Download luận văn thạc sĩ ngành hóa phân tích với đề tài: Tinh chế và phân tích đặc tính liên kết O-glycan của lectin từ rong đỏ Hydropuntia eucheumatoides, cho các bạn tham khảo Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620 Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://baocaothuctap.net

1. LỜI CẢM ƠN
Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Đình Hùng -
Trƣởng phòng Công nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng
Công nghệ Nha Trang, ngƣời đã giúp tôi chọn đề tài và tận tình hƣớng dẫn,
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Và tôi cũng xin chân
thành cảm ơn Ths Đinh Thành Trung - Phòng Công nghệ sinh học biển - Viện
Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, ngƣời đã giúp tôi hoàn thành
tốt phần thực nghiệm của mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công
nghệ, Phòng Đào tạo, Khoa Hóa học và Quý Thầy Cô giáo đã dạy dỗ và tạo
mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn cũng nhƣ hoàn thành mọi
thủ tục cần thiết.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng
Công nghệ Nha Trang đã giúp đỡ và tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho tôi thực
hiện luận văn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô giáo Viện Nghiên cứu và
Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, Trƣờng Đại học Nha Trang, Trƣờng Đại
học Khánh Hòa đã dạy dỗ, cung cấp nhiều kiến thức bổ ích và tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập.
Và cuối cùng, tôi xin cảm ơn Sở Giáo dục và Đào tạo Tỉnh Khánh Hòa,
Trƣờng THPT Chuyên Lê Quý Đôn – Nha Trang đã tạo điều kiện để tôi có
thể hoàn thành khóa học sau đại học tại Học viện Khoa học và Công nghệ.
Xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, ngày 09 tháng 09 năm 2019
Học viên
Trần Thị Hải Yến

2. LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng
dẫn, chỉ bảo của Thầy hƣớng dẫn và sự giúp đỡ của cán bộ phòng Công nghệ
sinh học biển - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang. Các số
liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên.
Nha Trang, ngày 09 tháng 09 năm 2019
Học viên
Trần Thị Hải Yến

3. 1
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỞ ĐẦU .......................................................................................................9
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................ 12
1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN........................................................ 12
1.2. TỔNG QUAN VỀ LECTIN............................................................... 14
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu lectin ............................................................. 14
1.2.2. Sự phân bố lectin trong sinh giới.................................................. 16
1.2.3. Vai trò sinh học của lectin ............................................................ 18
1.3. LECTIN TỪ RONG BIỂN................................................................. 19
1.3.1. Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trên thế giới .................. 19
1.3.1.1. Các phƣơng pháp tinh chế lectin từ rong biển......................... 19
1.3.1.2. Đặc tính liên kết carbohydrate của lectin................................ 21
1.3.1.3. Điểm đẳng điện và hàm lƣợng acid amin của lectin từ rong
biển. .................................................................................................... 23
1.3.1.4. Ảnh hƣởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính của lectin từ rong
biển. .................................................................................................... 24
1.3.1.5. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt tính của lectin rong biển
............................................................................................................ 25
1.3.1.6. Hàm lƣợng carbohydrate trong lectin từ rong biển.................. 25
1.3.1.7. Trọng lƣợng phân tử của lectin từ rong biển........................... 25
1.3.1.8. Cấu trúc của lectin từ rong biển.............................................. 26
1.3.1.9. Ứng dụng của lectin từ rong biển............................................ 29
1.3.2. Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trong nƣớc.................... 32

4. 2
1.4. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TINH CHẾ LECTIN .............................. 33
1.4.1. Sắc ký trao đổi ion........................................................................ 33
1.4.2. Sắc ký lọc gel ............................................................................... 33
1.4.3. Sắc ký ái lực................................................................................. 34
1.5. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ PROTEIN
DỰA VÀO PHỔ KHỐI LƢỢNG.............................................................. 35
1.5.1. Nguyên tắc chung......................................................................... 35
1.5.2. Phƣơng pháp xác định phân tử khối của protein ........................... 36
1.6. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ AXIT AMIN TRONG
LECTIN.................................................................................................... 36
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 39
2.1. VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU................. 39
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU. 40
2.2.1. Nguyên vật liệu ............................................................................ 40
2.2.2. Hóa chất ....................................................................................... 40
2.2.3. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu................................................ 41
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................... 42
2.3.1. Chuẩn bị huyền phù hồng cầu máu 2 % (hồng cầu máu thỏ, cừu, gà
và các nhóm máu ngƣời A, B, O) :......................................................... 42
2.3.2. Phân tích hoạt tính lectin bằng phƣơng pháp ngƣng kết hồng cầu
(hồng cầu máu thỏ, cừu, gà và các nhóm máu ngƣời A, B, O)................ 43
2.3.3. Xác định hàm lƣợng protein. ........................................................ 44
2.3.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thực nghiệm:............................................ 46
2.3.5. Phân tích các điều kiện tối ƣu để chiết lectin từ rong đỏ H.
eucheumatoides...................................................................................... 47
2.3.5.1. Phân tích tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết ............................. 48

5. 3
2.3.5.2. Phân tích nồng độ ethanol chiết.............................................. 48
2.3.5.3. Phân tích thời gian chiết ......................................................... 48
2.3.6. Phân tích nồng độ ethanol thích hợp để kết tủa lectin từ dịch chiết.
............................................................................................................... 49
2.3.7. Tinh sạch lectin bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion DEAE-
Sepharose............................................................................................... 50
2.3.8. Tinh sạch lectin bằng phƣơng pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S –
200 ........................................................................................................ 51
2.3.9. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối lƣợng phân tử lectin bằng
phƣơng pháp điện di SDS-PAGE ........................................................... 52
2.3.10. Phƣơng pháp phân tích ảnh hƣởng các đặc tính lý, hóa đến lectin
từ rong đỏ H. eucheumatoides................................................................ 56
2.3.10.1. Phƣơng pháp phân tích ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính
ngƣng kết hồng cầu............................................................................. 57
2.3.10.2. Phƣơng pháp phân tích ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính ngƣng
kết hồng cầu........................................................................................ 57
2.3.10.3. Phƣơng pháp phân tích ảnh hƣởng của cation hóa trị 2, EDTA
đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu........................................................ 58
2.3.10.4. Phƣơng pháp phân tích đặc tính liên kết carbohydrate của
lectin ................................................................................................... 58
2.3.11. Điều chế porcine stomach mucin đƣợc xử lý enzyme trypsin ..... 60
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 61
3.1. PHÂN TÍCH HOẠT TÍNH NGƢNG KẾT HỒNG CẦU THỎ, CỪU,
GÀ VÀ CÁC NHÓM MÁU NGƢỜI A, B, O VỚI DỊCH CHIẾT TỪ
RONG ĐỎ H. eucheumatoides ................................................................. 61
3.2. PHÂN TÍCH CÁC ĐIỀU KIỆN ĐỂ CHIẾT LECTIN TỪ RONG H.
eucheumatoides......................................................................................... 61

6. 4
3.2.1. Tỷ lệ nguyên liệu và dung môi chiết............................................. 61
3.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến quá trình chiết..................... 63
3.2.3. Ảnh hƣởng của thời gian chiết...................................................... 64
3.3. TINH CHẾ LECTIN .......................................................................... 65
3.3.1. Phân tích nồng độ ethanol thích hợp để kết tủa lectin ................... 65
3.3.2. Tinh sạch lectin bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose ......... 67
3.3.3. Tinh sạch lectin bằng sắc ký lọc gel Sephacryl S - 200................. 68
3.3.4. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định trọng lƣợng phân tử lectin bằng
phƣơng pháp điện di SDS-PAGE ........................................................... 69
3.3.5. Kết quả tổng hợp quá trình tinh sạch lectin từ rong đỏ H.
eucheumatoides...................................................................................... 71
3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH LÝ, HÓA CỦA LECTIN TỪ
RONG ĐỎ H. eucheumatoides ................................................................. 72
3.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của
lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides. ..................................................... 72
3.4.2. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin từ
rong đỏ H. eucheumatoides.................................................................... 74
3.4.3. Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của
lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides. ..................................................... 75
3.4.4. Phân tích khả năng liên kết carbohydrate của lectin từ rong đỏ H.
eucheumatoides...................................................................................... 76
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................ 88
4.1. KẾT LUẬN........................................................................................ 88
4.2. KIẾN NGHỊ....................................................................................... 88
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................ 89

7. 5
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
HC Hồng cầu
HTR Hoạt tính riêng
HTTS Hoạt tính tổng số
NKHC Ngƣng kết hồng cầu
OD Optical Density Mật độ quang
PBS Phosphate Buffered Saline Đệm muối photphat

8. 6
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Sự phân bố của lectin trong sinh giới........................................... 17
Bảng 1.2. Một số phƣơng pháp tinh chế lectin từ rong biển.......................... 19
Bảng 2.1. Các thiết bị chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ........................ 41
Bảng 2.2. Các loại đƣờng đơn và glycoprotein sử dụng để khảo sát đặc tính
liên kết carbohydrate của lectin .................................................................... 59
Bảng 3.1. Phân tích hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của dịch chiết thô từ rong
đỏ H. eucheumatoides với các dạng hồng cầu khác nhau............................. 61
Bảng 3.2. Kết quả tinh sạch lectin từ 300 gam rong thô H. eucheumatoides. 71
Bảng 3.3. Kết quả thí nghiệm ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt tính ngƣng
kết hồng cầu của lectin từ rong H. eucheumatoide........................................ 75
Bảng 3.4. Nồng độ đƣờng và glycoprotein nhỏ nhất có khả năng ức chế hoạt
tính ngƣng kết hồng cầu của lectin từ rong H. eucheumatoides .................... 79
Bảng 3.5. Khả năng ức chế đƣờng và glycoprotein của lectin từ rong đỏ và
rong lục. ....................................................................................................... 85

9. 7
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc bậc 1 của các lectin từ rong đỏ EDA-1 và EDA-2 từ rong
Eucheuma denticulatum; ESA-2 từ rong Eucheuma serra; KSA-1 và KSA-2
từ rong Kappaphycus striatum, KAA-1 và KAA-2 từ rong Kappaphycus
alvarezii , SfL-1 và SfL-2 từ rong Solieria filiformis ................................... 27
Hình 1.2. Cấu trúc Man9GlcNAc2................................................................. 28
Hình 1.3. Cấu trúc lõi của Man3GlcNAc2 ..................................................... 28
Hình 1.4. Cấu trúc của lectin từ rong đỏ, carrageenophytes.......................... 29
Hình 1.5. Biểu đồ thể hiện ứng dụng y sinh của lectin từ rong biển.............. 30
Hình 2.1. Hình ảnh rong Hydropuntia eucheumatoides................................ 39
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của tỷ lệ dung môi chiết:nguyên liệu
đến hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng của lectin........................................ 62
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến hoạt tính tổng
số và hoạt tính riêng của quá trình chiết lectin.............................................. 63
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của thời gian chiết (giờ) đến hoạt tính
tổng số và hoạt tính riêng của lectin. ............................................................ 64
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến khả năng kết
tủa lectin....................................................................................................... 65
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự tƣơng quan giữa giá trị A280nm và hoạt tính
ngƣng kết hồng cầu theo thứ tự các phân đoạn trong quá trình sắc ký trao đổi
ion DEAE – Sepharose................................................................................. 67
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn A280nm và hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của các
phân đoạn trong quá trình sắc ký lọc gel Sephacryl S-200............................ 68
Hình 3.7. Kết quả điện di lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides.................... 69
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin
từ rong đỏ H. eucheumatoides...................................................................... 73

10. 8
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin từ
rong đỏ H. eucheumatoides. ......................................................................... 74
Hình 3.10. Các dạng cấu trúc lõi mở rộng của O-glycan. ........................... 77
Hình 3.11. Các dạng cấu trúc N-glycan. . ..................................................... 78
Hình 3.12. Cấu trúc của một số đƣờng đơn. ................................................. 82
Hình 3.13. Cấu trúc của Fetuin và Asialofetuin............................................ 82
Hình 3.14. Cấu trúc của yeast mannan, porcine thyroglobulin và porcine
stomach mucin.. ........................................................................................... 84

11. 9
MỞ ĐẦU
Lectin có bản chất là protein hoặc glycoprotein có nguồn gốc không
miễn dịch và có mặt khắp nơi trong tự nhiên từ vi khuẩn đến động vật. Lectin
có khả năng liên kết với các monosaccharide, oligosaccharide và glycoprotein
đặc hiệu trên bề mặt tế bào hồng cầu và ngƣng kết hồng cầu, mà không làm
thay đổi tính chất của carbohydrate. Khả năng sử dụng lectin phụ thuộc chủ
yếu vào đặc tính liên kết carbohydrate của chúng. Hàm lƣợng lectin thay đổi
phụ thuộc vào các nguồn sinh vật khác nhau. Hiện tại, một số lƣợng lớn lectin
từ các nguồn sinh vật khác nhau đã đƣợc tinh chế. Thêm vào đó, lectin tái tổ
hợp cũng đã đƣợc sản xuất đối với một số mẫu sinh vật có sinh khối nhỏ [1].
Do khả năng có thể phân biệt sự khác nhau trong các cấu trúc carbohydrate,
lectin không chỉ đƣợc dùng cũng nhƣ thuốc thử hóa sinh trong nhiều lĩnh vực
nghiên cứu, bao gồm glycomic, mà còn đang hứa hẹn sử dụng trong các liệu
pháp chữa bệnh kháng virus và ung thƣ và cây trồng chuyển đổi gen [2].
Nguồn lợi sinh vật biển bao gồm vi tảo, rong biển, động vật không
xƣơng sống, cá, vi khuẩn, nấm và virus đã cung cấp một số lƣợng lớn các
phân tử hoạt tính sinh học tự nhiên đặc hiệu nhƣ thuốc kháng vi khuẩn, kháng
virus HIV, kháng virus cúm, kháng ung thƣ và thuốc chữa bệnh Alzheimer [3,
4]. Trong số đó, lectin là một trong số nhóm hợp chất nổi bật nhất cho sử
dụng làm thuốc chữa bệnh, bởi vì chúng có thể nhận biết các cấu trúc
carbohydrate khác nhau trong proteoglycan, glycoprotein và glycolipid, kết
quả là chúng có thể điều chỉnh các tế bào thông qua sự hình thành glyco liên
hợp và ngăn chặn sự tƣơng tác giữa tác nhân gây bệnh với vật chủ qua liên
kết với các cấu trúc oligosaccharide trên bề mặt của tác nhân gây bệnh [5].
Lectin từ rong biển đã cho thấy sự đa dạng trong hoạt tính sinh học nhƣ
lectin từ rong đỏ Eucheuma serra đã cho thấy hoạt tính phân bào trong cả hai
lympho bào ngƣời và chuột [6], hoạt tính kháng các chất gây ung thƣ [7], hoạt
tính kháng virus HIV [8] và hoạt tính kháng virus cúm [9], lectin KAA-2 từ
rong Kappaphycus alvarezii đã có hoạt tính ức chế mạnh sự lây nhiễm của
các dòng virus cúm (H1N1 và H3N2) với nồng độ nanomol [10, 11], và lectin

12. 10
BCA từ rong lục Boodlea coacta cũng đã cho thấy hoạt tính mạnh kháng lại
virus HIV và virus cúm H1N1 [12]. Vì vậy rong biển hứa hẹn sẽ là nguồn
lectin giá trị cho sử dụng trong y sinh để làm thuốc kháng ung thƣ và virus
trong tƣơng lai.
Việt Nam với chiều dài bờ biển khoảng 3.260 km, ở đó có một hệ thực
vật rong biển đa dạng với khoảng 1000 mẫu đƣợc dự đoán, trong đó 639 mẫu
đã xác định. Đó là nguồn sinh vật biển phong phú để nghiên cứu và khai thác
sử dụng lectin trong hóa sinh, y sinh hoặc trong thực phẩm chức năng để
phòng ngừa bệnh trong tƣơng lai. Tuy nhiên, các nghiên cứu về lectin từ rong
biển ở nƣớc ta chƣa đƣợc công bố nhiều, ngoại trừ một vài công bố về lectin
rong biển [13, 14, 15, 16, 17, 18]. Rong đỏ Hydropuntia eucheumatoides là
một trong số loài rong đƣợc dùng để sản xuất agar trên thế giới và Việt Nam,
ở nƣớc ta rong này đƣợc thu hoạch tự nhiên ở Nha Trang và Ninh Thuận, và
cho đến hiện tại chƣa có bất kì công bố nào về lectin từ loài rong này. Trên cơ
sở đó tôi tiến hành thực hiện đề tài “Tinh chế và phân tích đặc tính liên kết
O-glycan của lectin từ rong đỏ Hydropuntia eucheumatoides” với mục
đích không chỉ bổ sung thêm về số liệu lectin từ nguồn rong biển Việt Nam,
mà còn hƣớng đến sử dụng lectin trong y học.
Mục tiêu nghiên cứu:
Phân tích các đặc tính của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides hƣớng
đến đánh giá khả năng khai thác và sử dụng chúng trong hóa sinh, y sinh và
dƣợc liệu phòng trị bệnh.
Nội dung nghiên cứu:
+ Tinh chế lectin từ rong đỏ H.s eucheumatoides bằng phƣơng pháp
sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel.
+ Phân tích tính chất của lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides, bao
gồm:
* Phân tích đặc tính liên kết O-glycan bằng phƣơng pháp ức chế sự
ngƣng kết hồng cầu.

13. 11
* Xác định khối lƣợng phân tử lectin từ rong đỏ H. eucheumatoides
bằng phƣơng pháp điện di SDS-PAGE.
* Phân tích khả năng bền nhiệt, ảnh hƣởng của pH, cation hóa trị 2 và
EDTA đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của lectin từ rong đỏ H.
eucheumatoides.

14. 12
1CHƢƠNG 1. T NG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN
Rong biển có vai trò quan trọng đối với hệ sinh thái biển và đời sống
của con ngƣời. Ngoài giá trị về môi trƣờng, sinh thái nhƣ tham gia vào các
chu trình dinh dƣỡng của thủy vực, là nơi sống, trú ẩn, kiếm ăn của nhiều loài
sinh vật biển nhất là thời kỳ cây non, rong biển còn có giá trị lớn đối với đời
sống con ngƣời nhƣ cung cấp nguyên liệu cho các ngành công nghiệp chế
biến (chiết xuất keo agar, alginat, carrageenan, fucoidan…), làm thực phẩm,
thuốc chữa bệnh….
Rong biển là món quà thiên nhiên quý giá rất giàu chất dinh dƣỡng.
Trong các phƣơng pháp dƣỡng sinh của nhiều dân tộc trên thế giới, rong biển
đƣợc coi là thức ăn tạo sự dẻo dai, khỏe mạnh về thể chất và tinh thần cho con
ngƣời. Rong biển khô rất giàu chất bột, chất xơ, đạm và chất khoáng. Phân
tích giá trị thành phần dinh dƣỡng của rong biển cho thấy hàm lƣợng vitamin
A trong rong biển cao gấp 2 - 3 lần so với cà rốt, hàm lƣợng canxi cao gấp 3
lần so với sữa bò, vitamin B2 cao gấp 4 lần trong trứng. Theo nhiều nghiên
cứu tại Nhật Bản, trong rong biển chứa hàm lƣợng iốt khá cao. Trong đó, hàm
lƣợng iốt cao nhất đƣợc tìm thấy trong rong nâu, tiếp sau rong đỏ và rong lục,
khoảng 100 - 300 ppm trong rong biển khô. Ngoài ra, trong rong biển chứa
một lƣợng chất khoáng rất phong phú, có tác dụng điều tiết máu lƣu thông,
tiêu độc, loại bỏ các cặn bã có trong cơ thể; thêm vào đó, nó còn là chất
không thể thiếu của tuyến giáp, nơi tiết ra hooc-môn sinh trƣởng, giúp cơ thể
phát triển [19].
Từ thế kỷ thứ 18, rong biển đã đƣợc sử dụng phổ biến tại Nhật Bản, về
sau có các quốc gia châu Á nhƣ Trung Quốc, Hàn Quốc, Malaysia, Philippin.
Do đó, ngành rong biển ở các quốc gia này rất phát triển. Trong những năm
gần đây, do có sự giao lƣu văn hóa giữa các nƣớc, ngƣời Việt cũng bắt đầu
quan tâm đến rong biển. Việt Nam là một trong những nƣớc có tiềm năng để

15. 13
phát triển ngành rong biển, với bờ biển dài 3.260 km và diện tích mặt nƣớc
khoảng một triệu km2
, đặc biệt là khu vực miền Trung có bờ biển đá và dải
biến thiên nhiệt độ hẹp. Tại Việt Nam đã xác định đƣợc 800 loài rong biển
thuộc 4 ngành, trong đó, ngành rong đỏ chiếm hơn 400 loại, ngành rong lục
chiếm 180 loại, ngành rong nâu hơn 140 loại và ngành rong lam gần 100 loại;
và trong số hơn 800 loài thì ở vùng biển nƣớc ta có 90 loài mang lại giá trị
kinh tế; hiện nay có 7 loài rong kinh tế (rong nho, rong câu chỉ vàng, rong câu
thắt, rong câu cƣớc, rong sụn, rong bắp sú, rong sụn gai) đang đƣợc trồng phổ
biến ở Việt Nam.
Ngày nay, xuất phát từ nhu cầu nâng cao chất lƣợng cuộc sống, các nhà
khoa học đã và đang nghiên cứu chuyển nguồn rong biển thành các sản phẩm
có giá trị nhƣ: phlorotannin từ rong nâu Sargassum có khả năng chống gốc tự
do mạnh gấp 5 lần so với catechin trong trà xanh [20]; hợp chất carrageenan
trong rong biển đƣợc tách chiết và sử dụng làm chất phụ gia trong công nghệ
thực phẩm, dùng làm phụ gia chế biến và bảo quản thực phẩm [21], đƣợc bổ
sung vào bia rƣợu làm tăng độ trong, dùng trong sản xuất bánh pudding, kem,
phomat, ngoài ra, carrageenan có khả năng liên kết với protein qua gốc amin
nên nó đƣợc sử dụng trong công nghiệp sữa với vai trò làm cho các sản phẩm
sữa có độ ổn định khá cao, tạo nhũ tƣơng, chống tách lỏng mà không cần
dùng đến tinh bột và lòng trắng trứng [22]. Trong Y học, rong biển cũng đƣợc
sử dụng nhƣ một nguồn dƣợc liệu quý. Các hợp chất đƣợc tách chiết từ rong
biển đã có những tác dụng trong phòng ngừa các bệnh. Chẳng hạn: theo
Nghiên cứu đăng trên Thƣ viện y khoa quốc gia Mỹ cho thấy Fucoidan từ
rong nâu giúp tăng miễn dịch, góp phần làm chậm sự phát triển của khối u
thực tràng và ung thƣ vú; ngoài ra, chúng góp phần hỗ trợ chống viêm, giảm
đau khớp, hỗ trợ giảm tác dụng phụ của hóa, xạ trị.

16. 14
Bên cạnh những hiệu quả về kinh tế, rong biển còn góp phần giảm khí
thải nhà kính, làm sạch môi trƣờng, hấp thụ kim loại nặng tại các vùng biển ô
nhiễm, nuôi trồng thủy sản [19].
1.2. TỔNG QUAN VỀ LECTIN
1.2.1. Lịch s nghi n cứu ectin
Vào những năm cuối thế kỉ 19 con ngƣời đã bắt đầu có những bằng
chứng đầu tiên về một loại protein có khả năng gây ngƣng kết hồng cầu, dạng
protein này đƣợc tìm thấy nhiều trong các loại hạt, và tại thời điểm này các
nghiên cứu tập trung chủ yếu vào làm sáng tỏ nguyên lý gây độc của dạng
protein này. Đến năm 1884, Warden và Waddel đã giải thích đƣợc nguyên lý
gây độc của các hạt Aprus precatorius. Năm 1887, Dixson đã xác định đƣợc
một dịch lỏng có độc tố, đƣợc tách chiết từ hạt thầu dầu Ricinus precatorius là
một protein, vì những protein này đƣợc tìm thấy trong các mẫu chiết từ thực
vật nên chúng đã đƣợc đề cập dƣới tên gọi là hemagglutinin hay agglutinin
thực vật (phytoagglutinin). Peter Hermann Stillmark là ngƣời đầu tiên mô tả
đầy đủ về lectin trong luận án tiến sĩ vào năm 1888 ở Đại học Dorpat (một
trong những trƣờng đại học lâu đời nhất dƣới thời nƣớc Nga Sa Hoàng, nay là
Tartu, Estonia,). Stillmrak đã phân lập và tách chiết đƣợc ricin, một
chất hemagglutinin cực độc từ hạt của cây thầu dầu (Ricinus communis) [23].
Sau đó H. Hellin, cũng ở Đại học Tartu cho thấy sự hiện diện của một
hemagglutinin độc, gọi là abrin ở mẫu chiết của cây đậu Abrus precatorius.
Ricin và abrin đƣợc sử dụng để làm mô hình kháng nguyên cho các nghiên
cứu miễn dịch. Mặc dù các mẫu ông nghiên cứu khá thô so với các tiêu chí
hiện nay (ricin và abrin mỗi loại đều chứa một chất ngƣng kết yếu nhƣng có
độc tính mạnh và một chất độc yếu nhƣng có tính ngƣng kết mạnh, tất cả đều
đặc hiệu với galactose) nhƣng đó là nền tảng để xây dựng nguyên lý cơ bản
về miễn dịch học vào những năm 1890. Cũng chính Ehrlich phát hiện ra rằng
chuột đƣợc miễn dịch với ricin hoặc abrin ở liều dƣới ngƣỡng gây chết đã
giúp cho chuột có khả năng kháng lại ricin và abrin. Kết quả này cung cấp
bằng chứng rõ ràng cho tính đặc hiệu của các đáp ứng miễn dịch. Ehrlich

17. 15
cũng chứng tỏ đƣợc rằng tính miễn dịch đối với các độc tố đƣợc truyền từ mẹ
sang con bằng đƣờng máu trong quá trình mang thai và trong quá trình cho
con bú sau khi sinh. Bằng cách nghiên cứu hiệu ứng ức chế của huyết thanh
kháng ricin, ông đã chứng minh đƣợc rằng có một mối quan hệ định lƣợng
giữa lƣợng kháng huyết thanh và lƣợng kháng nguyên mà nó có thể trung hoà
và dựa trên cơ sở này để thực hiện việc định lƣợng đầu tiên đối với kháng thể
trong cơ thể sống. Những nghiên cứu này đã chứng minh tính đặc hiệu của
đáp ứng miễn dịch, hiện tƣợng ghi nhớ miễn dịch và sự truyền miễn dịch thể
dịch từ mẹ sang con.
Những kết quả ban đầu của Stillmark cũng đã nói lên một phần tính đặc
hiệu của hiện tƣợng ngƣng kết bởi ricin đối với hồng cầu của các động vật
khác nhau. Sự quan sát này đƣợc củng cố và mở rộng thêm bởi Karl
Landsteiner ở đại học Vienna, ngƣời khám phá ra các nhóm máu ngƣời A, B
và O vào năm 1900. Gần một thập kỷ sau ông đã công bố các hoạt tính ngƣng
kết của các chất chiết từ các hạt khác nhau thì khác nhau khi thử nghiệm trên
hồng cầu của các động vật khác nhau [24]. Vì tính đặc hiệu này, Landsteiner
kết luận rằng hoạt tính ngƣng kết có nguồn gốc thực vật này “về cơ bản giống
nhƣ kháng nguyên”. Vì vậy ông đã sử dụng những protein này để minh họa
cho khái niệm tính đặc hiệu trong chƣơng mở đầu của cuốn sách kinh điển
“Tính đặc hiệu của các phản ứng huyết thanh” năm 1936.
Năm 1919, James B. Summer ở đại học Cornell (Ithaca, New York), là
ngƣời đầu tiên tinh sạch lectin từ đậu rựa (Canavalia ensiformis) và sau đó đặt
tên là concanavalin A. Vào những năm 1940, Boyd và Karl cũng đã mô tả về
tính đặc hiệu của lectin ở đậu lima (Phaseolus limensis) và đậu tằm (Vicia
cracca) với loại đƣờng khác nhau và đƣa ra bằng chứng về tính đặc hiệu với
hồng cầu các nhóm máu A, B và O của lectin và khẳng định sự hiện diện của
các phân tử đƣờng khác nhau trên bề mặt hồng cầu.

18. 16
Khả năng phân biệt hồng cầu giữa các nhóm máu khác nhau của các
agglutinin từ thực vật đã đƣa đến đề xuất cho chúng một cái tên là lectin, từ
tiếng Latin legere, có nghĩa là chọn lọc [25]. Thuật ngữ này đƣợc tổng quát
hóa để bao gồm tất cả các agglutinin đặc hiệu với các phân tử đƣờng không
có nguồn gốc miễn dịch, bất kể chúng có nguồn gốc từ đâu hoặc đặc hiệu với
các nhóm máu nhƣ thế nào.
Lectin thực vật đƣợc nghiên cứu rộng rãi theo hƣớng điều tra và thăm
dò tính đặc hiệu cho đến những năm đầu của thập kỷ 70. Ở thời điểm đó
ngƣời ta đã nghiên cứu rất nhiều lectin, chủ yếu tập trung ở họ đậu. Các lectin
động vật ít thu hút sự chú ý và chỉ có một số nghiên cứu về lectin ở chạch, sên
và cua móng ngựa là đƣợc nghiên cứu kỹ. Lectin quan trọng nhất ở động vật
đƣợc khám phá chính là thụ thể asialoglycoprotein trong gan động vật có vú,
mà nó đặc hiệu với galactose [26]. Thụ thể này tham gia vào quá trình nhận
diện và loại bỏ các glycoprotein lão hóa trong máu, qua đó kiểm soát chu
trình sống của các glycoprotein trong máu.
Cấu trúc của lectin đƣợc bắt đầu nghiên cứu vào những năm của thập
kỷ 70 nhƣng phát triển chậm cho đến khi kỹ thuật tái tổ hợp ra đời. Ngày nay
ngƣời ta có thể tiến hành giải trình tự của lectin rồi giải đoán cấu trúc bậc ba
của nó dựa trên tính tƣơng đồng của các lectin cùng họ. Tuy nhiên nhiều
lectin đã đƣợc giải cấu trúc bậc ba mà không cần thông qua trình tự bậc một
nhờ vào kỹ thuật chụp ảnh tinh thể tia X. Hiện nay đã có tới hơn 200 lectin
đƣợc giải đoán cấu trúc [27].
1.2.2. Sự phân bố ectin trong sinh giới
Lectin đƣợc tìm thấy ở hầu hết các sinh vật ở mọi cấp bậc phân loại, từ
virus đến vi khuẩn, từ thực vật đến động vật.

19. 17
Bảng 1.1. Sự phân bố của lectin trong sinh giới
Phân bố Lectin Tài iệu tham khảo
Động vật Lớp Cá xƣơng (Osteichthye), lớp
Lƣỡng cƣ (Amphibia), lớp Bò sát
(Reptila), lớp Chim (Aves) và lớp
Thú (Mammalia), huyết tƣơng cá
chình (Anguilla rastiata), trứng cá
vƣợc (Perca piuviatitis), trong cơ
thể ngƣời.
[28]
Ngành ruột khoang ở vùng biển
Khánh Hòa.
[29]
Thực vật Dâu tằm (Moraceae), Mít, Sakê chi
Artocarpus (Artocarpus incia).
[30]
Rong (Algae) [31]
Họ Lan (Orchidaceae), họ Trinh nữ
(Mimosaceae), họ Thủy tiên
(Amaryllidaceae) và họ Hòa thảo
(Poceae).
[32]
Lectin từ các loại hạt (họ đậu, họ đại
kích), quả và củ (họ cà, họ hành), rễ
(họ bầu bí, họ đậu), ở chồi và lá (họ
xƣơng rồng và họ lan)
[32]
Virus Virus cúm [33]
Vi khuẩn Actinomyces naeslundii,
Escherichia coli
[34]

20. 18
1.2.3. Vai trò sinh học của ectin
Vai trò nổi bật nhất của lectin ở các sinh vật chính là chức năng nhận
diện các gốc đƣờng. Vai trò này thể hiện trong chức năng của lectin trong
miễn dịch tự nhiên, trong quá trình loại bỏ các glycoprotein trong máu ở gan
của động vật có xƣơng sống (sialoglycoprotein). Có nhiều bằng chứng cho
thấy lectin đóng vai trò nhƣ các protein hỗ trợ (chaperone) trong việc điều
phối sự vận chuyển glycoprotein nội bào.
Ở động vật: lectin có nhiều chức năng sinh học quan trọng nhƣ: quyết
định độ bám dính của tế bào, tham gia vào quá trình tổng hợp glycoprotein,
điều chỉnh lƣợng protein trong máu. Lectin có thể liên kết đƣợc với các
glycoprotein nội và ngoại bào. Một số lectin liên kết đặc hiệu với đƣờng
galactose cũng đƣợc tìm thấy trên bề mặt tế bào gan của động vật có vú.
Những lectin này đóng vai trò nhƣ những thụ thể bề mặt tế bào và có khả
năng loại bỏ một số glycoprotein nhất định trong hệ tuần hoàn. Thêm vào đó,
lectin cũng giữ một vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch của động vật.
Ở thực vật: có hai giả thuyết về vai trò của lectin. Một giả thuyết cho
rằng giúp thực vật chống lại vi khuẩn gây bệnh và động vật gây hại cho nó.
Giả thuyết này đƣợc đƣa ra dựa trên quan sát của Rehovot cho thấy lectin ức
chế quá trình tạo bào tử nấm. Ngoài ra, một quan sát của Lierner về sự chết
của ấu trùng bọ cánh cứng khi ăn thức ăn có lectin đậu đen [35]. Giả thuyết
thứ hai là sự kết hợp đặc hiệu của một giống đậu nào đó với một số vi khuẩn
cố định đạm nhất định. Thành phần đƣờng của các polysaccharide hoặc
lipopolysaccharide trên màng tế bào các loài vi khuẩn là khác nhau, và khả
năng liên kết của lectin của các họ đậu khác nhau với các gốc đƣờng này cũng
có sự khác biệt [36].

21. 19
1.3. LECTIN TỪ RONG BIỂN
1.3.1. Tình hình nghi n cứu ectin từ rong biển tr n thế giới
Lần đầu tiên Boyd (1966) đã khảo sát sự có mặt của agglutinin (lectin)
từ rong biển. Sau đó nhiều nghiên cứu về lectin đã đƣợc công bố với số lƣợng
trên 500 loài rong có chứa lectin, nhƣ ở Anh [37, 38, 39], ở Nhật [40, 41], ở
Tây Ban Nha [42, 43], ở Trung Quốc [44], ở Hoa Kỳ [45, 46], ở Brazil [47,
48, 49], ở Pakistan [50], ở Ấn độ [51], Việt Nam [13, 16] và ở Nam cực [52].
Trong số đó, lectin đã đƣợc cô lập chủ yếu là từ rong đỏ và đã đƣợc nghiên
cứu tính chất hóa-lý và hóa sinh chi tiết, nhƣ các lectin từ rong Agardhiella
tenera [53], Carpopeltis flabellata, Hypnea japonica [54, 55], Cystoclonium
purpureum [56], Gracilaria bursa –pastoris [57], Gracilaria tikvahiae [58],
Gracilaria verrucosa [59], Griffithsia flosculosa [60], Monospora sp [61],
Plumaria elegans, Ptilota serrata [62], Palmaria palmata [63, 61], Ptilota
plumosa [64, 65], Serraticardia maxima [66], Solieria chordalis [67] và
Solieria robusta [68].
1.3.1.1. Các phương pháp tinh chế lectin từ rong biển
Các lectin từ rong đỏ có thể đƣợc tinh chế bằng nhiều kỹ thuật sắc kí
khác nhau: sắc kí kỵ nƣớc, sắc kí trao đổi ion, sắc kí lọc gel, sắc kí pha đảo -
HPLC hoặc sắc kí ái lực. Do tính đặc hiệu carbohydrate của các lectin, chúng
hầu nhƣ đƣợc tinh chế bằng sắc kí ái lực.
Bảng 1.2. Một số phƣơng pháp tinh chế lectin từ rong biển.
Rong biển Phƣơng pháp tinh chế Khối lƣợng phân
tử/khối lƣợng các
mảnh.
Tài liệu tham
khảo
Agardhiella
tenera
Sắc ký lọc gel Sephadex Monomer 13 kDa [53]
Aglaothamnion
callophyllidicola
Sắc ký ái lực Fetuin-
agarose
Dimer, 50 và 14 kDa [69]
Bryothamnion
seaforthii
Sắc ký DEAE-cellulose Monomer 4.5 kDa [70]
Cystoclonium Sắc ký lọc gel, sắc ký cột Dimer, 6,2 kDa [56]

22. 20
purpureum DEAE-Sephadex
Eucheuma
amakusaensis
Sắc ký lọc gel Superdex và
sắc ký trao đổi ion DEAE-
Toyopearl
Monomer 29 kDa [71]
E. cottonii Sắc ký lọc gel Superdex và
sắc ký trao đổi ion DEAE-
Toyopearl
Monomer 29 kDa [71]
E. serra Sắc ký lọc gel Superdex và
sắc ký trao đổi ion DEAE-
Toyopearl
Monomer 29 kDa [6]
E.denticulatum Sắc ký lọc gel Superdex và
sắc ký trao đổi ion DEAE-
Toyopearl
Monomer 28 kDa [17]
Gracilaria
cornea
Sắc ký kỵ nƣớcPhenyl-
Sepharose CL-4B và sắc
ký ái lực
Monomer 60 kDa [72]
G. ornata Sắc ký trao đổi ionDEAE-
cellulose và sắc ký ái lực
mucin-Sepharose 4B
Monomer 17 kDa [73]
G. verrucosa Sắc ký trao đổi ion DEAE-
Toyopearl và sắc ký lọc
gel
71 kDa [74]
Griffithsia sp Sắc ký kỵ nƣớc, sắc ký
trao đổi ion và sắc ký ái
lực
Monomer 13 kDa [75]
Hypnea
cervicornis
Sắc ký trao đổi ion và sắc
ký pha đảo HPLC
Monomer, 9 kDa [76]
H. japonica Sắc ký lọc gel Toyopearl
và sắc ký pha đảo HPLC
Monomer,
8.5–9.5 kDa
[77]
H. musciformis Sắc ký trao đổi ion DEAE-
Cellulose và sắc ký pha
đảo HPLC
Monomer, 9.3 kDa [78]
Kappaphycus
alvarezii
Sắc ký lọc gel Superdex và
sắc ký trao đổi ion DEAE-
Toyopearl
Monomer, 28 kD [14]
K. striatum Sắc ký lọc gel Superdex và
sắc ký trao đổi ion DEAE-
Monomer, 28 kDa [15]

23. 21
Toyopearl
Ptilota filicina Sắc ký ái lực Trimer, 19,3 kDa [79]
Soliera filiformis Sắc ký trao đổi ion DEAE-
Sephacel
Monomer, 28 kDa [80]
Tichocarpus
crinitus
Sắc ký kỵ nƣớc Phenyl-
Sepharose và sắc ký lọc
gel Superdex
Monomer, 41 kD [81]
1.3.1.2. Đặc tính liên kết carbohydrate của lectin
Tùy thuộc vào nguồn gốc của các loài rong biển, hoạt tính ngƣng kết
hồng cầu của các mẫu lectin từ rong biển bị ức chế mạnh mẽ bởi các
glycoprotein và glycopeptide khác nhau mà có thể nhận ra các phức
carbohydrate. Do đó, dựa trên các ƣu tiên liên kết của chúng đối với
glycoprotein, các lectin từ rong biển có thể đƣợc phân thành 3 loại: loại đặc
hiệu N-glycan dạng phức, đặc hiệu N-glycan dạng high-mannose hoặc đặc
hiệu cả 2 dạng. Tuy nhiên, lectin từ rong biển cũng cho thấy sự đặc hiệu với
các đƣờng đơn và các dẫn xuất của chúng [82].
* Đặc hiệu phức carbohydrate
Một số lectin thể hiện tính đặc hiệu các chuỗi đƣờng của các loại N-
glycan [54], trong khi một số ít thì đặc hiệu với O-glycan [14]. Lectin từ rong
E. duperreyi [83], Ptilota filicina [79], Pterocladiella capillacea [84], G.
ornata [73] và G. cornea [72] đã bị ức chế mạnh bởi porcine stomach mucin
(PSM), PSM là một glycoprotein liên kết O-glycan có chứa các gốc cuối cùng
N-acetylgalactosamine, galactose và fucose [85]. Dịch chiết protein thô của
rong Gracilaria fisheri (GFE) có tính đặc hiệu với porcine stomach mucin,
fetuin và albumin bò với giá trị nồng độ ức chế nhỏ nhất (Cmin) là 1,56, 3,12
và 6,25 µg/mL (tƣơng ứng) [86]. Hoạt tính của lectin từ rong Gracilaria
veruscosa cho thấy có tính đặc hiệu với glycoprotein dạng phức (asialofetuin,
fetuin và thyroglobulin), có ái lực cao nhất với chuỗi oligosaccharide của
asialofetuin [74]. Hoạt tính của lectin từ rong Hypnea cervicornis bị ức chế

24. 22
mạnh chỉ với glycoprotein porcine stomach mucin [76]. Hoạt tính của các
lectin từ rong Tichocarpus crinitus [81] và Georgiella confluens [52] bị ức
chế bởi glycoprotein fetuin và porcine stomach mucin. Hoạt tính của lectin từ
rong A. callophyllidicola bị ức chế bởi fetuin và asialofetuin với nồng độ ức
chế nhỏ nhất lần lƣợt là 19 và 62 µg/mL [69].
Hoạt tính của lectin từ rong Hypnea japonica không bị ức chế bởi N-
glycan dạng high-mannose, nhƣng bị ức chế với một vài glycoprotein N-
glycan dạng phức nhƣ: transferrin, fetuin hoặc O-glycan và dẫn xuất asialo
của chúng [77]. Lectin đồng phân (hypnin A-3) từ rong H. japonica liên kết
với gốc fucose ở vị trí (α1-6) của N-glycan [87]. Lectin từ rong Hypnea
valentiae, H. boergesenii, H. nidulans và Graccilaria salicornia đặc hiệu với
O-glycan vì hoạt tính của chúng bị ức chế bởi asialofetuin chứa cả N-glycan
dạng phức và O-glycan cũng nhƣ bovine submaxillary mucin và dẫn xuất
asialo của chúng [14].
* Đặc hiệu với high-mannose
Rong đỏ, carrageenophyte, là một nguồn lectin có giá trị cao, nhƣ lectin
ESA-2 từ rong Eucheuma serra có khả năng liên kết với các oligosacchride
dạng high-mannose [8]. Các nghiên cứu về sự ức chế carbohydrate đã cho
thấy rằng lectin từ rong Kappaphycus alvarezii (trƣớc đây đƣợc gọi là E.
cottonii) và Eucheuma denticulatum là đặc hiệu với N-glycan dạng high-
mannose [17]. Tƣơng tự, các lectin từ rong Kappaphycus striatum [15] và
Kappaphycus alvarezii [14] có ái lực với N-glycan vì hoạt tính của chúng đã
bị ức chế mạnh bởi yeast mannan, porcine và bovine thyroglobulin mang
dạng N-glycan high-mannose. Lectin SfL-1 và SfL-2 từ Solieria filiformis
liên kết đặc hiệu với 3α, 6α pentamannose oligosaccharide, do đó cho thấy
đặc hiệu với oligosacchride high-mannose [88].

25. 23
* Đặc hiệu với cả hai high-mannose và glycoprotein dạng phức
Lectin từ rong Carpopeltis flabellata [54, 55] và Solieria robusta [89]
liên kết cả N-glycan dạng high-mannose và N-glycan dạng phức. Lectin từ
các rong đỏ nhƣ Eucheuma serra (ESA-1 và ESA-2), Eucheuma
amakusaensis (EAA-1, EAA-2 và EAA-3) và Eucheuma cottonii (ECA-1 và
ECA-2) đặc hiệu với glycan dạng phức nhƣng đặc hiệu ƣu tiên với
glycoprotein chứa N-glycan dạng high-mannose nhƣ là thyrogloblin và yeast
mannan [6, 71].
* Những lectin đặc hiệu với đường đơn
Hầu hết các lectin từ rong biển đặc hiệu với các glycoprotein. Tuy
nhiên, một vài lectin từ rong biển lại đặc hiệu với các đƣờng đơn khác nhau
nhƣ: hoạt tính của lectin từ rong Carpopeltis flabellata đã bị ức chế bởi L-
rhamnose [54]; hoạt tính của lectin từ rong Ptilota serrata (PSL) [85], Ptilota
filicina (PFL) [79] và Vidalia obtusiloba [90] bị ức chế mạnh bởi đƣờng đơn
(galactose) và dẫn xuất của chúng; hoạt tính của lectin từ rong Enantiocladia
duperreyi cũng bị ức chế bởi các đƣờng đơn (glucose và fucose) và dẫn xuất
của chúng [83]; hoạt tính của các lectin từ rong Enantiocladia duperreyi [83],
Ptilota filicina [79] và Ptilota serrata [85] bị ức chế bởi nitrophenyl-
galactoside mạnh hơn methyl-D-galactoside; vì vậy, những lectin này có vùng
kị nƣớc ở gần vị trí liên kết với carbohydrate [91]. Hoạt tính của của lectin từ
rong Graccilaria tikvahiae cũng bị ức chế bởi axit N-acetylneuraminic, N-
acetylneuraminic axit (2 3) lactose   [58].
1.3.1.3. Điểm đẳng điện và hàm lượng acid amin của lectin từ rong
biển.
Lectin từ rong biển có điểm đẳng điện thấp, thƣờng trong khoảng từ 4 –
6, nhƣ lectin từ rong Hypnea japonica có pHI = 4,3 [57, 92], Agardhiella
tenera có pHI = 6,1 [53], Graccilaria verrucosa có pHI = 4,8 [59]. Lectin từ

26. 24
rong biển thƣờng chứa lƣợng lớn gốc axit (của axit aspartic và axit glutamic)
và nhóm hydroxyl (của serine và threonine) và chứa ít các acid amin cơ bản
nhƣ arginine, histidine và lysine [92, 93, 85]. Lectin từ rong biển chứa hàm
lƣợng lớn các acid amin có tính axit nên pHI của chúng nghiêng về tính axit,
nhƣ các lectin từ rong Solieria filiformis [94] và rong Vidalia obtusiloba [90].
Lectin từ rong Tichocarpus crinitus có chứa lƣợng lớn proline với nhiều
nhóm axit và hydroxyl [81].
Thành phần acid amin trong lectin từ rong Hypnea cervicornis có chứa
nhiều cysteine và ít serine, tƣơng tự với lectin từ rong Hypnea musciformis
[76]. Tuy nhiên, lectin từ rong Hypnea japonica và Bryothamnion triquetrum
chứa ít cysteine hơn và nhiều serine hơn [77, 95].
1.3.1.4. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính của lectin từ rong
biển.
Hoạt tính của lectin từ rong biển nhƣ Kappaphycus alvarezii [14],
Agardhiella tenera [53], Cystoclonium purpureum [56] và Gracilaria
verrucosa [59] ổn định trên một phạm vi rộng của pH. Hoạt tính của lectin từ
rong Eucheuma serra cũng cho thấy ổn định trên khoảng pH từ 2,5 – 10,5 [6].
Lectin từ một vài mẫu rong đỏ nhƣ Ptilota serrata [85], Gracilaria bursa-
pastoris [54], Tichocarpus crinitus [81] và Acrocystis nana [96] cho thấy hoạt
tính chỉ ổn định trong khoảng pH trung tính (6 - 8) và bị mất đi hoạt tính nếu
pH nằm dƣới hoặc trên khoảng này.
Hoạt tính của lectin từ các rong Pterocladiella capillacea [84],
Gracilaria ornata [73], Kappaphycus alvarezii [14] và Gracilaria fisheri [86]
ổn định nhiệt đến 50 o
C. Lectin từ rong Carpopeltis flabellata [54, 92] và
Acrocystis nana [96] chỉ ổn định đến 30 o
C. Lectin từ một vài mẫu rong đỏ
nhƣ: Agardhiella tenera, Cystoclonium purpureum, Vidalia obtusiloba và
Pterocladiella capillacea thì nhạy với nhiệt, hoạt tính bị mất khi nhiệt độ tăng
lên 60 o
C [53, 56, 43, 90]. Tuy nhiên, một vài lectin từ rong đỏ ổn định ở

27. 25
nhiệt độ cao nhƣ: lectin từ rong Bryothamnion seaforthii, B. triquetrum (90
o
C) [70], Gracilaria verrucosad
, G. verrucosac
(c
High molecular weight G.
verrucosa haemagglutinin – HGVH, d
Low molecular weight G. verrucosa
haemagglutinin – LGVH, 100 o
C) [97, 74], Ptilota serrrata (80 o
C) [85] và
Georgiella confluens (80 o
C) [52].
1.3.1.5. Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của lectin rong biển
Hầu hết hoạt tính sinh học của lectin từ rong biển không phụ thuộc vào
cation hóa trị hai; tuy nhiên, một vài lectin nhƣ là Plumaria elegans, P.
serrata [62], P. filicina [79], Enantiocladia duperreyi [83] và V. obtusiloba
[90], A. nana [96] thì phụ thuộc vào ion kim loại nhƣ là Ca2+
, Mn2+
và Mg2+
.
Tuy nhiên, sự phụ thuộc vào cation hóa trị hai cho hoạt tính sinh học không
phải là đặc tính chung của lectin từ rong biển [98].
1.3.1.6. Hàm lượng carbohydrate trong lectin từ rong biển.
Một vài lectin từ rong biển là glycoprotein chứa hàm lƣợng
carbohydrate khác nhau, nhƣ lectin từ rong C. purpureum [56], G. bursa-
pastoris [93], E. duperreyi [83], G. ornata [73] và T. crinitus [81] là
glycoprotein. Hàm lƣợng carbohydrate của lectin từ rong biển có thể thấp nhƣ
2,7 % trong lectin của rong A. tenera [53] hay 2,9 % trong lectin của rong G.
ornata [73] hoặc cao nhƣ 43 % trong lectin của rong V. obtusiloba [90] hay
52,5 % trong lectin của rong G. cornea [72].
1.3.1.7. Trọng lượng phân tử của lectin từ rong biển.
Lectin từ rong biển thƣờng có khối lƣợng phân tử thấp và tồn tại ở dạng
monomer, nhƣ lectin từ các rong C. flabellata, S. robusta [92], B. seaforthii,
B. triquetrum [70], P. capillacea [84], H. musciforms [78], G. ornata [73],
G.cornea [72], Griffithsia sp. [75, 99, 100], K. alvarezii [14], T. crinitus [81]
và K. striatum [15]. Tuy nhiên, một vài lectin từ rong biển có cấu trúc dimer,
nhƣ lectin từ các rong P. palmata [60] và V. obtusiloba [90]; cấu trúc trimer
nhƣ lectin từ rong P. filicia [79], P. serrata [85], Ptilota plumosa và Ptilota
gunneri [101]; cấu trúc tetramer nhƣ lectin từ rong G. verrucosa [58]. Lectin

28. 26
từ rong Aglaothamnion callophyllidicola có cấu trúc dimer bao gồm hai nhóm
nhỏ có khối lƣợng phân tử khác nhau: 50 và 14 kDa [69]. Các đồng phân
lectin SfL-1 và SfL-2 từ rong S. filiformis có khối lƣợng phân tử là 27.552 và
27.985 kDa (tƣơng ứng) [88]. Trên cơ sở đặc tính hóa sinh cơ bản, Rogers và
Hori (1993) đã phân chia lectin từ rong biển thành 3 loại: (a) lectin liên kết
với glycoprotein có khối lƣợng phân tử thấp, (b) lectin liên kết với đƣờng đơn
có khối lƣợng phân tử trung gian, (c) lectin có khối lƣợng phân tử lớn liên kết
với đƣờng đơn (MW > 64.000). Trong số tất cả lectin từ rong biển đã công bố
cho đến hiện nay, lectin từ rong Bryothamnion seaforthii và B. triquetrum có
khối lƣợng nhỏ nhất là 3500 và 4500 Da (tƣơng ứng) [70].
1.3.1.8. Cấu trúc của lectin từ rong biển.
Phân tích cấu trúc của lectin giúp khám phá các ứng dụng tiềm năng
của chúng trong các lĩnh vực khác nhau. Trong tất cả các lectin từ rong biển,
cấu trúc bậc 1 của lectin từ B. triquetum (BTL) đã đƣợc xác định [95]. Đặc
tính cấu trúc của lectin từ rong B. triquetum đã chứng minh sự tƣơng tác của
lectin với octasaccharide [102]. Cấu trúc tinh thể của lectin griffithsin đã đƣợc
nghiên cứu chi tiết và nó là một dimer đồng nhất với mỗi đơn vị nhỏ chứa 121
amino axit [103, 104, 105]. Cấu trúc tinh thể lectin từ rong Griffithsia sp. và
sự tƣơng tác của nó với những phân tử glycan riêng biệt nhƣ là mannose, N-
acetylglucosamine, 1 6 mannobiose  và maltose đã cũng đƣợc xác định
[103, 104, 105]. Phân tích phức GRFT-glycan cho thấy gần nhƣ ba vị trí liên
kết carbohydrate giống nhau (cách nhau khoảng 15Ao
) đƣợc tìm thấy trên mỗi
monomer của GRFT và nhƣ vậy có sáu vị trí chính đƣợc tìm thấy trong dimer
[103]. Các nghiên cứu tƣơng tác GRFT-glucose [103] và GRFT-mannose
[104] cho thấy sự khác biệt trong định hƣớng của nguyên tử O1. Sự tƣơng tác
nhiệt đối với glucose (giảm 1,5 lần) và N-acetylglucosamine (giảm 2 lần) khi
đƣợc so sánh với mannose đƣợc chỉ rõ bởi các thí nghiệm chuẩn độ nhiệt
đẳng điện với GRFT [104, 105]. Tuy nhiên, sự bão hòa của liên kết không
xảy ra trong trƣờng hợp GRFT-glucose và GRFT-N-acetylglucosamine [105].
Vào năm 2010, Moulaei và các cộng sự đã tạo nên một biến thể
monomer của GRFT (mGRFT), và các nghiên cứu về phức Man9-GRFT đã

29. 27
chứng minh rằng lectin GRFT đã liên kết với các gốc đƣờng mannose cuối
cùng của nhánh D1 và D2 (Hình 1.2)
Cấu trúc bậc một của lectin từ rong Eucheuma sera [8], E. denticulatum
[17], K. striatum [18], K. alvarezii [11] và S. filiformis [80] đã cho thấy có
bốn miền lặp lại kế tiếp nhau, mỗi vùng chứa từ 67 đến 68 axit amin. Các
lectin này bao gồm hai thùng β (β-barrel), mỗi thùng chứa 2 tấm β, mỗi tấm β
chứa 5 dải β [106] (Hình 1.1).
*** * ***
EDA-1 GRYTVQNQWGGSSAPWNDAGLWILGSRGNQNVIAIDVSSSDVGANLKGTMTYSGEGPIGFKGVRRGD 67
EDA-2 GRYTVQNQWGGSSAPWNDAGLCILGSRGNQNVIAVDVTSSDGGANLGGTMTYSGEGPIGFKGARRGE 67
ESA-2 GRYTVQNQWGGSSAPWNDAGLWILGSRGNQNVMAVDVNSSDGGANLNGTMTYSGEGPIGFKGARRGE 67
KSA-1 GRYTVQNQWGGSSAPWNDAGLWILGSRGNQNVMAIDVNSSDGGANLNGTMTYSGEGPIGFKGARRGE 67
KSA-2 GRYTVQNQWGGSSAPWNDAGLWILGSRGNQNVMAIDVNSSDGGANLNGTMTYSGEGPIGFKGARRGE 67
KAA-1 GRYTVQNQWGGSSAPWNDAGLWILGSRSNQNVMAIDVNSSDGGANLNGTMTYSGEGPIGFKGARRGE 67
KAA-2 GRYTVQNQWGGSSAPWNDAGLWILGSRGNQNVMAIDVNSSDGGANLNGTMTYSGEGPIGFKGARRGD 67
SfL-1 GRYTVQNQWGGSSAPWNDAGLWLLGSRANQNVMDVSVTSSDGGATLTGTMTYSGEGPIGFKGTRRGD 67
SfL-2 GRYTVQNQWGGSSAPWNDAGVFVLGGRANQNVMAIDVSSSDGGKTLTGTMTYSGEGPIGFKGTRRGE 67
*** * ***
EDA-1 SNVYEVENQWGGSSAPWHPGGDFVIGSRAGQGVTEVKISSSDGGKTMTGTMTYEGEGPIGFKGSKSG 134
EDA-2 SNVYDVENQWGGSSAPWHAGGQFVIGSRSGQGVTALSVTSSDGGKTLTGTMTYEREGPIGFKGTQSG 134
ESA-2 SNVYDVENQWGGSSAPWHAGGQFVIGSRSGQGVLAVNITSSDGGKTLTGTMTYEREGPIGFKGTQSG 134
KSA-1 SNVYDVENQWGGSSAPWHAGGQFVIGSRSGQGVLAVNITSSDGGKTLTGTMTYEREGPIGFKGTQSG 134
KSA-2 SNVYDVENQWGGSSAPWHAGGQFVIGSRSGQGVLAVNITSSDGGKTLTGTMTYEREGPIGFKGTQSG 134
KAA-1 SNVYDVENQWGGSSAPWHAGGQFVIGSRSGQGVLAVNITSSDGGKTLTGTMTYEREGPIGFKGTQSG 134
KAA-2 SNVYDVENQWGGSSAPWHAGGQFVIGSRSGQGVLAVNITSSDGGKTLTGTMTYEREGPIGFKGTQSG 134
SfL-1 SNNYDVENQWGGSSAPWHAGGTFVIGSRSGQGVVAVDVNSSDGGKTLTGTMTYANEGPIGFKGTQSG 134
SfL-2 SNNYEVENQWGGSSAPWHPAGTFVIGSRSGQAVVAMNVTSHDGGKTLSGHMTYENEGPIGFKGTQAE 134
*** * ***
EDA-1 GDSYNVKNQWGGSSAPWNKAGIWALGDRSGQGVVSIDVTSSDGGKTLEGTMQYTGEGPIGFRGRLGD 201
EDA-2 GDTYNVENQWGGSSAPWNKAGIWALGDRNGQAMIAMDVSSSDGGQTLEGTMQYKGEGPIGFRGKLSG 201
ESA-2 GDTYNVENQWGGSSAPWNKAGIWALGDRSGQAMIAMDVSSSDGGKTLEGTMQYKGEGPIGFRGKLSG 201
KSA-1 GDTYNVENQWGGSSAPWNKAGIWALGDRSGQAMIAMDVSSSDGGKTLEGTMQYKGEGPIGFRGKLSG 201
KSA-2 GDTYNVENQWGGSSAPWNKAGIWALGDRSGQAMIAMDVSSSDGGKTLEGTMQYKGEGPIGFRGKLSG 201
KAA-1 GDTYNVENQWGGSSAPWNKAGIWALGDRSGQAMIAMDVSSSDGGKTLEGTMQYKGEGPIGFRGKLSG 201
KAA-2 GDTYNVENQWGGSSAPWNKAGIWALGDRSGQAMIAMDVSSSDGGKTLEGTMQYKGEGPIGFRGKLSG 201
SfL-1 GDSYNVENQWGGSSAPWNKAGAWALGDRDGQGVIGVDVTSSDGGKTLTGTMQYQNEGPIGFKGTSTG 201
SfL-2 GDTYNVENQWGGSSAPWNKAGVWALGSRASQGVVKLDVSSSDGGKTLTGTMQYQNEGPIGFRGTLTG 201
*** * ***
EDA-1 ANNYTVENQWGGSSAPWNKAGNWLIGDRYNQNIIAVKISSSDNGKNMDGTCTYANEGPIGFKGAAV- 267
EDA-2 ANNYAVENQWGGSSAPWNKAGDWLIGDRYNQNITAVKVSSDNDGKNLDGTCTYEREGPIGFKGVATS 268
ESA-2 ANNYSVENQWGGSSAPWNAAGDWLIGDRHNQNITAVKVSSDNDGKNLDGTCTYEREGPIGFKGVATS 268
KSA-1 ANNYSVENQWGGSSAPWNKAGDWLIGDRHNQNITAVKVSSDNDGKNLDGTCTYESEGAIGFKGVAS- 267
KSA-2 ANNYSVENQWGGSSAPWNKAGDWLIGDRHNQNITAVKVSSDNDGKNLDGTCTYEREGPIGFKGVATS 268
KAA-1 ANNYSVENQWGGSSAPWNKAGDWLIGDRHNQNITAVKVSSDNDGKNLDGTCTYESEGPIGFKGVAS- 267
KAA-2 ANNYSVENQWGGSSAPWNKAGDWLIGDRHNQNITAVKVSSDNDGKNLDGTCTYEREGPIGFKGVATS 268
SfL-1 GSNYKVENQWGGSSAPWNPAGNWLIGDRHNQNIVAVKVTSSDNGKTLGGTCTYEREGPIGFKGTAI- 267
SfL-2 ANNYKAENQWGGSSGAWNPAGLWLIGDRHNQNIIGVKVTSDDNGKTLEGTCTYYREGPIGFKGVAN- 267
Hình 1.1. Cấu trúc bậc 1 của các lectin từ rong đỏ EDA-1 và EDA-2 từ rong
Eucheuma denticulatum [17]; ESA-2 từ rong Eucheuma serra [8]; KSA-1 và

30. 28
KSA-2 từ rong Kappaphycus striatum [17, 107], KAA-1 và KAA-2 từ rong
Kappaphycus alvarezii [11], SfL-1 và SfL-2 từ rong Solieria filiformis [80].
Các axit amin giống nhau đƣợc tô màu xám nhạt. Các gốc đƣợc đánh dấu sao
là các acid amin (E: glutamic acid, W: Tryptophan, G: Glycine, R: Arginine,
P: Proline) tƣơng tác với các cấu trúc oligomannose trong Man9GlcNAc2 trên
lớp vỏ của virus HIV và virus cúm [108, 106].
liªn kÕt (
liªn kÕt (
liªn kÕt (
Hình 1.2. Cấu trúc Man9GlcNAc2. Man: mannose; GlcNAc: N-acetyl-D-
glucosamine
Hình 1.3. Cấu trúc lõi của Man3GlcNAc2 đƣợc thể hiện trong khung. Man:
mannose, GlcNAc: N-acetyl-D-glucosamine

31. 29
Hình 1.4. Cấu trúc của lectin từ rong đỏ, carrageenophytes. I, II, III và IV thể
hiện các vị trí liên kết với cấu trúc oligomannose [80, 106].
1.3.1.9. Ứng dụng của lectin từ rong biển
Lectin đƣợc cô lập từ rong biển rất đa dạng và phong phú. Do có đặc
tính là khối lƣợng phân tử nhỏ và sự có mặt của các kiên kết disunlphide,
lectin rong biển có tính ổn định cao. Hơn nữa, với cấu trúc nhỏ làm cho chúng
trở nên thích hợp hơn khi sử dụng nhƣ các đầu dò chẩn đoán các cấu trúc
carbohydrate trên bề mặt tế bào và nhắm đến mục đích dƣợc phẩm [76]. Gần
đây, lectin trong rong biển đã nhận đƣợc sự quan tâm đáng kể do có liên kết
đặc hiệu với oligosaccharide [87]. Các kết quả nghiên cứu liên quan đến sự
phát triển của các công cụ để nghiên cứu ung thƣ, HIV và các bệnh khác. Mục
tiêu cuối cùng là phát triển các loại thuốc kháng vi khuẩn, ngăn cản virus tấn
công vào tế bào chủ [109]. Dựa trên đặc điểm liên kết carbohydrate, lectin đã
đƣợc sử dụng trong các liệu pháp khác nhau, nhƣ chẩn đoán ung thƣ, dấu hiệu
bệnh lý của bệnh, nhận biết glycan và kiểm soát nhiều loại bệnh.

32. 30
Các ứng dụng của lectin từ rong biển có thể tóm tắt theo biểu đồ sau:
Hình 1.5. Biểu đồ thể hiện ứng dụng y sinh của lectin từ rong biển [110].
+ Khả năng kháng đau của lectin:
Tác dụng kháng đau của lectin từ rong biển Amansia multifida,
Bryothamnion seaforthii và Bryothamnion triquetrum đã đƣợc thông báo ở
hệ thần kinh trung ƣơng và ngoại vi [111, 112]. Lectin từ Amansia multifida
(Amansin/LEC) cũng đã đƣợc chỉ ra nhƣ thuốc giảm đau tiềm năng [111].
Lectin từ rong Hypnea cervicornis (HCA) có hiệu ứng kháng đau thông qua
sự tƣơng tác giữa carbohydrate và lectin. Lectin từ rong lục Caulerpa
cupressoides cho kết quả kháng đau và kháng viêm trong các mô hình kháng
đau và kháng viêm ở chuột [113].
+ Khả năng kháng vi m của lectin:
Lectin HCA cô lập từ rong Hypnea cervicornis bao gồm khả năng
kháng viêm hiệu quả trong kiểu phù nề chân và chứng viêm màng bụng.
Kháng viêm hiệu quả cũng thể hiện ở lectin từ các rong Caulerpa
cupressoides, Chlorella stigmatophora, Phaeodactylum tricornutum và
Amansia multifida [110].

33. 31
+ Khả năng chống ung thƣ của lectin:
Lectin trong chống ung thƣ có thể dùng nhƣ là đầu dò chẩn đoán.
Nhiều lectin trong rong đã đƣợc báo cáo là có khả năng chống khối u, chống
lại tế bào ung thƣ ở ngƣời [114]. Chẳng hạn, lecin ESA từ rong Eucheuma
serra (ESA) gây chết tế bào ung thƣ đại tràng Colo 201 và tế bào ung thƣ cổ
tử cung Hela, có hoạt tính kích thích sự phân bào tế bào lympho của ngƣời và
chuột và làm giảm đáng kể khả năng tồn tại của tế bào ung thƣ Colo 201
trong điều kiện thí nghiệm, trong khi các tế bào bình thƣờng vẫn không bị ảnh
hƣởng [7]. Lectin BSL từ rong Bryothamnion seaforthii và BTL từ rong
Bryothamnion triquetrum có khả năng phân biệt các biến thể tế bào ung thƣ
đại tràng ở ngƣời [115]. Ngoài ra lectin từ một số loài rong khác cũng có khả
năng kháng ung thƣ nhƣ: Acrocystis nana [116], Halosaccion glandiforme
[117], Hypnea cervicornis [87], Solieria filiformis [88].
+ Khả năng kháng virus của lectin:
Lectin có nguồn gốc từ rong biển là một nguồn hợp chất kháng virus
[118]. Hoạt tính kháng virus phụ thuộc vào khả năng liên kết các
oligosacharide chứa manose có trên bề mặt của lớp vỏ virus. Lectin từ vi
khuẩn lam và các loại rong biển khác nhau đặc hiệu với dạng giàu mannose,
làm cho chúng trở thành ứng cử viên đầy hứa hẹn trong phòng ngừa sự lan
truyền khác nhau của màng virus nhƣ: sự suy giảm miễn dịch ở ngƣời (HIV),
siêu vi khuẩn cúm, siêu vi viêm gan C (HCV), virus Ebola và hội chứng hô
hấp cấp tính nặng (SARS) [103].
Lectin BCA từ rong lục Boodlea coacta có hoạt tính ức chế virus HIV
và virus cúm và cho thấy hoạt tính mạnh kháng hầu hết các chủng virus cúm,
bao gồm chủng cô lập của cúm H1N1 [10]. Lectin từ rong Kappaphycus
alvarezii (KAA-2) có hoạt tính mạnh kháng hầu hết các chủng virus cúm bao
gồm virus cúm H1N1 có nguồn gốc từ lợn [10].

34. 32
Lectin CV-N đƣợc cô lập từ vi tảo lục lam Nostoc ellipsosporum cho
thấy một loạt các hoạt tính kháng virus cho cúm (A và B), virus Ebola, virus
herpes 6 ở ngƣời, HCV và virus sởi [119]. Lectin CV-N cũng là chất ức chế
tiềm năng của các chủng HIV-1, HIV-2 và virus suy giảm miễn dịch lâm sàng
[120, 121].
Griffithsin (GRFT) – một lectin đƣợc cô lập từ rong đỏ Griffithsia cũng
cho thấy có hoạt tính chống HIV mạnh, với nồng độ hiệu quả (EC50) là 0,043
– 0,63 µM [75].
1.3.2. Tình hình nghi n cứu ectin từ rong biển trong nƣớc
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về lectin trong rong chủ yếu là các nghiên
cứu của TS Lê Đình Hùng và cộng sự tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng
Công nghệ Nha Trang, bao gồm các kết quả sàng lọc lectin từ 88 mẫu rong
biển [13, 16], tinh chế và mô tả đặc tính của lectin từ rong đỏ Kappaphycus
alvarezii, Kappaphycus striatum, Eucheuma denticulatum, Gracilaria
salicornia, Hydropuntia eucheumatoides và từ bọt biển Stylissa flexibilis [14,
15, 17, 122, 123, 124], các dòng cDNA mã hóa lectin từ rong K. striatum và
E. denticulatum [17, 18, 107] và sự thay đổi theo mùa trong hàm lƣợng lectin
từ các rong đỏ đang nuôi trồng K. alvarezii và K. striatus [125].
Những nghiên cứu về đặc tính lectin cho thấy rằng: lectin từ rong biển
khác với lectin từ thực vật bậc cao ở một số tính chất: nhiều lectin từ rong
biển thƣờng tồn tại dạng monomer và có khối lƣợng phân tử nhỏ hơn lectin từ
thực vật bậc cao, hoạt tính ngƣng kết của chúng bền trong một khoảng rộng
của nhiệt độ và pH, không phụ thuộc vào cation hóa trị 2. Lectin từ rong biển
hầu hết không có ái lực với đƣờng đơn nhƣng có đặc tính liên kết
carbohydrate với các glycoprotein (liên kết dạng O-glycan hay N-glycan)
[98]. Chính vì vậy khả năng ứng dụng lectin từ rong biển trong y học ngày
càng đƣợc chú ý.
Dựa trên kết quả sàng lọc hemagglutinin từ rong biển Việt Nam [13]
cho thấy rằng: đặc tính liên kết carbohydrate của chi rong Gracilaria có nhiều
điểm khác so với các chi rong khác, chúng đặc hiệu với các glycoprotein dạng

35. 33
dạng O-glycan. Rong đỏ H. eucheumatoides trƣớc đây là loài rong thuộc chi
Gracilaria, từ năm 2004 chi Gracilaria đƣợc đổi tên thành chi Hydropuntia
[126]. Rong H. eucheumatoides dùng để sản xuất agar ở Việt Nam và thế
giới. Trên thế giới, rong phân bố nhiều trên quần đảo Palau (Tây Thái Bình
Dƣơng), quần đảo Montebello (Tây Úc),...; ở nƣớc ta rong có trữ lƣợng lớn ở
vùng biển Nha Trang và Ninh Thuận. Đây chính là những điều kiện thuận lợi
giúp chúng tôi nghiên cứu, phân tích những đặc tính của lectin từ loài rong
này, từ đó có những định hƣớng để sử dụng lectin từ rong H. eucheumatoides
trong tƣơng lai.
1.4. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TINH CHẾ LECTIN
1.4.1. Sắc ký trao đổi ion
Lectin có bản chất protein nên phân tử của nó mang điện tích. Tùy
thuộc vào pH của môi trƣờng mà lectin mang điện tích dƣơng hoặc âm. Lợi
dụng tính chất này ngƣời ta đã sử dụng cột sắc ký trao đổi ion để tinh chế
lectin. Các chất nhựa gắn các nhóm chứa ion tích điện dƣơng nhƣ DEAE-
sephadex, DEAE-xenluloza, DEAE-trisacryl…đƣợc sử dụng làm chất trao đổi
anion. Các chất nhựa gắn các nhóm chức ion tích điện âm nhƣ CM-sephadex,
CM-xenluloza, CM-trisacryl…đƣợc sử dụng làm chất trao đổi cation. Mỗi
chất trao đổi ion đều có khả năng trao đổi một lƣợng ion nhất định gọi là dung
lƣợng trao đổi. Ngƣời ta có thể sử dụng hai loại chất trao đổi ion ở trên để
tinh chế lectin dựa vào bản chất ion hóa và khả năng trao đổi ion của phân tử
lectin trong những điều kiện môi trƣờng pH nhất định.
1.4.2. Sắc ký ọc ge
Đây là phƣơng pháp tách lectin ra khỏi hỗn hợp protein dựa vào kích
thƣớc phân tử. Chất nhựa thƣờng đƣợc sử dụng là Sephadex. Mỗi hạt
Sephadex có bản chất là polysaccharide chứa nhiều liên kết ngang tạo thành
hệ thống lỗ lƣới xốp. Có nhiều loại Sephadex, trong đó mỗi loại có mức độ
liên kết khác nhau tạo nên kích thƣớc của lỗ xốp khác nhau. Chính mức độ
liên kết này quyết định khả năng phân tách các chất có kích thƣớc phân tử

36. 34
khác nhau. Để tinh chế lectin, ngƣời ta thƣờng dùng loại Sephadex G-75 và
Sephadex G-100.
Phƣơng pháp sắc ký lọc gel còn đƣợc dùng để xác định khối lƣợng
phân tử của chất cần tách.
1.4.3. Sắc ký ái ực
Nguyên tắc của phƣơng pháp sắc ký ái lực là dựa trên ái lực kết hợp
đặc hiệu của lectin với một phân tử khác gọi là phối tử (ligand) đƣợc gắn vào
một chất nền tạo nên pha tĩnh của cột sắc ký. Chất nhựa đƣợc sử dụng nhiều
nhất là một số loại gel: Sephadex, Sepharose, Sephacryl, Ultrogel….Quá trình
thực hiện sắc ký ái lực đƣợc tiến hành qua 3 giai đoạn: giai đoạn 1 là tạo cột
ái lực với lectin, giai đoạn 2 là gắn hay hấp phụ lectin vào cột ái lực và giai
đoạn 3 là phản hấp phụ lectin khỏi cột ái lực.
+ Giai đoạn 1: Thiết kế cột ái lực lectin: việc lựa chọn chất kết hợp có
ái lực đặc hiệu với lectin cần tách có ý nghĩa rất quan trọng. Vì vậy, cần phải
dựa vào tính chất của lectin cần tách, đặc tính lý hóa của chất kết hợp và đặc
biệt là khả năng liên kết đặc hiệu giữa lectin và chất kết hợp. Trong các thí
nghiệm tinh chế lectin ngƣời ta thƣờng lựa chọn các chất đƣờng, glycoprotein
hoặc chất cộng hợp đƣờng có ái lực hóa học với một lectin nhất định.
+ Giai đoạn 2: Hấp phụ lectin vào cột và loại bỏ các chất không có ái
lực với cột: Các lectin có ái lực với cột cần đƣợc tạo điều kiện tốt cho quá
trình hấp phụ (pH, nhiệt độ, quá trình hấp phụ nhiều lần), ở giai đoạn này các
protein không có ái lực với ligand và các protein hay lectin thừa sẽ bị đẩy ra
khỏi cột.
+ Giai đoạn 3: Giải hay phản hấp phụ lectin ra khỏi cột: Cần phải dùng
một dung dịch giải hấp phụ có ái lực thích hợp để phản hấp phụ lectin ra khỏi
cột.
Quá trình thực hiện sắc ký phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: dung dịch
giải hấp phụ, tốc độ dòng chảy.

37. 35
1.5. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ PROTEIN
DỰA VÀO PHỔ KHỐI LƢỢNG
Phƣơng pháp khối phổ hay phƣơng pháp phổ khối lƣợng (Mass
spectrometry – MS) là một kỹ thuật dùng để xác định tỉ lệ khối lƣợng/điện
tích (m/z). Phƣơng pháp phổ khối lƣợng đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực
khác nhau, ví dụ trong hóa học phƣơng pháp này có nhiều ứng dụng quan
trọng nhƣ: xác định phân tử khối khối phổ, nhận biết các chất cùng với công
thức cấu trúc của chúng, xác định công thức cấu trúc của phân tử. Phƣơng
pháp này có khả năng phát hiện ra các hợp chất với độ nhậy cực cao từ 10-12
đến 10-6
gam.
1.5.1. Nguy n tắc chung
Khi cho các phân tử ở trạng thái khí va chạm với một dòng electron có
năng lƣợng cao thì từ các phân tử sẽ bật ra 1 hay 2 electron, khi đó nó trở
thành các ion mang điện tích : +1, +2 (trong đó ion có điện tích +1 chiếm tỉ lệ
lớn).
ABC + e
ABC+ + 2e (1)
(2)ABC+2 + 3e
Ion (1) đƣợc gọi là ion gốc hay ion phân tử.
Nếu các ion phân tử tiếp tục va chạm với dòng electron có năng lƣợng
cao thì chúng sẽ bị phá vỡ thành nhiều mảnh ion, tạo nên các gốc hoặc các
phân tử trung hòa khác nhau. Quá trình này đƣợc gọi là quá trình phân mảnh
(fragmentation).
ABC+ A+ + BC
ABC+ AB+ + C
A+ + B
Năng lƣợng của quá trình phân mảnh chỉ vào khoảng 30 – 100 eV, cao
hơn năng lƣợng ion hóa phân tử (8 – 15 eV).

38. 36
Các ion có khối lƣợng m và điện tích e. Tỉ số m/e đƣợc gọi là số khối z.
Bằng cách nào đó tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau và xác định
đƣợc xác suất có mặt của chúng. Tiến hành vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ
giữa xác suất có mặt (hay cƣờng độ I) và số khối z, đồ thị thu đƣợc chính là
phổ khối lƣợng [127]
Từ vị trí của các peak phân tử đọc đƣợc trên phổ khối lƣợng ta sẽ biết
đƣợc số khối của phân tử hay còn gọi là phân tử khối khối phổ.
1.5.2. Phƣơng pháp xác định phân t khối của protein
Lectin có bản chất là protein hoặc glycoprotein, chúng là các polyme
đƣợc tạo thành từ sự kết hợp của 20 loại α-amino axit thông qua các liên kết
peptide. Dƣới tác dụng của các tác nhân, lectin sẽ bị phân cắt thành các chuỗi
peptide ngắn hơn. Ví dụ: xian bromua (BrCN) có khả năng phân cắt mạch
peptit sau gốc Methionin (Met); hoặc enzyme Tripsin có khả năng phân cắt
liên kết sau gốc Lysin (Lys) và Arginin (Arg), emzyme Chimotripsin có khả
năng phân cắt liên kết sau gốc Phenylalanin (Phe), Tyrosin (Tyr), Leuxin
(Leu), Axit aspactic (Asp), Axit glutamic (Glu) và Trytophan (Trp),.... Sau khi
các chuỗi peptide đƣợc tinh chế, tiến hành cho mẫu vào máy phân tích khối
phổ, thu khối phổ đồ. Từ đó xác định phân tử khối của protein.
1.6. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ AXIT AMIN TRONG
LECTIN
Trình tự các axit amin trong protein nói chung cũng nhƣ lectin nói
riêng đƣợc xác định theo phƣơng pháp thoái biến Edman [128], phƣơng pháp
này đƣợc phát triển bởi Pehr Edman, đây là một phƣơng pháp xác định trình
tự các axit amin trong chuỗi peptide. Trong phƣơng pháp này, gốc axit amin
đầu cuối (đầu N) đƣợc đánh dấu và tách khỏi peptide mà không làm phá vỡ
liên kết peptide giữa các gốc axit amin khác.

39. 37
Cơ chế của phản ứng:
Phenyl isothiocyanate phản ứng với nhóm –NH2 của axit amin đầu N
không mang điện tích, trong môi trƣờng kiềm nhẹ tạo thành dẫn xuất
phenylthiocarbamoyl. Tiếp đến, trong môi trƣờng axit, dẫn xuất này bị phân
cắt thành dẫn xuất thiazolinone. Sau đó, axit amin thiazolinone đƣợc chiết với
dung môi hữu cơ thích hợp và đƣợc xử lý bằng axit để tạo thành
phenylthiohydantoin (PTH) ổn định hơn – dẫn xuất axit amin có thể đƣợc xác
định bằng phƣơng pháp sắc ký hoặc điện di. Quá trình này đƣợc lặp lại một
lần nữa để xác định axit amin tiếp theo. Chiều dài chuỗi peptide bị hạn chế do
quá trình tạo dẫn xuất không phải lúc nào cũng hình thành hoàn chỉnh. Vấn đề
tạo dẫn xuất có thể đƣợc giải quyết bằng cách tách các peptide lớn thành các
peptide nhỏ hơn trƣớc khi tiến hành phản ứng. Phƣơng pháp này có khả năng
sắp xếp chính xác đến 30 axit amin. Ƣu điểm lớn của phƣơng pháp suy thoái
Edman là phản ứng chỉ cần sử dụng 10 – 100 pico-mol peptide cho quá trình
xác định trình tự chuỗi peptide.
Hạn chế của phương pháp suy thoái Edman:
Vì sự thoái biến Edman bắt nguồn từ đầu N của protein nên nó sẽ
không hoạt động nếu đầu N đã bị biến đổi hóa học (ví dụ nhóm –NH2 bị
acetyl hóa hoặc hình thành axit pyroglutamic). Trình tự sẽ dừng lại nếu gặp
phải một axit không phải là axit amin (ví dụ axit isoaspartic), vì chất trung

40. 38
gian vòng năm cạnh bền không thể đƣợc hình thành. Phƣơng pháp thoái biến
Edman thƣờng không hữu ích để xác định vị trí của cầu disulfide. Nó cũng
cần một lƣợng peptide từ 1 pico-mol trở lên để có kết quả rõ rệt.

41. 39
2CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu: Rong đỏ Hydropuntia eucheumatoides thu ở vùng
biển Ninh Thuận.
Hình 2.1. Hình ảnh rong Hydropuntia eucheumatoides
Rong H. eucheumatoides phát triển ở phía Nam miền Trung Việt Nam
trong vùng triều ở độ sâu 1,5 - 3 m, nó đƣợc thu từ tháng 3 đến tháng 9 và
đƣợc sử dụng để nấu kẹo. Trữ lƣợng của rong nhỏ, nhƣng có giá trị cao trên
thị trƣờng.
Rong H. eucheumatoides trƣớc đây có tên gọi là Gracilaria
eucheumatoides (Harvey). Nguyên nhân là do trƣớc năm 2004, các loài rong
câu ở Việt Nam vẫn đƣợc xếp trong một chi Gracilaria thuộc bộ Gigartinales;
nhƣng hiện nay, theo các nghiên cứu mới nhất về hình thái giải phẫu hình thái

42. 40
cơ quan sinh sản đực và phân tích DNA, các tác giả đã thống nhất sắp xếp
chúng vào 3 chi: Gracilaria, Gracilariopsis và Hydropuntia thuộc bộ
Gracilariales nên rong Gracilaria eucheumatoides đã đƣợc cập nhật với tên
khoa học mới là Hydropuntia eucheumatoides [126, 129].
Rong H. Eucheumatoides đƣợc định danh theo khóa phân loạ nhƣ sau:
Giới Plantae
Ngành Rhodophyta
Lớp Florideophyceae
Bộ Gracilariales
Họ Gracilariaceae
Chi Hydropuntia
Loài Hyropuntia eucheumatoides
Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha
Trang, Thành phố Nha Trang, Tỉnh Khánh Hòa.
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 06/2018 đến tháng 09/2018.
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nguy n vật iệu
Rong đỏ H. Eucheumatoides đƣợc thu ở biển Ninh Thuận vào tháng
4/2018. Sau khi thu, rong đƣợc rửa sạch bằng nƣớc biển, giữ lạnh và chuyển
về phòng thí nghiệm. Rong đƣợc xay nhuyễn trong nitơ lỏng, cho vào các túi
nilon và cất giữ lạnh ở - 20 o
C cho đến khi dùng.
Hồng cầu của máu thỏ, cừu và gà do Viện Vắc Xin và Sinh Phẩm Y Tế
Nha Trang, Tỉnh Khánh Hòa cung cấp. Hồng cầu thuộc các nhóm máu A, B,
O ở ngƣời đƣợc lấy từ Bệnh viện Đa khoa Tỉnh Khánh Hòa.
2.2.2. Hóa chất
- Các loại đƣờng và glycoprotein: D-glucose, D-mannose, D-galactose,
D-xylose, D-glucosamine, D-gluconic acid, p-nitrophenyl-D-galactoside, p-
nitrophenyl-D-glucoside, p-nitrophenyl-D-mannoside, laminaran, transferrin,

43. 41
fetuin, porcine thyroglobulin và procine stomach mucin; Yeast mannan mua
từ hãng Merck (Đức).
- Nhựa sắc kí lọc gel Sephacryl S-200 (Pharmacia, Uppsala – Thụy
điển).
- Nhựa sắc kí trao đổi ion DEAE-sepharose Fast Flow (Pharmacia,
Uppsala – Thụy điển)
- Enzyme trypsine, papain (Sigma – Mỹ).
- Thuốc thử Folin (Merck – Đức)
- BSA (Bovine serume albumin – Đức).
- Hóa chất phân tích các loại: NaH2PO4, Na2HPO4, NaCl, CuSO4,
NaOH, Na2CO3, H2SO4, CH3COOH, glyxerol.
Tất cả các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều đạt hạng phân tích.
2.2.3. Thiết bị s dụng trong nghi n cứu
Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu gồm:
Bảng 2.1. Các thiết bị chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm
STT Thiết bị Model máy Xuất sứ
1 Máy đo quang phổ UV-Vis 6405UV/VIS Jenway-Anh
2 Máy ly tâm Z36HK Hermel-Đức
3 Máy ly tâm eppendorf 5417R Eppendorf – Đức
4 Máy đo pH 827pH Lab Metrohm-Thụy Sỹ
5 Bể ổn nhiệt B12 Heraeus-Đức
6 Bể siêu âm UTRASONIC Hàn quốc
7 Hệ thống sắc ký lọc gel GPC-2414 Waters-Mỹ

44. 42
8 Thiết bị điện di đứng AJ-6530 Atto-Japan
9 Tủ ấm ON-11E Gallenkamp
10 Máy lắc (kiểu tròn) 3017 GFL – Đức
11 Cân phân tích CP224S Satorius – Đức
12 Bộ siêu lọc Toya-Roshi, UHP43 Nhật
13 Máy đo quang Spectro UV 2505/24RS Labomed
14 Cột sắc kí ion 1,6x20 (cm) GE Healthcare –
Thụy điển
15 Các loại Micropipet 2 20 ;20 200 ;...l l Nichiryo – Nhật
16 Khay 96 giếng đáy chữ V Polystyrene Greiner – Đức
17 Hệ thống bơm và thu phân
đoạn
Frac-920 GE Healthcare –
Thụy điển
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Chuẩn bị huyền phù hồng cầu máu 2 % (hồng cầu máu thỏ,
cừu, gà và các nhóm máu ngƣời A, B, O) :
Mỗi mẫu máu đƣợc rửa từ 3 đến 5 lần với 50 thể tích dung dịch NaCl
0,15 M. Sau khi rửa, huyền phù hồng cầu máu 2 % (v/v) đƣợc chuẩn bị bằng
cách thêm dung dịch đệm photphat 0,02 M có chứa NaCl 0,15 M,
pH = 7,2 và đƣợc dùng nhƣ hồng cầu tự nhiên [13].
Hồng cầu các mẫu máu đƣợc xử lý enzyme tripsin hay papain đƣợc
chuẩn bị nhƣ sau:
1
10
thể tích của dung dịch trypsin hay papain 0,5 % (w/v)
đƣợc thêm vào huyền phù các mẫu máu tự nhiên 2% (v/v), trộn đều và đƣợc ủ
ở 37 o
C trong 60 phút. Sau khi ủ, hồng cầu các mẫu máu đƣợc rửa từ 3 đến 5
lần với dung dịch muối và hòa lại bằng dung dịch đệm photphat 0,02 M có

45. 43
chứa NaCl 0,15 M, pH = 7,2. Ta thu đƣợc huyền phù hồng cầu các mẫu máu
2 % đã xử lý enzyme trypsin hay papain [13].
2.3.2. Phân tích hoạt tính ectin bằng phƣơng pháp ngƣng kết hồng
cầu (hồng cầu máu thỏ, cừu, gà và các nhóm máu ngƣời A, B, O).
Hoạt tính của lectin đƣợc xác định dựa trên phƣơng pháp ngƣng kết
hồng cầu [13].
Các thí nghiệm phân tích hoạt tính của lectin đƣợc thực hiện trong đĩa
96 giếng đáy chữ V. Đầu tiên, cho 25 µL dung dịch đệm photphat 0,02 M có
chứa NaCl 0,15 M, pH = 7,2 vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng đáy chữ V. Tiếp
đến cho 25 µL mẫu dịch chiết lectin cần phân tích hoạt tính ngƣng kết hồng
cầu vào giếng đầu tiên, trộn đều, pha loãng sang các giếng tiếp theo với tỷ lệ
pha loãng là n
1
2
(n: số lần pha loãng) và giữ ở nhiệt độ phòng trong khoảng
thời gian 1 giờ. Sau đó, tiếp tục thêm 25 µL hồng cầu 2 % vào tất cả các
giếng, lắc nhẹ nhàng hỗn hợp và giữ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Đọc kết
quả.
Kết quả dƣơng tính đƣợc thể hiện khi hình thành một lớp chất keo đồng
nhất trên bề mặt giếng. Kết quả thử nghiệm là âm tính khi tất cả hồng cầu
lắng xuống đáy giếng thành chấm nhỏ.
Hoạt tính của lectin (HU/mL) đƣợc thể hiện nhƣ là một tiêu chuẩn, và
là giá trị nghịch đảo của độ pha loãng lớn nhất mà dịch chiết lectin còn có khả
năng làm ngƣng kết hồng cầu cho vào phản ứng.
Thí nghiệm đƣợc thực hiện 3 lần đối với mỗi loại hồng cầu đƣợc thử
nghiệm.
Hoạt tính lectin: đƣợc xác định theo 2 chỉ số:
- Hoạt tính tổng (Utổng): là tổng số đơn vị hoạt tính có trong một thể tích nhất
định. Đơn vị: HU
Utổng = V. 2n
Trong đó: V: tổng thể tích (mL)
n: số lần pha loãng
- Hoạt tính riêng (Uriêng): là số đơn vị hoạt tính lectin có trong 1mg protein.

46. 44
Đơn vị: HU/mg
Pr
toång
rieâng
toång
U
U
otein
Trong đó: Utổng: tổng số đơn vị hoạt tính.
Proteintổng: tổng hàm lƣợng protein.
MAC (minimum agglutination concentration): là nồng độ protein nhỏ nhất có
khả năng gây ngƣng kết hồng cầu đã đƣợc xử lý enzyme. Đơn vị : µg/mL
Haømlöôïng protein
MAC
HA
2.3.3. Xác định hàm ƣợng protein.
Xác định hàm lƣợng protein bằng phƣơng pháp của Lowry và cộng sự
[130], dùng albumin huyết thanh bò (BSA – Bovine serium albumin) làm chất
chuẩn.
* Nguyên tắc
Trong môi trƣờng kiềm, ion Cu2+
tạo thành phức chất với các liên kết
peptide trong protein, khi đó nó bị khử thành ion Cu+
. Ion Cu+
và các gốc của
Tyrosine, Tryptophan và Cysteine phản ứng với thuốc thử Folin để tạo ra một
sản phẩm không bền rồi bị khử thành molipden/vonfram xanh. Cƣờng độ màu
tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định.
Đo cƣờng độ màu bằng thiết bị đo màu quang điện ở bƣớc sóng 750nm.
Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA) có thể xác định đƣợc hàm lƣợng
protein ở nồng độ vài chục µg.
* Hóa chất
- Dung dịch A: 4 gam NaOH (0,1 M) và 20 gam Na2CO3 2 % pha trong 1000
mL nƣớc cất.
- Dung dịch B: 0,5 gam CuSO4.5H2O 0,5 % pha trong dung dịch Natri Xitrat
(1 %) hoặc trong dung dịch Natri – Kali Tactrat 1 %.
- Dung dịch C: hỗn hợp của 2 dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (v/v), pha
trƣớc khi sử dụng.

47. 45
Ghi chú: Thuốc thử Folin, pha loãng 2 lần với nƣớc cất trƣớc khi sử dụng.
- Dung dịch gốc: Albumin huyết thanh bò (BSA) 1mg/mL.
* Các bƣớc tiến hành
- Cân 10 mg BSA hòa tan trong 10 mL nƣớc cất, thu đƣợc dung dịch gốc có
nồng độ 1 mg/mL.
- Sau đó, pha loãng dung dịch gốc bằng nƣớc cất thành các nồng độ 20, 40,
60, 80, 100 và 120 µg/mL để tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn.
- Lấy chính xác 0,5 mL dịch chứa protein với các nồng độ khác nhau cho vào
ống nghiệm, thêm vào đó 2,5 mL dung dịch C, lắc đều để yên trong 20 phút.
- Sau đó, thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25 mL thuốc thử Folin đã pha
loãng 2 lần, lắc đều và để yên trong 60 phút.
- Đem so màu của hỗn hợp trên máy so màu quang điện ở bƣớc sóng 750nm.
Thực hiện thí nghiệm với mẫu kép, lấy giá trị trung bình, xây dựng
đƣờng hồi quy. Kết quả đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê thông thƣờng.
Mẫu thí nghiệm cũng đƣợc chuẩn bị tƣơng tự nhƣ đã nêu trên. Sau đó,
đem so màu ở bƣớc sóng 750nm, đối chiếu với đồ thị chuẩn BSA (Phụ lục 1)
để tính hàm lƣợng protein trong các mẫu.

48. 46
2.3.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thực nghiệm:
Rong H.
eucheumatoides
Xử lý
Chiết
Lọc, ly tâm thu dịch
chịchie61t
Kết tủa dịch chiết
Ly tâm, thu tủa
Hòa tan tủa, thẩm tách
Ly tâm, thu dịch trong
Sắc ký trao đổi ion
Thu các phân đoạn có lectin
cô đặc
Sắc ký lọc gel
Sephacryl S - 200
Điện di SDS - PAGE
Lectin
Bã
Dịch
Xác định:
- Đặc tính liên kết cacbohiđrat
- Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính
Lectin: pH, nhiệt độ, …
- Khả năng gây ngƣng kết hồng cầu.
- Điện di SDS-Page, xác định:
+ Độ tinh sạch của lectin thu nhận
đƣợc
+Trọng lƣợng phân tử của Lectin
thu đƣợc
Cặn
Khảo sát điều kiện chiết:
- Dung môi chiết.
- Tỷ lệ nguyên liệu: dung môi
chiết (w/v).
- Thời gian chiết (giờ).
Khảo sát:
Nồng độ ethanol C2H5OH (%).

49. 47
Mô tả sơ đồ:
Rong đỏ H. eucheumatoides sau khi thu về đƣợc rửa sạch, tiến hành
xay rong thành bột mịn bằng cối xay inox có bổ sung nitơ lỏng. Cho rong đã
xay vào túi nilon và bảo quản trong tủ đông -20 o
C để chuẩn bị cho các thí
nghiệm sau này.
Quá trình chiết lectin đƣợc thực hiện trong các điều kiện tối ƣu nhƣ: tỷ
lệ nguyên liệu:dung môi, nồng độ dung môi, thời gian chiết. Dịch chiết thô
đƣợc lọc bằng túi vải, tiến hành ly tâm 6.000 vòng/phút trong 15 phút để loại
bỏ cặn bã.
Thêm ethanol với nồng độ thích hợp vào dịch chiết để kết tủa lectin.
Sau khi tủa, tiến hành ly tâm dịch tủa ở 6.000 vòng/phút trong 30 phút. Loại
bỏ dịch trong. Dùng lƣợng đệm ít nhất để hòa tan kết tủa. Dịch tủa sau đó
đƣợc thẩm tách, rồi tiến hành ly tâm ở 6.000 vòng/phút trong 30 phút, thu
phần dịch trong. Đây chính là chế phẩm của lectin.
Tiến hành tinh sạch lectin bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-sepharose,
thu các phân đoạn có hoạt tính ngƣng kết hồng cầu, cô đặc dịch trong bằng
màng siêu lọc kích thƣớc 10 kDa. Thẩm tách để loại muối. Tiếp tục tinh chế
lectin bằng sắc ký lọc gel Sephacryl S-200, thu các phân đoạn có hoạt tính, cô
đặc, thẩm tách trong nƣớc cất để tiến hành các thí nghiệm sau.
Lectin thu đƣợc sau sắc ký lọc gel đƣợc dùng để khảo sát một số tính
chất lý hóa nhƣ: ảnh hƣởng của nhiệt độ, ảnh hƣởng của pH, ảnh hƣởng của
cation hóa trị 2 hay EDTA, đặc tính liên kết cacbohidrat; cũng nhƣ dùng để
đánh giá độ tinh sạch, xác định khối lƣợng phân tử của lectin bằng phƣơng
pháp điện di.
2.3.5. Phân tích các điều kiện tối ƣu để chiết ectin từ rong đỏ H.
Eucheumatoides
Nguyên tắc chung:
Khi tiến hành phân tích một yếu tố nhất định trong quá trình tách chiết
nhƣ: tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết, nồng độ dung môi, thời gian

50. 48
chiết,…thì khi đó sẽ cố định các yếu tố khác và tiến hành thay đổi yếu tố
chúng ta đang phân tích. Yếu tố nào phân tích xong thì sẽ đƣợc cố định ở giá
trị tối ƣu để tiếp tục phân tích ảnh hƣởng của các yếu tố còn lại. Với mỗi yếu
tố phân tích, khi giá trị hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng của lectin đạt giá
trị cực đại thì đó là điều kiện tối ƣu đối với yếu tố chúng ta đang phân tích.
2.3.5.1. Phân tích tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết
Cân khoảng 5 gam rong đã xay cho vào các ống Falcon, tiếp tục cho
vào dung dịch ethanol 20 % với các tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v): 1:2,
1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, giữ ở 4 o
C trong 6 giờ. Sau đó lọc thô qua túi vải
rồi ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết thô (mỗi
mẫu đƣợc tiến hành 3 lần lặp lại).
Xác định hàm lƣợng protein, hoạt tính tổng số, hoạt tính riêng của từng
dịch chiết thô. Phân tích, so sánh và chọn ra tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết
(w/v) thích hợp nhất.
2.3.5.2. Phân tích nồng độ ethanol chiết
Cân khoảng 5 gam rong đã xay cho vào các ống Falcon, thêm tiếp dung
môi etanol với các nồng độ khác nhau 10 %; 20 %; 30 %; 40 %, với tỷ lệ
nguyên liệu:dung môi (w/v) thích hợp, giữ các ống này ở 4 o
C trong 6 giờ.
Sau đó lọc thô qua túi vải rồi ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút,
thu dịch chiết thô (mỗi mẫu đƣợc tiến hành 3 lần lặp lại).
Xác định hàm lƣợng protein, hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng của
từng dịch chiết thô. Phân tích, so sánh và chọn ra nồng độ dung môi chiết
thích hợp.
2.3.5.3. Phân tích thời gian chiết
Cho vào các ống Falcon rong đã xay với tỷ lệ nguyên liệu:dung môi tối
ƣu, thêm tiếp dung môi ethanol có nồng độ tối ƣu, giữ ở 4 o
C và trong các
khoảng thời gian khác nhau: 2, 4, 6, 8, 10, 12 (giờ). Sau từng khoảng thời
gian 2, 4, 6,…(giờ), tiến hành lọc sản phẩm qua túi vải rồi ly tâm với tốc độ

51. 49
6000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết thô (mỗi mẫu đƣợc tiến hành 3
lần lặp lại).
Xác định hàm lƣợng protein, hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng của
từng dịch chiết. Phân tích, so sánh và chọn ra thời gian chiết thích hợp.
2.3.6. Phân tích nồng độ ethanol thích hợp để kết tủa ectin từ dịch
chiết.
Tiến hành phân tích khả năng tủa lectin từ dịch chiết thô bằng tác nhân
tủa là ethanol ở các nồng độ khác nhau.
Trƣớc hết cần xác định thể tích dịch chiết thô của lectin, sau đó tính toán
theo công thức (*) để xác định thể tích ethanol tuyệt đối (đƣợc giữ lạnh ở -20
o
C) cần thêm vào dịch chiết để sau khi trộn nồng độ của ethanol có các giá trị
khoảng 50%, 60%, 70%, 80%. Tiến hành trộn và giữ lạnh ở 4 o
C qua đêm.
Phần kết tủa sẽ đƣợc thu lấy và ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong
20 phút ở 4 o
C. Kết tủa đƣợc rửa 3 lần với cồn tuyệt đối (giữ lạnh ở -20 o
C) và
ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 20 phút ở 4 o
C
(Các thí nghiệm đƣợc tiến hành 3 lần và lấy giá trị trung bình).
Công thức xác định nồng độ ethanol dùng để kết tủa lectin ứng với thể
tích 1,0 lít:
1000(y x)
y (mL)
(100 x)



[131]
Trong đó: x: nồng độ ethanol trong dịch chiết thô.
y: nồng độ ethanol thu đƣợc sau khi trộn.
100: nồng độ ethanol tuyệt đối (thực tế nồng độ ethanol
tuyệt đối chỉ đạt 96o
)
Kết tủa lectin thu đƣợc đƣợc hòa với dung dịch đệm photphat 0,02 M
không muối, pH= 7,5 (lƣợng ít nhất) để đƣa về cùng thể tích. Sau đó, tiến
hành xác định hoạt tính tổng số, hoạt tính riêng, từ đó chọn ra nồng độ tủa
thích hợp.

52. 50
2.3.7. Tinh sạch ectin bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion
DEAE-Sepharose
* Nguyên tắc: Nhựa DEAE – Sepharose là nhựa trao đổi anion yếu.
Hỗn hợp mẫu qua cột sắc ký chứa nhiều loại protein với khả năng tích điện
tích âm khác nhau, do đó, khả năng liên kết với nhựa cũng sẽ khác nhau.
Trong quá trình rửa giải, khi thay đổi nồng độ muối, những protein nào liên
kết yếu với cột sẽ bị đẩy ra trƣớc, còn những protein liên kết chặt hơn sẽ bị
đẩy ra ở nồng độ muối cao hơn.
* Quy trình chạy sắc ký trao đổi ion: Lectin từ dịch chiết sau khi kết
tủa đƣợc thẩm tách trong dung dịch đệm cacbonat 0,02 M, pH = 9,0. Phần
dịch trong đƣợc tiến hành chạy qua cột sắc ký trao đổi ion, dùng pha động là
dung dịch đệm cacbonat 0,02 M, pH = 9,0 (loại khí) để rửa giải các protein
không liên kết và các chất màu, đến khi đo đƣợc A280nm gần bằng 0. Lectin sẽ
đƣợc rửa giải bằng dung dịch đệm cacbonat 0,02 M có chứa NaCl 0,5 M, pH
= 9,0, thu các phân đoạn. Tiến hành đo A280nm, xác định hoạt tính ngƣng kết
hồng cầu của các phân đoạn, từ đó thu nhận các phân đoạn có hoạt tính và
tiến hành cô đặc nồng độ bằng màng siêu lọc kích cỡ 10 kDa. Vẽ đồ thị biểu
diễn sự tƣơng quan giá trị A280 nm, hoạt tính ngƣng kết hồng cầu và thứ tự các
phân đoạn.
Các thông số đƣợc thiết lập trong quá trình chạy sắc ký trao đổi ion
DEAE – Sepharose:
- Nhựa trao đổi ion DEAE – Sepharose
- Kích thƣớc cột: 1,6 x 20 cm
- Pha động: dung dịch đệm cacbonat 0,02 M; pH = 9,0 (loại khí);
dung dịch đệm cacbonat 0,02 M, có chứa NaCl 0,5 M,
pH = 9,0 (loại khí).
- Thể tích mẫu: 10 mL
- Tốc độ dòng: 10 mL/phút
- Thể tích mỗi phân đoạn: 5 mL/phân đoạn
- Số lƣợng phân đoạn: 54 phân đoạn.
- Tổng thể tích dung dịch đệm rửa giải: 270 mL.

53. 51
2.3.8. Tinh sạch ectin bằng phƣơng pháp sắc ký ọc ge Sephacry
S – 200 .
* Nguyên tắc: Sephacryl S-200 là gel agarose có khả năng phân tách
những protein có kích thƣớc từ 5,0.103
– 2,5.105
Da. Do đó, khi cho dịch
chiết chứa protein qua cột, những chất có kích thƣớc lớn đi len lõi ở bên ngoài
các hạt gel, di chuyển nhanh và ra ngoài trƣớc; trong khi đó những phân tử có
kích thƣớc nhỏ thì bị hấp thụ vào bên trong lỗ gel nên di chuyển chậm, ra
khỏi cột sau.
* Quy trình chạy sắc ký lọc gel: Dịch thu đƣợc sau khi chạy sắc ký
trao đổi ion DEAE-sepharose có hoạt tính ngƣng kết hồng cầu đƣợc cô đặc
bằng màng siêu lọc có kích thƣớc cỡ 10 kDa, sau đó tiến hành thẩm tách
trong đệm photphat 0,05M có chứa NaCl 0,15M, pH = 7,0 ở 4 o
C (để qua
đêm) để cân bằng nồng độ muối và pH.
Tiến hành tinh sạch lectin bằng cách bơm mẫu vào cột sắc ký, sử dụng
pha động là dung dịch đệm photphat 0,05M có chứa NaCl 0,15M, pH = 7,0
(loại khí), rửa giải một thể tích cột, thu các phân đoạn. Sau đó đo A280nm và
xác định hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của từng phân đoạn. Thu nhận các
phân đoạn có hoạt tính và cô đặc nồng độ dịch thu đƣợc bằng màng siêu lọc
kích cỡ 10 kDa.
Vẽ đồ thị biểu diễn sự tƣơng quan giá trị A280nm, hoạt tính ngƣng kết
hồng cầu và thứ tự các phân đoạn.
* Các thông số kỹ thuật đƣợc thiết lập khi tinh sạch lectin bằng sắc ký lọc gel:
- Gel: Sephacryl S – 200
- Kích thƣớc cột: 1x30cm
- Pha động: dung dịch đệm photphat 0,05M có chứa NaCl 0,15M,
pH = 7,0 (loại khí)
- Thể tích mẫu: 1,0 mL
- Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút
- Thể tích mỗi phân đoạn: 2,5 mL/phân đoạn
- Số lƣợng phân đoạn: 52 phân đoạn.
- Tổng thể tích dung dịch đệm rửa giải: 130 mL.