1. SLE adalah penyakit otoimun sistemik yang melibatkan banyak organ dan menyebabkan gejala klinis yang beragam. 2. Pemeriksaan sel Lupus Eritematosus (sel LE) merupakan salah satu temuan penting untuk mendiagnosis SLE. 3. Ada beberapa metode untuk memeriksa sel LE, termasuk menggunakan darah defibrinated, darah heparin, dan darah yang membeku.

1. TUTOR HEMATOLOGI PEMERIKSAAN SEL LUPUS ERITEMATOSUSNUZULUL QURIYAH / PAULUS BUDIONO N.1

2. PENDAHULUAN (1)SLE.SLESLESistemik Lupus Eritematosus (SLE) adalahpenyakit yang penyebabnyatidakdiketahuiTerjadikerusakanjaringandanselolehotoantibodidankompleks-imunpatogenikMerupakan penyakit otoimun yang melibatkan banyak organ dan memberikan gejala-gejala klinik yang beragam2

3. .SLESLEEtiopatogenesisdanpenatalaksanaanmasihdiperdebatkandanberbagaipenelitiandarisegalaaspektelahdilakukan, namunbelummenjawabsejumlahpertanyaanSel Lupus Eritematosus (sel LE) merupakansalahsatutemuan yang memberikankeyakinanbahwa SLE merupakanpenyakitotoimunPENDAHULUAN (2)3

4. PERMASALAHANManifestasi klinis SLE sangat bervariasi,gambaran klinis terutama keluhan penderita juga beragamKelambatan diagnosis SLEPemeriksaan sel LE masih digunakan atau dipertimbangkandi daerahPemeriksaan serologis awal yang sering digunakan untuk menegakkan diagnosis SLE adalah pemeriksaan ANA (Antinuclear Antibody)cukup mahalwww.themegallery.com4

5. Pembentukan Sel LE123Depolimerisasi DNA inti sel lekosit yang rusak, diikuti pelepasan bagian-bagian dari inti sel, sehingga terbentuk masa globular yang homogen, kemudiandifagositoleh selnetrofil sel LETubuh akan membentuk antibodi (otoantibodi) faktorLE Kerusakan pada jaringan penyambung menyebabkan pelepasan protein ke dalam aliran darah(antigen)www.themegallery.com5

6. 12Metode Pemeriksaan Sel LEDefibrinated Blood(Metode Zinkham dan Conley)Dipakai di RSU dr. Soetomo6MereaksikanSerum Pasien dengan Lekositnya SendiriMetode5Darah Heparin34Mereaksikan Serum Pasien denganLekosit Orang NormalClotted Blood(Metode Zimmer dan Hargraves)www.themegallery.com6

7. Metode Menggunakan Defibrinated Blood132Darah vena10 ml dimasukkan dalamErlenmeyer yang berisi glass beads. Digoyang dengangerakan memutar selama 5 menit atausampaitidakterdengar suara gelas lagi, untukmendapatkan defribinatedblood. Kemudian dimasukkan dalam inkubator padasuhu 37ºC selama 3 - 4 jamLapisan buffy coat diambil dengan pipet Pasteur dan dibuat sediaan hapus, dipulas dengan pewarnaan RomanowskyDarah dimasukkan ke dalam tabung Wintrobe, disentrifus pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menitwww.themegallery.com7

8. Metode Menggunakan Darah HeparinDarah vena 10 ml dimasukkandalamtabungberisi heparin 60 unit danglass beads 3 mm sebanyak 10 buah. Tabungdibolak-balikkansupayadarahdan heparin tercampurDarah diinkubasi pada suhu kamar 30 menit dan diletakkan pada rotator selama 30 menitMetode Menggunakan Darah HeparinDibiarkan lagi selama 30 menit.Kemudian disentrifus pada kecepatan 1500 rpm selama 5 menitPlasmanya dibuang dan lapisan buffy coat diambil dengan menggunakan pipet Pasteur, dimasukkan ke dalam tabung WintrobeDisentrifus pada kecepatan 1500 rpm selama 5 menitLapisan buffy coat diambil dan dibuat sediaan hapus dan dipulaswww.themegallery.com8

9. Metode Menggunakan Clotted BloodDarah vena 10 ml dibiarkan beku pada suhu kamar kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 2 jamBekuan darah diambil dan ditempatkan di atas saringan yang terbuat dari kawat. Serum dan sel yang keluar dari saringan dimasukkan dalam tabungMetode Menggunakan Clotted BloodDisentrifus pada kecepatan 2000 rpm selama 5 menitDiambil 1 ml lapisan yang teratas dari sel, dimasukkan ke dalam tabung Wintrobe dan disentrifus lagi pada kecepatan 2000 rpm selama 5 menit untuk mendapatkan lapisan buffy coatDibuat sediaan hapus dari buffy coat dan dipulas dengan pewarnaan Romanowskywww.themegallery.com9

10. Metode Mereaksikan Serum Pasien dengan Lekosit Orang Normal (1)Serum : darah vena10 ml dibiarkan beku pada suhu kamar, kemudian disimpan pada suhu -20°C sampai digunakan.12Normal Leucocyte Suspension : darah golongan O, jumlah 5 ml dimasukkan dalam tabung yana berisi heparin 1 ml.Disentrifus pada kecepatan 1500 rpm selama 15 menit. Setengah bagian bawah dari sel dibuang dengan memakai pipet Pasteur,sisanya dicampur dan dibiarkan mengendap pada suhu 37°C sampai didapat 1 – 2 ml plasma.Supernatan plasma ini disentrifus pada kecepatan 1000 rpm dan dicuci 3 kali dengan normal salin. Kemudian salin dibuang dan suspensi lekosit ditampung (0,5 ml)www.themegallery.com10

11. Metode Mereaksikan Serum Pasien dengan Lekosit Orang Normal (2)Campur 1 volume serum dan 1 volume suspensi dan diinkubasi 37°C selama 3 – 4 jam3Disentrifus pada 1000 rpm selama 5 menit, lapisan buffy coat dibuat sediaan hapus dan dipulas dengan pewarnaan Romanowsky 4www.themegallery.com11

12. Metode Mereaksikan Serum Pasien dengan Lekositnya Sendiri(1)1Persiapan spesimen dan merusak dinding lekosita. Darah vena 10 ml diletakkan pada waterbath dengan suhu 37°C selama 1 – 2 jam sampai terjadi bekuan. Kemudian bekuan dengan kawat saringan diletakkan pada mortir dan dihaluskan dengan alat penumbukb. Darah heparin 5 ml dalam tabung 15 ml yang berisi glass bead, disentrifus pada kecepatan 50 rpm selama 30 menit pada suhu 37°C. Kemudian diletakkan pada suhu 37°C selama 15 menitwww.themegallery.com12

13. Metode Mereaksikan Serum Pasien dengan Lekositnya Sendiri (Lanjutan...)Spesimen darah dipindahkan ke beberapa tabung Wintrobe dengan pipet Pasteur, disentrifus pada kecepatan 2500 rpm selama 20 menit. Serum yang hemolisis dipindahkan, buffy coat disimpan234Diperiksa dengan mikroskop pada pembesaran 1000xBagian buffy coat dipindahkan dengan pipet Pasteur yang bersih, diteteskan ke 3 slide mikroskop, dibuat hapusan dan dipulas dengan pengecatan Leishman atau Wrightwww.themegallery.com13

14. Metode di RSU Dr. Soetomo(1)Darah vena 5 ml dibiarkanbekupadasuhuruangan 1 – 2 jamSerum dibuang dan bekuannya dihaluskan dalam mortir. Setelah halus, diambil dengan pipet kapilerMetode di RSU Dr. SoetomoDibiarkanselama 10 – 15 menit agar terjadifagositosisKemudian disentrifus pada kecepatan 2000 rpm selama 5 menitLapisanbuffy coatdiambildandibuathapusanPewarnaan dengan giemsa selama 3 – 4 menit. Dibilas air dan dilihat dengan mikroskop dengan pembesaran 1000xwww.themegallery.com14

15. Metode di RSU Dr. Soetomo(2)Syarat pembacaan :1Dibuat 3 buah hapusan buffy coatDiperiksa dengan mikroskop pembesaran 1000x selama minimal 10 menit2www.themegallery.com15

16. INTERPRETASIPositifNegatifFalse negatifFalse positif rheumatoid arthritis, anemia hemolitik, interaksi obat (penisilin, hidralazin, obat antikonvulsi, metildopa)didapatkan kurang dari 2 sel LEdidapatkan minimal 2 sel LEpemakaian adenokortiko-steroid,severe leucopenia, remisi spontanwww.themegallery.com16

17. Membedakan Sel LE dengan Sel Tart (1)PerbedaanSel LE :-sel netrofil yang memfagosit inti sel lekosit lain yang sudah rusak dan membentuk masa globular yang homogen- masa inti nampak homogenSel Tart :monosit yang memfagosit sel monosit yang lain/ sel yang lain- inti masih nampak benang-benang kromatinwww.themegallery.com17

18. Membedakan Sel LE dengan Sel Tart (2)Sel LESel Tart18

19. PENUTUPDi daerah penggunaan pemeriksaan sel LE masih dipertimbangkan, meski dari penderita SLE yang diperiksa hanya 75% yang ditemukan sel LE-nya, karena relatif lebih murah dibanding pemeriksaan ANA www.themegallery.com19

20. Atas PerhatiannyaTerima Kasih20

21. KEPUSTAKAANBrown, Barbara A. Hematology : Principles and Procedures. 3rd ed. Philadelphia : Lea & Febiger, 1980, pp. 184 - 187 Dacie, S.J.V. et al. Practical Haematology. 7th ed. Singapore : Churchill-Livingstone, Medical Division of Longman Group UK Ltd, 1991, pp. 530 – 532Dacie, S.J.V. et al. Practical Haematology. 8th ed. Singapore : Churchill-Livingstone, Medical Division of Longman Group UK Ltd,1998, pp. 569 – 571Harrison. Prinsip-PrinsipIlmuPenyakitDalam. 13th ed. Volume 4. Jakarta : EGC, 2000, pp. 1834 – 1839Mukherjee, Kanai L. Medical Laboratory Technology. 1st ed. Volume I,New Delhi : Tata Mc. Graw Hill Publishing Company Limited, 1988, pp. 337 – 341Seiverd, Charles E. Hematology for Medical Technology. 5th ed. Philadelphia : Lea & Febiger, 1983, pp. 522 – 527Simmons, Arthur. Technical Hematology. 3rd ed. Philadelphia : J.B. Lippincott Company, 1980, pp. 126 – 129, 145SimposiumNasional I Systemic Lupus ErythematosusdanPembentukanPerhimpunan SLE Indonesia. Jakarta, 199521

22. Buffy Coat22

23. Buffy Coat

24. Pewarnaan GiemsaKomposisi :Bubuk warna Giemsa 0,75 gMethanol 65 mlGlycerol 35 mlBuffer : KH2PO4 6,63 g Na2HPO4 3,20 g Aquades ad 1000 mlPanaskan 50° /15 menit lalu saringSebagai stok cat GiemsaLarutan cat Giemsa kerja:Encerkan dengan buffer dengan perbandingan 1 : 4-524

25. Tehnik Pengecatan GiemsaFiksasimetanol 1 – 2 menitTuangihapusandenganlarutankerja cat giemsa 20 – 30 menitCucidengan buffer Keringkandanlihatdibawahmikroskopdenganpembesaran 1000 x25

26. Pewarnaan WrightKomposisi :Eosin & Methylene blue dg pelarut methanolBuffer : KH2PO4 6,63 g Na2HPO4 3,20 g Aquades ad 1000 ml26

27. Tehnik Pengecatan WrightHapusandarahkeringdifiksasidenganmeneteskan cat wrightmenutupi rata hapusandarah, selama 2 menitMeneteskanlarutan buffer samaatau 1,5 kalinya. Tiupsampaitimbulwarnametalikdantunggusampai 20 menitCucihapusandengan air, sampaiseluruhlapisan cat tercuciKeringkandanlihatdenganpembesaran 1000 x27

28. Pewarnaan LeishmanKomposisi :Bubuk warna Leishman 0,2 gMethanol 100 mlBuffer : Disodium hydrogen phosphate 3,76 g (Na2HPO4-2H2O) Potassium dihydrogen phosphate anhydrous (KH2PO4) 2,10 g Aquades ad 1000 mlBilas botol bersih dengan metanol tambah beberapa glass beads, tambahkan bubuk warna dan metanol ,kocok agar larut.28

29. Teknik Pengecatan LeishmanFiksasidenganmetanol 2-3 menitPengenceranLeishmanstainningdenganlarutan buffer ( 1: 2 ). Biarkanselama 7 – 10 menitBilasdenganlarutan buffer. Biarkan 2 - 3 menitBuangsisalarutan buffer dankeringkanLihatdenganmikroskoppembesaran 1000X29

30. Kriteria ARA (American Rheumatology Association) 1982Ruamkupu-kupuLupus diskoidFotosensitivitasUlkusronggamulutArtritisSerositisa. Pleuritis : terdengar “gesekan” olehdokteratauefusipleura ataub. Perikarditis : tampakpada EKG atau “gesekan” atauadanyaefusi pericardialKelainanGinjala. Proteinuriapersisten > 0,5 g/dl per hari30

31. Kriteria ARA (2)7. b. Silinderselular; mungkinseldarahmerah, hemoglobin, granular tubular ataucampuranKelainanneurologisa. Seizures (serangantiba-tiba); tanparangsanganobatataukekacauanmetaboliktertentub. PsikosistanparangsanganobatKelainanhematologisa. Anemiahemolitik; denganretikulosis, ataub. Lekopenia : 4.000 sel/µL padaduaataulebihpemeriksaan, atauc. Limfopenia : 1.500 sel/µL padaduaataulebihpemeriksaan, ataud.Trombositopenia : 100.000 /µL tanpaadanyagangguanobat31

32. Kriteria ARA (3)Kelainanimunologisa. Sel LE positifpadasediaan, ataub. Anti DNA : adanyaantiboditerhadap DNA aslidengantiter abnormal, atauc.Anti-SM : adanyaantiboditerhadap antigen-nuklear-SM (Smooth Muscle)d.STS (Serologis test for syphilis) positifpalsu paling sedikit 6 bulantesTPI (TreponemaPallidumImmobilization) atau FTA (Fluorescence TreponemalAntibody).11. Antibodi-antinuklear : suatutiterabnormal antibodi- antinukleardengancaraimunofluoresen32

33. PEMERIKSAAN ANA(ANTINUCLEAR ANTIBODY)POSITIF PADA BEBERAPA PENYAKIT AUTOIMUN: - SLE, SJOGRENS SYNDROMES33

34. DETEKSI ANABeberapa otoantibodi dapat merupakan suatu petanda (marker) pada penyakit tertentu, seperti anti ds-DNA, anti-SM, anti PCNA untuk SLEAnti Sc 170 dan anti centromer (ACA) untuk Sklerosis Sistemik34

35. Substrat antigen : sel kultur HEp2(human carcinoma larynx)Bahan : serum, pengenceran 1:25 / 1:40Tehnik : IMUNOFLUORESEN yang memberi fluoresensi khas (memakai mikroskop fluoresen)1. Fluoresensi Nuklear : 5 pola Cenderung pada penyakit : (tidak spesifik) 1.1 Homogen SLE 1.2 Speckled UCTD, PSS, SLE35

36. 1.3 Rim SLE 1.4 Nucleolar PSS, SLE 1.5 Centromere CREST2. Fluoresensi Cytoplasmic : dijumpai pada penyakit : 2.1 Fine Speckled (JO-1) SLE 2.2 Ribosomal-p UCTD, PSS, SLE36

37. Spektrum penyakit autoimunOrgan spesifikHashimotos thyroiditisThyrotoxicosisInsulin dependent diabetes mellitusAutoimun haemolytic anaemiaIdiopathic thrombocytopenic purpuraPrimary billiary cirrhosisUlcerative colitis37

38. Spektrum penyakit autoimunNon organ spesifikSjogrens syndromeRheumatoid arthritisDermatomyositisSclerodermaMixed connective tissue diseaseDiscoid lupus erythematosusSystemic lupus erythematosus (SLE)38

39. Pembentukan sel LE menurut Dacie (1993)Lekosit ——> Diberikan trauma : -mekanis- kimiawiKerusakan membran sel lekosit Inkubasi : inti sel lekosit kontak dengan faktor LE yang ada dalam serum (gama globulin)Depolimerisasi inti, struktur kromatis hilang, massa homogen komplemenDifagosit netrofil yang aktifSel LE39

40. Prinsip PemeriksaanSerum pasien ---->gamma globulin yang secara langsung menuju ke inti lekosit. Inti sesudah bereaksi dengan faktor LE---->badan LE dengan ciri-ciri : bulat, homogen, inti yang terbentuk yang menarik netrofil dan ditelan oleh satu netrofil disebut sel LE.Sel LE mengambil pewarnaan dan dapat dikenali di bawah mikroskop ketika membuat hapusan buffy coatMemerlukan lekosit yang mengalami trauma.Sel LE sering hampir sama dengan Tart Cell ---->monosit memfagosit sel lain biasanya lekosit atau sel nukleus yang lain. 40

41. Sensitivitas Diagnostik = TP x100% TP+FNJumlah penderita yang memberikan hasil positif dari semua penderita yang diperiksa dengan dugaan menderita penyakit tsbSpesifisitas Diagnostik = TN x 100% TN+FP Jumlah penderita yang memberikan hasil negatif dari semua penderita yang diperiksa dengan dugaan tidak menderita penyakit tsb41

42. Nilai Ramal Positif = TP x 100% (~ Sp) TP+FP Jumlah penderita dengan hasil benar2 positif dari semua penderita yang memberi hasil positif Nilai Ramal Negatif = TN x 100% (~ Sn) TN+FN Jumlah penderita dengan hasil yang benar2 negatif dari semua penderita yang memberi hasil negatif42