Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng cellulase ở một số chủng Bacillus phân lập từ đất vườn.doc

Dịch vụ viết thuê đề tài – KB Zalo/Tele 0917.193.864 – luanvantrust.com
Kham thảo miễn phí – Kết bạn Zalo/Tele mình 0917.193.864
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
Nguyễn Thùy Dương
NGHIÊN CỨU SỰ TỔNG HỢP CẢM
ỨNG CELLULASE Ở MỘT SỐ CHỦNG
BACILLUS PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VƯỜN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Thành phố Hồ Chí Minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
NGHIÊN CỨU SỰ TỔNG HỢP CẢM ỨNG
CELLULASE Ở MỘT SỐ CHỦNG
BACILLUS PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VƯỜN
Chuyên ngành: Vi sinh vật
Mã số: 60 42 40
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. TRẦN THANH THỦY
Thành phố Hồ Chí Minh

i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. TRẦN THANH THỦY – Người đã
hết lòng dạy dỗ, quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình tôi thực
hiện đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả các Thầy, Cô khoa Sinh học đặc biệt là cô
Tuyến và Ths. Minh Định phụ trách phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường
Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã hết lòng hướng dẫn và giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian theo học và tiến hành đề tài.
Tôi xin cảm ơn Sở Giáo dục – Đào tạo tỉnh Tiền Giang, Trường THPT Vĩnh
Bình – Tiền Giang đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian đi học.
Tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, động viên
và luôn bên cạnh tôi.

ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu được trình bày trong phần kết quả
của luận văn này là do chính bản thân tôi thực hiện và chưa từng
được ai công bố trong bất kì công trình nào.
Tác giả luận văn

iii
MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn .......................................................................................................................i
Lời cam đoan...................................................................................................................ii
Mục lục.......................................................................................................................... iii
Danh mục các chữ viết tắt..............................................................................................vi
Danh mục các bảng .......................................................................................................vii
Danh mục các hình.......................................................................................................viii
MỞ ĐẦU.........................................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..........................................................................3
1.1. Vi khuẩn Bacillus..................................................................................................4
1.1.1. Đặc điểm chung..............................................................................................4
1.1.2. Hệ enzyme của Bacillus..............................................................................6
1.1.3. Một số ứng dụng quan trọng của Bacillus ..................................................7
1.2. Cellulose và enzyme cellulase ..............................................................................9
1.2.1. Cellulose......................................................................................................9
1.2.2. Sơ lược về enzyme cellulase.....................................................................10
1.2.3. Phương pháp nuôi cấy VSV để thu nhận enzyme cellulase......................20
1.3. Sự cảm ứng sinh tổng hợp enzyme.....................................................................22
1.3.1. Hiện tượng cảm ứng..................................................................................22
1.3.2. Mô hình cảm ứng operon Lac ...................................................................23
1.3.3. Sinh tổng hợp enzyme cảm ứng................................................................27
1.3.4. Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzyme ....................................................28
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................30
2.1. Nguyên vật liệu...................................................................................................31
2.2. Hóa chất, thiết bị.................................................................................................31
2.2.1. Hóa chất.....................................................................................................31
2.2.2. Thiết bị ......................................................................................................31
2.3. Các môi trường sử dụng......................................................................................31

iv
2.4. Các phương pháp nghiên cứu .............................................................................33
2.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus........................................................................33
2.4.2. Phương pháp bảo quản giống....................................................................34
2.4.3. Quan sát hình thái khuẩn lạc .....................................................................34
2.4.4. Phương pháp nhuộm Gram...........................................................................34
2.4.5. Phương pháp nhuộm bào tử..........................................................................35
2.4.6. Phương pháp xác định hoạt tính catalase .....................................................36
2.4.7. Phương pháp định danh đến loài bằng sinh học phân tử ..........................36
2.4.8. Phương pháp chiết dung dịch enzyme thô từ canh trường nuôi cấy VK .. 37
2.4.9. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme bằng cách đo đường kính vòng
thủy phân ................................................................................................................38
2.4.10. Xác định hoạt độ cellulase theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS39
2.4.11. Phương pháp định lượng cellulose.............................................................41
2.4.12. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng .................42
2.4.13. Phương pháp khảo sát một số điều kiện môi trường nuôi cấy để thu nhận
cellulase ..................................................................................................................42
2.4.14. Phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme cellulase thô.............................43
2.4.15. Phương pháp khảo sát một vài đặc điểm cellulase của chủng Bacillus
được chọn ...............................................................................................................43
2.4.16. Phương pháp xử lí số liệu...........................................................................44
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN....................................................................45
3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng VK có hoạt tính cellulase ............................46
3.1.1. Phân lập.....................................................................................................46
3.1.2. Tuyển chọn sơ bộ ......................................................................................47
3.1.3. Tuyển chọn lần hai....................................................................................48
3.1.4. Tuyển chọn lần ba .....................................................................................50
3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai chủng ĐM19.1 và ĐM20.2...................52
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp
cellulase của hai chủng Bacillus................................................................................54
3.3.1. Ảnh hưởng của các loại cơ chất cảm ứng .................................................54

v
3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng.................................................56
3.4. Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT lên khả năng sinh tổng hợp cellulase
của hai chủng Bacillus ...............................................................................................58
3.4.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy............................................................58
3.4.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ........................................................................59
3.4.3. Ảnh hưởng của pH ban đầu.......................................................................63
3.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ............................................................................65
3.5. Định danh chủng ĐM19.1 đến loài bằng sinh học phân tử ................................68
3.6. Thu nhận cellulase thô từ canh trường nuôi cấy B. amyloliquefaciens ĐM19.1 69
3.7. Khảo sát một vài đặc điểm CPE cellulase của B. amyloliquefaciens ĐM19.1 ..70
3.7.1. Khảo sát giá trị pH thích hợp cho hoạt động của enzyme ........................70
3.7.2. Khảo sát nồng độ cơ chất thích hợp cho hoạt động của enzyme ..............72
3.7.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của enzyme ......................73
3.7.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên lượng glucose tạo thành 75
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................77
4.1. Kết luận...............................................................................................................77
4.2. Kiến nghị.............................................................................................................79
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................79
PHỤ LỤC......................................................................................................................89

vi
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CPE
CPE B
CMC
DNS
KL
KHV
MT
NA
NB
NXB
OD
TB
STT
VK
VSV
Chế phẩm enzyme
Chế phẩm enzyme của chủng B. amyloliquefaciens
Carboxymethyl cellulose
Acid 3,5 – dinitrosalicylic
Khuẩn lạc
Kính hiển vi
Môi trường
Nutrient Agar
Nutrient Broth
Nhà xuất bản
Mật độ quang
Tế bào
Số thứ tự
Vi khuẩn
Vi sinh vật

vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số enzyme ngoại bào của Bacillus..................................................................... 6
Bảng 1.2. Thuộc tính enzyme cellulase từ B. subtilis ............................................................14
Bảng 2.2. Xây dựng đường chuẩn glucose theo phương pháp so màu với thuốc thử
DNS..............................................................................................................................................................40
Bảng 3.1. Vòng phân giải CMC của 69 chủng vi khuẩn có hoạt tính cellulase .........48
Bảng 3.2. Tóm tắt khả năng sinh cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập.............50
Bảng 3.3. Hoạt độ cellulase của 8 chủng VK được chọn .....................................................51
Bảng 3.4. Kết quả 3 lần tuyển chọn các chủng VK có hoạt tính cellulase cao...........52
Bảng 3.5. Đặc điểm sinh học của hai chủng ĐM19.1 và ĐM20.2...................................52
Bảng 3.6. Hàm lượng cellulose trong các loại cơ chất ..........................................................54
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các loại cơ chất cảm ứng đến hoạt độ cellulase của 2
chủng Bacillus .........................................................................................................................................55
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến hoạt độ cellulase của 2
chủng Bacillus .........................................................................................................................................56
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus.....57
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus 60
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ đến hoạt độ cellulase của 2 chủng
Bacillus .......................................................................................................................................................62
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus64
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus .....66
Bảng 3.14. Các điều kiện MT thích hợp cho sự sinh tổng hợp cellulase của 2
chủng Bacillus .........................................................................................................................................67
Bảng 3.15. Kết quả thu nhận enzyme thô từ Bacillus amyloliquefaciens ĐM19.1 .. 69
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của CPE B......................................................70
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính của CPE B ...........................71
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của CPE B ...........................................73
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của thời gian lên hoạt tính của CPE B..........................................74

viii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cơ chế hoạt động của exoglucanase..........................................................................11
Hình 1.2. Cơ chế hoạt động của endoglucanase.......................................................................11
Hình 1.3. Cơ chế hoạt động của β –glucosidase.......................................................................12
Hình 1.4. Cơ chế thủy phân cellulose theo Erikson................................................................12
Hình 1.5. Cấu trúc của operon lac...................................................................................................23
Hình 1.6. Promoter của operon lac.................................................................................................24
Hình 1.7. Hoạt động của operon lac trong MT nuôi cấy không có chất cảm ứng ....25
Hình 1.8. Hoạt động của operon lac trong MT nuôi cấy có chất cảm ứng ...................26
Hình 1.9. Sự điều hòa enzyme theo nguyên tắc liên kết ngược.........................................29
Hình 3.1. Hình thái KL của một số chủng VK phân lập được ...........................................46
Hình 3.2. Vòng phân giải CMC của một số chủng VK phân lập được bằng phương
pháp cấy chấm điểm..............................................................................................................................47
Hình 3.3. Vòng phân giải CMC của một số chủng VK phân lập được bằng phương
pháp đo đường kính vòng thủy phân .............................................................................................49
Hình 3.4. Vòng phân giải CMC của 8 chủng VK có hoạt tính cellulase cao nhất....50
Hình 3.5. Hoạt độ cellulase của 8 chủng vi khuẩn có đường kính vòng phân giải
lớn nhất .......................................................................................................................................................51
Hình 3.5. Hình thái KL của hai chủng ĐM19.1 và ĐM20.2...............................................53
Hình 3.6. Hình thái tế bào của hai chủng ĐM19.1 và ĐM20.2.........................................53
Hình 3.7. Bào tử của hai chủng ĐM19.1 và ĐM20.2 ............................................................53
Hình 3.9. Ảnh hưởng của các loại cơ chất cảm ứng đến hoạt độ cellulase của 2
chủng Bacillus .........................................................................................................................................55
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến hoạt độ cellulase của 2
chủng Bacillus .........................................................................................................................................57
Hình 3.11. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus....58
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus 60
Hình 3.13. Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ đến hoạt độ cellulase của 2 chủng
Bacillus .......................................................................................................................................................62

ix
Hình 3.14. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus64
Hình 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ cellulase của 2 chủng Bacillus.....66
Hình 3.16. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của CPE B.......................................................70
Hình 3.17. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính của CPE B............................72
Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của CPE B............................................73
Hình 3.19. Ảnh hưởng của thời gian lên hoạt tính của CPE B ..........................................75

1
MỞ ĐẦU
Lí do chọn đề tài
Enzyme đã được sử dụng từ rất lâu. Khoảng 5.000 năm trước công nguyên, ở
Jerico người ta đã biết đến kỹ thuật làm bánh mì. Trong thành cổ Babylon, việc nấu
rượu vang, sản xuất dấm, tương, chao… đã được thực hiện. Ở các mức độ khác
nhau, đây là những quá trình sinh học xưa nhất trong lịch sử phát triển văn minh
nhân loại.
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế
phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong
các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm,
khối lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá
trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau.
Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại
enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là
enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. So với nguồn
enzyme từ động vật và thực vật, nguồn enzyme từ VSV có nhiều ưu điểm như hoạt
tính enzyme cao, thời gian tổng hợp enzyme từ VSV rất ngắn, nguyên liệu sản xuất
rẻ tiền, có thể sản xuất theo qui mô công nghiệp. Qua nhiều năm, việc sử dụng VSV
như một nguồn cung cấp enzyme đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất, các sản
phẩm được tạo ra nhiều hơn với giá thành giảm, chất lượng sản phẩm tăng lên đáng
kể và làm giảm tác động xấu tới môi trường.
Trong các VSV phải kể đến các loài VK thuộc chi Bacillus. Các ứng dụng
của Bacillus có liên quan đến enzyme ngày càng tăng và hiệu quả ngày càng cao.
Các ứng dụng của chúng bao trùm hàng loạt lĩnh vực, từ sản xuất thực phẩm thủ
công truyền thống đến công nghệ lên men hiện đại, đến sinh học phân tử, y-dược
học chữa các bệnh hiểm nghèo, mỹ phẩm, xử lý môi trường ô nhiễm, thu hồi bạc
kim loại từ các phế liệu. Hệ enzyme của Bacillus rất phong phú và đa dạng gồm
protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase, pectinase. Trong đó,

2
cellulase - hệ enzyme thủy phân cellulose – là một enzyme đã được sản xuất với qui
mô công nghiệp và ứng dụng rộng rãi trong trong nhiều ngành công nghiệp như chế
biến thực phẩm, công nghiệp dệt, tẩy, sản xuất ethanol; trong nông nghiệp, cellulase
được dùng trong xử lý đất để tăng độ màu mỡ.
Nhằm đa dạng hóa nguồn cung cấp enzyme cellulase từ VSV và nâng cao
hiệu quả sinh tổng hợp cellulase, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sự tổng
hợp cảm ứng cellulase ở một số chủng Bacillus phân lập từ đất vườn”.
Mục tiêu của đề tài
Nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp cellulase của các chủng Bacillus phân lập
từ đất vườn .
Nhiệm vụ của đề tài
1. Phân lập được một số chủng Bacillus sinh enzyme cellulase từ đất vườn. Từ
đó, tuyển chọn ra chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao.
2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và một số đặc tính sinh học của các chủng đã
chọn.
3. Xác định nguồn cơ chất cảm ứng thích hợp cho sinh tổng hợp cellulase cao.
Khảo sát nồng độ cơ chất cảm ứng tối ưu cho sinh tổng hợp cellulase cao.
4. Xác định các điều kiện môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp cellulase.
5. Phân loại đến loài 1 chủng Bacillus sinh tổng hợp cellulase có hoạt tính cao
nhất.
6. Xác định hiệu suất thu nhận của chế phẩm enzyme thô từ chủng cho hoạt tính
cellulase cao nhất.
7. Nghiên cứu một số đặc điểm của chế phẩm enzyme thô.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
− Thời gian: từ tháng 11/2011 đến tháng 09/2012
− Địa điểm: thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh-Sinh hóa, khoa Sinh học,
Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh.

3
Chương 1. TỔNG
QUAN TÀI LIỆU

4
1.1. Vi khuẩn Bacillus
1.1.1. Đặc điểm chung
Vi khuẩn Bacillus được Ehrenberg mô tả lần đầu tiên năm 1835 là “Vibrio
subtilis”. Bacillus là VK Gram dương, hình que có kích thước khác nhau (0,5 –
2,5)x(1,2 – 10)μm. Bacillus có chùm tiêm mao giúp chúng có khả năng di động.
Bacillus có khả năng sinh bào tử. Bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia tử ngoại,
phóng xạ và nhiều độc tố, có khả năng tồn tại trong nhiều năm. Bào tử của VK
không phải là một hình thức sinh sản mà chỉ hình thức thích nghi giúp VK vượt qua
những điều kiện sống bất lợi.
Bacillus có khả năng phát triển và sinh bào tử trong điều kiện hiếu khí, trao
đổi năng lượng thông qua quá trình lên men hoặc hô hấp hiếu khí. Nhiều loài
Bacillus tiết enzyme ngoại bào chịu trách nhiệm chuyển hóa các hợp chất cao phân
tử trong môi trường (những chất không thể chuyển vào TB vì quá lớn) thành các
chất có trọng lượng phân tử thấp làm nguồn cacbon và năng lượng.
Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 – 10 như
Bacillus alcalophilus, hay có loại phù hợp với pH = 2 – 6 như Bacillus
acidocaldrius [5]. Có nhiều chủng Bacillus ưa nhiệt độ cao (450
C – 750
C) hay ưa
lạnh (50
C – 250
C), nhưng thường gặp Bacillus sống ở nhiệt độ 300
C – 370
C.
Phần lớn Bacillus là những VK dị dưỡng hóa năng, thu năng lượng do oxy
hóa các hợp chất hữu cơ. Một số VK ưa nhiệt tự dưỡng không bắt buộc (B.
schlegelli) có khả năng phát triển trong môi trường chỉ có CO2 và CO là nguồn
cacbon duy nhất. Một số loài Bacillus (B. subtilis) có khả năng sử dụng các chất vô
cơ, trong khi một số loài khác (B. sphaericus, B. cereus) cần các hợp chất hữu cơ
(vitamin, acid amin) cho sự sinh trưởng. Đặc biệt Bacillus gây bệnh côn trùng (B.
popilliae, B. lentimorbus) có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển
trong môi trường nuôi cấy thông thường như: NA, NB [46].
Các loài thuộc chi Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong nước,
không khí đặc biệt là trong đất do có khả năng hình thành nội bào tử và sống hiếu
khí tùy tiện. Dưới đây là một số loài Bacillus thường gặp.

5
B. subtilis – KL khô, không màu hoặc có màu xám nhạt, hơi nhăn, tạo ra lớp
màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào MT thạch. Trực khuẩn
hình que, ngắn, nhỏ, TB đứng riêng rẽ hoặc chuỗi. Bào tử hình bầu dục, phân bố
lệch tâm.
B. amyloliquefaciens có hình thái KL và TB tương tự B. subtilis nhưng khác
nhau về đặc tính sinh hóa. Thành phần G + C của B. subtilis khoảng 41,5% - 43,5%,
còn trong chủng B. amyloliquefaciens là 43,5% - 44,9%. B. amyloliquefaciens có
khả năng lên men đường lactose nhanh và lên men glucose chậm.
B. licheniformis là VK hoại sinh, bào tử hình oval, phát tán chủ yếu trong
đất, kể cả đất nghèo dinh dưỡng như đất hoang hay sa mạc. KL nhỏ, màu trắng đục,
bề mặt nhăn nheo.
B. pumilus phát tán rộng khắp nơi, thường có mặt trong đất nhiều hơn B.
subtilis. KL nhỏ, TB gần giống tế bào B. subtilis.
B. megaterium – KL hình tròn đều, không có thùy, không có nếp, mép tròn
hoặc hơi lượn sóng, màu trắng kem. Tế bào B. megaterium dài, đứng riêng rẽ hoặc
xếp thành chuỗi. Bào tử hình elip, nằm lệch tâm.
B. simplex – KL có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết vào môi
trường. Tế bào B. simplex nhỏ, thường đứng riêng rẽ, không gắn thành chuỗi, bào tử
hình bầu dục nằm lệch tâm.
B. brevis – KL màu trắng, đôi khi có màu vàng, lồi hoặc phẳng, lấp lánh,
mép răng cưa giống như dạng mỡ đặc.Trực khuẩn đứng riêng rẽ, đôi khi xếp thành
chuỗi. Bào tử hình bầu dục, nằm cuối tế bào làm cho TB có một đầu hơi phồng.
B. polymyxa – KL vô màu, phẳng hoặc lồi, trơn, lan dần ra xung quanh, mép
đôi khi có thùy. Tế bào B. polymyxa đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đôi, chuỗi ngắn.
bào tử hình bầu dục, trên bề mặt cắt ngang như hình sao, nằm giữa TB.
B. aslersporus – KL nhỏ, màu trắng hay màu lục nhạt, phẳng, mềm, nhày,
đồng chất. TB đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đôi. Bào tử hình trụ hay hình kéo dài,
nằm giữa TB. Khi hình thành bào tử TB phồng lên một chút giống như dạng
Clostridium.

6
1.1.2. Hệ enzyme của Bacillus
Bacillus có hệ enzyme ngoại bào rất đa dạng. Một số enzyme ngoại bào phổ
biến của Bacillus được tóm tắt ở bảng 1.1.
Bảng 1.1. Một số enzyme ngoại bào của Bacillus [64], [68]
Enzyme Tên chủng Bacillus
Amylase B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. polymyxa, B.
stearothermophilus, B. caldolyticus, B. subtilis, B.
Licheniformis, B. megaterium, Bacillus spp.
Cellulase B. subtilis, B. brevis, B. fimus, B. polymyxa, B. pumilus,
B. amyloliquefaciens.
Xylanase B. amyloliquefciens, B. fimus, B. polymyxa, B. subtilis
var. amylosacchariticus.
Alkalophilic Alkalophilic Bacillus spp.
protease
Serine-metal B. licheniformis, B. pumilus.
protease
Serine protease B. licheniformis, B. subtilis, B. pumilus, B. subtilis var.
amylosacchariticus.
Metal protease B. amyloliquefciens, B. cereus, B. licheniformis, B.
megaterium, B. polymyxa, B. subtilis, B. subtilis var.
amylosacchariticus, B. thermoproteolyticus, B.
thuringiensis.
 Amylase là nhóm enzyme thủy phân tinh bột bao gồm nhiều enzyme khác
nhau về tính đặc hiệu tác dụng lên tinh bột (vị trí khác nhau trên mạch tinh bột)
như α-amylase, β-amylase, glucoamylase… Amylase là một trong những enzyme
được ứng dụng rộng rãi hơn cả, đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm.

7
Amylase của Bacillus có thể chịu được nhiệt độ cao, có thể giữ được hoạt lực
ngay cả khi đun sôi trong nước một thời gian ngắn. Tính bền nhiệt này là một ưu
điểm lớn được sử dụng để xử lí nguyên liệu ở các công đoạn phải dùng nhiệt độ
cao hoặc MT nhiệt đới như ở nước ta. Ở Nhật, hàng năm sản xuất tới 7 000 tấn
amylase từ VK [21].
 Protase là nhóm enzyme thủy phân liên kết peptide của protein, polypeptide
đến sản phẩm cuối cùng là các acid amin. Nhiều protease còn có thể xúc tác phản
ứng thủy phân liên kết este, liên kết amid và phản ứng chuyển vị gốc amin [3], [2].
Protease Bacillus có đủ loại, tùy theo pH thích hợp người ta chia ra protease acid
tính, kiềm tính và trung tính. Protease cũng như amylase có ứng dụng khá rộng rãi
trong công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm.

 . Cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thông qua
việc thủy phân liên kết β-1,4-D-glucosid trong cellulose. Cellulase là một trong
những enzyme có vai trò rất quan trọng trong quá trình chuyển hóa vật chất hữu cơ
có trong thiên nhiên và có ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp thực phẩm, bảo vệ môi
trường. Dù được biết đến chậm hơn rất nhiều so với enzyme amylase và protease,
nhưng những nghiên cứu và ứng dụng của cellulase là không ít. Ngày nay, nhiều
nước đã sản xuất chế phẩm cellulase từ VSV trong công nghiệp ở qui mô lớn và áp
dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau.

1.1.3. Một số ứng dụng quan trọng của Bacillus

Bacillus được ứng dụng nhiều trong sản xuất enzyme công nghiệp vì nó có
khả năng sinh các loại enzyme như protease, amylase, cellulase, lipase, urease…
Ngoài ra, Bacillus còn có khả năng sinh các chất chuyển hóa sơ cấp như nucleotide
acid, inosinic acid, guanilic acid, kháng sinh. Dưới điều kiện sống thiếu dinh dưỡng
Bacillus còn có khả năng sinh các loại kháng sinh peptid như surfactin hay subtilin
có hoạt tính kháng khuẩn [49].
Sự hình thành bào tử của Bacillus thường xảy ra đồng thời với quá trình sinh
hóa khác như tổng hợp protein tinh thể (B. sphaericus, B. thurigiensis) hay tổng hợp
một số chất kháng khuẩn bản chất polypeptide (baxitraxin, tyroxidin, gramixidin,

8
polymidin). Nhiều kháng sinh polypeptide được mô tả chi tiết về tính chất hóa học
và chức năng. Căn cứ vào thành phần cấu tạo và chức năng tác dụng, người ta chia
kháng sinh polypeptide thành 3 lớp:
- Adeine: có tác dụng ức chế sinh tổng hợp màng tế bào VK.
- Baxitraxin: có tác dụng ức chế sinh tổng hợp màng TB.
- Gramixidin, polymidin, tyroxidin: có tác dụng sửa đổi và cấu tạo chức
năng của màng [76].
Baxitraxin là nhóm quan trọng nhất, được tổng hợp từ VK B. licheniformis
và B. subtilis. Baxitraxin có hoạt tính sinh học đa dạng: kích thích phân giải TB, tạo
TB trần, ngăn cản sự đồng hóa các acid amin tổng hợp mucopeptide thành TB.
Baxitraxin có hiệu lực chống các VK Gram dương như: Actinomyces, Clostridium,
Staphylococcus, Haemophilus, Diplococcus, Corynebacterium…
Baxitraxin được ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm để bảo quả
thịt cá, trong y học điều chế thuốc chữa bệnh, đặc biệt Zn-baxitraxin là một trong
bảy loại kháng sinh được ứng dụng rộng rãi trong chăn nuôi để kích thích tăng trọng
và phòng chống bệnh [19].
Hiện nay, một số chủng Bacillus như B. laterosporus, B. fimus và B. cereus
đang được nghiên cứu trong sản xuất chất dẻo sinh học (hydroxybutyrate). Bacillus
pasteurii được đưa vào đất ướt để tạo ra calcite – một chất xi măng liên kết đất,
chuyển hóa đất thành đá làm vững nền móng các toà nhà và giúp chúng chịu được
động đất [77] .
Trong công nghệ thực phẩm, người ta ứng dụng VK Bacillus để sản xuất các
enzyme quan trọng. Chế phẩm amylase từ B. subtilis, B. diastaticus chịu nhiệt độ
cao được dùng trong giai đoạn dịch hóa tinh bột trước khi đường hóa rất tốt, ở nhiệt
độ 80 – 900
C/ 10 – 15 phút α-amylase của VK bị vô hoạt một phần rất nhỏ [22].
Chế phẩm protease từ B. subtilis có khả năng thủy phân tốt protein (gọi tên là
subtilizin), từ B. mensentericus thủy phân tốt protid đến acid amin và đông tụ được
sữa nên được ứng dụng để thay thế một phần renin sản xuất phomat, rút ngắn thời
gian trong trong quy trình sản xuất nước mắm và cải thiện hương vị của nước mắm.

9
Trong chế phẩm sinh học, B. thuringiensis được ứng dụng làm thuốc trừ
sâu vi sinh, B. thuringiensis làm chế phẩm Israelensis serotype H14 diệt lăng
quăng. Do có khả năng tạo bào tử chịu nhiệt, sinh các loại enzyme ngoại bào và
khả năng đối kháng với các VSV gây bệnh (Streptococcus pyogenes, E. coli,
Samonella, Vibrio spp) nên Bacillus spp. được sử dụng làm probiotic trong chăn
nuôi và thủy sản, Bacillus subtilis dùng làm chế phẩm phòng và điều trị viêm tai
mũi họng ở người.
Trong công nghệ sinh học, Bacillus còn được dùng làm vật chủ biểu hiện gen
để sản xuất các loại enzyme, acid amin, vitamin và polysaccharide.
Các chủng B. brevis có khả năng tiết nhiều protein nhưng không tiết protease
vào MT nuôi cấy nên được sử dụng làm hệ thống vector biểu hiện các protein tái tổ
hợp của người, động vật có vú và các sinh vật khác như nhân tố tăng trưởng biểu
mô, insulin, interleukin 1-β của bò, hormon tăng trưởng của cá bơn, antigen virus
viêm gan B,…[54], [68], [76].
1.2. Cellulose và enzyme cellulase
1.2.1. Cellulose
Cellulose là polymer sinh học phong phú nhất trên trái đất (Murahima,
2002), được sinh tổng hợp chủ yếu bởi thực vật với tốc độ 4.109
tấn/năm. Hàng
năm có khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp nhờ quá trình
quang hợp. Hàng ngày, hàng giờ một lượng lớn cellulose được tích lũy trong đất
do các sản phẩm tổng hợp của thực vật thải ra, cây cối chết đi cành lá rụng
xuống, một phần do con người thải ra dưới dạng rác, giấy vụn, mùn cưa…Trong
số này có đến 30% là màng TB thực vật mà thành phần chủ yếu là cellulose.
Cellulose chiếm đến 89% trong bông và 40 – 50% trong gỗ.
Cellulose là polymer mạch thẳng, mỗi đơn vị là disaccharid gọi là cellobiose
có cấu trúc từ hai phân tử D-glucose được nối với nhau qua liên kết β-1,4-glucoside.
Cellulose cấu tạo dạng sợi, các sợi liên kết lại tạo thành những bó nhỏ gọi là các
microfibrin có cấu trúc không đồng nhất, có những phần đặc biệt gọi là phần kết
tinh và phần xốp hơn gọi là phần vô định hình [30].

10
Cellulose không tan trong nước nhưng có thể trương lên do hấp thu nước.
Cellulose bị phân hủy khi đun nóng với acid hoặc kiềm đặc ở nồng độ cao. Tuy
nhiên, cellulose sẽ bị phân hủy bởi enzyme cellulase ở nhiệt độ từ 40 – 500
C [30].
Trong TB thực vật cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose (chiếm 20 –
40% trọng lượng khô). Đây là loại heteropolymer chứa nhiều loại monosaccharide
như galactose, mannose, glucose, xylose, arabinose và các nhóm acetyl; do bản chất
không kết tinh nên hemicellulose tương đối dễ bị thủy phân. Cellulose còn liên kết
chặt chẽ với lignin (10 – 25% trọng lượng khô). Đây là thành phần ảnh hưởng rất
nhiều đến sự thủy phân cellulose của enzyme. Chỉ trong một số trường hợp (ví dụ
trong sợi bông) cellulose tồn tại trong trạng thái một polymer gần tinh khiết [30].
Việc sử dụng cơ chất lignocellulose để sản xuất các enzyme thủy phân cơ
chất này có tiềm năng ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp như hóa chất, nhiên
liệu, thực phẩm, rượu và bia, thức ăn gia súc, vải sợi, bột giặt, giấy và bột giấy
[17]…
1.2.2. Sơ lược về enzyme cellulase
Cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thông qua
việc thủy phân liên kết β-1,4-D-glucosid trong cellulose.
1.2.2.1. Phân loại và cơ chế hoạt động
Từ năm 1960, những quan sát đầu tiên về cellulase được tiến hành bởi
Seilliere. Sau đó, hàng loạt nghiên cứu của các tác giả đã được tổng kết một cách hệ
thống và toàn diện trong các công trình của Goksoyr và Eriksen, Bisaria và Ghose,
Enari, Tanaka và Matsuno…, đã cung cấp khá đầy đủ và chính xác về hệ enzyme
thủy phân cellulose. Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzyme
cellulase được chia làm ba loại:
 Exoglucanase (EC 3.2.1.91)
Enzyme này còn có các tên gọi khác như :1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase,
exo-1,4-glucanase, cellulase C1, cellobiohydrolase, CBH1, cellobiosidase,
avicellase, exo cellobiohydrolase, exo-β-glucancellobiohydrolase…

11
Enzyme này thủy phân liên kết β-1,4-glucosid từ đầu không khử của
chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose, không thủy phân cellulose dạng kết tinh
và dạng hòa tan mà chỉ làm thay đổi tính chất lý hóa của chúng. Có lẽ vai trò
chính của enzyme này là giúp cho endoglucanase tác động lên cellulose kết
tinh.
Hình 1.1. Cơ chế hoạt động của exoglucanase [78]
 Endoglucanase (EC 3.2.1.4)
Enzyme này còn có tên gọi khác như: β-1,4-endoglucan hydrolase,
endocellulase, CMCase, Cx, β-1,4-glucanase, cellulosin AP, alkali cellulase,
cellulose A …
Enzyme này thủy phân liên kết β-1,4-glucosid một cách ngẫn nhiên bên
trong chuỗi cellulose để giải phóng cellodextrin, cellobiose và glucose; nó tác
động mạnh đến cellulose vô định hình nhưng tác động yếu đến cellulose kết
tinh.
Hình 1.2. Cơ chế hoạt động của endoglucanase [78]
 β –glucosidase (EC 3.2.1.21)
Enzyme này còn có tên gọi khác như:, p-nitrophenyl β-glucosidase,
salicilinase…; thủy phân cellobiose và các cello-oligosaccharide mạch ngắn tạo

12
thành glucose; β-glucosidase không tấn công cellulose hoặc các cellodextrin
khác
cellobiose β-glucosidase
glucose
Hình 1.3. Cơ chế hoạt động của β –glucosidase [78]
Trong thiên nhiên, thủy phân cellulose có sự tham gia của tất cả ba loại
enzyme cellulase như endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase. Từ những
nghiên cứu riêng rẽ từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động tổng hợp của cả ba
loại enzyme cellulase, nhiều tác giả đều đưa ra kết luận chung là các loại enzyme
cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là
glucose. Có nhiều cách trình bày khác nhau, cách trình bày cơ chế tác động của
cellulase do Erikson đưa ra được nhiều người công nhận hơn cả.
Hình 1.4. Cơ chế thủy phân cellulose theo Erikson [34]
1.2.2.2. Cấu trúc và tính chất
 Cấu trúc
Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là acid amin, các
acid amin được nối với nhau bởi liên kết peptid –CO-NH-. Ngoài ra trong cấu trúc

13
còn có những phần phụ khác. Cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme nhóm
endoglucanase và exoglucanase bao gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận
cùng, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác và được gắn thêm vùng glycosil
hóa, cuối đuôi là vùng liên kết với cellulose (CBD: cellulose binding domain). Vùng
này có vai trò tạo liên kết với cellulose tinh thể.
Trong quá trình phân hủy cellulose có sự tương quan mạnh giữa khả năng
xúc tác phân giải cellulose của các enzyme và ái lực của các enzyme này đối với
cellulose. Hơn nữa, hoạt tính của cellulase dựa vào tinh thể cellulose và khả năng
kết hợp của CBD với cellulose. Điều này chứng tỏ CBD làm gia tăng hoạt tính
cellulase đối với tinh thể cellulose. Sự có mặt của CBD sẽ hỗ trợ enzyme cellulase
thực hiện việc cắt đứt nhiều liên kết trong cellulose tinh thể. Vùng gắn kết với
cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc thay đổi
chiều dài của vùng glycosil hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme
[14].
 Tính chất
Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như carboxymethyl
cellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC). Cellulase cắt liên kết β-1,4-
glucosid trong cellulose, lignin và cắt β-D-glucan của ngũ cốc.
Cellulase hoạt động ở pH từ 3 – 7, nhưng pH tối thích trong khoảng 4 và 5.
Nhiệt độ tối ưu từ 40 – 500
C. hoạt tính cellulase bị phá hủy hoàn toàn ở 800
C trong
10 – 15 phút [34].
Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose,
cellobiose và bị ức chế hoàn toàn bởi Hg. Ngoài ra, cellulose còn bị ức chế bởi các
ion kim loại khác như Mn, Ag, Zn nhưng ở mức độ nhẹ.
Trọng lượng của enzyme cellulase thay đổi từ 30 – 110KDa (Begunin, 1990;
Gilkes và ctv, 1991).
Enzym cellulase là hệ enzym khá phổ biến ở hầu hệt các loài VSV có trong
tự nhiên, bao gồm nấm mốc, xạ khuẩn và cả VK. Trichoderma là một trong những
giống nấm được nghiên cứu nhiều nhất và đặc biệt là T. reesei. Tính ưu việt là hệ

14
enzym của chúng hoạt động rất mạnh và có khả năng phân giải hoàn toàn cellulose
tự nhiên. Trichoderma có khả năng tổng hợp một lượng lớn endoglucanase và
exoglucanase, nhưng chỉ một lượng ít β –glucosidase. VK chủ yếu tổng hợp
endoglucanase và β-glucosidase, gần như không tạo ra exoglucanase.
Endoglucanase được tạo ra từ nhiều loại nấm mốc và VK, có trọng lượng phân tử
nằm trong khoảng từ 12.000 đến 50.000.
Bảng 1.2. Thuộc tính enzyme cellulase từ B. subtilis [81]
Chiều dài chuỗi 499 AA.
Tình trạng trình tự Hoàn chỉnh
Trọng lượng phân tử 55 287 Da
Sự tồn tại Tồn tại ở dạng protein.
1.2.2.3. Ứng dụng của cellulase
Cellulase là một trong những enzyme có vai trò rất quan trọng trong quá trình
chuyển hóa vật chất hữu cơ có trong thiên nhiên và có ý nghĩa rất lớn trong công
nghiệp thực phẩm, bảo vệ môi trường. Dù được biết đến chậm hơn rất nhiều so với
enzyme amylase và protease, nhưng những nghiên cứu và ứng dụng của cellulase là
không ít.
 Trong công nghiệp giấy [89]
Enzyme cellulase được bổ sung vào nhiều giai đoạn khác nhau trong quá
trình sản xuất giấy:
Trong giai đoạn nghiền bột giấy cơ học, bổ sung enzyme cellobiohydrolase
làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, từ đó làm tang khả năng nghiền và tiết
kiệm 20% năng lượng.
Trong giai đoạn nghiền bột giấy hóa học, ngoài enzyme cellulase, người ta
còn bổ sung thêm hemicellulose và pectinase nhằm phá vỡ lớp vỏ ngoài của gỗ,
giúp tăng cường khả năng khuếch tán của hóa chất vào bên trong gỗ nhằm làm tăng
hiệu quả khử lignin.

15
Trong giai đoạn tẩy trắng giấy: trước đây người ta thường sử dụng acid HCl
để tẩy trắng giấy, nhưng HCl thải ra trong quá trình sản xuất làm ô nhiễm môi
trường và gây hại cho sức khỏe con người. Ngày nay, người ta sử dụng enzyme
cellulase giúp giữ cho sợi giấy không bị ăn mòn nhiều và không ảnh hưởng môi
trường cũng như sức khỏe con người.
 Trong công nghiệp dệt [89]
Trong công nghiệp dệt, người ta sử dụng cellulase để giữ màu vải sáng bền
và không bị sờn cũ.
Cellulase được dùng để làm mềm vải jean và tạo ra các vệt “stone washed”.
Trước đây, các vệt “stone washed” được làm thủ công bằng cách dùng đá bọt chà
lên vải jean, làm mất lớp kiềm trêm bề mặt vải và tạo ra những sợi chỉ trắng. Hiện
nay, người ta sử dụng enzyme cellulase trong giai đoạn giặt vải jean thay cho đá
bọt. Cellulase chỉ phân hủy theo các vết kiềm trên nền vải đã nhuộm màu để tạo ra
các vệt “stone washed”. Các vệt “stone washed” được tạo ra bằng phương pháp này
bền hơn so với phương pháp mài bằng đá bọt. Ngoài ra, người ta có thể tăng độ đậm
nhạt của các vệt này bằng cách tăng hay giảm hàm lượng cellulase sử dụng trong
giai đoạn giặt.
 Trong xử lý môi trường
Các chất thải hữu cơ chiếm một khối lượng rất lớn trong tổng số chất thải
hiện nay ở các đô thị và các khu công nghiệp. Trong các chất thải hữu cơ có nguồn
gốc thực vật, cellulose chiếm khoảng 50%. Các chất thải hữu cơ chứa cellulose
thường là những chất rất khó phân hủy, trong điều kiện tự nhiên thời gian phân hủy
rất lâu (trên 8 tháng ở điều kiện khí hậu nhiệt đới). Thời gian phân hủy các chất thải
này càng lâu càng gây ô nhiễm đất, nước, không khí. Để khắc phục tình trạng này,
các nhà khoa học đã đưa vào khối ủ các chế phẩm VSV giàu cellulase, kết quả thời
gian phân hủy sẽ được rút ngắn (còn khoảng 1 tháng) [15]. Điều này rất có ý nghĩa
trong việc góp phần hạn chế ô nhiễm môi trường đồng thời thúc đẩy quá trình
chuyển hóa vật chất trong tự nhiên.

16
Phức hệ cellulase còn được sử dụng để xử lí nguồn nước thải do các nhà máy
giấy thải ra. Nguyên liệu làm giấy là gỗ, gỗ chứa rất nhiều loại polysaccharide,
trong đó có cellulose là polysaccharide quan trọng, quyết định tới chất lượng và số
lượng giấy. Vì vậy, khi bổ sung các chế phẩm chứa phức hệ cellulase vào nước thải
của các nhà máy giấy, các cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc sẽ cho lại hiệu quả xử
lí cao [89].
 Trong sản xuất thức ăn gia súc [17]
Nguồn phế liệu giàu cellulose trong công nghiệp và nông nghiệp rất đa dạng,
phong phú như: rơm rạ, bã mía, lõi ngô, vụn bông, mạt cưa… Tuy nhiên, phần lớn
các phế phẩm này bị vứt bỏ hoặc được ủ làm phân bón, hoặc sử dụng làm chất đốt.
Trong khi đó, nguồn nguyên liệu rẻ tiền dùng trong chế biến thức ăn gia súc lại
thiếu. Vì vậy, việc ứng dụng cellulase để phân hủy nguồn phế phẩm giàu cellulose
vừa làm nguồn thức ăn cho gia súc, vừa góp phần bảo vệ môi trường là một vấn đề
rất đáng quan tâm.
Hiện nay, người ta đã dùng VSV để lên men bã mía bổ sung vào thức ăn gia
súc.
 Trong kỹ thuật di truyền [17]
Chế phẩm enzyme cellulase tinh khiết được dùng để phá vỡ vách TB thực
vật mà không làm tổn thương các cơ quan bên trong TB, đảm bảo sự nguyên vẹn
của nhân tố di truyền. Do đó, phương pháp này đã nhanh chóng thay thế các phương
pháp cơ học và hóa học. Cellulase còn được dùng trong kỹ thuật “lai ghép tế bào
trần”.
 Trong công nghiệp chế biến thực phẩm [89]
Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, cà phê chủ yếu được sản xuất
bằng phương pháp khô, phương pháp này cho chất lượng cà phê không cao. Để tiến
hành nâng cao chất lượng cà phê, phương pháp lên men đã được áp dụng. Đó là quá
trình sử dụng phức hệ enzyme cellulase và pectinase để xử lí bóc vỏ cà phê và làm
tăng khả năng ly trích dịch quả. Trong khâu bóc vỏ, cellulose gây hiện tượng thẩm
thấu, làm giảm chất lượng sau khi sấy và cản trở việc bóc vỏ. khi sử dụng chế phẩm

17
enzyme thương mại Biovina-09 có hoạt tính cellulase và pectinase cho thấy số
lượng cà phê được bóc vỏ tăng, hạt cà phê được bóc vỏ bằng chế phẩm không còn
nhớt như hạt không sử dụng chế phẩm enzyme, hiệu suất bóc vỏ khá cao. Trong quá
trình ly trích dịch quả, cellulose và pectin cản trở sự thoát các chất hòa tan trong TB
ra ngoài tế bào. Khi sử dụng chế phẩm enzyme thì hiệu suất trích ly cao hơn hẳn khi
không sử dụng là 46%.
Trong sản xuất nước hoa quả không cồn, cellulase được thêm vào giai đoạn
dịch hóa, hemicellulase sẽ đem lại hiệu quả cho sản phẩm, làm cho độ đồng hóa của
nước quả có thịt tốt hơn. Dịch quả sau khi ép chiết thường chứa các thành phần TB
thịt quả và các chất xơ có bản chất polysaccharide làm cho dịch quả có độ nhớt cao
và có màu đục. Glucanase thường được bổ sung để phá vỡ thành TB, thủy phân các
polysaccharide làm giảm độ nhớt của dịch quả tạo thuận lợi cho quá trình tách chiết
và làm trong. Để tăng hiệu suất trích ly dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm
quan nước quả và giảm bớt một số công đoạn thì việc bổ sung endoglucanase là rất
quan trọng. Enzyme này là điểm mấu chốt cải thiện hiệu suất dịch hóa. Bổ sung
endoglucanase để tăng hiệu suất trích li dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm
quan nước quả.
Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó
có cellulase, thành TB của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động
của protease và đường hóa.
 Trong sản xuất nhiên liệu sinh học [89]
Nhiên liệu sinh học (biofuel) là loại nhiên liệu có thể phục hồi được, được tạo
ra từ sản phẩm của ngành nông nghiệp, thực phẩm hay quá trình tái chế các sản
phẩm dầu ăn và dầu thực vật. Bioethanol và biodiesel là hai loại nhiên liệu sinh học
được sử dụng rộng rãi nhất cho ngành giao thông vận tải; trong đó, bioethanol được
sản xuất nhờ enzyme cellulase thủy phân sinh khối cellulose.
 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ [89]
Trong giai đoạn đường hóa của quá trình sản xuất ethanol, amylase là thành
phần chính trong quá trình thủy phân. Tuy nhiên, việc bổ sung một số enzyme như

18
cellulase, hemicellulase sẽ giúp phá hủy TB, giúp tăng lượng đường tạo thành và
đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rượu
tăng đến 1,5%.
1.2.2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng enzyme cellulase trong và ngoài
nước
Enzyme cellulase đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới. Đây là enzyme
được ứng dụng rất rộng rãi, chỉ đứng sau protease và amylase.
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng enzyme cellulase – một hệ enzyme phức tạp
- được sinh ra bởi nhiều VSV, phổ biến là nấm và VK (Bahkali, 1996), (Shin et al.,
2000) và (Immanuel et al., 2006). Mặc dù những loài nấm sợi tỏ ra phân hủy rất tốt
các cellulose tự nhiên (Selby et al., 1963), (Mandels và Reese, 1964) thế nhưng VK
lại có tốc độ sinh trưởng cao hơn so với nấm nên có tiềm năng lớn để được dùng
trong việc sản xuất cellulase. Tuy nhiên, việc nghiên cứu khả năng sinh enzyme
cellulase của các dòng VK nhìn chung vẫn còn khiêm tốn so với nghiên cứu trên
nấm (Crawford, 1986; Li and Gao, 1996; Ekperigin, 2006). Dù vậy, đặc điểm phân
giải cellulose của vài giống VK như Cellulomonas, Cellovibrio, Pseudomonas,
Sporosphytophaga spp. (Nakamura và Kappmura, 1982); Bacillus và Micrococcus
(Immanuel et al., 2006) đã được báo cáo [64].
 Nghiên cứu ngoài nước

Người đầu tiên phát hiện khả năng phân giải cellulose của các VSV hiếu khí
là G.Van Iterson (1903).
Việc nghiên cứu sử dụng bã mía để nuôi cấy VK Cellulomonas và dùng sinh
khối của VK làm thức ăn bổ sung trong chăn nuôi được khởi xướng bởi SrinivaSan
và cs (1968).
Năm 1971, người ta đã phân lập được một số loài VSV có khả năng phân
giải cellulose trong dạ cỏ của động vật nhai lại.
Mandel (1960) đã nghiên cứu “Sự cảm ứng tổng hợp enzyme cellulase của vi
nấm bằng cellobiose” [62].

19
Năm 1991, Parminder và cộng sự đã nghiên cứu “Sự sản xuất cellulase bởi
chủng T. reesei trên những nguồn cơ chất cellulose khác nhau ở các pH khác nhau”
[67].
Năm 1997, Raioka đã nghiên cứu “Tăng cường sản xuất enzyme cellulase
của các chủng Cellumonas nuôi cấy trên các phế thải giàu cellulose khác nhau”[74].
Năm 2005, M.A. Milala, A. Shugaba, A.C. Ene và J.A. Wafar đã “Nghiên
cứu sử dụng phế liệu nông nghiệp cho việc sản xuất enzyme cellulase bởi
Aspergilus niger” [66] .
Ikram-ul-Haq và cộng sự năm 2005 đã nghiên cứu “Hoạt độ đường hóa
cotton của cellulose được tổng hợp bởi sự nuôi cấy kết hợp hai chủng Aspergilus
niger và T. viridae” [56].
Năm 2009, Abou –Taleb và cộng sự đã nghiên cứu “Các yếu tố ảnh hưởng
đến dinh dưỡng và MT sản xuất cellulose của hai chủng trực khuẩn B. alcalophilus
S39 và B. amyloliquefaciens C23” [35].
Năm 2012, Afzal và cộng sự đã nghiên cứu “Đặc tính cellulase của B. cereus
MRLB1 phân lập từ đất” [38].
 Nghiên cứu trong nước
Các nghiên cứu về cellulose theo nhiều hướng khác nhau: thu nhận, khảo sát
đặc tính, tinh sạch, cố định và ứng dụng cellulose. Một số công trình nghiên cứu về
cellulose gần đây như:
Nguyễn Thị Kiều Hoa, năm 2002, đã khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến
sự sinh tổng hợp cellulase ở Trichoderma reesei [6].
Năm 2003, Lê Hồng Phú đã tiến hành nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme
pectinase và cellulase trên vỏ cà phê của Aspergilus niger và ứng dụng trong sản
xuất phân hữu cơ [18].
Năm 2004, Trần Thạnh Phong khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme
cellulase từ Trichoderma reesei và Aspergilus niger trên môi trường lên men bán
rắn [17].

20
Năm 2005, Lê Thị Hồng Nga nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng cellulase và
pectinase của một số chủng nấm mốc [13].
Năm 2006, Võ Thị Xuyến bước đầu nghiên cứu tạo chế phẩm cellulase từ
một số chủng VSV và khả năng thủy phân cellulose [34].
Năm 2012, Võ Hoài Bắc, Lê Hương Thuỷ, Lê Thị Lan Oanh (Viện Nghiên
cứu Hải sản) đã tiến hành thực hiện “Nghiên cứu lựa chọn chủng VSV thủy phân
cellulose rong bã thải từ sản xuất agar để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi”. Qua đó
đã sàng lọc được 2 chủng VSV sinh enzyme cellulase ngoại bào có hoạt tính cao là
B. lichenformis và B. subtilis VTCC-B-505 có khả năng thủy phân bã agar rất tốt.
1.2.3. Phương pháp nuôi cấy VSV để thu nhận enzyme cellulase
Hiện nay, trong công nghệ sản xuất người ta áp dụng hai phương pháp: nuôi
cấy bề mặt và nuôi cấy chìm [9].
 Phương pháp nuôi cấy bề mặt (lên men bán rắn)
Trong phương pháp này VSV phát triển trên MT dinh dưỡng ở thể rắn đã
được làm ẩm và vô trùng. Các chất dinh dưỡng thường là các nguyên liệu tự nhiên
như cám, phế liệu của ngành nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm. Trong MT
dinh dưỡng thường cho thêm các chất cảm ứng cần thiết cho sự tổng hợp enzyme
nào đó hoặc một số chất dinh dưỡng bổ sung nguồn nitơ, photpho như nước chiết
ngô, khoai tây, dịch nấm men… Để đảm bảo độ xốp MT cần có các chất làm xốp
như trấu với tỷ lệ 10 – 20%. Trước khi cấy giống, MT cần được thanh trùng để đảm
bảo không bị nhiễm VSV lạ.
pH trong phương pháp nuôi cấy bề mặt thay đổi theo chủng VSV: 5,6 – 6,2
đối với nấm sợi và 6,2 – 7,2 đối với VK ở nhiệt độ duy trì 28 – 300
C, độ ẩm MT
nên khoảng 58 – 60%, trong thời gian 36 – 72 giờ. Đối với mỗi chủng VSV, cần lựa
chọn thời gian nuôi cấy thích hợp để lượng enzyme sinh ra trong MT lớn nhất [14].
Các cơ chất tự nhiên và tổng hợp đều được sử dụng trong lên men bán rắn và
là các chất không tan trong nước, có thể được VSV sử dụng để sinh trưởng, phát
triển và trao đổi chất. Được sử dụng rộng rãi nhất để lên men bán rắn là các nguyên
liệu giàu cellulose có nguồn gốc thực vật như bột lúa mì, bột gạo, cellulose tinh

21
khiết các nguyên liệu khác. Các phế liệu của nông nghiệp và công nghiệp thực
phẩm thường sử dụng như cám mì, bã mía, sắn, củ cải đường, vỏ cam chanh, lõi
ngô, trấu [17].
Lên men bán rắn có nhiều điểm vượt trội so với lên men trong MT dịch thể.
Đó là việc không cần khuấy đảo hay thông khí; đặc biệt là thành phần MT nuôi cấy
rất đơn giản, các cơ chất thường dùng là những cơ chất rẻ tiền và ổn định nên có
tiềm năng sử dụng để sản xuất enzyme ở quy mô lớn.
Những ưu điểm khác so với lên men trong MT dịch thể là nồng độ cơ chất
cao hơn, ít bị nhiễm tạp, không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận
hành cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa ít tốn kém. Lượng enzyme được tạo ra
từ nuôi cấy bán rắn thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy lỏng. Chế phẩm
enzyme dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính của enzyme, chế
phẩm khô, dễ dàng bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp trong
điều kiện không cần enzyme tinh sạch [16], [29].
 Phương pháp nuôi cấy chìm
Trong phương pháp này VSV phát triển trong MT lỏng có sục khí và khuấy
đảo liên tục, nguồn carbon thường dùng là tinh bột, rỉ đường…, còn nguồn nitơ
thường là cao ngô, dịch men bia thủy phân… Ngoài ra, trong thành phần MT cũng
cần bổ sung thêm các chất khoáng. MT nuôi cần được thanh trùng trước khi cấy
giống bằng cách sục hơi trực tiếp ở nhiệt độ cao trong thời gian phù hợp và phải
được dịch hóa sơ bộ để tránh trường hợp tinh bột hồ hóa làm cho MT sệt lại. Sau
khi làm nguội MT đến nhiệt độ thích hợp thì có thể tiến hành cấy giống. Quá trình
nuôi cấy cần khuấy đảo và sục khí liên tục. Thời gian nuôi cấy kéo dài từ 1 – 4 ngày
tùy loại gống. Trong nuôi cấy chìm, việc khống chế pH, chế độ hiếu khí, bảo đảm
điều kiện vô trùng là những điều kiên quan trọng [17].
Phương pháp này có ưu điểm là tiết kiệm diện tích sản xuất, dễ cơ giới hóa tự
động hóa, enzyme thu được tinh khiết hơn. Tuy nhiên, phương pháp này lại có hạn
chế là lượng enzyme thu được có hoạt tính không cao, tốn điện năng do cần sục khí
liên tục và nếu bị nhiễm VSV lạ thì phải bỏ toàn bộ khối MT nuôi cấy.

22
1.3. Sự cảm ứng sinh tổng hợp enzyme
1.3.1. Hiện tượng cảm ứng
Hiện tượng cảm ứng là hiện tượng làm tăng sự tổng hợp enzyme trong TB,
khi bổ sung một chất nào đó vào MT nuôi cấy thì sự tổng hợp enzyme phân giải cơ
chất đó sẽ tăng lên đáng kể. Hiện tượng cảm ứng thường biểu hiện rất nhạy cảm ở
VSV, hơn hẳn ở động vật, thực vật.
Hiện tượng cảm ứng có tính đa hướng và tính hợp đồng. Đặc điểm này được
thể hiện ở chỗ: một chất cảm ứng có thể cùng một lúc gây ra sự tổng hợp cảm ứng
của một vài enzyme. Chẳng hạn chất tổng hợp cảm ứng β-galactosidlactose (hoặc
chất cảm ứng tương tự của nó) ngoài khả năng gây ra sự tổng hợp cảm ứng enzyme
β-galactosidase còn đồng thời gây ra sự tổng hợp cảm ứng của hai enzyme khác nữa
là galactosid permease (có tác dụng chuyển cơ chất qua màng tế bào) và galactosid
transferase. Cả ba loại enzyme này được thực hiện có tính chất hợp đồng về số
lượng.
Sự cảm ứng thường có tính chất dây chuyền. Trong một hệ thống bao gồm
nhiều phản ứng, cơ chất đầu tiên của hệ thống có thể cảm ứng quá trình tổng hợp tất
cả các enzyme xúc tác cho quá trình chuyển hóa nó. Điều này được thực hiện theo
cơ chế sau: trước hết chất cảm ứng làm tăng quá trình tổng hợp enzyme tương ứng,
sau đó sản phẩm của phản ứng này lại cảm ứng tổng hợp enzyme thứ hai để phân
giải nó, tiếp theo sản phẩm thứ hai lại cảm ứng tổng hợp cho enzyme thứ ba.
Hiện tượng cảm ứng thường có tính chất đặc hiệu, ví dụ: khi thêm DL serin
vào MT nuôi cấy E.coli thì enzyme D-serindeaminase được tổng hợp tăng lên 200
lần, trong khi hàm lượng L-serindeaminase chỉ tăng 4 lần, còn L-threonindeaminase
thì không thay đổi. Nhưng khi thêm L-threonin vào cũng MT ấy thì sự tổng hợp L-
threonindeaminase lại chiếm ưu thế [7].
Trong số các enzyme do VSV tổng hợp, một số enzyme bình thường chỉ
được tổng hợp với một lượng rất ít, nhưng hàm lượng của chúng có thể tăng gấp lên
nhiều lần khi chúng ta cho thêm một số chất nhất định vào MT nuôi cấy. Monob và
Cohn (1952) gọi các enzyme này là enzyme cảm ứng. Chất gây nên hiệu quả này

23
gọi là cơ chất chất cảm ứng. Cơ chất cảm ứng thường được coi là yếu tố quan trọng
dùng để điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme. Cơ chất cảm ứng thường là cơ
chất đặc hiệu của enzyme hay những chất tương tự như cơ chất hoặc những sản
phẩm trung gian của quá trình biến đổi các chất [12], [79].
1.3.2. Mô hình cảm ứng operon Lac
Jacob, Monob và cộng sự là những người đầu tiên nghiên cứu về sự điều hòa
biểu hiện gen [20]. Khi tiến hành nghiên cứu trên operon Lac, họ đã chứng minh
được rằng:
- Sự điều hòa ba enzyme có liên quan trong chu trình lactose (được mã
hóa trong operon lac) xảy ra ở mức độ biểu hiện gen chứ không phải
bằng cách hoạt hóa tiền chất enzyme.
- Chất cảm ứng tác động vào chất kìm hãm sự phiên mã chứ không phải
bằng cách hoạt hóa một “protein cảm ứng”.
1.3.2.1. Cấu trúc operon lactose [8]
Operon lactose (operon lac) có chức năng sản sinh các enzyme tham gia vào
quá trình hấp thụ và phân giải đường lactose thành galactose và glucose. Nó chỉ
hoạt động khi có mặt đường lactose, vì vậy lactose được gọi là chất cảm ứng và
operon lac được gọi là operon cảm ứng (inducible).
Hình 1.5. Cấu trúc của operon lac [90]
Operon lac gồm các thành phần:
- Nhóm các gene cấu trúc bao gồm các gen được sắp xếp liền kề nhau trên
DNA mã hóa cho các enzyme phân giải đường lactose, cụ thể là ba gen : lacZ, lacY
và lacA.

24
 LacZ mã hoá cho enzym β-galactosidase, enzyme này thủy phân lactose
tạo thành glucose và galactose. Khi được cảm ứng bằng lactose, số
lượng enzyme β-galactosidase tăng từ hầu như bằng không lên đến
khoảng 2% trọng lượng của TB.
 LacY mã hoá cho enzym permease, enzyme này làm tăng tính thấm của
màng TB với các β-galactosidase. Permease vận chuyển lactose từ MT
nuôi cấy qua màng vào bên trong TB.

 LacA mã hoá enzym thiogalactoside transacetylase: xúc tác phản ứng
chuyển nhóm acetyl từ acetyl CoA đến liên kết với nhóm OH ở vị trí C6
của phân tử β- thiogalactoside.

- Gen chỉ huy (Operator) là trình tự DNA cách gen Z chừng 10 cặp base về
phía trước, là vị trí tương tác với chất ức chế. Nó chứa trình tự 21 cặp base đối xứng
xuôi ngược, giúp chất ức chế (lac repressor) có thể nhận biết và bám vào bằng cách
khuếch tán dọc theo DNA từ cả hai phía. Quá trình sao chép chỉ có thể tiến hành khi
gen operator ở trạng thái “mở” (không kết hợp với một chất nào cả) và ngừng lại khi
nó bị “đóng” (kết hợp với chất ức chế).
- Vùng khởi động (promoter lac) là đoạn DNA dài chừng 90 cặp base nằm
trước và trùm lên operator lac 7 cặp base. Nó chứa hai vị trí tương tác : một với
RNA polymerase và một với protein hoạt hoá dị hoá (catabolite activator protein =
CAP). Promoter điều khiển việc nhận biết vị trí khởi đầu phiên mã của RNA
polymerase. Ở VK có hai trình tự quan trọng trong promoter là TATAAT (ở vị trí -
10) và TTGACA (ở vị trí -35), cả hai trình tự phối hợp nhau cho phép RNA
polymerase gắn vào và khởi sự dịch mã, trình tự -35 tạo điều kiện đầu tiên cho sự
gắn vào.
Consensus sequences
for most E. coli promoters
Transcription start site
Promoter region
Hình 1.6. Promoter của operon lac [83]

25
- Gen điều hoà (regulator) nằm trước vùng khởi động, gen này phiên mã,
dịch mã ra protein ức chế (repressor lac) có tác dụng điều chỉnh hoạt động của
nhóm gen cấu trúc. Protein ức chế gồm bốn polypeptide giống nhau, gọi là tứ phân
(tetramer), đều chứa 360 amino acid. Trên protein ức chế có hai vị trí liên kết: một
gắn với trình tự gồm 24 cặp base của operator trong operon lac và một gắn với chất
cảm ứng lactose.
1.3.2.2. Sự cảm ứng operon Lac [19]
Sự cảm ứng bởi cơ chất ở operon lac là một quá trình điều hòa phiên mã
(điều hòa ở mức độ gen). Năm 1961, Jacob và Monob đã đưa ra mô hình cảm ứng ở
operon lac gồm 5 bước như sau:
- Bước 1: Gen điều hòa mã hóa tạo ra protein ức chế có khả năng gắn vào
operator và ức chế sự phiên mã của các gen cấu trúc.
- Bước 2: Một chất cảm ứng có phân tử lượng nhỏ kết hợp với chất ức chế và
làm biến đổi chất ức chế.
- Bước 3: Phức hợp chất cảm ứng – chất ức chế không gắn được vào operator.
- Bước 4: Sự lỏng lẻo trên operator tạo điều kiện thuận lợi cho sự phiên mã các
gen cấu trúc.
- Bước 5: Trình tự RNA thông tin được dịch mã để sinh tổng hợp protein.
 Khi MT nuôi cấy không có chất cảm ứng

Khi trong MT nuôi cấy E. coli không có lactose (chất cảm ứng) thì gen điều
hòa dịch mã ra protein ức chế (lac repressor) chất này vốn tự thân có hoạt tính, bám
chặt vào yếu tố chỉ huy (operator lac ), làm cho vùng khởi động (promoter) bị tê liệt
và RNA polymerase không bám vào đươc, gây kìm hãm sự phiên mã của các gen
cấu trúc Z, Y và A. Do đó các sản phẩm enzyme của operon lac không được tạo ra.

Hình 1.7. Hoạt động của operon lac trong MT nuôi cấy không có chất cảm

26
 Khi MT nuôi cấy có chất cảm ứng

Khi có chất cảm ứng (lactose) trong MT nuôi cấy, VK sẽ bắt đầu hấp thụ và
phân giải nó, nghĩa là các enzyme liên quan đã được sinh ra. Tức là:
Lúc này gen điều hòa vẫn sản xuất ra protein ức chế (repressor), nhưng lúc
này chất cảm ứng (inducer), ở đây là allolactose - dạng biến đổi của lactose bám
vào một tiểu đơn vị của chất ức chế (repressor) làm biến đổi cấu hình của chất này.
Vì vậy chất ức chế mất ái lực và không thể bám vào operator lac và nó sẽ tách ra
khỏi DNA. => RNA polimerase bám vào vùng khởi động và các gene cấu trúc của
operon lac được phiên mã tạo ra phân tử mRNA polycistron và các enzyme tương
ứng được tổng hợp, giúp phân giải đường lactose.
Hình 1.8. Hoạt động của operon lac trong MT nuôi cấy có chất cảm ứng [83]
Thực tế trong quá trình nuôi cấy VSV, khi MT có chứa glucose chất ức chế
sẽ gắn vào vùng operator của operon lac và ngăn cản sự phiên mã. Nhưng khi có
chất cảm ứng (lactose), chất cảm ứng sẽ gắn với protein ức chế làm cho protein ức
chế không có khả năng tương tác với vùng operator của operon. Nhờ vậy mà RNA
polymerase có thể gắn vào vùng promoter và tiến hành phiên mã operon lac. Khi
MT có glucose, operon lac vẫn bị kìm hãm mặc dù có chất cảm ứng trong MT, sự
kìm hãm này duy trì cho đến khi nguồn glucose cạn kiệt. Sự kìm hãm operon lac
như trên gọi là sự kìm hãm dị hóa. Sự kìm hãm dị hóa xảy ra là do mức độ cAMP
(cyclic adenozin monophosphate) thấp trong MT có nguồn glucose dồi dào. Nồng
độ cAMP có tương quan nghịch với lượng glucose có trong MT, tức là khi nồng độ

27
glucose tăng cao thì nồng độ cAMP thấp và ngược lại. Khi lượng glucose trong MT
giảm thì lượng cAMP tăng lên, cAMP sẽ liên kết với CAP (catabolite gene
activation protein) – protein có khả năng hoạt hóa sự biểu hiện của operon lac, tạo
thành phức hợp CAP- cAMP. Phức hợp này liên kết với operon lac ở promoter thúc
đẩy sự phiên mã của RNA polymerase. Việc gắn phức hợp cAMP-CAP vào operon
lac kích thích hoạt động của RNA polymerase lên gấp từ 20 – 50 lần.
1.3.3. Sinh tổng hợp enzyme cảm ứng
Các enzyme tham gia thủy phân được VSV tổng hợp là những enzyme cảm
ứng. Hiện tượng cảm ứng trong tổng hợp enzyme đã được Jacob và Monob tìm ra
vào năm 1961, cơ chế điều khiển này thể hiện rất rõ ở VSV. Tác động của các yếu
tố bên ngoài lên tế bào VSV thường là tác động trực tiếp, tế bào VSV phản ứng lại
các tác động này thường cũng rất nhanh. Chính vì thế, ta có thể sử dụng các yếu tố
MT như nhiệt độ, độ pH và đặc biệt là cơ chất cảm ứng để điều khiển quá trình sinh
tổng hợp enzyme của VSV [19].
Bình thường khi không có cơ chất cảm ứng, chất kìm hãm có trong TB sẽ
tương tác với gen điều khiển làm cho quá trình tổng hợp enzyme bị ức chế. Khi ta
cho cơ chất cảm ứng vào MT nuôi cấy, cơ chất sẽ tương tác với chất kìm hãm và
các gen tương ứng. Enzyme được tổng hợp sẽ phân hủy cơ chất.
Khi có mặt cơ chất cảm ứng của một enzyme thủy phân nào đó trong môi
trường nuôi cấy thì lượng enzyme này được tổng hợp ra gấp nhiều lần so với bình
thường khi không có cơ chất. Cho cơ chất với liều lượng tăng dần thì khả năng tổng
hợp enzyme cảm ứng của VSV cũng sẽ tăng dần. Nhưng nếu ta vẫn cứ tiếp tục tăng
nồng độ cơ chất lên đến một mức độ nào đó thì quá trình này sẽ chựng lại hoặc
giảm do hiện tượng tăng áp suất thẩm thấu do cơ chất gây nên.
Nhiều nghiên cứu cho biết cellulose là nguồn chất cảm ứng thích hợp nhất
đối với sự tổng hợp cellulase. Cellulase là enzyme cảm ứng vì vậy trong MT nuôi
cấy VSV sinh enzyme này nhất thiết phải bổ sung cellulose là chất cảm ứng và là
nguồn carbon. Nguồn carbon thường dùng và có hiệu quả khi nuôi VSV tổng hợp

28
cellulase là giấy lọc, bông thấm nước, giấy báo,mùn cưa, phế liệu nông nghiệp chứa
cellulose như rơm rạ, lõi ngô, cám, bã củ cải đường [22].
Một số chất có tác dụng ức chế sinh tổng hợp cellulase như glucose,
succinate, acetate, citrate, các sản phẩm trung gian của chu trình Krep, muối amon
thường làm ức chế tổng hợp cellulase. Cao ngô, cao nấm men, pepton có thể là chất
tăng sinh tổng hợp cellulase ở một số chủng VSV, nhưng cũng có thể kìm hãm tổng
hợp cellulase ở một số chủng khác.
1.3.4. Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzyme
Sự tổng hợp cảm ứng enzyme bởi cơ chất và ức chế tổng hợp enzyme bởi sản
phẩm cuối cùng là hai quá trình liên quan mật thiết với nhau và được điều hòa trong
quá trình phiên mã (điều hòa ở mức độ gen). Cơ chế điều hòa quá trình sinh tổng
hợp cảm ứng enzyme được giải thích theo học thuyết operon ở E.coli nổi tiếng của
Jacob và Monob năm 1961. Theo học thuyết này, cơ thể sống chỉ tạo ra một lượng
đáng kể những enzyme cảm ứng khi có mặt chất cảm ứng. Còn những enzyme bản
thể thường xuyên được tạo thành với mức độ đáng kể hoặc tối đa cả trên MT không
có chất cảm ứng mà enzyme tác dụng [80].
Ngoài cơ chế điều hòa enzyme ở mức độ gen, trong quá trình sống của TB còn
có kiểu điều hòa ở mức độ enzyme theo nguyên tắc liên kết ngược hay còn gọi là cơ
chế dị lập thể (alosteric) điều hòa tổng hợp các chất trao đổi. Sự tổng hợp phần lớn
các sản phẩm trao đổi chất thường xảy ra ở nhiều giai đoạn, ở mỗi giai đoạn được
thực hiện bởi một enzyme xác định. Enzyme này khác với những enzyme khác ở
chỗ ngoài khả tăng tác động lên chất cảm ứng còn có tính nhạy cảm với sản phẩm
cuối cùng. Sản phẩm cuối cùng được tích tụ trong TB tới một nồng độ xác định sẽ
ức chế hoạt động của enzyme đầu tiên làm cho cả chuỗi phản ứng bị ngừng lại.
Enzyme tuy vẫn được tổng hợp nhưng bất hoạt. Kết quả là TB tạm ngừng tổng hợp
sản phẩm cuối cùng cho tới khi nào nồng độ chất này không còn dư [33].
Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzyme theo nguyên tắc liên kết ngược xảy ra
như sau: enzyme ở giai đoạn đầu kết hợp với sản phẩm cuối cùng làm biến dạng bề
mặt hoạt động, do đó nó không còn khả năng xúc tác phản ứng trong chuỗi phản

29
ứng. Người ta gọi biến dạng này là biến dạng dị lập thể và những hệ thống enzyme
có thể bị biến dạng bởi các chất chuyển hóa được gọi là hệ thống dị lập thể [33].
Dẫn chứng cho quá trình điều hòa dị lập thể là quá trình sinh tổng hợp valin
từ acid pyruvic qua bốn giai đoạn nhờ bốn enzyme xúc tác tương ứng. Khi sản
phẩm cuối cùng đạt được nồng độ cao nó sẽ tác dụng với enzyme ban đầu làm nó bị
biến dạng và bất hoạt [19].
Acid
pyruvic
Enzyme I
Enzyme II Enzyme III
Acid α- Acid α, β- Acid α-
acetolactic dioxyisovaleric cetoisovaleric
Enzyme IV
Ức chế enzyme
Valin
Hình 1.9. Sự điều hòa enzyme theo nguyên tắc liên kết ngược [19]
Do đó, để điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme bằng cơ chất cảm ứng
cần chú ý:
− Có gen tương ứng trong nhiễm sắc thể của TB.
− Có đầy đủ các nguyên liệu để xây dựng phần tử của enzyme đó.
− Năng lượng cần thiết dùng cho tổng hợp enzyme.
− Muốn thu nhận enzyme cảm ứng nào thì phải cho cơ chất cảm ứng của
enzyme đó vào MT nuôi cấy VSV.
− Tác động cảm ứng chỉ đạt hiệu quả cao ở một liều lượng cơ chất nhất định.
Nếu vượt quá liều lượng này sẽ làm cho quá trình tổng hợp enzyme sẽ càng giảm.
Như vậy, ta có thể coi việc có cơ chất cảm ứng là việc rất cần thiết để thu
nhận những enzyme mong muốn. Trong công nghiệp sản xuất enzyme, cần phải lựa
chọn những cơ chất cảm ứng thích hợp và xác định nồng độ tối ưu của nó trong MT
để có hiệu suất sinh tổng hợp cao nhất [19].

30
Chương 2. VẬT LIỆU
VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

31
2.1. Nguyên vật liệu
Các chủng Bacillus phân lập được từ đất vườn thuộc xã Bình Nhì, huyện Gò
Công Tây, tỉnh Tiền Giang.
Nguyên liệu làm cơ chất là các phế liệu nông nghiệp: rơm, bã mía, lõi ngô,
trấu, cám mua tại chợ Vĩnh Bình, Gò Công Tây, Tiền Giang.
2.2. Hóa chất, thiết bị
2.2.1. Hóa chất
Glucose, agar, CMC, cao thịt, cao nấm men, pepton, tinh bột, KH2PO4,
K2HPO4, MgSO4.7H2O, NaNO3, KCl, FeSO4.7H2O…
2.2.2. Thiết bị
− Nồi hấp vô trùng Huxley (Đ
Loan)
− Tủ ấm Sanyo (Nhật)
− Tủ lạnh Hitachi (Nhật)
− Tủ sấy Memmert (Đức)
− Tủ cấy vô trùng (Việt Nam)
− Máy đo pH Hana (Nhật)
− Máy quang phổ UV/ Visib
Spectrophometer (Nhật)
2.3. Các môi trường sử dụng [14]
− Máy li tâm Hettich (Đức)
− Kính hiển vi Olympus CHL
(Nhật)
− Cân phân tích điện tử Scientech
(Nhật)
− Máy ảnh kĩ thuật số Cannon
(Nhật)
− Pipetman Nichigo (Nhật)
− Máy ảnh kĩ thuật số Olympus
(Nhật)
− Máy lắc Gerhardt (Đức)
MT1: Môi trường phân lập và giữ giống VK (MPA)
Cao thịt 5g
Pepton 5g
NaCl 5g
Agar 20g
Nước cất 1000ml
pH 7,0 – 7,2

32
MT2: Môi trường định tính khả năng sinh enzyme cellulase
Pepton 5g
Cao nấm men 2,5g
CMC 5g
Agar 20g
MT3: Môi trường thử hoạt tính của enzyme cellulase
Pepton 0,2g
CMC 5g
Glucose 0,05g
MnSO4.4H2O 0,1g
NaCl 3g
K2HPO4 1,5g
KH2PO4 1,5g
Agar 20g
MT4: Môi trường bán rắn sản xuất enzyme cellulase
Trấu 20%
Cám 80%
MgSO4.7H2O 0,05g
K2HPO4 0,1g
NaCl 0,3g
CaCl2 0,1g
Độ ẩm ban đầu 50 – 55%
Pepton 5g
Cao thịt 5g
Cao nấm men 5g
Glucose 10g

33
MnSO4.4H2O 0,1g
Tween 80 0,5g
Agar 18g
2.4. Các phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus [23], [5]
a. Nguyên tắc
Tách rời các khuẩn lạc VK, nuôi cấy VK trên MT dinh dưỡng đặc trưng để
thu KL riêng rẽ, cách biệt nhau.
b. Tiến hành
Thời gian lấy mẫu chia làm hai lần: lần 1 là ngày 24/12/2011 và lần 2 vào
ngày 15/01/2012.
Lấy một ít đất (10g) cho vào bình
lắc đều để tạo huyền phù, gia nhiệt tới
huyền phù có độ pha loãng 10-1
.
Lắc đều rồi hút 1ml dung dịch 10-
1
được dung dịch pha loãng nồng độ 10-
2
. dịch nồng độ 10-3
10-4
, 10-5
.
tam giác và thêm 90ml nước cất vô trùng
850
C trong 20 – 25 phút, thu được dịch
cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất ta
Tiếp tục pha loãng như thế ta được dung
Nhỏ 0,1ml (2 giọt) dung dịch ở nồng độ 10- 3
, 10-4
, 10- 5
lên đĩa petri thứ 1
có chứa MT1. Dùng que trang trải đều khắp trên mặt thạch, giữ nguyên que trang
tiếp tục sang đĩa petri thứ 2 rồi thứ 3.
Sau đó gói các đĩa petri bằng giấy báo và ủ ở nhiệt độ phòng 24 giờthu
được các KL riêng rẽ.
Làm thuần
Lấy 1 KL riêng rẽ hòa với nước cất vô trùng, cấy trang lên đĩa petri có MT1.
Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng cho đến khi xuất hiện KL. Nếu thấy các dạng KL đồng đều
về hình dạng, màu sắc thì giống phân lập đã thuần khiết.
Chọn KL riêng rẽ cấy chuyền sang ống thạch nghiêng. Nuôi cấy và ủ mẫu ở
nhiệt độ phòng trong 24 giờ, sau đó bảo quản ở 40
C.

34
c. Yêu cầu
Chủng phân lập phải đạt độ thuần khiết và được kí hiệu để nhận biết.
2.4.2. Phương pháp bảo quản giống
* Cấy chuyền và bảo quản [11]
Dùng que cấy cấy zich zắc VK trên bề mặt thạch nghiêng MPA, để ở 300
C,
sau 24 giờ thấy xuất hiện KL thì chuyển vào tủ lạnh 40
C giữ giống.
Tiến hành cấy chuyền định kì một tháng một lần, trước khi sử dụng phải hoạt
hóa giống.
* Giữ giống trên môi trường thạch dưới lớp dầu khoáng [12]
Cho 0,2ml dầu khoáng (paraffin lỏng hay vazơlin) vào ống eppendoff, khử
trùng bằng cách hấp ở 1210
C/ 30 phút, để nguội.
Nuôi cấy VK đạt đến độ trưởng thành. Dùng que cấy vô trùng lấy 1 lượng
VK cho vào ống eppendoff, trên đậy nắp và dùng keo parafin quấn quanh miệng
ống, bảo quản ở điều kiện lạnh 4-60
C.
2.4.3. Quan sát hình thái khuẩn lạc [14]
Quan sát một số chỉ tiêu của chủng nghiên cứu trên môi trường MPA.
- Khả năng phát triển của KL.
- Bề mặt KL.
- Màu sắc KL.
2.4.4. Phương pháp nhuộm Gram [25]
a. Nguyên tắc
Dựa trên khả năng bắt màu của TB chất và thành TB với thuốc nhuộm tím
kết tinh và iot mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau.
Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị
rửa trôi khi xử lí bằng cồn. VSV có phức chất này thuộc loại Gram dương.
Loại phức chất thứ hai không giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu
khi xử lí bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. VSV có phức chất này
thuộc loại Gram âm
b. Cách tiến hành

35
− VK được cấy trong ống thạch nghiêng chứa môi trường MPA từ 16 – 24h.
Cho một giọt nước cất vô trùng lên phiến kính, dùng que cấy vô trùng lấy
một ít tế bào VK hòa vào giọt nước và dàn mỏng.
− Hơ phiến kính lên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần, chú ý không để phiến kính
nóng quá vì như thế tế bào VK sẽ bị biến dạng. Khi giọt nước bay hơi dần
VK sẽ gắn chặt vào phiến kính.
− Nhuộm màu bằng cách nhỏ tím gentian lên vết bôi qua giấy lọc, giữ 1 – 2
phút.
− Tiếp theo nhỏ dung dịch lugol lên tiêu bản để trong 1 phút, sau đó bỏ giấy
lọc và đổ thuốc đi, rửa lại tiêu bản bằng nước cất.
− Tiếp tục rửa bằng cồn 960
trong thời gian 30 – 40 giây, rửa lại tiêu bản bằng
nước cất rồi để khô vết bôi.
− Nhuộm bổ sung bằng Fuchsin khoảng 1 – 2 phút, rửa lại bằng nước cất đến
khi hết màu rồi để tiêu bản cho khô.
Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính x100.
c. Kết quả
Nếu VK bắt màu tím thì đó là vi khuẩn Gram dương, VK bắt màu hồng là
VK Gram âm. Chọn các chủng VK Gram dương để tiếp tục nghiên cứu.
2.4.5. Phương pháp nhuộm bào tử [25]
a. Nguyên tắc
Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử: dày, chắc, khó bắt màu, chứa
nhiều lipit. Khi tế bào được xử lí bằng nhiệt và acid thì TB chất của bào tử rất dễ bắt
màu. Nhuộm cả TB chất của bào tử và TB với thuốc nhuộm có khả năng bắt màu
mạnh, sau đó tẩy màu TB chất của TB và nhuộm nó với một thuốc nhuộm phân biệt
khác. Khi đó TB chất và bào tử sẽ bắt màu phân biệt.
− Làm vết bôi với VK đã nuôi cấy hai tuần tuổi và để vết bôi khô tự nhiên.
− Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên vết bôi, hơ nóng vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn,
giữ 2 phút rồi rửa nước.

36
− Đặt lên vết bôi miếng giấy lọc rồi nhỏ Fuchsin, hơ nóng cho đến khi bốc hơi
trong vòng 5 phút, nếu thuốc nhuộm cạn phải bổ sung ngay.
− Bỏ giấy lọc ra và rửa vết bôi bằng nước.
− Tẩy màu bằng dung dịch H2SO4 1% trong 2 phút, sau đó rửa vết bôi bằng
nước.
− Nhuộm vết bôi bằng xanh methylene trong 5 – 15 phút.
− Rửa vết bôi lại với nước và để khô tự nhiên.
Quan sát tiêu bản trên KHV với vật kính dầu.
c. Kết quả
Bào tử sẽ mang màu đỏ, TB sinh dưỡng mang màu xanh.
2.4.6. Phương pháp xác định hoạt tính catalase [28]
a. Nguyên tắc
Catalase xúc tác phản ứng thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O
và giải phóng oxi (có hiện tượng sủi bọt).
− Nhỏ một giọt dung dịch H2O2 3% lên trên KL, hoặc chuyển một lượng VSV
lên lam rồi thử bằng dung dịch H2O2 3%, dựa vào hiện tượng có sủi bọt (+)
hay không (-) mà kết luận về hoạt tính catalase của mỗi chủng từ đó cho
biết mỗi chủng có phải là VK hiếu khí hay không.
2.4.7. Phương pháp định danh đến loài bằng sinh học phân tử [14]
 Thu nhận DNA
− Phá màng TB và màng nhân bằng protein đặc hiệu (proteinase K) để giải
phóng các DNA, đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.
− Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu: sử dụng hỗn hợp
phenol và cloroform (có tác dụng làm biến tính protein) để tách riêng pha có
chứa DNA.
− Làm kết tủa các acid nucleic bằng ethanol hoặc isopropanol để thu được các
acid nucleic dạng cô đặc, dễ bảo quản.
 Chạy PCR (polymerase chain reaction)

37
• Nguyên tắc: khuếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng cặp mồi chuyên biệt.
• Tiến hành: phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu
kì gồm 3 bước:
- Bước 1 (biến tính): trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép,
DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường khoảng là 940
C
– 950
C trong vòng 30 giây – 1 phút.
- Bước 2 (lai): nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ
này dao động khoảng từ 400
C – 700
C và kéo dài trong vòng 30 giây – 1 phút.
- Bước 3 (tổng hợp): nhiệt độ được tăng lên 720
C để DNA polymerase hoạt
động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của trình tự
DNA, thường kéo dài từ 30 giây – 1 phút.
 Giải trình tự DNA
Nguyên tắc hóa học (phương pháp Maxam và Gilbert): dựa vào các phản ứng
thủy giải hóa học đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn
có kích thước chênh lệch nhau 1 nucleotide.
Nguyên tắc enzyme học (phương pháp Sanger và các phương pháp cải biên):
dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA
polymerase. Với việc sử dụng thêm các deoxinucleotide thông thường, kết quả
tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước
chênh nhau 1 nucleotide.
Ở cả hai phương pháp trên, các phân tử DNA sẽ được phân tách qua điện di
trên gel polyacrylamid. Nếu sử dụng bằng đồng vị phóng xạ thì kết quả trình tự
cần xác định sẽ được đọc trên bảng phóng xạ tự ghi từ bảng điện di. Sau khi giải
trình tự gen 16sRNA, so sánh với ngân hàng gen NCBI để định danh đến loài
chủng VK nghiên cứu.
2.4.8. Phương pháp chiết dung dịch enzyme thô từ canh trường nuôi cấy VK
[17]
Nuôi VK trên MT 4, sau thời gian nuôi cấy thu dịch nuôi cấy VK: cho 60ml
nước cất vô trùng vào mỗi bình tam giác chứa MT nuôi VK, khuấy trộn trong 30

Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng cellulase ở một số chủng Bacillus phân lập từ đất vườn.doc

Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng cellulase ở một số chủng Bacillus phân lập từ đất vườn.doc

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng cellulase ở một số chủng Bacillus phân lập từ đất vườn.doc

Similar to Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng cellulase ở một số chủng Bacillus phân lập từ đất vườn.doc (18)

More from Dịch vụ viết thuê đề tài trọn gói 🥰🥰 Liên hệ ZALO/TELE: 0917.193.864 ❤❤

More from Dịch vụ viết thuê đề tài trọn gói 🥰🥰 Liên hệ ZALO/TELE: 0917.193.864 ❤❤ (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng cellulase ở một số chủng Bacillus phân lập từ đất vườn.doc