng lên quy mô lớn: có thể tiến hành hấp phụ thể tích dịch
nhiều hơn và cho ra nhiều sản phẩm hơn.

28
%
100.00
90.00
80.00
70.00
60.00
50.00
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
Ảnh hưởng của tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột
85.15
76.15
71.33
2 4 6 8 10 12 Tỷ lệ
Kết luận: Hạt nhựa sau khi được xử lý ethanol 96% trong 24 giờ sẽ
được xử lý bằng dung dịch NaOH 4% trong 4 giờ.
3.2. Khảo sát quá trình hấp phụ saponin lên hạt nhựa macroporous D101
ở điều kiện động
3.2.1. Khảo sát tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột
Tiến hành theo thí nghiệm đã trình bày ở mục 2.3.5.1.
Kết quả so sánh dung lượng hấp phụ hiệu suất rửa giải và hàm lượng
saponin trong cao của mỗi cột với tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột khác nhau
thể hiện ở bảng 3.2, hình 3.2.
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ/ chiều cao cột lên dung lượng hấp phụ của hạt
Tỷ lệ 4 6 10
Qe (mg/g) 26,92 27,30 27,86
Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột

29
0 1 5 7 10 11 12 13 14 16 17
Nhận xét:
Bảng 3.2 cho thấy với tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột khác nhau từ 4
đến 10 thì dung lương hấp phụ chỉ chênh lệch 3.37%. Do vậy tỷ lệ này không
ảnh hưởng nhiều đến khả năng hấp phụ của hạt nhựa.
Nhìn vào hình 3.2, hiệu suất giải hấp phụ tăng từ 76,15% đến 85,15%
khi tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột tăng từ 4 đến 6, nhưng sau đó giảm dần
khi tỷ lệ này tiếp tục tăng đến 10 (71,33%).
Kết luận: chọn tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột là 6 cho quá trình hấp
phụ và giải hấp phụ.
3.2.2. Xác định dung lượng hấp phụ của hạt nhựa trên điều kiện động
Tiến hành xử lý hạt nhựa trước tiên bằng ethanol 96% tiếp tục xử lý
bằng trong NaOH 4% rồi tiến hành như mục 2.3.5.2.
Kết quả thu được như sau:
Hình 3.3 Hình ảnh sắc ký của dịch ra theo mỗi BV
Bảng 3.3 Kết quả dung lượng hấp phụ của hạt nhựa (n= 3)
Tác nhân Dung lượng hấp phụ (mg/g)
NaOH 4% 25,77± 0,60

30
Nhận xét:
Quan sát hình ảnh sắc ký hình 3.3 đồng thời so sánh hình ảnh sắc ký
của dịch lên cột ban đầu (vết (0)) và dịch ra sau hấp phụ có sự tương đồng
giữa các vết tạp về số lượng cũng như cường độ màu cho thấy saponin được
hấp phụ lên hạt nhựa và tạp chất được loại bỏ theo dịch ra. Những BV đầu
tiên saponin được hấp phụ hoàn toàn cho đến BV thứ 10 bắt đầu xuất hiện vết
saponin mờ trên sắc ký đồ và đậm lên khi đến BV thứ 13 trở về sau. Chọn BV
thứ 12 là điểm dừng hấp phụ để tính toán Qe của hạt nhựa.
Kết quả ở bảng 3.3 thu được cho thấy ở điều kiện động cũng tương tự
như ở điều kiện tĩnh dung lượng hấp phụ của hạt nhựa xử lý thêm NaOH 4%.
Dung lượng hấp phụ của hạt nhựa ở điều kiện động là 25,77 mg/g.
3.3. Khảo sát quá trình giải hấp phụ saponin trên hạt nhựa macroporous
D101
3.3.1. Lựa chọn dung môi giải hấp phụ saponin
Tiến hành như mục 2.3.6.1 và đánh giá nồng độ saponin trong dịch rửa
giải rồi tìm được nồng độ ethanol phù hợp, kết quả thể hiện ở hình 3.4.
Hình 3.4 So sánh khả năng rửa giải của các dung môi
EtOH EtOH EtOH EtOH EtOH EtOH EtOH EtOH Aceton
10% 20% 30% 40% 50% 70% 80% 96%
Dung môi rửa giải
0.12
0.05
0.65
1.00
0.00
1.20
2.00
4.60
4.15
4.22
5.00
4.00
3.00
5.39
6.19
mg/ml
7.00
6.00
Nồng
độ
dịch
giải
hấp
phụ

31
Nhận xét:
Quan sát biểu đồ cho thấy nồng độ saponin trong dịch rửa giải cũng
như tỷ lệ saponin được giải hấp phụ tăng lên khi ethanol sử dụng để giải hấp
phụ có nồng độ tăng lên và aceton có khả năng rửa giải saponin tốt nhất với
nồng độ saponin trong dịch rửa giải cao nhất. Tuy nhiên sức rửa giải của
ethanol 50%, 70%, 96% cũng tốt hơn các nồng độ còn lại và với ethanol 96%
thì kém aceton 0,8 g/ml. Cân nhắc các yếu tố về an toàn, chi phí và quy mô sử
dụng lựa chọn ethanol để rửa giải. Ethanol 50%, 70%, 96% được lựa chọn để
nghiên cứu thể tích rửa giải.
Kết quả cũng cho thấy ethanol nồng độ thấp 10%, 20% có khả năng rửa
giải saponin kém nên có thể lựa chọn để khảo sát khả năng rửa loại tạp chất.
3.3.2. Khảo sát thể tích rửa giải
3.3.2.1. Quá trình rửa tạp chất
Nước thường được sử dụng để loại bỏ các tạp màu tan trong nước,
đường đồng thời cũng làm sạch dịch chiết còn bám trên cột. Hơn nữa dựa vào
hình 3.4 thấy rằng ethanol 10%, 20% khả năng rửa giải saponin kém nhất và
có thể loại thêm một số tạp chất. Thí nghiệm tiến hành để quan sát khả năng
loại tạp của các dung môi trên và xác định thể tích dung môi cần cho quá trình
rửa tạp đánh giá qua hình ảnh sắc ký đồ.
Thí nghiệm tiến hành như mục 2.3.6.2 với mỗi dung môi chạy với vận
tốc 4 BV/h, thu được kết quả ở hình 3.5.
Nhận xét:
Dựa vào hình ảnh sắc ký hình 3.5: cả 3 dung môi khi rửa cột đều có
hình ảnh vết tạp màu nâu trên sắc ký đồ, nước không rửa ra saponin, ethanol
10% và 20% đều rửa ra một phần saponin. Mặc dù vậy nhưng ethanol 20% có
khả năng loại tạp tốt hơn khi trên sắc ký đồ có nhiều vết tạp hơn, vì vậy để

32
Nước 10% 20%
1 2 3 4 5 6 7
giảm bớt tạp giúp tăng hàm lượng saponin thu được, nhóm nghiên cứu quyết
dùng ethanol 20% cho giai đoạn rửa tạp.
 Chọn nước và ethanol 20% để rửa tạp.
Hình 3.5 Sắc ký đồ của dịch ra theo thứ tự dung môi rửa tạp là nước, ethanol
10% và 20% (từ trái qua phải)
Nhìn tiếp vào hình 3.6, sau khi tăng lượng nước rửa lên 6 BV không
còn thấy vết tạp trên sắc ký đồ và thực tế quan sát dịch rửa tạp thu được có
màu nhạt dần qua các BV và đặc biệt đến BV thứ 6, 7:
Hình 3.6 Hình ảnh sắc ký của dịch rửa giải với nước

33
Cũng tương tự như nước, quan sát sắc ký đồ hình 3.7, ở những BV đầu
tiên, ethanol 20% có khả năng rửa thêm một số tạp hiện lên trên sắc ký đồ.
Vết tạp xuất hiện cho đến BV thứ 5, 6. Vì vậy, dừng quá trình rửa ở BV thứ 6
để không lãng phí thêm ethanol mà còn giảm lượng saponin bị mất.
Hình 3.7 Hình ảnh sắc ký đồ của dịch rửa giải với ethanol 20%
Khối lượng cắn loại được sau quá trình rửa tạp được mô tả ở bảng 3.4
sau đây:
Bảng 3.4 Khối lượng cắn loại được sau rửa tạp với nước và ethanol 20%
Dung môi Thể tích Khối lượng cắn (g)
Nước 7BV 0,88
Ethanol 20o 6BV 1,07
Kết luận: quá trình rửa tạp đầu tiên với 7 BV nước và sau đó rửa tiếp
với 6 BV ethanol 20% với vận tốc 4 BV/h.
3.3.2.2. Quá trình giải hấp phụ bằng ethanol 50%, 70%, 96%
Từ kết quả thí nghiệm 3.3.1 cho thấy ethanol 50%, 70%, 96% có sức
rửa giải tốt nhất vì vậy đề tài tiến hành khảo sát thể tích rửa giải trên các nồng
độ ethanol này.
Tiến hành thí nghiệm như mục 2.3.6.2 với vận tốc rửa giải là 1.5 BV/h.
1 2 3 4 5 6

34
6 7 1 2 3 1
Nhận xét:
Dựa vào hình ảnh sắc ký hình 3.8, Sau 6-7 BV ethanol 50% vết
saponin mờ hẳn (hình 3.8 (a)), rửa lại với ethanol 70% vết saponin của dịch
ra đậm lên (hình 3.8 (b)). Tuy nhiên khi thử tiếp với ethanol 96% hình ảnh
sắc ký của vết saponin cho thấy không còn rửa ra saponin được nữa.
(a) (b) (c)
Hình 3.8 (a) Hình ảnh sắc ký của dịch rửa giải ethanol 50% theo thứ tự ở
BV thứ 6 và 7 từ trái qua phải, (b) Hình ảnh sắc ký của dịch rửa giải ethanol
70% theo thứ tự ở BV thứ 1, 2 và 3 từ trái qua phải, (c) Hình ảnh sắc ký của
dịch rửa giải ethanol 96%
Dựa vào hình 3.9 biểu diễn nồng độ saponin được rửa giải sau mỗi BV,
rửa giải hiệu quả nhất ở khoảng 3 BV đầu tiên, sau đó giảm dần với mỗi BV
tiếp theo và đến BV thứ 5, 6 nồng độ saponin được rửa giải không đổi và
giảm cho đến BV thứ 9, điều này phù hợp với sắc ký đồ chấm được vết
saponin nhạt hẳn ở BV thứ 6, 7.
Vì vậy chúng tôi chọn điều kiện rửa giải với 6 BV ethanol 50% và sau
đó là 3BV ethanol 70% với vận tốc 1,5 BV/h.

35
Kết luận:
Quá trình rửa giải gồm 2 quá trình: rửa tạp (7 BV nước và 6 BV
ethanol 20%) với vận tốc 4 BV/h và giải hấp phụ (6 BV ethanol 50% và 3 BV
ethanol 70%) với vận tốc 1,5 BV/h.
Hình 3.9 Đường cong giải hấp phụ bằng ethanol 50%
3.4 Đề xuất quy trình làm giàu saponin ứng dụng hạt nhựa
macroporous D101
Tiến hành thí nghiệm như mục 2.3.7 với các thông số lựa chọn:
- Dịch được hấp phụ qua cột 3 L với vận tốc 2 BV/h.
- Sau rửa tạp thứ tự với 7 BV nước (1680 ml) và 6 BV ethanol 20%
(1440 ml) với tốc độ là 4 BV/h tiến hành giải hấp phụ: thứ tự với 6 BV
(1440 ml) ethanol 50% và 3 BV (720 ml) ethanol 70% với tốc 1,5
BV/h. Dịch giải hấp phụ được cô đặc và sấy đến thể chất cao khô.
9.00
8.00
7.00
6.00
5.00
4.00
3.00
2.00
1.00
0.00
8.02
3.76
1.76
1.29 0.80
1 2 3 4 5 6 7 8 9
0.37
10 BV
mg/g

36
 Kết quả thu được ở bảng 3.5.
Bảng 3.5 Kết quả phân lập saponin Ngưu tất trên quy mô 170 g (n=3)
Mẻ
Khối
lượng cao
(g)
Hàm lượng
saponin trong
cao (%)
Hiệu suất
giải hấp
phụ (%)
Hiệu suất
quá trình
(%)
1 9,27 39,83 85,87 77,73
2 9,50 39,94 88,24 79,83
3 9,54 40,45 89,77 80,88
TB± SD 9,44± 0,15 40,07± 0,33 87,96± 1,96 79,48± 1,60
RSD (%) 1,59 0,83 2,23 2,01
Nhận xét:
Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy quy trình khá ổn định. Sau quá trình tinh
chế saponin ở mẻ 170 g dược liệu Ngưu tất, thu được khoảng 9,44 g cao với
hàm lượng saponin 40,07% hiệu suất rửa giải khoảng 87,96%. Sau chiết xuất
và phân lập hiệu suất cả quá trình tính theo saponin là 79,48%.
(a) (b)
Hình 3.10 Hình (a), (b) thứ tự là hình ảnh cao trước và sau tinh chế

37
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
4.1. Bàn luận về phương pháp nghiên cứu
4.1.1. Phương pháp chiết và xử lý dịch chiết
Về phương pháp chiết xuất saponin từ rễ Ngưu tất. Các nghiên cứu về
thành phần hóa học thường sử dụng dung môi MeOH để chiết xuất tuy nhiên
dung môi này độc hại và ít được ứng dụng ở quy mô công nghiệp. Đã có một
vài nghiên cứu quy trình chiết xuất từ rễ ngưu tất và dung môi thường sử
dụng dung môi ethanol + nước. Khảo sát trước đây của xí nghiệp dược phẩm
TW-5 đưa ra kết luận: dung môi chiết là ethanol nồng độ 85%, nhiệt độ 90o
,
tỷ lệ dược liệu: dung môi là 1:8 và chiết 2 lần trong vòng 4 giờ. Với mục tiêu
lấy hết saponin trong dược liệu nhóm đã chọn các thông số như trên nhưng
chiết 3 lần với dung môi lựa chọn là ethanol 50%. Saponin toàn phần chiếm
khoảng 3,5% trong dược liệu khô (định lượng theo phương pháp đo quang) .
4.1.2. Bàn luận về phương pháp tinh chế saponin trong rễ Ngưu tất
Hiện nay có nhiều cách để phân lập saponin trong Ngưu tất như sử dụng
sắc ký cột silica gel, cột ODS hay lắc phân đoạn với dung môi hữu cơ, nhưng
gặp phải một số nhược điểm như tính kinh tế không cao, khó áp dụng lên quy
mô lớn hay vấn đề liên quan đến sức khoẻ và môi trường. Hướng đi mới sử
dụng hạt nhựa macroporous D101 phân lập saponin từ rễ Ngưu tất có nhiều
ưu điểm như: thực hiện đơn giản, chi phí thấp, hạt nhựa có thể tái sử dụng
nhiều lần, dung môi thân thiện với môi trường và dễ áp dụng quy mô lớn.
Thực tế, hạt nhựa macroporous có nhiều loại khác nhau, nhưng D101 đã được
chứng minh là rất hiệu quả trong phân lập saponin nên nhóm chọn loại hạt
nhựa này để nghiên cứu.
Bàn luận về các giai đoạn tiến hành:
Giai đoạn xử lý hạt nhựa: mục đích để hạt trương nở hoàn toàn và loại

38
các tạp trong quá trình sản xuất còn bám trên hạt nhựa. Trong các nghiên cứu
trước đây thường xử lý hạt nhựa theo 1 trong 2 cách sau: ngâm ethanol tuyệt
đối trong 24 giờ hoặc sau khi ngâm ethanol tiếp tục ngâm thứ tự với dung
dịch HCl và NaOH trong 4 giờ. Tuy nhiên vẫn chưa có nghiên cứu nào chứng
minh ảnh hưởng của các nhân tố này đến dung lượng hấp phụ của hạt nhựa.
Vì vậy nghiên cứu đánh giá các tác nhân: ethanol, axit, bazơ để khảo sát ảnh
hưởng của chúng lên khả năng hấp phụ của hạt nhựa.
Giai đoạn hấp phụ:
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hấp phụ saponin của hạt nhựa
macroporous D101 như nhiệt độ, pH của dịch nạp cột, tốc độ dịch hấp phụ, tỷ
lệ chiều cao: đường kính cột. Tốc độ dịch hấp phụ càng nhỏ thì thời gian tiếp
xúc giữa chất tan và hạt nhựa càng tăng lên nhưng thời gian hấp phụ cũng
tăng lên, quá trình hấp phụ kéo dài. Tìm hiểu các tài liệu khác cũng như thông
số được cung cấp bởi nhà sản xuất, tốc độ hấp phụ khoảng từ 1-4 BV/giờ. Đề
tài chọn tốc độ hấp phụ 2 BV/giờ mặc dù quá trình này sẽ kéo dài hơn nhưng
đảm bảo hạt hấp phụ được tối đa. Tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột càng lớn thì
quãng đường di chuyển của chất tan càng dài, do đó thời gian tiếp xúc giữa
chất tan và hạt nhựa tăng lên, dung lượng hấp phụ tăng lên. Nghiên cứu lựa
chọn các tỷ lệ này là 4, 6, 10 để khảo sát tìm ra tỷ lệ thích hợp cho quá trình
hấp phụ và rửa giải.
Khi xác định dung lượng hấp phụ của hạt nhựa trên điều kiện động
chúng tôi dùng phương pháp SKLM để xác định thời điểm dừng hấp phụ vì
chi phí rẻ, hơn nữa mục đích chỉ là nhận biết lúc mà dịch sau hấp phụ có
saponin hay không để xác định thời điểm dừng hấp phụ. Để đơn giản quy
trình, khi xuất hiện vết mờ saponin trên sắc ký đồ tức là dịch ra chứa saponin
và xem như đó chỉ là một phần nhỏ.

39
Giai đoạn rửa giải:
Loại tạp giúp rửa đi một số tạp chất và cho hàm lượng saponin trong
sản phẩm cao sau cùng tăng lên. Trước đây khảo sát chỉ rửa tạp với nước kết
quả hàm lượng saponin trong cao thấp hơn (37,21%), vì vậy để tăng hàm
lượng saponin trong sản phẩm ethanol 20% được sử dụng và lượng saponin
mất theo dịch rửa khoảng 3%.
Tốc độ rửa giải càng lớn càng tốn dung môi rửa đồng thời dịch ra
loãng. Tốc độ được chọn là 1,5 BV/h (chậm hơn tốc độ hấp phụ) để giảm
thiểu lượng dung môi sử dụng, tăng tỷ lệ chuyển khối của saponin và đồng
thời dịch ra đặc hơn, tốn ít năng lượng để cô thành sản phẩm cao.
4.2. Bàn luận về kết quả
Kết quả nghiên cứu cho thấy xử lý hạt nhựa ban đầu thêm với NaOH
4% làm tăng dung lượng hấp phụ, có thể giải thích do ngoài được rửa hết tạp
kém tan bằng ethanol thì còn loại thêm được tạp có bản chất axit bên trong
hạt. Cũng như vậy, HCl có thể rửa được những chất bazơ nhưng cũng chỉ làm
tăng khả năng hấp phụ ít, mà nếu sử dụng thêm axit để xử lý dẫn đến tốn dung
môi hoá chất nên chúng tôi quyết định chỉ ngâm thêm với NaOH 4%. Sự khác
biệt này có ý nghĩa rất lớn khi áp dụng quy trình này ở phạm vi rộng. Khi
lượng hạt nhựa là cố định, lượng dịch được hấp phụ nhiều hơn và dẫn đến thu
được nhiều sản phẩm cao hơn.
Kết quả khảo sát tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột thích hợp cho quá
trình hấp phụ và rửa giải cho thấy, tỷ lệ này không ảnh hưởng đến dung lượng
hấp phụ của hạt nhựa cũng như hiệu suất giải hấp phụ. Nguyên nhân có thể là
do vận tốc hấp phụ chậm dẫn đến hạt nhựa tiếp xúc với chất tan đủ lâu để hấp
phụ tối đa nên chiều dài cột không ảnh hưởng đến thông số này. Tuy nhiên
hiệu suất giải hấp phụ lại tăng lên khi tỷ lệ chiều cao/ đường kính tăng và bắt
đầu giảm ở khi tăng tỷ lệ này đến mức độ nào đó. Có thể giải thích như sau:

40
khi tỷ lệ này nhỏ, quãng đường đi của dung môi ngắn làm giảm tỷ lệ chuyển
khối của chất tan, còn khi tỷ lệ này lớn, quãng đường đi của dung môi dài và
cũng là điều kiện làm saponin hấp phụ trở lại lên hạt nhựa nên tỷ lệ rửa giải bị
giảm đi. Vì vậy, tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột bằng 6 là thường hợp: dung
môi tiếp xúc với hạt nhựa lâu hơn và tỷ lệ hấp phụ trở lại lên hạt nhựa là ít
nhất.
Loại tạp với khoảng 7 BV nước và 6 BV ethanol 20% và quan sát được
màu sắc của dịch rửa có màu vàng nâu (phụ lục 4.1) và trên sắc ký đồ của
dịch ethanol 20% có thêm các vết tạp màu xanh. Thể tích rửa được quyết định
bởi vết tạp trên sắc ký đồ và màu sắc dịch ra.
Sau rửa giải hết bằng ethanol 50% cột được rửa tiếp với 3BV ethanol
70% để kết luận xem đã rửa giải được tối đa chưa qua quan sát trên sắc ký đồ.
Kết quả là vẫn rửa giải thêm được saponin và vết sắc ký đậm. Vì vậy chúng
tôi chọn rửa giải với cả hai nồng độ trên. Với ethanol 96% có khả năng rửa
giải tốt hơn nhưng một phần do sử dụng ethanol 96% sẽ kéo theo một số tạp
kém tan chưa được loại bỏ trong quả trình rửa nước và ethanol nồng độ thấp
(phụ lục 4.2), hơn nữa ethanol 96% dễ bay hơi gây hao hụt và cháy nổ trong
sản xuất.
Kết quả cuối cùng thu được cao có hàm lượng saponin toàn phần là
40,07% cao gấp khoảng 8 lần so với cao thô ban đầu (5%) với hiệu suất toàn
rửa giải đạt 87,96% và hiệu suất theo saponin toàn quá trình là 79,48%. Điều
quan trọng là kết quả cũng khá ổn định khi lặp lại quy trình 3 lần. So với hàm
lượng saponin trong cao Bidentin- một sản phẩm hiện cũng đang được ưa
chuộng trên thị trường của Viện Dược liệu nghiên cứu trước đó là 25% (định
lượng theo phương pháp đo quang) thì tinh chế bằng hạt nhựa macroporous
D101 làm tăng hàm lượng saponin trong cao lên 40,07%, xấp xỉ 2 lần.

41
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
KẾT LUẬN
Từ kết quả thu được, một số kết luận được rút ra như sau:
1. Hạt nhựa ban đầu được xử lý với ethanol 96% trong 24 giờ, sau khi loại hết
ethanol tiếp tục ngâm hạt trong NaOH 4% trong 4 giờ rồi rửa đến pH trung
tính để đạt được hiệu quả hấp phụ cao nhất.
2. Dịch được đưa qua cột để hấp phụ với vận tốc 2 BV/h với dung lượng hấp
phụ của hạt nhựa là khoảng 25,77 mg saponin/ g hạt nhựa trên quy mô động
với tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột là 6, sau đó thứ tự được loại tạp bằng 7
BV nước và 6 BV ethanol 20%. Sau loại tạp, rửa cột thứ tự 6 BV ethanol 50%
và 3 BV ethanol 70% với vận tốc 1,5BV/h.
3. Áp dụng các thông số trên thu được sản phẩm cao Ngưu tất hàm lượn
saponin 40,07%; hiệu suất toàn bộ quá trình là 79,48% cỡ mẻ 170 g dược liệu.
ĐỀ XUẤT
Các kết quả trên đây là bước đầu tìm hiểu ứng dụng hạt nhựa
macroporous D101 trong làm giàu sponin từ rễ Ngưu tất và là cơ sở để tiến
hành các nghiên cứu sau này. Em xin đề xuất:
- Tiếp tục khảo sát thêm hoạt tính sinh học của cao sau tinh chế.
- Tiếp tục nghiên cứu để tìm phương pháp tái sử dụng hạt nhựa nhằm
tăng số lần sử dụng.
- Khai triển quy trình tinh chế lên quy mô lớn hơn.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Bộ môn Dược học cổ truyền trường Đại học Dược Hà Nội (2013),
Dược học cổ truyền, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, p. 232.
2. Đỗ Tất lợi (2004), Những câu thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất
bản Y học, pp. 48- 49.
3. Hội đồng Dược điển Việt Nam (2009), Dược điển Việt nam IV, Nhà
xuất bản Y học, Hà Nội, p. 748.
4. Ngô Vân Thu, Trần Hùng (2011), Sách dược liệu tập 1, Nhà xuất bản
Y học, Hà Nội, pp. 233-234.
5. Nguyễn Hải Phong (2013), Kỹ thuật chiết pha rắn và ứng dụng, Đại
học Quốc gia Hà Nội.
6. Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam tập 1, Nhà xuất bản trẻ
HCM, p. 730.
7. Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam tập
2, Nhà xuất bản Khoa học kĩ thuật, Hà Nội, pp. 430-435.
Tài liệu tiếng Anh
8. Chen, Qinghua Liu, Zhuying He, Jian-hua (2009), "Achyranthes
bidentata polysaccharide enhances immune response in weaned
piglets", Immunopharmacology and immunotoxicology. 31 (2), pp. 253-
260.
9. Chen, XM Xu, YJ Tian, GY (2005), "Physical-chemical properties and
structure elucidation of abPS isolated from the root of Achyranthes
bidentata", Acta pharmaceutica Sinica. 40 (1), pp. 32-35.

10. Devi, P Uma, Murugan (2007), "Antibacterial, in vitrolipid
peroxidation and phytochemical observation on Achyranthes bidentata
Blume", Pakistan Journal of Nutrition. 6 (5), pp. 447-451.
11. Ding, Fei Cheng, Qiong Gu, Xiaosong (2008), "The repair effects of
Achyranthes bidentata extract on the crushed common peroneal nerve
of rabbits", Fitoterapia. 79 (3), pp. 161-167.
12. Guo, Jian-jun Lei, Xiao Ren, Dao-yuan Yang, Hong-yan Yang, Xing-
bin (2015), "Study on purification and antioxidant activity of total
saponins of Gynostemma tea", Science and Technology of Food
Industry. 5, p. 024.
13. He, Cui-Cui Hui, Rong-Rong Tezuka, Yasuhiro Kadota (2010),
"Osteoprotective effect of extract from Achyranthes bidentata in
ovariectomized rats", Journal of ethnopharmacology. 127 (2), pp. 229-
234.
14. Hong, Xiu-yun Wu, Xiao-ying (2012), "Purification and HPLC-ELSD
determination of Gypenosides from Gynostemma pentaphyllum
(Thunb.) Makino Leaves [J]", Food Science. 14, p. 056.
15. LA. Karimi, R. Srinivasan (2012), 11th International Symposium on
Process Systems Engineering, Elsevier, pp. 725- 726.
16. Li, Jing Chase, Howard A (2010), "Development of adsorptive (non-
ionic) macroporous resins and their uses in the purification of
pharmacologically-active natural products from plant sources", Natural
product reports. 27 (10), pp. 1493-1510.
17. Li, Hu (1995), "Determination of oleanolic axit in the root of
Achyranthes bidentata Bl. from different places of production by TLC-
scanning", China journal of Chinese materia medica. 20 (8), pp. 459-
460, 511.

18. Li (1997), "The immunomodulatory effect of Achyranthes bidentata
polysaccharides", Acta pharmaceutica Sinica. 32 (12), pp. 881-887.
19. Lin, Jinyang Zhang, Zhuoying Shan (2010), "Effect of Achyranthes
bidentata polysaccharides on the expression of the BCL-2 and BAX in
hepatic tissues of exhaustive exercise in rats", African Journal of
Traditional, Complementary and Alternative Medicines. 7 (4).
20. Liu, Yanze Wang, Zhimin Zhang, Junzeng (2015), Dietary Chinese
herbs: Chemistry, pharmacology and clinical evidence, Springer
Science & Business Media. p. 45.
21. Liu, Zhen Wang, Jieyin Gao, Wenyuan Man, Shuli Wang, Ying Liu,
Changxiao (2013), "Preparative separation and purification of steroidal
saponins in Paris polyphylla var. yunnanensis by macroporous
adsorption resins", Pharmaceutical biology. 51 (7), pp. 899-905.
22. Lu, Mao, Zhang, Xu (1997), "The research on analgestic and anti-
inflammatory action of different processed products of Achyranthes
bidentata", Journal of Chinese medicinal materials. 20 (10), pp. 507-
509.
23. Bo Mattiasson, Ashok Kumar, Igor Yu. Galaev (2010), Macroporous
polymers Production Properties and Biotechnological/Biomedical
applications, CRC press, USA, p. 7.
24. Meng, Da-Li, Li, Xian Wang, Jin-Hui Li, Wei (2005), "Note: A new
phytosterone from Achyranthes bidentata Bl", Journal of Asian natural
products research. 7 (2), pp. 181-184.
25. Oh, Sang Deog Kim, Mihyun Min, Byung-Il Choi, Gi Soon Kim, Sun-
Kwang Bae (2014), "Effect of Achyranthes bidentata Blume on 3T3-L1
adipogenesis and rats fed with a high-fat diet", Evidence-Based
Complementary and Alternative Medicine. 2014.

26. Phillipson, J David (1993), Chinese drugs of plant origin—chemistry,
pharmacology and use in traditional and modern medicine, Pergamon.
27. Rensheng Xu, Yang Ye, Weimin Zhao (2011), Introduction to Natural
Products Chemistry, Science press, p. 18.
28. Su, Zhixing Chang, Xijun Xu, Keli Luo, Xingyin Zhan, Guangyao
(1992), "Efficiency and mechanism of macroporous poly
(vinylthiopropionamide) chelating resin for adsorbing and separating
noble metal ions and determination by atomic spectrometry", Analytica
chimica acta. 268 (2), pp. 323-329.
29. Armen Takhtajan (2009), Flowering Plants, Springer, Russia, pp. 142.
30. Vetrichelvan, Jegadeesan, (2002), "Effect of alcoholic extract of
Achyranthes bidentata blume on acute and sub acute inflammation",
Indian journal of pharmacology. 34 (2), pp. 115-118.
31. Wagner, Hildebert Bauer, Rudolf Melchart, Dieter Xiao, Pei-Gen
Staudinger, Anton (2011), Chromatographic fingerprint analysis of
herbal medicines, Springer.
32. Wang, Qiu-Hong Yang, Liu Jiang, Hai Wang, Zhi-Bin Yang, Bing-You
Kuang, Hai-Xue (2011), "Three new phytoecdysteroids containing a
furan ring from the roots of Achyranthes bidentata Bl", Molecules. 16
(7), pp. 5989-5997.
33. Wang Xiao, Fang Lei, Zhao Hengqiang, Lin Xiaojing (2013), Natural
product extraction: principles and applications, The Royal Society of
Chemistry, pp. 317- 319.
34. Wang, Zp Gao, Ying Li, Wm Liu, Jie (2010), "Study on purification of
total flavonoids and saponins of Astragalus with macroporous resin",
Journal of Chinese medicinal materials. 33 (7), pp. 1163-1166.

35. Xu, Xianxiang Xia, Lunzhu "Study on separation and purification of
total saponins from Radix clematidis with macroporous absorptive resin
[J]", Traditional Chinese Drug Research & Clinical Pharmacology. 1,
p. 020.
36. Xue, Shengxia Chen, Xiaoming Lu, Jianxin Jin, Liqin (2009),
"Protective effect of sulfated Achyranthes bidentata polysaccharides on
streptozotocin-induced oxidative stress in rats", Carbohydrate
Polymers. 75 (3), pp. 415-419.
37. Yang, Liu Jiang, Hai Yan, Mei-Ling Xing, Xu-Dong Zhang (2016), "A
new phytoecdysteroid from the roots of Achyranthes bidentata Bl",
Natural Product Research, pp. 1-7.
38. Yu, Zhang (1995), "Effect of Achyranthes bidentata polysaccharides on
antitumor activity and immune function of S180-bearing mice",
Chinese journal of oncology. 17 (4), pp. 275-278.
39. Zhang, Rong Hu, Shi-Jie Li, Chen Zhang, Feng Gan, Hong-Quan Mei,
Qi-Bing (2012), "Achyranthes bidentata root extract prevent OVX-
induced osteoporosis in rats", Journal of ethnopharmacology. 139 (1),
pp. 12-18.
40. Zhao, Wan-ting Meng, Da-li Li, Xian Li, Wei (2007), "Chemical
constituents of Achyranthes bidentata Bl.[J]", Journal of Shenyang
Pharmaceutical University. 4, p. 004.
41. Zheng, Jie-zhen Zhou, Da-xing Gu, Jing Li, Fen-fen Chen (2008),
"Effect of Active Components of Achyranthes Bidentata Blume on
Contraction of Vascular Smooth Muscle [J]", Journal of Anhui
Traditional Chinese Medical College. 4, p. 021.
42. Zhou, Songlin Chen, Xia Gu, Xiaosong Ding, Fei (2009), "Achyranthes
bidentata Blume extract protects cultured hippocampal neurons against

glutamate-induced neurotoxicity", Journal of ethnopharmacology. 122
(3), pp. 547-554.
43. Żwir-Ferenc, Biziuk (2006), "Solid phase extraction technique–trends,
opportunities and applications", Polish Journal of Environmental
Studies. 15 (5), pp. 677-690.
44. Teng Chen (2012), Preparation method of Achyranthes bidentata
saponin, Google Patents, CN 101837034 A.

C:M=20:1
CT C T
PHỤ LỤC
Phụ lục 4.1 Hình ảnh sắc ký đồ của hỗn hợp mẫu chuẩn và mẫu thử (CT),
mẫu chuẩn (C) và mẫu thử (T) với hệ dung môi Cloroform: Methanol (20:1)
(a) (b)
Phụ lục 4.2 Hình ảnh màu sắc dịch được rửa với nước và ethanol 20% thứ tự
(a), (b)

Phụ lục 4.3 Hình ảnh sắc ký của dịch rửa giải với ethanol 96%
Phụ lục 4.4 Hình ảnh sắc ký của mẫu chuẩn (C), dịch lên cột ban đầu (Đ) và
dịch rửa giải (S)

Ứng dụng nhựa Macroporous trong làm giàu saponin từ rễ ngưu tất ( Achyranthes Bidentata Blume).docx

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Ứng dụng nhựa Macroporous trong làm giàu saponin từ rễ ngưu tất ( Achyranthes Bidentata Blume).docx

Similar to Ứng dụng nhựa Macroporous trong làm giàu saponin từ rễ ngưu tất ( Achyranthes Bidentata Blume).docx (20)

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149

More from DV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Ứng dụng nhựa Macroporous trong làm giàu saponin từ rễ ngưu tất ( Achyranthes Bidentata Blume).docx