Tailieu.vncty.com do an-nhan_giong_in_vi_tro_cay_co_ngot_stevia_4562

743 views

Published on

http://tailieu.vncty.com

Published in: Data & Analytics
0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total views
743
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
6
Actions
Shares
0
Downloads
18
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Tailieu.vncty.com do an-nhan_giong_in_vi_tro_cay_co_ngot_stevia_4562

  1. 1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM -----oOo----- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CỎ NGỌT (STEVIA REBAUDIANA) NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD:Ths. NGUYỄN THÀNH SUM SVTH: MSSV PHẠM TRỌNG 10261191 MAI ĐỨC DŨNG 10251691 NGUYỄN ĐỨC THIỆN 10149321 TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 6/ 2013
  2. 2. TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM -----oOo----- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CỎ NGỌT (STEVIA REBAUDIANA) NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD:Ths. NGUYỄN THÀNH SUM SVTH: MSSV PHẠM TRỌNG 10261191 MAI ĐỨC DŨNG 10251691 NGUYỄN ĐỨC THIỆN 10 149321 TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 6/ 2013
  3. 3. Trang i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập tại trường ĐH công nghệp Tp.HCM , chúng em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của Quý Thầy, Cô, Gia đình và bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, chúng em xin gửi đến Quý Thầy Cô ở Viện Công Nghệ Sinh Học & Thực Phẩm– Trường Đại Học Công Nghệp Thành phố Hồ Chí Minh lời cảm ơn chân thành . Với tri thức và tâm huyết của mình, các thầy, cô đã truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập tại trường. Chúng em xin chân thành cảm ơn Ths.Nguyễn Thành Sum đã tận tâm hướng dẫn chúng em qua từng buổi học trên lớp cũng như những buổi nói chuyện, thảo luận về lĩnh vực trong nghiên cứu khoa học. Nếu không có những lời hướng dẫn, dạy bảo của thầy thì đồ án của chúng em rất khó có thể hoàn thành. Bài báo cáo này không tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của Quý Thầy Cô để bài báo cáo được hoàn thiện hơn.
  4. 4. Trang ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN........................................................................................................... i MỤC LỤC ..............................................................................................................ii DANH MỤC HÌNH ẢNH......................................................................................v DANH MỤC BẢNG..............................................................................................vi CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................... viii PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ .....................................................................................1 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................2 2.1. Giới thiệu cây Cỏ ngọt...................................................................................2 2.1.1. Vị trí phân loại.....................................................................................2 2.1.2. Nguồn gốc cây cỏ ngọt........................................................................2 2.1.3. Phân bố................................................................................................3 2.1.4. Đặc điểm hình thái ..............................................................................3 2.1.5. Đặc điểm sinh trưởng:.........................................................................4 2.1.6. Điều kiện sinh trưởng..........................................................................5 2.2. Nhân giống cây trồng in vitro........................................................................6 2.2.1. Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật ..............................................6 2.2.2. Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật.......................6 2.2.3. Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật..................8 2.2.4. Các giai đoạn nhân giống in vitro .......................................................8 2.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro .................................10 2.2.6. Điều kiện nuôi cấy.............................................................................12 2.2.7. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy.................................................12 2.2.8. Chất điều hoà sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV)................................13
  5. 5. Trang iii 2.2.9. Những thành tựu về nuôi cấy cây cỏ ngọt trên thế giới và Việt Nam ...........................................................................................................15 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................16 3.1. Vật liệu ........................................................................................................16 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu........................................................................16 3.1.2. Trang thiết bị và dụng cụ...................................................................16 3.1.3. Môi trường nuôi cấy..........................................................................18 3.1.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro................................................................18 3.2. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................19 3.2.1. Phương pháp khử trùng.....................................................................19 3.2.2. Phương pháp thí nghiệm ...................................................................19 3.2.3. Phân tích thống kê .............................................................................25 3.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu...............................................................25 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................26 4.1. Thí nghiệm 1: khảo sát nồng độ và thời gian khử trùng ảnh hưởng đến tỉ lệ sống của mẫu cấy cây Cỏ Ngọt in vitro....................................................................26 4.2. Thí nghiệm 2: khảo sát tìm môi trường cơ bản phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển cây Cỏ ngọt in vitro .............................................................................27 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các nhóm chất điều tiết sinh trưởng lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro. ..............................................................29 4.3.1. Thí nghiệm 3a: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung Ki kết hợp với 0.2 mg/l IBA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro........................30 4.3.2. Thí nghiệm 3b: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường có bổ sung Ki kết hợp với 0.2 mg/l NAA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro................32 4.3.1. Thí nghiệm 3c: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường có bổ sung BA kết hợp với 0.2 mg/l IBA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro..................33
  6. 6. Trang iv 4.3.1. Thí nghiệm 3c: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường có bổ sung BA kết hợp với 0.2 mg/l NAA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro................34 4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của IBA , NAA và IAA đến sự hình thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro..............................................................................35 4.4.1. Thí nghiệm 4a: Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến sự hình thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro. .......................................................................................36 4.4.2. Thí nghiệm 4b: Khảo sát ảnh hưởng của NAA ở các nồng độ khác nhau đến sự hình thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro..............................................37 4.4.3. Thí nghiệm 4c: Khảo sát ảnh hưởng của IAA đến sự hình thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro. .......................................................................................39 PHẦN 5: KẾT LUẬN .......................................................................................42 KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
  7. 7. Trang v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Cây Cỏ Ngọt (Stevia rebaudiana) ............................................................2 Hình 2.1 Cây Cỏ Ngọt.............................................................................................2 Hình 2.2 Các bộ phận của cây cỏ ngọt....................................................................4 Hình 4.1 Các dạng mẫu trong thí nghiệm khử trùng mẫu: a. mẫu sống và mọc chồi;.......................................................................................................................27 Hình 4.2 Kết quả nghiệm thức tìm môi trường cơ bản cho cỏ ngọt in vitro.........29 Hình 4.3 Chiều cao và số chồi ở các nghiệm thức nhân nhanh chồi trong môi trường có sự kết hợp giữa Ki và 0.2 mg/l IBA ....................................................31 Hình 4.4 Nghiệm thức nhân nhanh chồi kết hợp giữa Ki và 0.2 mg/l NAA ........33 Hình 4.5 Chiều cao và hình thái chồi trong các nghiệm thức kết hợp giữa BA và 0.2 mg/l IBA..........................................................................................................34 Hình 4.6 Hình thái cây trong các nghiệm thức nhân nhanh chồi có kết hợp giữa BA và 0.2 mg/l NAA ............................................................................................35 Hình 4.7 Rễ hình thành ở các nghiệm thức bổ sung IBA .....................................37 Hình 4.8 Rễ hình thành ở các nghiệm thức bổ sung NAA. ..................................39 Hình 4.9 Rễ hình thành ở các nghiệm thức bố sung IAA.....................................41
  8. 8. Trang vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số chất khử trùng và khoảng thời gian khử trùng thường dùng trong nhân giống in vitro ..................................................................................................9 Bảng 3.1 Các nghiệm thức trong thí nghiệm tạo mẫu Cỏ Ngọt in vitro sạch bệnh ...............................................................................................................................20 Bảng 3.2 Các nghiệm thức thí nghiệm tìm môi trường cơ bản cho cây Cỏ Ngọt in vitro. ......................................................................................................................21 Bảng 3.3 Các nghiệm trong thí nghiệm nhân nhanh chồi thức nhân nhanh chồi .22 Bảng 3.4 các nghiệm thức trong thí nghệm tìm môi trường ra rễ cho cây Cỏ Ngọt in vitro ...................................................................................................................24 Bảng 4.1 Kết quả nghiệm thức khảo sát nồng độ và thời gian khử trùng mẫu Cỏ ngọt bằng chất khử trùng TCCA...........................................................................26 Bảng 4.2 Kết quả của thí nghiệm tìm môi trường cơ bản tối ưu cho cây Cỏ ngọt in vitro .......................................................................................................................28 Bảng 4.3 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi có sự bổ sung kết hợp giữa Ki và 0.2 mg/l IBA..........................................................................................................30 Bảng 4.4 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi có bổ sung kết hợp giữa Ki và 0.2 mg/l NAA..............................................................................................................32 Bảng 4.5 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi kết hợp giữa BA và 0.2 mg/l IBA ...............................................................................................................................33 Bảng 4.6 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi kết hợp giữa BA và 0.2 mg/l NAA ...............................................................................................................................34 Bảng 4.7 Kết quả thí nghiệm khảo sát môi trường tạo rễ bổ sung IBA................36 Bảng 4.8 Kết quả thí nghiệm khảo sát môi trường tạo rễ bổ sung NAA..............37 Bảng 4.9 Kết quả thí nghiệm khảo sát môi trường tạo rễ bổ sung IAA ...............39
  9. 9. Trang vii
  10. 10. Trang viii CÁC TỪ VIẾT TẮT MS : Murashige và Skoog IBA : Indol butyric acid NAA : Napthlacetic acid IAA : Indol acetic acid Ki : Kinetin BA : Benzyl adenin ĐC : Nghiệm thức đối chứng
  11. 11. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 1 PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ Theo thông kê gần đây, tỉ lệ mắc bệnh đái tháo đường, thường được gọi là bệnh tiểu đường đang gia tăng nhanh tại Việt Nam. Năm 1990 tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường chỉ ở mức từ 0,9%( Huế) cho đến 2,52%( thành phố Hồ Chí Minh), nhưng chỉ sau 10 năm, năm 2001 tỷ lệ này ở các thành phố lớn đã là 4,1%, năm 2002 tăng lên 4,4%- với mức tính ở cả cộng đồng là 2,7% dân số; nếu tính ở nhóm người có yếu tố nguy cơ mắc bệnh cao thì tỷ lệ bệnh đã tăng trên 10%-. Theo thống kê năm 2008, tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường trong cả nước là trên 5% (khoảng 4,5 triệu người), tại các thành phố lớn và khu công nghiệp có tỷ lệ từ 7,0 đến 10% . Theo dự đoán, con số người mắc bệnh tiểu đường tại Việt Nam sẽ còn tăng hơn nữa khi kinh tế tiếp tục tăng trưởng và càng ngày càng nhiều người tại Việt Nam chuyển sang lối sống thành thị hiện đại. “Chúng ta sẽ chứng kiến một đại dịch thực sự tại Việt Nam trong những năm tới,” ông Jessper Hoiland được Tờ The New York Times trích thuật. “Ngày nay nhiều người chết vì ăn quá nhiều hơn là vì đói” ( Hoiland ). Các con số chính thức ở Việt Nam cho thấy bệnh tiểu đường túyp 2 gia tăng với chỉ 1% người trưởng thành trong dân số vào năm 1991, năm đầu tiên có khảo sát toàn quốc, lên 6% vào năm ngoái, theo trích dẫn của tờ The New York Times. Trước tình hình đó, dựa trên đường Steviozit có trong cây cỏ ngọt có công thức là C38H60O18 có độ ngọt gấp 300 lần so với đường saccharose, ít năng lượng, ngon, không lên men, không bị phân huỷ, bởi vậy rất có triển vọng dùng để thay đường trong chế độ ăn kiêng và hỗ trợ trong căn bệnh tiểu đường. Hiện nay ở nước ta, Cây cỏ ngọt là một trong những cây trong nhóm được chú ý phát triển. Cây cỏ ngọt đã đang được nhân giống bằng phương pháp truyền thống như giâm cành, gieo hạt nên khó đảm bảo được về chất lượng, tính đồng nhất của giống và có thể gây thoái hóa giống. Vì vậy, chúng tôi thực hiên đề tài: “NHÂN GIỐNG CÂY CỎ NGỌT IN VITRO (STEVIA REBAUDIANA)”. Nhằm mục đích góp một phần nhỏ vào việc tạo nguồn cây con đồng nhất cho sản xuất.
  12. 12. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu cây Cỏ ngọt Tên thường gọi: Cỏ ngọt, Cỏ mật, cỏ cúc... Tên khoa học: Stevia rebaudiana 2.1.1. Vị trí phân loại Giới: Plantae Bộ: Asterales Tông: Eupatorieae Họ: cúc Asteraceae (Compositae) Chi: Stevia Loài: Stevia rebaudiana Cỏ ngọt có khoảng 240 loài có nguồn gốc từ vùng Nam Mỹ, Trung Mỹ, Mexico và một vài tiểu bang miền namHoa Kỳ. Một số loài cỏ ngọt tiêu biểu sau :  Stevia eupatoria  Stevia ovata  Stevia plummerae  Stevia rebaudiana  Stevia salicifolia  Stevia serrata Tuy nhiên các nhà khoa học đã khảo sát trên 184 loài cỏ ngọt thì có khoảng 18 loài cho chất ngọt nhưng trong 18 loài này Stevia ribaudiana là loài cho chất ngọt nhiều nhất. 2.1.2. Nguồn gốc cây cỏ ngọt Có nguồn gốc từ thung lũng Rio Monday nằm ở đông bắc Panama Trung Mỹ. Vào thế kỉ 16, các thủy thủ người Tây Ban Nha đã từng đề cập đến loại thảo mộc này rồi nhưng đến năm 1888 các nhà thực vật học người Paraguay là Mises Santiago Bertoni mới phân loại và chính thức đặt tên gọi nó là Stevia rebaudianoa Hình 2.2 Cây Cỏ Ngọt Hình 2.1 Cây Cỏ Ngọt (Stevia rebaudiana)
  13. 13. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 3 Bertoni. Từ ngàn năm nay thổ dân Guarani người Paraguay đã dùng loại thảo mộc này để làm dịu ngọt các loại thức ăn, nước uống có tính đắng và cũng dùng để trị một số bệnh béo phì, tim mạch, cao huyết áp. 2.1.3. Phân bố Cỏ ngọt được trồng và sử dụng hầu hết các Châu lục, đặc biệt ở các nước Nhật Bản, Inđônêxia, Braxin, Paraguay, Mỹ, Thái Lan… Ngày nay cỏ ngọt được trồng khá phổ biến ở Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan, Hàn Quốc, Inđônêxia và một số nước khác. Cỏ ngọt được nhập vào nước ta từ năm 1988 trồng thử nghệm. Hiện nay cỏ ngọt đã thích ứng với nhiều vùng khí hậu khác nhau ở nước ta như, sinh trưởng tốt tại Sông Bé, Lâm Đồng, Đắc Lắc, Hà Nội, Hà Tây, Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Yên bái. 2.1.4. Đặc điểm hình thái a. Thân, cành Cỏ ngọt là dạng thân bụi thân tròn có nhiều lông, mọc thẳng. Chiều cao thu hoạch là 50-60 cm, tốt đạt 80-120 cm, thân chính có đường kính đạt 2.5 –8 mm. Cỏ ngọt phân cành nhiều, khi ra hoa mới phân cành cấp 2, 3. cành cấp 1 thường xuất hiện từ các đốt lá cách mặt đất 10 cm. Thông thường cây cỏ ngọt cho 25– 30 cành. Tổng số cành trên cây có thể đạt 140. Thân non màu xanh, già màu tím nâu, có hệ thân mầm phát triển mạnh. b. Lá Mọc đối thành từng cặp hình thập tự, mép lá có từ 12-16 răng cưa. Lá hình trứng ngược. Cây con gieo từ hạt có 2 lá mầm tròn tới cặp lá thứ tư mới có răng cưa ở mép lá. Lá trưởng thành dài khoảng 50 – 70mm, rộng 17-20mm có 3 gân song song, lá màu xanh lục,trên thân có70-90 lá. c. Hoa Hoa tự, nhóm họp dày đặc trên đế hoa, trong đó có 4-7 hoa đơn lưỡng tính. Mỗi hoa đơn hình ống có cấu trúc gồm một đế hoa với 5 đài màu xanh, 5 cánh tràng màu trắng khoảng 5 mm, các lá bắc tiêu giảm, nhị 4-5 dính trên tràng có
  14. 14. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 4 màu vàng sáng, cá chỉ nhị rời còn bao phấn dính mép với nhau. Bầu hạ 1 ô, 1 noãn, vòi nhụy mảnh chẻ đôi, các nhánh hình chỉ cao hơn bao phấn do đó mà khả năng tự thụ phấn thấp hoặc không có. d. Quả và hạt Quả và hạt của cây cỏ ngọt nhỏ, thuộc loại quả bế, khi chín màu nâu thẫm, 5 cạnh dài từ 2- 2,5mm. Hạt có 2 vỏ hạt, có phôi, nhưng nội nhũ trần do vậy tỉ lệ này mầm thấp. e. Rễ Rễ của cây gieo từ hạt ít phát triển hơn so với cành giâm. Hệ rễ chùm lan rộng ở đường kính 40 cm và có độ sâu từ 20– 30 cm, hệ rễ phát triển tốt trong điều kiện đất tơi xốp, đủ ẩm. Là cây lâu năm có thân rễ khỏe, mọc nông từ 0–30 cm tùy thuộc vào độ phì nhiêu, tơi xốp và mực nước ngầm của đất. Hình 2.3 Các bộ phận của cây cỏ ngọt. 2.1.5. Đặc điểm sinh trưởng: Cỏ ngọt là cây lâu năm, nó có thể sống từ 5-10 năm. Tuy nhiên, khi năng suất
  15. 15. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 5 của cỏ ngọt đã xuống thấp thì nên nhổ bỏ và trồng lại cây mới. Là cây bán nhiệt đới ưa ẩm, ưa sáng nhưng sợ úng và chết khi ngập nước. Sinh sản hữu tính (gieo hạt) hoặc vô tính (giâm cành). 2.1.6. Điều kiện sinh trưởng a. Nhiệt độ Cỏ ngọt là cây trồng nhiệt đới, sinh trưởng trong điều kiện mát mẻ. Có thể sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ từ 15-30℃, nhiệt độ thích hợp nhất là 20-22℃. Nhiệt độ tối thích hợp cho sự nảy mầm của hạt là 20℃. Nhiệt độ cao làm tăng hàm lượng steviozit. Từ 15-30℃ cây sinh trưởng khoẻ, cho năng suất thu hoạch cao. Nhiệt độ > 35℃. cây sinh trưởng kém. b. Ẩm độ Môi trường sống tự nhiên của cây cỏ ngọt thích hợp nhất là khí hậu cận nhiệt đới, ưa ẩm ướt, với lượng mưa trung bình hàng năm từ 1400-1600mm. Độ ẩm thích hợp nhất cho sinh trưởng, phát triển là 70-85%. Cỏ ngọt thường mọc tự nhiện trên các đầm lầy. c. Ánh sáng Cỏ ngọt là cây tương đối mẫn cảm với độ chiếu sáng. Cường độ ánh sáng mạnh làm tăng hàm lượng steviozit. d. Đất và dinh dưỡng khoáng Cỏ ngọt có thể sinh trưởng và phát triển trên nhiều loại đất khác nhau, nhưng thích hợp nhất là đất tơi xốp, thông thoáng, nhiều mùn. Trên những đất như thế cỏ ngọt cho thu hoạch cao, hàm lượng các chất ngọt tăng. Đất sét không thích hơp cho sự sinh trưởng của cỏ ngọt. Cỏ ngọt là cây thu hoạch lá do vậy nó yêu cầu chế độ dinh dưỡng cao, vì thế bón phân là biện pháp tích cực để tăng năng suất cỏ ngọt. Cỏ ngọt ưa đất trung tính, PH trong đất khoảng từ 6,5 đến 7 là tốt nhất.
  16. 16. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 6 2.2. Nhân giống cây trồng in vitro 2.2.1. Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học. Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên. Do đó, tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất. Hơn nữa, dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản cây trồng quý hiếm. Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô bắt đầu bằng một mảnh nhỏ thực vật vô trùng đặt vào môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này tạo ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống. Nuôi cấy mô tế bào thực vật cho đến nay được chứng minh là phương pháp nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan hiệu quả nhất. Năm 1939, nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan trên sự hình thành chồi (White, 1939) và rễ (Nobercourt, 1939). Và các kết quả nghiên cứu về sự tác động của các nhân tố bên trong và bên ngoài ảnh hưởng đến sự hình thành cơ quan (Thorpe, 1980, 1988). Qua kết quả nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan in vitro, cho thấy có 3 nhân tố ảnh hưởng trực tiếp: Môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy và mẫu được sử dụng trong nuôi cấy. Vận dụng quá trình hình thành cơ quan in vitro qua sự tác động tương hỗ của các nhân tố nói trên, có hàng ngàn loài thực vật đã được nghiên cứu quá trình hình thành chồi và rễ (Brown & Thorpe, 1986). 2.2.2. Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ nằm trong sinh lý thực vật. Ở nước ta ngành này mới được chú ý và phát triển khoảng 15 - 20 năm trở lại đây. Trong công tác giống cây trồng, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã
  17. 17. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 7 được phát triển những cơ sở lý thuyết về tế bào học và cơ sở sinh lý thực vật học như Nguyễn Văn Uyển (1993) và một số nhà nuôi cấy mô nước ngoài đã nhận định: Đó là tính toàn thế của mô và tế bào thực vật, cho phép tái sinh được cây hoàn chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi cấy tách rời. Đây là một điểm rất quan trọng, bởi vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện được những kỹ thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng. Khả năng loại trừ virus bằng nuôi cây đỉnh sinh trưởng, tạo các dòng vô tính sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính. Vấn đề này được các nhà khoa học khai thác để phục tráng các giống khoai tây, cây ăn trái (cam, quýt). Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi protocorm vào nhân giống vô tính với tốc độ cực nhanh cây trồng phục vụ sản xuất: cây lương thực (khoai tây), cây cảnh (phong lan), cây lâm nghiệp (bạch đàn, tếch,...). Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm, khả năng trao đổi Quốc tế các nguồn gen sạch bệnh dưới dạng cây nuôi trong ống nghiệm. Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn, từ đó tạo ra các dòng đồng hợp tử tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình lai tạo. Khả năng hấp thu DNA ngoại lai vào tế bào nhờ công nghệ gen. Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật như nuôi cấy vi sinh vật và qua đó khả năng ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao phục vụ công tác tạo giống. Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng dung hợp protoplast tái sinh cây hoàn chỉnh từ các protoplast lai. Khả năng sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất thụ khi lai xa. Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở nhiệt độ thấp không mất tính toàn thế của tế bào. Đồng thời nuôi cấy mô tế bào cũng tạo những cơ sở cho quá trình nghiên cứu di truyền thực vật, vai trò chất điều hoà sinh trưởng thực vật.
  18. 18. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 8 Ngày nay cùng với công nghệ gen, nuôi cấy mô tế bào là một phần quan trọng không thể thiếu, thúc đẩy việc ứng dụng công nghệ sinh học trong ngành kinh tế. Hai nhiệm vụ lớn của công nghệ sinh học thực vật ở nước ta từ nay tới năm 2010 là: Tạo ra các giống cây trồng mới bằng phương pháp công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là công nghệ gen và nhân nhanh các giống, dòng ưu việt bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (Nguyễn Văn Uyển, 1995). 2.2.3. Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật. Theo Bùi Bá Bổng (1995), nhân giống bằng nuôi cấy mô có những lợi điểm sau: Tạo ra cây con đồng nhất và giống như cây mẹ. Phần này giống như nhân giống vô tính. Đối với các cây trồng thuộc nhóm thụ phấn chéo như phần lớn các loài cây ăn trái, các cây con sinh ra từ hạt không hoàn toàn đồng nhất, và có thể không giống như cây mẹ, trong trường hợp này nhân giống vô tính có lợi điểm hơn nhân giống qua hạt. So với kiểu nhân giống vô tính thông thường (chiết cành, hom), nhân giống bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong thời gian ngắn. Có thể tạo ra cây con sạch bệnh nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban đầu một cách chặt chẽ hoặc làm cho vật liệu ban đầu trở nên sạch bệnh. Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh. Một giống cây quý có thể được nhân ra nhanh chóng để đưa vào sản xuất. Việc trao đổi giống được dễ dàng. 2.2.4. Các giai đoạn nhân giống in vitro Theo Nguyễn Xuân Linh (1998), sự thành công của việc nhân giống in vitro chỉ đạt được khi trải qua các giai đoạn: a. Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy Đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng để đưa
  19. 19. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 9 vào nuôi cấy in vitro. Theo tài liệu của Street (1974) các chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô nuôi cấy như sau: Bảng 2.1 Một số chất khử trùng và khoảng thời gian khử trùng thường dùng trong nhân giống in vitro Tác nhân vô trùng Nồng độ (%) Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả Hypochlorit Calcium 9-10 5-30 Rất tốt Natri hypochlorit 2 5-3 Rất tốt Hydroperoxid 10-12 5-15 Tốt Nước brom 1 -2 2 - 10 Rất tốt HgCl2 0,1 -1 2 - 10 TB Chất kháng sinh 4 - 50mg/l 30 - 60 Khá tốt Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên. Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết quả. b. Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy Mục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy. Thường mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành đã chuyên hoá sâu. Người ta cũng còn nhận thấy rằng mẫu cấy trong thời gian sinh trưởng nhanh của cây trong mùa sinh trưởng cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi. c. Giai đoạn 3: Nhân nhanh Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Để tăng hệ số nhân, ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hoà
  20. 20. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 10 sinh trưởng (Auxin, Cytokynin, Gibberellin,...), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men,. kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Tuỳ thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành qua các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính. d. Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường 2 - 3 tuần, từ những chồi riêng lẽ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. e. Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất. Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt dộ, ánh sáng, ẩm độ, giá thể,.) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như ruộng sản xuất. 2.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro a. Mẫu nuôi cấy Murashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của chọn lựa mẫu cấy thích hợp và chỉ cho thấy hầu hết những cơ quan có thể dùng để nuôi cấy mô. Điều quan trọng cho thấy một số nhân tố khi chọn lọc mẫu bao gồm kiểu gen, cơ quan được chọn lọc, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khoẻ của mẫu và nguồn mẫu. b. Kiểu gen Kiểu gen ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy. Với loài thuốc lá được sử
  21. 21. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 11 dụng như cây kiểu mẫu, Cheng và Smith (1973) ghi nhận sự khác nhau giữa các genom qua nuôi cấy sinh trưởng mô lõi. Hơn nữa, Jaramillo và Summers (1990) ghi nhận kiểu di truyền ảnh hưởng đến số lượng và đường kính mô sẹo qua nuôi cấy hạt phấn cà chua Lycopersycon esculentum Mill. c. Chọn cơ quan Murashige (1974) cho rằng hầu hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng sử dụng nuôi cấy in vitro. Ông cho rằng mẫu nuôi cấy khác nhau ở các loài khác nhau, như ở Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy, theo Doerschung và Miller (1976) cho rằng chồi mầm thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây nẩy mầm từ hạt. d. Tuổi và sinh lý Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôi cấy cho thấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hoá tế bào và tuổi sinh lý. Có nhiều nghiên cứu khác nhau vế ảnh hưởng của tuổi sinh lý mẫu nuôi cấy, theo Pierik (1970) ghi nhận rễ phát sinh trên lá non và không phát sinh trên lá già. e. Mẫu in vitro Trong những năm gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu in vitro có khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộng hay trong vườn ươm như ở cây Azalea (Economou và Read, 1986). Tuy nhiên, Lu et al. (1991) ghi nhận nuôi cấy túi phấn đạt tỷ lệ thành công cao khi nuôi cấy túi phấn trên cây đồng ruộng. f. Sức sống của mẫu Điều cần thấy rằng mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng đến nuôi cấy in vitro. Morel (1952, 1955) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để loại virus sản xuất những cây sạch bệnh và điều này nói lên rằng cần phải cẩn thận chọn mẫu nuôi cấy nhất là đối với những cây bệnh, nếu nuôi cấy cây bị bệnh thì sẽ có một số lượng lớn những cây bệnh được nhân lên.
  22. 22. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 12 2.2.6. Điều kiện nuôi cấy a. Nhiệt độ Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là 20 - 27℃. Theo Murashige (1974), nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng và phát triển cây in vitro qua những tiến trình sinh lý như hô hấp hay hình thành tế bào hay cơ quan. b. Cường độ ánh sáng Cường độ ánh sáng là một nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả năng nuôi cấy in vitro cây có lá xanh. Ảnh hưởng của ánh sáng hình như có liên hệ với các loài, có loài chịu ánh sáng cao, ánh sáng trung bình và ánh sáng thấp hay tối (Papachatzi et al., 1981; Miller và Murashige, 1976; Thorpe và Murashige, 1970). Việc nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điêu kiện ánh sáng 1000 lux (Dương Công Kiên, 2002). c. Quang kỳ và chất lượng ánh sáng + Thời gian chiếu sáng Ảnh hưởng sâu sắc đến những đáp ứng sinh lý ở cây trồng. + Chất lượng ánh sáng Ảnh hưởng trực tiếp đến cây in vitro, vì ánh sáng cao hơn ánh sáng đỏ hay ánh sáng đỏ có ảnh hưởng đến những biến đổi sinh lý trên cây như ra hoa, chế độ dinh dưỡng và những hiện tượng khác như tăng sinh chồi in vitro. + Các chất khí Thành phần chất khí trong bình nuôi cấy có ảnh hưởng đến sinh trưởng cây in vitro. O2, CO2 và ethylen là những thành phần chất khí được khảo sát nhiều trong môi trường nuôi cấy. Ẩm độ cũng được quan tâm đến, do ảnh hưởng đến quá trình làm khô mẫu nuôi cấy. 2.2.7. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp trong nuôi cấy mô là rất cần thiết. Vì
  23. 23. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 13 mỗi loại cây trồng khác nhau đều yêu cầu một hàm lượng dinh dưỡng khác nhau. Mặt khác, môi trường còn thay đổi tuỳ thuộc vào sự phân hoá của mô cấy, tuỳ theo trường hợp duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hay tái sinh cây hoàn chỉnh. Việc lựa chọn môi trường cần dựa vào tài liệu đã cho cùng đối tượng nuôi cấy hoặc thăm dò qua một số môi trường đã cho để xác định môi trường thích hợp cho mẫu nuôi cấy. Các môi trường đều được thành lập từ một số thành phần chính với nguyên tắc có sự cân bằng các yếu tố trong môi trường. Các thành phần chính:  Đường làm nguồn carbon.  Các muối khoáng đa lượng.  Các vitamin.  Các chất điều hòa sinh trưởng. Ngoài ra các tác giả còn cho thêm một số chất hữu cơ như: Nước dừa, nước chiết nấm men. 2.2.8. Chất điều hoà sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV) Chất ĐHSTTV hay hormones sinh trưởng là các hợp chất hữu cơ (gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo). Chúng có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Tuy nhiên, các chất ĐHSTTV chỉ làm tăng cường quá trình trao đổi chất mà không tham gia trực tiếp vào quá trình trao đổi chất. Nó không thể dùng để thay thế chất dinh dưỡng. Chất ĐHSTTV gây nên tác dụng mạnh mẽ với một lượng vô cùng bé lên trao đổi chất của tế bào, ở nồng độ cao chúng có thể hoạt động như chất kìm hãm. Trong thành phần môi trường nuôi cấy, các chất ĐHSTTV làm việc như chiếc chìa khoá đóng mở sự hoạt động của gen, điều khiển sự phát sinh hình thái và tổng hợp hoạt chất. Tác dụng của chất ĐHSTTV liên quan đến hiện tượng kìm hãm và cảm ứng tổng hợp enzyme trong cơ thể thực vật, hoạt hoá các bộ phận của phân tử DNA.
  24. 24. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 14 Mỗi một chất ĐHSTTV đều mang một chức năng riêng, nhưng trong cơ thể của thực vật, để điều khiển những hoạt động của thực vật, chúng tham gia vào thường không phải là một mà là vài chất. Tuỳ mỗi giai đoạn nuôi cấy, giai đoạn phát triển của thực vật, sự kết hợp các chất này có khác nhau. Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài chúng tôi sử dụng các chất thuộc nhóm auxin và cytokinin. a. Auxin Tác dụng sinh lý của auxin chủ yếu làm tăng thể tích của tế bào, kích thích sự hình thành rễ, kìm hãm sự sinh trưởng của chồi bên, kìm hãm sự rụng hoa, rụng quả. Auxin hoạt hoá các hợp chất cao phân tử (protein, cellulose, pectin) và ngăn cản sự phân giải chúng. Auxin được xem là hormone thực vật quan trọng nhất vì chúng có vai trò rất cơ bản trong quá trình phối hợp sinh trưởng và biệt hoá tế bào cần thiết cho sự phát triển bình thường của thực vật. Auxin cùng với một số chất điều chỉnh khác đảm bảo cho sự tạo thành khối các tế bào đang phân chia thành cơ thể thực vật hoàn chỉnh. Trong nuôi cấy mô thường sử dụng các chất như: Indol acetic acid (IAA) Naphthyl acetic acid (NAA). 2,4-D Dichlorophenol acetic acid (2,4-D). Indol butyric acid (IBA). b. Cytokinin Bao gồm các nhóm chất: 6-Benzylaaminopurin (BAP), Kinetin (Ki), Zeatin (Z), Thidiazuron (TDZ). Cytokinin có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của tế bào cấy mô và làm tăng tốc độ phân bào. Khi ở nồng độ cao, nó có tác dụng kích thích sự tạo chồi, đồng thời ức chế sự phân hoá rễ của mô cấy.
  25. 25. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 15 Cytokinin có hiệu quả rất rõ trên sự phân chia của tế bào, trong quá trình này cytokinin cần thiết nhưng chúng không có hiệu quả nếu vắng mặt auxin. Trong một tỷ lệ giữa cytokinin và auxin thì có kích thích tạo chồi hay tạo rễ, thông thường cytokynin cao hơn auxin thì kích thích tạo chồi. Và ngược lại, auxin cao hơn cytokinin thì kích thích sự tạo rễ. Trong cơ thể thực vật cytokinin có tác dụng rất lớn là tăng cường sự tổng hợp DNA và protein, kích thích quá trình trao đổi chất. 2.2.9. Những thành tựu về nuôi cấy cây cỏ ngọt trên thế giới và Việt Nam a. Trên thế giới Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về việc nhân giống cây cỏ ngọt in vitro trên thế giới. Một số kết quả nghiên cứu nhân giống cây cỏ ngọt bằng phương pháp in vitro đã được công bố trên các tạp chí như : MUHAMMAD RAFIQ và cộng sự thuộc Viện Công nghệ sinh học và kỹ thuật di truyền, Đại học Sindh, Jamshoro, Pakistan được đăng trên tạp chí Pak. J. Bot., 39(7): 2467-2474 (2007). Họ tiến hành khảo sát khả năng ra rễ của cây cỏ ngọt in vitro trên môi trường MS với các nồng độ khác nhau của hai CĐHST thực vật là IAA và NAA. Kết quả thu được là với việc bổ sung 0.5 mg/L NAA việc hình thành rễ của cây cỏ ngọt là tốt hơn so với các nghiệm thức còn lại. Maria GENEVA và các cộng sự thuộc Viện Sinh lý thực vật và Di truyền học, Viện Hàn lâm Khoa học Bulgaria, Sofia 1113, Bulgaria được đăng trên Tạp chí Sinh học Thổ Nhĩ Kỳ (Turkish Journal of Biology) tháng 1/ 2013. Nghiên cứu cho rằng: Môi trường MS bổ sung 1.0 mg/l BAP kết hợp với 0.1mg/l là môi trường phù hợp nhất cho việc nhân nhanh chồi của cây cỏ ngọt in vitro. Và môi trường ½ MS bổ sung 0.1 mg/l IBA cho kết quả tạo rễ của cây cỏ ngọt in vi tro là tối ưu nhất. b. Tại việt nam Cây cỏ ngọt là loại cây mới có mặt ở nước ta khoảng 20 năm nay. Việc nhân giống cỏ ngọt chủ yếu bằng phương pháp gieo hạt, giâm cành. Việc nghiên cứu
  26. 26. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 16 về nhân giống bằng phương pháp in vitro còn ít . Một nghiên cứu quy trình nhân giống cây cỏ ngọt bằng phương pháp in vitro mới đây của Nguyễn Thị Thu Hậu và các cộng sự thuộc Viện Nghiên cứu khoa học Tây Nguyên và Trường Đại học Tây Nguyên, đã được trình bày tai hội thảo quốc tế về khoa học và công nghệ phục vụ sản xuất nông nghiệp công nghệ cao của tỉnh Lâm Đồng tháng 3/ 2013. Kết quả nghiên cứu như sau: Nhân nhanh chồi cây cỏ ngọt Stevia rebaudianna Bertoni được hình thành tốt nhất trên môi trường ½ MS có bổ sung 30 g/l đường sucrose; 7,5 g/l agar; 0,3 mg/l kinetin. Các chồi hình thành rễ cao và chất lượng rễ tốt nhất trên môi trường ½ MS có bổ sung 15 g/l đường sucrose; 7,5 g/l agar; 0,5 mg/l NAA. PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu Cây Cỏ ngọt (Stevia rebaudiana) 3 tháng tuổi, nhập từ Trường Đại học Nông nghiệp Hà nội. 3.1.2. Trang thiết bị và dụng cụ a. Thiết bị  Tủ vô trùng  Nồi hấp khử trùng
  27. 27. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 17  Tủ sấy  Máy đo ph  Cân điện tử  Tủ lạnh  Kệ đặt bình
  28. 28. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 18 b. Dụng cụ:  Pince  Kéo  Dao cấy  Bình thuỷ tinh 400ml  Đĩa  Đèn cồn  Giấy bạc  Giây thun  Túi nilon chịu nhiệt 3.1.3. Môi trường nuôi cấy Các môi trường được sử dụng gồm: MS, ¾ MS, ½ MS, White . Môi trường ½ MS, ¾ MS là môi trường có phần đa lượng và vi lượng bằng ½ và ¾ của môi trường MS. Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật được sử dụng là: BA, Ki, NAA, IBA ,IAA. Các thành phần khác:  Agar: 8g/l  Đường saccharose : 30g/l Môi trường được điều chỉnh về pH=5,8 ± 0,1 (bằng KOH 1N và HCl 1N) trước khi hấp khử trùng bằng autoclave ở 1atm (121℃) trong 25 phút. 3.1.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro  Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày  Nhiệt độ: 25 ± 2°c  Độ ẩm: 75-80%  Cường độ ánh sáng: 2000-3000 lux
  29. 29. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 19 3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Phương pháp khử trùng Đoạn thân mang chồi ngủ của cây cỏ ngọt được sử dụng để khử trùng trước khi cấy vào môi trường  Bên ngoài tủ cấy: Đoạn thân cây Cỏ ngọt cắt bỏ lá, cắt thành khúc khoảng 5cm đem rửa bằng xà bông. Sau đó, rửa sạch xà bông bằng nước máy Tiếp tục cho mẫu ngâm vào cồn 70° trong 30 giây. Rửa lại bằng nước cất vô trùng.  Trong tủ cấy vô trùng: Ngâm mẫu vào dung dịch hóa chất TCCA (nồng độ 5000ppm- 7000ppm và thời gian từ 10- 15 phút) cho thêm hai giọt Tween80. Rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng  Cấy mẫu Mẫu cấy là những đoạn thân 1.5 cm có mang chồi nách được cấy có cực vào môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BA với hàm lượng là 0.2 mg/l 3.2.2. Phương pháp thí nghiệm Các thí nghiệm đều được bố trí theo kiểu thí nghiệm đơn yếu tố và hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. a. Thí nghiệm 1: khảo sát nồng độ và thời gian khử trùng ảnh hưởng đến tỉ lệ sống của mẫu cấy cây Cỏ Ngọt in vitro. Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ chất khử trùng TCCA và thời gian thích hợp cho việc vô trùng mẫu Cỏ Ngọt nhằm tạo nguồn mẫu sạch ban đầu cho quá trình nhân giống tiếp theo.
  30. 30. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 20 Vật liệu: mẫu thân chứa chồi nách của cây Cỏ Ngọt. Các nghiệm thức trong thí nghiệm Bảng 3.1 Các nghiệm thức trong thí nghiệm tạo mẫu Cỏ Ngọt in vitro sạch bệnh Nghiệ m thức Nồng độ TCCA (ppm) Thời gian (phút) 1 5000 10 2 5000 15 3 5000 20 4 6000 10 5 6000 15 6 6000 20 7 7000 10 8 7000 15 9 7000 20 Mỗi nghiệm thức cấy 50 bình, mỗi bình chứa 20ml môi trường. Mỗi bình cấy 1 mẫu. Tổng số mẫu là 450 mẫu Thời gian thí nghiệm là 3 tuần. Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ mẫu chết (%) Tỉ lệ mẫu không nhiễm vi sinh vật (%) Tỉ lệ mẫu sống và mọc chồi (%)
  31. 31. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 21 b. Thí nghiệm 2: khảo sát tìm môi trường cơ bản của cây Cỏ ngọt in vitro Mục đích thí nghiệm: khảo sát môi trường cơ bản thích hợp cho việc nhân giống Cỏ Ngọt in vitro Vật liệu thí nghiệm: các đoạn thân mang chồi nách của cây Cỏ Ngọt đã được vô trùng ở thí nghiệm 1. Các nghiệm thức trong thí nghiệm: Bảng 3.2 Các nghiệm thức thí nghiệm tìm môi trường cơ bản cho cây Cỏ Ngọt in vitro. Nghiệm thức Môi trường 1 White 2 ½ MS 3 ¾ MS 4 MS Mỗi nghiệm thức cấy 5 bình. Mỗi bình cấy 15 mẫu. tổng số mẫu: 300 . Thời gian thí nghiệm 3 tuần. Chỉ tiêu theo dõi:  Chiều cao của chồi  Số đốt thân c. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro. Mục đích thí nghiệm: Tìm các chất điều hòa sinh trưởng và nồng độ phù hợp
  32. 32. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 22 để nhân nhanh cây Cỏ ngọt in vitro. Vật liệu: mẫu cấy được lấy từ chồi Cỏ ngọt in vitro ở thí nghiệm 2. Thí nghiệm gồm 20 nghiệm thức. Bảng 3.3 Các nghiệm trong thí nghiệm nhân nhanh chồi thức nhân nhanh chồi Nghiệm thức Môi trường Ki (mg/l) IBA (mg/l) ĐC ½ MS 0.0 0.0 A1 ½ MS 0.1 0.2 A2 ½ MS 0.5 0.2 A3 ½ MS 1 0.2 A4 ½ MS 2 0.2 A5 ½ MS 3 0.2 Ki (mg/l) NAA (mg/l) B1 ½ MS 0.1 0.2 B2 ½ MS 0.5 0.2 B3 ½ MS 1 0.2 B4 ½ MS 2 0.2 B5 ½ MS 3 0.2 BA (mg/l) IBA (mg/l) C1 ½ MS 0.1 0.2 C2 ½ MS 0.5 0.2
  33. 33. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 23 C3 ½ MS 1 0.2 C4 ½ MS 2 0.2 C5 ½ MS 3 0.2 BA (mg/l) IAA (mg/l) D1 ½ MS 0.1 0.2 D2 ½ MS 0.5 0.2 D3 ½ MS 1 0.2 D4 ½ MS 2 0.2 D5 ½ MS 3 0.2 Mỗi nghiệm thức cấy 3 bình Mỗi bình cấy 15 mẫu. Tổng số mẫu: 900 mẫu Thời gian thí nghiệm: 3 tuần Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng chồi: Số chồi trung bình / mẫu cấy. Hệ số nhân: Số đốt trung bình/ bình nuôi cấy. Số đốt thân/mẫu cấy ( hệ số nhân) . d. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của IBA , NAA và IAA đến sự hình thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro. Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ IBA , NAA và IAA thích hợp cho quá trình tạo rễ của cây Cỏ ngọt in vitro, nhằm chuẩn bị cây con khoẻ mạnh để đưa ra vườn ươm. Vật liệu thí nghiệm: Mẫu được lấy từ chồi Cỏ Ngọt ở nghiệm thức tốt nhất của
  34. 34. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 24 thí nghiệm 3 Thí nghiệm gồm: 15 nghiệm thức Bảng 3.4 các nghiệm thức trong thí nghệm tìm môi trường ra rễ cho cây Cỏ Ngọt in vitro Nghiệm thức Môi trường IBA (mg/l) ĐC ½ MS 0.0 E1 ½ MS 0.2 E2 ½ MS 0.5 E3 ½ MS 1.0 E4 ½ MS 3.0 E5 ½ MS 5.0 NAA (mg/l)F1 ½ MS 0.2 F2 ½ MS 0.5 F3 ½ MS 1.0 F4 ½ MS 3.0 F5 ½ MS 5.0 IAA (mg/l) G1 ½ MS 0.2 G2 ½ MS 0.5 G3 ½ MS 1.0 G4 ½ MS 3.0 G5 ½ MS 5.0 Mỗi nghiệm thức cấy 4 bình Mỗi bình cấy 10 mẫu Tổng số mẫu: 600 mẫu Thời gian thí nghiệm: 4 tuần Chỉ tiêu theo dõi:
  35. 35. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 25 Số rễ /cây (rễ): Đếm tất cả rễ ở mỗi cây khi 60% số cây đã ra rễ Chiều dài rễ (cm): Đo chiều dài rễ sau 4 tuần nuôi cấy 3.2.3. Phân tích thống kê Số liệu thu thập được xử lý trên máy vi tính bằng chương trình SPSS 16.0 . Đọc kết quả dựa vào bảng ANOVA, bảng trung bình và bảng so sánh khác biệt giữa các nghiệm thức (Bằng phương pháp LSD) 3.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 05/2012 - 06/2013 tại viện Công nghệ sinh học và Thực Phẩm, Trường Đại học Công Nghiệp Tp. HCM.
  36. 36. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 26 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: khảo sát nồng độ và thời gian khử trùng ảnh hưởng đến tỉ lệ sống của mẫu cấy cây Cỏ Ngọt in vitro. Do nguồn mẫu ban đầu không sạch, lấy từ tự nhiên còn lẫn bùn, đất, không vô trùng, dễ mang mầm bệnh, nên việc khử trùng mẫu là một bước quan trọng để đảm bảo cho nguồn nguyên liệu sạch của quá trình nhân giống in vitro. Bảng 4.1 Kết quả nghiệm thức khảo sát nồng độ và thời gian khử trùng mẫu Cỏ ngọt bằng chất khử trùng TCCA Nồng độ chất khử trùng TCCA (ppm) Thời gian Mẫu chết (%) mẫu nhiễm VSV (%) mẫu sống và mọc chồi (%) 5000 ppm 10 phút 4 86 10 15 phút 8 54 38 20 phút 42 20 38 6000 ppm 10 phút 8 74 18 15 phút 10 42 48 20 phút 50 16 34 7000 ppm 10 phút 10 64 26 15 phút 18 40 42
  37. 37. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 27 20 phút 58 16 26 Từ kết quả của bảng 4.1 cho thấy: Nồng độ 5000 ppm, thời gian xử lý ở 15 phút và 20 phút có tỉ lệ mẫu sống và mọc chồi cao nhất là 38% Nồng độ 6000 ppm, thời gian xử lý ở 15 phút cho tỉ lệ mẫu sống và mọc chồi cao nhất là 48% Nồng độ 7000 ppm, thời gian xử lý ở 15 phút cho tỉ lệ mẫu sống và mọc chồi cao nhất là 42%. Theo chúng tôi có thể ở nồng độ 6000ppm và thời gian 15 đủ để hàm lượng Clo trong TCCA diệt hiệu quả tế bào vi sinh vật nhưng không ảnh hưởng đến sức sống của mẫu. Hình 4.1 Các dạng mẫu trong thí nghiệm khử trùng mẫu: a. mẫu sống và mọc chồi; b. mẫu nhiễm VSV; c. mẫu chết. 4.2. Thí nghiệm 2: khảo sát tìm môi trường cơ bản phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển cây Cỏ ngọt in vitro
  38. 38. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 28 Bảng 4.2 Kết quả của thí nghiệm tìm môi trường cơ bản tối ưu cho cây Cỏ ngọt in vitro Nghiệm thức Môi trường Chiều cao chồi (cm) Số đốt thân/mẫu cấy 1 White 2.53a 4.57b 2 ½ MS 4.77d 5.03c 3 ¾ MS 4.57c 4.97c 4 MS 3.80b 3.93a *Các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05. Nhận xét: Qua bảng 4.2 cho thấy ở nghiệm thức 2 ( ½ MS) cho chiều cao chồi và số đốt thân trung bình là cao nhất 4.77 cm, và 5.03 chồi, cao hơn so với các nghiệm thức còn lại. Theo chúng tôi có thể ở nồng độ và tỷ lệ các chất khoáng đa lượng và vi lượng trong môi trường ½ MS phù hợp hơn cho quá trình trao đổi chất trong tế bào cây cỏ ngọt, nên sự hình thành chồi và vươn cao chồi vượt trội hơn so với các môi trường còn lại trong thí nghiệm.
  39. 39. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 29 Hình 4.2 Kết quả nghiệm thức tìm môi trường cơ bản cho cỏ ngọt in vitro 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các nhóm chất điều tiết sinh trưởng lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro. Việc nhân chồi in vitro có vai trò quan trọng trong việc tạo ra lượng lớn cây con in vitro làm nguyên liệu cho các quá trình nhân giống tiếp theo. Đây là quá trình quan trọng và cũng có thể nói đây là nhiệm vụ của nhân giống vô tính. Thật ra, bản thân thực vật có khả năng tự tổng hợp và điều chỉnh các chất điều hòa sinh trưởng thực vật thích hợp với mỗi thời kỳ sinh trưởng, phát triển, với thời tiết khí hậu, điều kiện sống. Vai trò của các chất sinh trưởng thể hiện ở nhiều mặt như điều khiển vận động, điều khiển quá trình ra hoa, các hoạt động sinh lý, sinh hóa trong cơ thể thực vật (Oparin, 1977; Marosti Mihaly, 1976; Nguyễn Văn Uyển, 1995). Đối với mô nuôi cấy trong tình trạng dị dưỡng, khả năng tự tổng hợp và điều chỉnh các chất điều hòa sinh trưởng là rất hạn chế, cần bổ sung những chất này vào môi trường nuôi cấy một lượng phù hợp. Tùy vào mỗi loại mô cấy, loại cây, thời gian phát triển của mô cấy và mục đích nuôi cấy mà chịu sự ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng khác nhau. Tuy nhiên ở hầu hết các đối tượng thực vật, tỷ lệ hình thành chồi sẽ
  40. 40. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 30 tố hơn nếu trong môi trường nuôi cấy có bổ sung vừa Cytokinin và một lượng nhỏ Auxin(Vũ Văn Vụ, 1999). Trong phần này chúng tôi tiến hành khảo sát lượng Auxin bổ sung cùng với Citokinin trong tạo chồi rất nhiều nồng độ khác nhau, tuy nhiên vì đồ án quá dài và nhiều nội dung nên những kết quả không khả quan chúng tôi lượt bỏ bớt, chỉ nêu ra những nghiệm thức khả quan. 4.3.1. Thí nghiệm 3a: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung Ki kết hợp với 0.2 mg/l IBA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro. Bảng 4.3 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi có sự bổ sung kết hợp giữa Ki và 0.2 mg/l IBA Nghiệm thức Ki (mg/l) IBA (mg/l ) Số chồi (chồi) Chiều cao chồi (cm) Số đốt thân/mẫu cấy (hệ số nhân) ĐC 0 0 1.93a 5.17d 8.97a A1 0.1 0.2 2.5b 5.33d 11.33b A2 0.5 0.2 4.03c 3.73c 11.37b A3 1 0.2 4.6d 2.87b 16.87c A4 2 0.2 6.66e 2.63b 16.57c A5 3 0.2 7.17f 2.20a 23.4d *Các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05. Từ kết quả của bảng 4.3 nhận thấy: Ở nghiệm thức A5 cho hệ số chồi trung bình (7.17 chồi/ mẫu) và số đốt thân/mẫu cấy(23.4đốt/mẫu) là cao nhất, cao hơn nghiệm thức đối chứng và các nghiệm thức còn lại. Theo chúng tôi có thể ở nồng độ bổ sung 3mg/l Ki và 0.2mg/l IBA vào môi
  41. 41. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 31 trường nuôi cấy là phù hợp hơn cho quá trình kích thích sự hấp thu dinh dưỡng và sự trao đổi chất trong mẫu cấy cây cỏ ngọt, thông qua việc kích thích sinh tổng hợp các Protein Enzyme của 2 chất là Kinetin và IBA. Hình 4.3 Chiều cao và số chồi ở các nghiệm thức nhân nhanh chồi trong môi trường có sự kết hợp giữa Ki và 0.2 mg/l IBA
  42. 42. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 32 4.3.2. Thí nghiệm 3b: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường có bổ sung Ki kết hợp với 0.2 mg/l NAA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro. Bảng 4.4 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi có bổ sung kết hợp giữa Ki và 0.2 mg/l NAA Nghiệm thức Ki (mg/l) NAA (mg/l ) Số chồi (chồi) Chiều cao chồi (cm) Số đốt thân/mẫu cấy (hệ số nhân) ĐC 0 0 2.00b 5.17c 8.97b B1 0.1 0.2 3.37c 3.07b 11.83c B2 0.5 0.2 0.00a 0.00a 0.00a B3 1 0.2 0.00a 0.00a 0.00a B4 2 0.2 0.00a 0.00a 0.00a B5 3 0.2 0.00a 0.00a 0.00a *Các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05. Theo số liệu của bảng 4.4 cho thấy ở Nghiệm thức B1(0.1mg/lKI và 0.2mg/lNAA) cho hệ số chồi trung bình(3.37 chồi/mẫu) và số đốt thân trung bình/ mẫu cấy cao nhất (11.83 đốt/ mẫu), cao hơn so với đối chứng và các nghiệm thức còn lại, tuy nhiên về chiều cao chồi thì thấp hơn so với đối chứng (5.17 cm). Nếu tính theo hệ số nhân nhanh thì nghiệm thức B1 vẫn hiệu quả hơn nghiệm thức đối chứng(8.97 so với 11.83 đốt). Nhìn vào hình 4.4 chúng tôi có nhận xét sơ bộ NAA khi kết hợp với Kinetin gốc mẫu cấy có sẹo lớn và sự phát triển của chồi hầu như bị ức chế.
  43. 43. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 33 Hình 4.4 Nghiệm thức nhân nhanh chồi kết hợp giữa Ki và 0.2 mg/l NAA 4.3.1. Thí nghiệm 3c: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường có bổ sung BA kết hợp với 0.2 mg/l IBA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro. Bảng 4.5 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi kết hợp giữa BA và 0.2 mg/l IBA Nghiệm thức BA (mg/l) IBA (mg/l ) Số chồi (chồi) Chiều cao chồi (cm) Số đốt thân/mẫu cấy (hệ số nhân) ĐC 0.0 0.0 2.00a 5.15e 8.97e C1 0.1 0.2 2.10a 4.43d 7.57c C2 0.5 0.2 2.47b 2.60c 5.93b C3 1.0 0.2 3.65c 1.77b 8.10d C4 2.0 0.2 4.06d 1.13a 7.80cd C5 3.0 0.2 2.39b 1.00a 4.23a *Các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.
  44. 44. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 34 Nhìn vào bảng số liệu bảng 4.5 và hình 4.5 chúng ta dễ dàng nhận thấy: Ở tất cả các nghiệm thức có chiều cao chồi và số đốt đều thấp hơn so với đối chứng. Như vậy việc kết hợp giữa Ba và IBA là không phù hợp cho đối tượng cây Cỏ ngọt trong nuôi cấy in vitro Hình 4.5 Chiều cao và hình thái chồi trong các nghiệm thức kết hợp giữa BA và 0.2 mg/l IBA 4.3.1. Thí nghiệm 3c: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường có bổ sung BA kết hợp với 0.2 mg/l NAA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro. Bảng 4.6 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi kết hợp giữa BA và 0.2 mg/l NAA Nghiệm thức BA (mg/l) NAA (mg/l ) Số chồi (chồi) Chiều cao chồi (cm) Số đốt thân/mẫu cấy (hệ số nhân) ĐC 0.0 0.0 1.93b 5.17d 8.97b D1 0.1 0.2 6.21d 2.53c 15.67c D2 0.5 0.2 4.74c 1.60b 0.00a
  45. 45. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 35 D3 1.0 0.2 0.00a 0.00a 0.00a D4 2.0 0.2 0.00a 0.00a 0.00a D5 3.0 0.2 0.00a 0.00a 0.00a *Các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05. Từ số liệu bảng 4.6 cho thấy: Nghiệm thức D1(0.1mg/l BA) cho số đốt trên thân trung bình/ mẫu cấy cao nhất (15.67 đốt/mẫu cấy ), Khi tăng nồng độ BA lên 0.5mg/l hoặc cao hơn nữa thì số đốt trên thân giảm và chiều cao chồi cũng giảm mạnh, có chồi dị dạng(hình 4.6). Theo chúng tôi, một nồng độ quá cao của BA(đối với cây cỏ ngọt) sẽ kích thích quá mạnh sự phân chia tế bào theo hướng tăng số lượng nhưng lại giảm sự biệt hóa của các mô để hình thành cấu trúc chồi. Hình 4.6 Hình thái cây trong các nghiệm thức nhân nhanh chồi có kết hợp giữa BA và 0.2 mg/l NAA 4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của IBA , NAA và IAA đến sự hình
  46. 46. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 36 thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro. Rễ là một bộ phận quan trọng của cây. Nó có tác dụng hút nước, muối khoáng và chất dinh dưỡng cung cấp cho cây sinh trưởng và phát triển. Do đó, trong việc tạo cây in vitro hoàn chỉnh ta phải quan tâm đến bộ rễ của cây, tìm môi trường thật sự thích hợp cho sự tạo và phát triển của rễ. Cây in vitro có bộ rễ khỏe thì mới có khả năng sống trong điều kiện vườn ươm do khi chuyển từ điều kiện in vitro ra vườn ươm có sự tác động mạnh mẽ đến cây con in vitro như: ẩm độ, ánh sáng, nhiệt độ, môi trường thuần hóa không thích hợp,…cây rất dễ bị chết. 4.4.1. Thí nghiệm 4a: Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến sự hình thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro. Bảng 4.7 Kết quả thí nghiệm khảo sát môi trường tạo rễ bổ sung IBA Nghiệm thức IBA (mg/l) Số rễ (rễ) Chiều dài rễ (cm) ĐC 0.0 0.27a 0.33a E1 0.2 3.83b 1.63b E2 0.5 5.30c 2.43c E3 1.0 6.63d 1.73b E4 3.0 3.57b 0.47a E5 5.0 0.17a 0.17a *Các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05. Từ bảng số liệu 4.7 nhận thấy: Ở nghiệm thức E3 (1mg/l IBA) cho số rễ trung bình cao nhất (6.63 rễ/ cây), tuy nhiên chiều dài rễ thì nghiệm thức E2
  47. 47. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 37 (0.5mg/l IBA) lại cho kết quả tốt nhất 2.43 cm/rễ. Trong 2 nghiệm thức trên mỗi nghiệm thức có một yếu tố tốt riêng, chúng tôi đang lập lại nhiều lần để so sánh và đưa ra kết luận chính xác nên chọn nghiệm thức nào. Hình 4.7 Rễ hình thành ở các nghiệm thức bổ sung IBA 4.4.2. Thí nghiệm 4b: Khảo sát ảnh hưởng của NAA ở các nồng độ khác nhau đến sự hình thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro. Bảng 4.8 Kết quả thí nghiệm khảo sát môi trường tạo rễ bổ sung NAA Nghiệm thức NAA (mg/l) Số rễ (rễ) Chiều dài rễ (cm) ĐC 0.0 0.27a 0.33a F1 0.2 5.27c 1.30c
  48. 48. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 38 F2 0.5 10.63e 4.93e F3 1.0 9.23d 4.47d F4 3.0 5.13c 0.83b F5 5.0 3.73b 0.27a *Các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05. Nhìn vào bảng số liệu 4.8 và hình 4.8 dễ dàng nhận thấy: Nghiệm thức bổ sung 0.5 mg/l NAA(NT F2) là nghiệm thức tốt nhất của môi trường tạo rễ ở thí nghiệm này. Có thể ở nồng độ 0.5mg/l NAA được bổ sung vào môi trường nuôi cấy kết hợp với lượng Auxin nội sinh vừa đủ để kích thích các tế bào vùng chu luân của rễ tạo mầm rễ mới và kéo dài rễ, còn ở những nồng độ cao hơn của NAA lại kích thích mạnh cho sự phân chia tế bào theo hướng tạo thành mô sẹo mà không biệt hóa hình thành mầm rễ.
  49. 49. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 39 Hình 4.8 Rễ hình thành ở các nghiệm thức bổ sung NAA. 4.4.3. Thí nghiệm 4c: Khảo sát ảnh hưởng của IAA đến sự hình thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro. Bảng 4.9 Kết quả thí nghiệm khảo sát môi trường tạo rễ bổ sung IAA Nghiệm thức IAA (mg/l) Số rễ (rễ) Chiều dài rễ (cm)
  50. 50. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 40 ĐC 0.0 0.27a 0.33a G1 0.2 2.00b 1.00b G2 0.5 5.37d 2.27c G3 1.0 5.87e 2.47c G4 3.0 4.07c 0.97b G5 5.0 1.93b 0.37a *Các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05. Từ số liệu của bảng 4.9 cho thấy: Số rễ và chiều dài rễ tăng khi nồng độ IAA được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tăng dần, số rễ và chiều dài rễ đạt tốt nhất ở nghiệm thức G3(5.87 rễ, 2.47cm). Tuy nhiên khi tăng nồng độ IAA lên 3mg/l, 4mg/l, thì Số rễ lẫn chiều dài lại giảm mạnh, đồng thời tại gốc mẫu cấy hình thành những khối sẹo lớn(hình 4.9), Có thể với nồng độ lớn hơn 1mg/l IAA đã kích thích cho sự phân chia tế bào mạnh hơn tính biệt hóa các tế bào chu luân hình thành rễ.
  51. 51. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 41 Hình 4.9 Rễ hình thành ở các nghiệm thức bố sung IAA
  52. 52. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 42 PHẦN 5: KẾT LUẬN  Nồng độ chất khử trùng TCCA là 6000ppm và thời gian khử trùng 15 phút là phù hợp nhất để khử trùng mẫu thân cây Cỏ Ngọt.  Môi trường cơ bản phù hợp nhất cho sự phát triển của cây Cỏ ngọt in vitro là ½ MS.  Môi trường nhân nhanh chồi của cây Cỏ ngọt in vitro bổ sung kết hợp 3.0 mg/l Ki và 0.2 mg/l IBA cho hệ số nhân cao nhất.  Môi trường tạo rễ cho cây Cỏ ngọt in vitro bổ sung 0.5 mg/l NAA cho số rễ và chiều dài rễ tốt nhất..
  53. 53. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 43 KIẾN NGHỊ Từ những kết quả thí nghiệm trên chúng tôi dưa ra một số kiến nghị sau: - Lập lại thí nghiệm tạo chồi và rễ nhiều lần để đưa ra kết luận chính xác. - Tiếp tục khảo sát sinh trưởng và phát triển của cây con ngoài vườn ươm.
  54. 54. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO. Tài liệu trong nước 1. Bùi Bá Bổng, 1995. Nhân giống cây bằng nuôi cấy mô. Sở khoa học công nghệ môi trường An Giang. 2. Dương Công Kiên, 2002. Nuôi cấy mô thực vật. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh. 3. Nguyễn Xuân Linh, 1998. Hoa và kỹ thuật trồng hoa. NXB Nông nghiệp Hà Nội 4. Nguyễn Văn Uyển,1995-1996, Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật. Tập 1 (1995), Tập 2 (1996), Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh 5. Nguyễn Văn Uyển, 1993. Nuôi cấy mô tế bào thực vật phục vụ công tác giống cây trồng, nhà xuất bản nông nghiệp. 6. Vũ Văn Vụ, 1999. Sinh lý thực vật ứng dụng. Nhà xuất bản giáo dục. Tài liệu nước ngoài 7. Brown, D. C. W., and Thorpe, T. A., 1986, Plant regeneration by organogenesis, in: “Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,” Vol. 3, I. K. Vasil, ed., Academic Press, Inc., New York 8. Doerschung, M. R. and Miller, C. O. (1967) Chemical control of adventitious organ formation in Lactuca sativa explants. 9. ECONOMOU A.S., READ P.E., 1986. Microcutting production from sequential reculturing of hardy deciduous azalea shoot tips 10.Jaramillo J, Summers WL. 1990. Tomato anther callus production: solidifying agent and concentration influence induction of callus. 11. Gamborg, O.L., T. Murashige, T.A. Thorpe, and I. K. Vasil, 1976. Plant tissue culture media. In Vitro 12:473–8. 12. Morel, G. and Martin, C. 1952. Virus-free Dahlia through meristem culture. C.R. Hebd. Seances Acad. Sci. Paris 235: 1324-1325. 13.Miller LR, Murashige T. 1976 Tissue culture propagation of tropical foliage plants. 14.Miller L.R. & Murashige T., In Vitro, (1976)
  55. 55. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 45 15.MURASHIGE, T. 1974. Plant propagation through tissue culture. Ann. Rev. Plant Physiol. 16.MURASHIGE T., SKOOG F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 17.Nobecourt, P., 1939, Su la perennite, et l’ angmentation de volumes des cultures de tissues vegetaux. Compte rendu de la societe de biologic 18.PAPACHATZI, M., P. ALLEN and P. HASEWAGA. In vitro propagation of Hosta decorata`Thomas Hogg' using cultured shoot tips. HortScience 106(2). 1981. 19.Wilson, H.M. and Street, H.E. (1974). The growth, anatomy and morphogenetic potential of callus and cell suspension cultures of Hevea brasiliensis 20.White, P. R. (1939) Potentially unlimited growth of excised plant callus in an artificial nutrient. 21.Thorpe, T. A., 1980, Organogenesis in vitro: Structural, physiological and biochemical aspects, Int. Rev. Cytol. (Suppl.), 11A:71–111. 22.Thorpe, T. A., 1988, Physiology of bud induction in conifers in vitro, in: “Genetic Manipulation of Woody Plants,” J. W. Hanover and D. E. Keathley, eds., Plenum Publishing Corporation. Tài liệu từ Internet. Nghiên cứu công nghệ sản xuất giống cây cỏ ngọt (STEVIA REBAUDIANA BERTONI) IN VITRO (http://dalat.gov.vn/web/Portals/0/2013/kyyeuNNCNCIN.pdf) http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-quy-trinh-san-xuat-duong-an-kieng-tu-cay-co-ngot- 1825/ https://www.google.com.vn/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=2&cad =rja&ved=0CDEQFjAB&url=http%3A%2F%2Fxa.yimg.com%2Fkq%2Fgroups%2F 22729997%2F1014075913%2Fname%2FUNKNOWN_PARAMETER_VALUE&ei= ljOUbLgHs_slAWfmoHwBg&usg=AFQjCNFy0nIR2n1l6QK6T1dPKX2NUHKq7Q
  56. 56. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 46 &bvm=bv.48572450,d.dGI http://www.vietnam.vn/Thongtin/Toc-Do-Do-Thi-Hoa-Lam-Tang-So-Benh-Nhan- Tieu-Duong-O-Viet-Nam.html http://www.phununet.com/WikiPhununet/ChiTietWiKi.aspx?m=0&StoreID=1 3037 http://www.duoclieuviet.vn/huong-dan-nuoi-trong-duoc-lieu/ky-thuat-trong- co-ngot.html#.Uc5XJaJkODQ http://steviaventures.com/ http://www.ykhoa.net/yhoccotruyen/baiviet/29_321.htm http://globalstevia.vn/
  57. 57. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 47 PHỤ LỤC Bảng môi trường MS Thành phần môi trường MS Khối lượng (mg/L) CoCl2.6H2O 0.025 CuSO4.5H20 0.025 FeNaDTA 36.7 H3BO3 6.2 KI 0.83 MnSO4.H2O 16.9 NaMoO4.2H2O 0.25 ZnSO4.7H2O 8.6 CaCl2 332.02 KH2PO4 170 KNO3 1900 MgSO4 180.54 NH4NO4 1650 Glycine 1650 MyO-Inositol 1650 Nicotine acid 1650 Pyridoxine HCl 1650 Thiamin acid 1650
  58. 58. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 48 Bảng môi trường White Thành phần môi trường WHITE Khối lượng (mg/L) KNO3 80 Ca(NO3).4H2O 300 KCl 65 NaH2PO4.H2O 16.8 MgSO4.7H2O 720.78 FeSO4.7H2O 3.47 MnSO4.H2O 5.31 ZnSO4.7H2O 2.67 H3BO3 1.5 FeSO4.7H2O 3.47 MnSO4.H2O 5.31 ZnSO4.7H2O 2.67 H3BO3 1.5 KI 0.75 MyO-inositol 100 Glysine 2 Pyrydoxin-HCl 0.5 Thiamin-HCl 0.1 Nicotine 0.5
  59. 59. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 49 Bảng số liệu thô của các thí nghiệm - Bảng số liệu thí nghiệm khảo sát thời gian và nồng độ chất khử trùng TCCA. Nồng độ TCCA Thời gian Mẫu chết (%) mẫu nhiễm VSV (%) mẫu sống và mọc chồi (%) 5000 ppm 10 phút 4 86 10 15 phút 8 54 38 20 phút 42 20 38 6000 ppm 10 phút 8 74 18 15 phút 10 42 48 20 phút 50 16 34 7000 ppm 10 phút 10 64 26 15 phút 18 40 42 20 phút 58 16 26 - Bảng số liệu của thí nghiệm khảo sát môi trường cơ bản phù hợp với cây cỏ ngọt in vitro. Bảng số liệu tổng đốt thân trung bình/mẫu cấy của các nghiệm thức tìm môi trường cơ bản cho cỏ ngọt in vitro Số đốt thân trung bình/mẫu cấy Nghiệm thức lần 1 lần 2 lần 3 1 4.5 4.7 4.5 2 5.0 5.1 5.0 3 5.2 4.9 4.8 4 4.0 3.8 4.0
  60. 60. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 50 Bảng số liệu chiều cao trung bình/chồi của các nghiệm thức tìm môi trường cơ bản cho cỏ ngọt in vitro Chiều cao trung bình/chồi Nghiệm thức lần 1 lần 2 lần 3 1 2.6 2.5 2.5 2 4.8 4.8 4.7 3 4.6 4.4 4.7 4 3.8 3.7 3.9 - Bảng số liệu của thí nghiệm khảo sát nồng độ CĐHST phù hợp với môi trường nhân nhanh chồi. Số chồi Nghiệm thức kết quả trung bình của các lần lặp lại kết quả lần1 kết quả lần 2 kết quả lần 3 ĐC 2 2 1.8 A1 2.3 2.7 2.5 A2 3.9 4 4.2 A3 4.71 4.5 4.6 A4 6.67 6.5 6.8 A5 7 7.1 7.4 B1 3.26 3.4 3.45 B2 0 0 0 B3 0 0 0 B4 0 0 0 B5 0 0 0
  61. 61. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 51 C1 2.1 2.2 2 C2 2.3 2.5 2.6 C3 3.64 3.5 3.8 C4 3.97 4 4.2 C5 2.56 2.2 2.4 D1 6.22 6 6.4 D2 4.71 4.8 4.7 D3 0 0 0 D4 0 0 0 D5 0 0 0 Chiều cao chồi Nghiệm thức kết quả trung bình của các lần lặp lại kết quả lần1 kết quả lần 2 kết quả lần 3 ĐC 5 5.3 5.2 A1 5.1 5.4 5.5 A2 3.8 3.8 3.6 A3 2.8 2.9 2.9 A4 2.5 2.6 2.8 A5 2.2 2.3 2.1 B1 3 3.3 2.9 B2 0 0 0 B3 0 0 0
  62. 62. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 52 B4 0 0 0 B5 0 0 0 C1 4.4 4.3 4.6 C2 2.5 2.8 2.5 C3 1.7 1.6 2 C4 1.2 1.1 1.1 C5 1 0.8 1.2 D1 2.6 2.5 2.5 D2 1.8 1.6 1.4 D3 0 0 0 D4 0 0 0 D5 0 0 0 Số đốt thân Nghiệm thức kết quả trung bình của các lần lặp lại kết quả lần1 kết quả lần 2 kết quả lần 3 ĐC 9.2 8.7 9 A1 11.3 11.5 11.2 A2 10.4 11.6 12.1 A3 17.1 17 16.5 A4 17.2 14.5 18 A5 24.7 22 23.5 B1 12 13 10.5
  63. 63. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 53 B2 0 0 0 B3 0 0 0 B4 0 0 0 B5 0 0 0 C1 7.5 8 7.2 C2 5.9 6 5.9 C3 7.9 8.1 8.3 C4 7.6 8 7.8 C5 4.2 4.5 4 D1 14.4 16 16.6 D2 0 0 0 D3 0 0 0 D4 0 0 0 D5 0 0 0 Bảng số liệu của thí nghiệm khảo sát nồng độ CĐHST phù hợp với môi trường tạo rễ số rễ Nghiệm thức kết quả trung bình của các lần lặp lại kết quả lần1 kết quả lần 2 kết quả lần 3 ĐC 0.3 0 0.5 E1 3.6 4.1 3.8 E2 5.1 5.2 5.6 E3 6.6 6.5 6.8 E4 3.3 3.6 3.8 E5 0 0.3 0.2
  64. 64. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 54 F1 5.5 5 5.3 F2 10.5 11 10.4 F3 9 9.5 9.2 F4 5.5 5 4.9 F5 3.5 4 3.7 G1 1.8 2.3 1.9 G2 5.4 5.2 5.5 G3 5.9 5.7 6 G4 4.1 3.9 4.2 G5 2.1 1.7 2 Nghiệm thức kết hợp giữa IBA và Ki chiều dài rễ Nghiệm thức kết quả trung bình của các lần lặp lại kết quả lần1 kết quả lần 2 kết quả lần 3 ĐC 0.5 0 0.5 E1 1.5 1.8 1.6 E2 2.2 2.6 2.5 E3 1.6 1.7 1.9 E4 0.5 0.4 0.5 E5 0 0.3 0.2 F1 1.2 1.5 1.2 F2 5 4.9 4.9 F3 4.6 4.5 4.3
  65. 65. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 55 F4 0.7 0.8 1 F5 0.4 0.2 0.2 G1 0.9 1.3 0.8 G2 2.5 2.1 2.2 G3 2.3 2.6 2.5 G4 1.1 1 0.8 G5 0.3 0.3 0.5
  66. 66. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 56 Bảng kết quả xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 16.0 ONEWAY Chieu_cao_choi BY Nghiem_thuc /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN LSD DUNNETT (1) ALPHA(0.05). Oneway Descriptives Chieu_cao_choi N Mean Std. Deviation Std. Error 95% Confidence Interval for Mean Minimum MaximumLower Bound Upper Bound White 3 2.5333 .05774 .03333 2.3899 2.6768 2.50 2.60 1/2 MS 3 4.7667 .05774 .03333 4.6232 4.9101 4.70 4.80 3/4 MS 3 4.5667 .15275 .08819 4.1872 4.9461 4.40 4.70 MS 3 3.8000 .10000 .05774 3.5516 4.0484 3.70 3.90 Total 12 3.9167 .91932 .26539 3.3326 4.5008 2.50 4.80 Test of Homogeneity of Variances Chieu_cao_choi Levene Statistic df1 df2 Sig. 1.333 3 8 .330
  67. 67. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 57 ANOVA Chieu_cao_choi Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 9.217 3 3.072 307.222 .000 Within Groups .080 8 .010 Total 9.297 11 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:Chieu_cao_choi (I) Nghiem_t huc (J) Nghiem_t huc Mean Difference (I-J) Std. Error Sig. 95% Confidence Interval Lower Bound Upper Bound LSD White 1/2 MS -2.23333* .08165 .000 -2.4216 -2.0450 3/4 MS -2.03333* .08165 .000 -2.2216 -1.8450 MS -1.26667* .08165 .000 -1.4550 -1.0784 1/2 MS White 2.23333* .08165 .000 2.0450 2.4216 3/4 MS .20000* .08165 .040 .0117 .3883 MS .96667* .08165 .000 .7784 1.1550 3/4 MS White 2.03333* .08165 .000 1.8450 2.2216 1/2 MS -.20000* .08165 .040 -.3883 -.0117 MS .76667* .08165 .000 .5784 .9550 MS White 1.26667* .08165 .000 1.0784 1.4550 1/2 MS -.96667* .08165 .000 -1.1550 -.7784 3/4 MS -.76667* .08165 .000 -.9550 -.5784
  68. 68. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 58 Dunnett t (2-sided)a 1/2 MS White 2.23333* .08165 .000 1.9982 2.4685 3/4 MS White 2.03333* .08165 .000 1.7982 2.2685 MS White 1.26667* .08165 .000 1.0315 1.5018 *. The mean difference is significant at the 0.05 level. a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. Homogeneous Subsets Chieu_cao_choi Nghiem_t huc N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 4 Duncana White 3 2.5333 MS 3 3.8000 3/4 MS 3 4.5667 1/2 MS 3 4.7667 Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.
  69. 69. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 59 ONEWAY So_dot_than BY Nghiem_thuc /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN LSD DUNNETT (1) ALPHA(0.05). Oneway Descriptives So_dot_than N Mean Std. Deviation Std. Error 95% Confidence Interval for Mean Minimum MaximumLower Bound Upper Bound White 3 4.5667 .11547 .06667 4.2798 4.8535 4.50 4.70 1/2 MS 3 5.0333 .05774 .03333 4.8899 5.1768 5.00 5.10 3/4 MS 3 4.9667 .20817 .12019 4.4496 5.4838 4.80 5.20 MS 3 3.9333 .11547 .06667 3.6465 4.2202 3.80 4.00 Total 12 4.6250 .47122 .13603 4.3256 4.9244 3.80 5.20 Test of Homogeneity of Variances So_dot_than Levene Statistic df1 df2 Sig. 2.429 3 8 .140 ANOVA So_dot_than Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 2.296 3 .765 41.742 .000 Within Groups .147 8 .018 Total 2.443 11
  70. 70. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 60 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:So_dot_than (I) Nghiem _thuc (J) Nghiem _thuc Mean Difference (I-J) Std. Error Sig. 95% Confidence Interval Lower Bound Upper Bound LSD White 1/2 MS -.46667* .11055 .003 -.7216 -.2117 3/4 MS -.40000* .11055 .007 -.6549 -.1451 MS .63333* .11055 .000 .3784 .8883 1/2 MS White .46667* .11055 .003 .2117 .7216 3/4 MS .06667 .11055 .563 -.1883 .3216 MS 1.10000* .11055 .000 .8451 1.3549 3/4 MS White .40000* .11055 .007 .1451 .6549 1/2 MS -.06667 .11055 .563 -.3216 .1883 MS 1.03333* .11055 .000 .7784 1.2883 MS White -.63333* .11055 .000 -.8883 -.3784 1/2 MS -1.10000* .11055 .000 -1.3549 -.8451 3/4 MS -1.03333* .11055 .000 -1.2883 -.7784 Dunnett t (2-sided)a 1/2 MS White .46667* .11055 .007 .1483 .7850 3/4 MS White .40000* .11055 .017 .0816 .7184 MS White -.63333* .11055 .001 -.9517 -.3150 *. The mean difference is significant at the 0.05 level. a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it.
  71. 71. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 61 Homogeneous Subsets So_dot_than Nghiem_t huc N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 Duncana MS 3 3.9333 White 3 4.5667 3/4 MS 3 4.9667 1/2 MS 3 5.0333 Sig. 1.000 1.000 .563 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.
  72. 72. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 62 ONEWAY So_Choi BY Nghiem_thuc /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN LSD DUNNETT (1) ALPHA(0.05). Oneway Descriptives So_Choi N Mean Std. Deviation Std. Error 95% Confidence Interval for Mean Minimum MaximumLower Bound Upper Bound 0.0 Ki + 0.0 IBA 3 1.9333 .11547 .06667 1.6465 2.2202 1.80 2.00 0.1 Ki + 0.2 IBA 3 2.5000 .20000 .11547 2.0032 2.9968 2.30 2.70 0.5 Ki + 0.2 IBA 3 4.0333 .15275 .08819 3.6539 4.4128 3.90 4.20 1.0 Ki + 0.2 IBA 3 4.6033 .10504 .06064 4.3424 4.8643 4.50 4.71 2.0 Ki + 0.2 IBA 3 6.6567 .15044 .08686 6.2829 7.0304 6.50 6.80 3.0 Ki + 0.2 IBA 3 7.1667 .20817 .12019 6.6496 7.6838 7.00 7.40 Total 18 4.4822 2.00055 .47153 3.4874 5.4771 1.80 7.40 Test of Homogeneity of Variances So_Choi Levene Statistic df1 df2 Sig. .456 5 12 .802 ANOVA So_Choi Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 67.730 5 13.546 528.911 .000 Within Groups .307 12 .026 Total 68.037 17
  73. 73. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 63 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:So_Choi (I) Nghiem_thuc (J) Nghiem_thuc Mean Difference (I-J) Std. Error Sig. 95% Confidence Interval Lower Bound Upper Bound LSD 0.0 Ki + 0.0 IBA 0.1 Ki + 0.2 IBA -.56667* .13067 .001 -.8514 -.2820 0.5 Ki + 0.2 IBA -2.10000* .13067 .000 -2.3847 -1.8153 1.0 Ki + 0.2 IBA -2.67000* .13067 .000 -2.9547 -2.3853 2.0 Ki + 0.2 IBA -4.72333* .13067 .000 -5.0080 -4.4386 3.0 Ki + 0.2 IBA -5.23333* .13067 .000 -5.5180 -4.9486 0.1 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA .56667* .13067 .001 .2820 .8514 0.5 Ki + 0.2 IBA -1.53333* .13067 .000 -1.8180 -1.2486 1.0 Ki + 0.2 IBA -2.10333* .13067 .000 -2.3880 -1.8186 2.0 Ki + 0.2 IBA -4.15667* .13067 .000 -4.4414 -3.8720 3.0 Ki + 0.2 IBA -4.66667* .13067 .000 -4.9514 -4.3820 0.5 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 2.10000* .13067 .000 1.8153 2.3847 0.1 Ki + 0.2 IBA 1.53333* .13067 .000 1.2486 1.8180 1.0 Ki + 0.2 IBA -.57000* .13067 .001 -.8547 -.2853 2.0 Ki + 0.2 IBA -2.62333* .13067 .000 -2.9080 -2.3386 3.0 Ki + 0.2 IBA -3.13333* .13067 .000 -3.4180 -2.8486 1.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 2.67000* .13067 .000 2.3853 2.9547 0.1 Ki + 0.2 IBA 2.10333* .13067 .000 1.8186 2.3880 0.5 Ki + 0.2 IBA .57000* .13067 .001 .2853 .8547 2.0 Ki + 0.2 IBA -2.05333* .13067 .000 -2.3380 -1.7686
  74. 74. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 64 3.0 Ki + 0.2 IBA -2.56333* .13067 .000 -2.8480 -2.2786 2.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 4.72333* .13067 .000 4.4386 5.0080 0.1 Ki + 0.2 IBA 4.15667* .13067 .000 3.8720 4.4414 0.5 Ki + 0.2 IBA 2.62333* .13067 .000 2.3386 2.9080 1.0 Ki + 0.2 IBA 2.05333* .13067 .000 1.7686 2.3380 3.0 Ki + 0.2 IBA -.51000* .13067 .002 -.7947 -.2253 3.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 5.23333* .13067 .000 4.9486 5.5180 0.1 Ki + 0.2 IBA 4.66667* .13067 .000 4.3820 4.9514 0.5 Ki + 0.2 IBA 3.13333* .13067 .000 2.8486 3.4180 1.0 Ki + 0.2 IBA 2.56333* .13067 .000 2.2786 2.8480 2.0 Ki + 0.2 IBA .51000* .13067 .002 .2253 .7947 Dunnett t (2-sided)a 0.1 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA .56667* .13067 .004 .1876 .9458 0.5 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 2.10000* .13067 .000 1.7209 2.4791 1.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 2.67000* .13067 .000 2.2909 3.0491 2.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 4.72333* .13067 .000 4.3442 5.1024 3.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 5.23333* .13067 .000 4.8542 5.6124 *. The mean difference is significant at the 0.05 level. a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. Homogeneous Subsets So_Choi Nghiem_thuc N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 4 5 6 Duncana 0.0 Ki + 0.0 IBA 3 1.9333 0.1 Ki + 0.2 IBA 3 2.5000
  75. 75. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 65 0.5 Ki + 0.2 IBA 3 4.0333 1.0 Ki + 0.2 IBA 3 4.6033 2.0 Ki + 0.2 IBA 3 6.6567 3.0 Ki + 0.2 IBA 3 7.1667 Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.
  76. 76. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 66 ONEWAY Chieu_cao_choi BY Nghiem_thuc /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN LSD DUNNETT (1) ALPHA(0.05). Oneway [Descriptives Chieu_cao_choi N Mean Std. Deviation Std. Error 95% Confidence Interval for Mean Minimum MaximumLower Bound Upper Bound 0.0 Ki + 0.0 IBA 3 5.1667 .15275 .08819 4.7872 5.5461 5.00 5.30 0.1 Ki + 0.2 IBA 3 5.3333 .20817 .12019 4.8162 5.8504 5.10 5.50 0.5 Ki + 0.2 IBA 3 3.7333 .11547 .06667 3.4465 4.0202 3.60 3.80 1.0 Ki + 0.2 IBA 3 2.8667 .05774 .03333 2.7232 3.0101 2.80 2.90 2.0 Ki + 0.2 IBA 3 2.6333 .15275 .08819 2.2539 3.0128 2.50 2.80 3.0 Ki + 0.2 IBA 3 2.2000 .10000 .05774 1.9516 2.4484 2.10 2.30 Total 18 3.6556 1.25802 .29652 3.0300 4.2812 2.10 5.50 Test of Homogeneity of Variances Chieu_cao_choi Levene Statistic df1 df2 Sig. 1.247 5 12 .347 ANOVA Chieu_cao_choi Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 26.671 5 5.334 274.331 .000 Within Groups .233 12 .019
  77. 77. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 67 [Descriptives Chieu_cao_choi N Mean Std. Deviation Std. Error 95% Confidence Interval for Mean Minimum MaximumLower Bound Upper Bound 0.0 Ki + 0.0 IBA 3 5.1667 .15275 .08819 4.7872 5.5461 5.00 5.30 0.1 Ki + 0.2 IBA 3 5.3333 .20817 .12019 4.8162 5.8504 5.10 5.50 0.5 Ki + 0.2 IBA 3 3.7333 .11547 .06667 3.4465 4.0202 3.60 3.80 1.0 Ki + 0.2 IBA 3 2.8667 .05774 .03333 2.7232 3.0101 2.80 2.90 2.0 Ki + 0.2 IBA 3 2.6333 .15275 .08819 2.2539 3.0128 2.50 2.80 3.0 Ki + 0.2 IBA 3 2.2000 .10000 .05774 1.9516 2.4484 2.10 2.30 Total 26.904 17 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:Chieu_cao_choi (I) Nghiem_thuc (J) Nghiem_thuc Mean Difference (I-J) Std. Error Sig. 95% Confidence Interval Lower Bound Upper Bound LSD 0.0 Ki + 0.0 IBA 0.1 Ki + 0.2 IBA -.16667 .11386 .169 -.4147 .0814 0.5 Ki + 0.2 IBA 1.43333* .11386 .000 1.1853 1.6814 1.0 Ki + 0.2 IBA 2.30000* .11386 .000 2.0519 2.5481 2.0 Ki + 0.2 IBA 2.53333* .11386 .000 2.2853 2.7814 3.0 Ki + 0.2 IBA 2.96667* .11386 .000 2.7186 3.2147 0.1 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA .16667 .11386 .169 -.0814 .4147 0.5 Ki + 0.2 IBA 1.60000* .11386 .000 1.3519 1.8481
  78. 78. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 68 1.0 Ki + 0.2 IBA 2.46667* .11386 .000 2.2186 2.7147 2.0 Ki + 0.2 IBA 2.70000* .11386 .000 2.4519 2.9481 3.0 Ki + 0.2 IBA 3.13333* .11386 .000 2.8853 3.3814 0.5 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA -1.43333* .11386 .000 -1.6814 -1.1853 0.1 Ki + 0.2 IBA -1.60000* .11386 .000 -1.8481 -1.3519 1.0 Ki + 0.2 IBA .86667* .11386 .000 .6186 1.1147 2.0 Ki + 0.2 IBA 1.10000* .11386 .000 .8519 1.3481 3.0 Ki + 0.2 IBA 1.53333* .11386 .000 1.2853 1.7814 1.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA -2.30000* .11386 .000 -2.5481 -2.0519 0.1 Ki + 0.2 IBA -2.46667* .11386 .000 -2.7147 -2.2186 0.5 Ki + 0.2 IBA -.86667* .11386 .000 -1.1147 -.6186 2.0 Ki + 0.2 IBA .23333 .11386 .063 -.0147 .4814 3.0 Ki + 0.2 IBA .66667* .11386 .000 .4186 .9147 2.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA -2.53333* .11386 .000 -2.7814 -2.2853 0.1 Ki + 0.2 IBA -2.70000* .11386 .000 -2.9481 -2.4519 0.5 Ki + 0.2 IBA -1.10000* .11386 .000 -1.3481 -.8519 1.0 Ki + 0.2 IBA -.23333 .11386 .063 -.4814 .0147 3.0 Ki + 0.2 IBA .43333* .11386 .003 .1853 .6814 3.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA -2.96667* .11386 .000 -3.2147 -2.7186 0.1 Ki + 0.2 IBA -3.13333* .11386 .000 -3.3814 -2.8853 0.5 Ki + 0.2 IBA -1.53333* .11386 .000 -1.7814 -1.2853 1.0 Ki + 0.2 IBA -.66667* .11386 .000 -.9147 -.4186 2.0 Ki + 0.2 IBA -.43333* .11386 .003 -.6814 -.1853 Dunnett t (2-sided)a 0.1 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA .16667 .11386 .480 -.1637 .4970 0.5 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA -1.43333* .11386 .000 -1.7637 -1.1030
  79. 79. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 69 1.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA -2.30000* .11386 .000 -2.6303 -1.9697 2.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA -2.53333* .11386 .000 -2.8637 -2.2030 3.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA -2.96667* .11386 .000 -3.2970 -2.6363 *. The mean difference is significant at the 0.05 level. a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. Homogeneous Subsets Chieu_cao_choi Nghiem_thuc N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 4 Duncana 3.0 Ki + 0.2 IBA 3 2.2000 2.0 Ki + 0.2 IBA 3 2.6333 1.0 Ki + 0.2 IBA 3 2.8667 0.5 Ki + 0.2 IBA 3 3.7333 0.0 Ki + 0.0 IBA 3 5.1667 0.1 Ki + 0.2 IBA 3 5.3333 Sig. 1.000 .063 1.000 .169 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.
  80. 80. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 70 ONEWAY So_dot_than BY Nghiem_thuc /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN LSD DUNNETT (1) ALPHA(0.05). Oneway Descriptives So_dot_than N Mean Std. Deviation Std. Error 95% Confidence Interval for Mean Minimum MaximumLower Bound Upper Bound 0.0 Ki + 0.0 IBA 3 8.9667 .25166 .14530 8.3415 9.5918 8.70 9.20 0.1 Ki + 0.2 IBA 3 11.3333 .15275 .08819 10.9539 11.7128 11.20 11.50 0.5 Ki + 0.2 IBA 3 11.3667 .87369 .50442 9.1963 13.5370 10.40 12.10 1.0 Ki + 0.2 IBA 3 16.8667 .32146 .18559 16.0681 17.6652 16.50 17.10 2.0 Ki + 0.2 IBA 3 16.5667 1.83394 1.0588 3 12.0109 21.1224 14.50 18.00 3.0 Ki + 0.2 IBA 3 23.4000 1.35277 .78102 20.0395 26.7605 22.00 24.70 Total 18 14.7500 5.02819 1.1851 5 12.2495 17.2505 8.70 24.70 Test of Homogeneity of Variances So_dot_than Levene Statistic df1 df2 Sig. 3.735 5 12 .029
  81. 81. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 71 ANOVA So_dot_than Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 417.512 5 83.502 81.510 .000 Within Groups 12.293 12 1.024 Total 429.805 17 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:So_dot_than (I) Nghiem_thuc (J) Nghiem_thuc Mean Difference (I-J) Std. Error Sig. 95% Confidence Interval Lower Bound Upper Bound LSD 0.0 Ki + 0.0 IBA 0.1 Ki + 0.2 IBA -2.36667* .82642 .014 -4.1673 -.5661 0.5 Ki + 0.2 IBA -2.40000* .82642 .013 -4.2006 -.5994 1.0 Ki + 0.2 IBA -7.90000* .82642 .000 -9.7006 -6.0994 2.0 Ki + 0.2 IBA -7.60000* .82642 .000 -9.4006 -5.7994 3.0 Ki + 0.2 IBA -14.43333* .82642 .000 -16.2339 -12.6327 0.1 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 2.36667* .82642 .014 .5661 4.1673 0.5 Ki + 0.2 IBA -.03333 .82642 .968 -1.8339 1.7673 1.0 Ki + 0.2 IBA -5.53333* .82642 .000 -7.3339 -3.7327 2.0 Ki + 0.2 IBA -5.23333* .82642 .000 -7.0339 -3.4327 3.0 Ki + 0.2 IBA -12.06667* .82642 .000 -13.8673 -10.2661
  82. 82. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 72 0.5 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 2.40000* .82642 .013 .5994 4.2006 0.1 Ki + 0.2 IBA .03333 .82642 .968 -1.7673 1.8339 1.0 Ki + 0.2 IBA -5.50000* .82642 .000 -7.3006 -3.6994 2.0 Ki + 0.2 IBA -5.20000* .82642 .000 -7.0006 -3.3994 3.0 Ki + 0.2 IBA -12.03333* .82642 .000 -13.8339 -10.2327 1.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 7.90000* .82642 .000 6.0994 9.7006 0.1 Ki + 0.2 IBA 5.53333* .82642 .000 3.7327 7.3339 0.5 Ki + 0.2 IBA 5.50000* .82642 .000 3.6994 7.3006 2.0 Ki + 0.2 IBA .30000 .82642 .723 -1.5006 2.1006 3.0 Ki + 0.2 IBA -6.53333* .82642 .000 -8.3339 -4.7327 2.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 7.60000* .82642 .000 5.7994 9.4006 0.1 Ki + 0.2 IBA 5.23333* .82642 .000 3.4327 7.0339 0.5 Ki + 0.2 IBA 5.20000* .82642 .000 3.3994 7.0006 1.0 Ki + 0.2 IBA -.30000 .82642 .723 -2.1006 1.5006 3.0 Ki + 0.2 IBA -6.83333* .82642 .000 -8.6339 -5.0327 3.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 14.43333* .82642 .000 12.6327 16.2339 0.1 Ki + 0.2 IBA 12.06667* .82642 .000 10.2661 13.8673 0.5 Ki + 0.2 IBA 12.03333* .82642 .000 10.2327 13.8339 1.0 Ki + 0.2 IBA 6.53333* .82642 .000 4.7327 8.3339 2.0 Ki + 0.2 IBA 6.83333* .82642 .000 5.0327 8.6339 Dunnett t (2- sided)a 0.1 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 2.36667 .82642 .053 -.0310 4.7643 0.5 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 2.40000* .82642 .050 .0024 4.7976 1.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 7.90000* .82642 .000 5.5024 10.2976 2.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 7.60000* .82642 .000 5.2024 9.9976 3.0 Ki + 0.2 IBA 0.0 Ki + 0.0 IBA 14.43333* .82642 .000 12.0357 16.8310
  83. 83. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 73 *. The mean difference is significant at the 0.05 level. a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. Homogeneous Subsets So_dot_than Nghiem_thuc N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 4 Duncana 0.0 Ki + 0.0 IBA 3 8.9667 0.1 Ki + 0.2 IBA 3 11.3333 0.5 Ki + 0.2 IBA 3 11.3667 2.0 Ki + 0.2 IBA 3 16.5667 1.0 Ki + 0.2 IBA 3 16.8667 3.0 Ki + 0.2 IBA 3 23.4000 Sig. 1.000 .968 .723 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.
  84. 84. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 74 ONEWAY So_choi BY Nghiem_thuc /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN LSD DUNNETT (1) ALPHA(0.05). Oneway Descriptives So_choi N Mean Std. Deviation Std. Error 95% Confidence Interval for Mean Minimum MaximumLower Bound Upper Bound 0.0 Ki + 0.0 NAA 3 1.9333 .11547 .06667 1.6465 2.2202 1.80 2.00 0.1 Ki + 0.2 NAA 3 3.3700 .09849 .05686 3.1253 3.6147 3.26 3.45 0.5 Ki + 0.2 NAA 3 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00 1.0 Ki + 0.2 NAA 3 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00 2.0 Ki + 0.2 NAA 3 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00 3.0 Ki + 0.2 NAA 3 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00 Total 18 .8839 1.35619 .31966 .2095 1.5583 .00 3.45 Test of Homogeneity of Variances So_choi Levene Statistic df1 df2 Sig. 10.278 5 12 .001
  85. 85. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum Trang 75 ANOVA So_choi Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 31.221 5 6.244 1.627E3 .000 Within Groups .046 12 .004 Total 31.267 17 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:So_choi (I) Nghiem_thuc (J) Nghiem_thuc Mean Difference (I-J) Std. Error Sig. 95% Confidence Interval Lower Bound Upper Bound LSD 0.0 Ki + 0.0 NAA 0.1 Ki + 0.2 NAA -1.43667* .05059 .000 -1.5469 -1.3264 0.5 Ki + 0.2 NAA 1.93333* .05059 .000 1.8231 2.0436 1.0 Ki + 0.2 NAA 1.93333* .05059 .000 1.8231 2.0436 2.0 Ki + 0.2 NAA 1.93333* .05059 .000 1.8231 2.0436 3.0 Ki + 0.2 NAA 1.93333* .05059 .000 1.8231 2.0436 0.1 Ki + 0.2 NAA 0.0 Ki + 0.0 NAA 1.43667* .05059 .000 1.3264 1.5469 0.5 Ki + 0.2 NAA 3.37000* .05059 .000 3.2598 3.4802 1.0 Ki + 0.2 NAA 3.37000* .05059 .000 3.2598 3.4802 2.0 Ki + 0.2 NAA 3.37000* .05059 .000 3.2598 3.4802

×