1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 28666
(51) A61K 39/10 (2006.01)
G01N 33/531 (2006.01)
КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2013/1170.1
(22) 05.09.2013
(45) 15.07.2014, бюл. №7
(72) Иванов Николай Петрович; Саримбекова Сауле
Нургалиевна
(73) Товарищество с ограниченной
ответственностью "Вита-СТ"
(54) СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ
УТРАЧЕННОЙ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ
ЕДИНОГО БРУЦЕЛЛЕЗНОГО АНТИГЕНА
ДЛЯ ПОСТАНОВКИ КОЛЬЦЕВОЙ РЕАКЦИИ
С МОЛОКОМ
(57) Изобретение относится к ветеринарии, а
именно к способу восстановления утраченной
диагностической активности и специфичности
бруцеллезного антигена для постановки кольцевой
реакции с молоком.
Аналогов в доступной литературе не найдено.
Задачей изобретения является восстановление
утраченной диагностической активности и
специфичности бруцеллезного антигена для
постановки кольцевой реакции с молоком.
Технический результат достигается тем, что
осуществляют отмывание микробных клеток с
помощью 1%-ного раствора твина-20, а осадок
ресуспензирует.
Предлагаемый способ позволяет восстановить
утраченную диагностическую активность и
специфичность бруцеллезного антигена для
постановки кольцевой реакции с молоком.
Сущность способа.
Способ восстановления утраченной
диагностической активности и специфичности
единого бруцеллезного антигена для постановки
кольцевой реакции с молоком осуществляется путем
центрифугирования бактериальной массы бруцелл
антигена для кольцевой реакции с молоком при
15000 об/мин в течении 5 минут, с последующим
удалением надосадочной жидкости и добавлением в
объеме 1:5 1% раствора твина-20, с последующим
выдерживанием при помешивании в течении
30 минут, центрифугированием бактериальной
массы бруцелл при 15000 об/мин в течении 5 минут
с последующим удалением надосадочной жидкости,
концентрат антигена протравливают и окрашивают
гематоксилином, центрифугируют окрашенную
суспензию при 5000 об/мин в течении 30 мин,
удаляют надосадочную жидкость, взвешивают
осадок и ресуспендируют до 7% концентрации в
молочнокислом буфере с рН 3,6, шуттеллируют в
течении 2 ч и разливают во флаконы.
(19)KZ(13)A4(11)28666

2. 28666
2
Изобретение относится к ветеринарии, а именно
к способу восстановления утраченной
диагностической активности и специфичности
бруцеллезного антигена для постановки кольцевой
реакции с молоком.
Аналогов в доступной литературе не найдено.
Задачей изобретения является восстановления
утраченной диагностической активности и
специфичности бруцеллезного антигена для
постановки кольцевой реакции с молоком.
Технический результат заключается в
восстановления утраченной диагностической
активности и специфичности бруцеллезного
антигена для постановки кольцевой реакции с
молоком.
Технический результат достигается тем, что
осуществляют отмывание микробных клеток с
помощью 1%-ного раствора твина-20.
Предлагаемый способ позволяет восстановить
утраченную диагностическую активность и
специфичность бруцеллезного антигена для
постановки кольцевой реакции с молоком.
Сущность способа.
Способ восстановления утраченной
диагностической активности и специфичности
единого бруцеллезного антигена для постановки
кольцевой реакции с молоком осуществляется путем
центрифугирования бактериальной массы бруцелл
антигена для кольцевой реакции с молоком при
15000 об/мин в течении 5 минут, с последующим
удалением надосадочной жидкости и добавлением в
объеме 1:5 1% раствора твина-20, с последующим
выдерживанием при помешивании в течении 30
минут, центрифугированием бактериальной массы
бруцелл при 15000 об/мин в течении 5 минут с
последующим удалением надосадочной жидкости,
концентрат антигена протравливают и окрашивают
гематоксилином, центрифугируют окрашенную
суспензию при 5000 об/мин в течении 30 мин,
удаляют надосадочную жидкость, взвешивают
осадок и ресуспендируют до 7% концентрации в
молочнокислом буфере с рН 3,6, шуттеллируют в
течение 2 ч и разливают во флаконы.
Пример восстановления утраченной
диагностической активности и специфичности
бруцеллезного антигена для постановки кольцевой
реакции с молоком.
Бактериальную массы бруцелл выделяют из
антигена для кольцевой реакции с молоком при
15000 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную
жидкость разбавляют 1%-ным раствором твина-20 в
соотношении 1:5. Далее раствор выдерживают при
комнатной температуре при помешивании в течении
30 минут. Затем бактериальную массу бруцелл
центрифугируют при 15000 об/мин в течении 5
минут с последующим удалением надосадочной
жидкости. Осадок ресуспендируют в
фенолизированном физиологическом растворе до
концентрации 100 млрд м.к./см3
.
Приготовленную суспензию проверяют на
чистоту и стерильность путем микроскопии мазков,
окрашенных по Грамму и Козловскому, и высева на
МПБ, МПА, печеночно-мартеновский агар и бульон
с переваром Хоттингера, МТШБ под вазелиновым
маслом и среду Сабуро - по две пробирки и два
флакона с 50 мл бульона на каждый образец. За
высевами наблюдают в течение 10 дней.
При отсутствии посторонней микрофлоры
приготовленный антиген считается пригодным для
окрашивания.
Приготовление протравы.
В качестве протравы применяют 0,5%-ный
раствор сернокислого железа окисного.
Необходимое количество сернокислого железа
растворяют в горячей дистиллированной воде и
доводят до кипения. Охлажденный раствор
фильтруют через бумажный фильтр для удаления
красновато-темно-коричневого преципитата и
используют для протравы. При хранении в закрытой
емкости раствор может быть для применения в
течение одного года.
Приготовление красящего раствора.
К 500 мл приготовленного в стеклянной посуде
насыщенного раствора алюмоаммонийных квасцов
добавляют гематоксилин, предварительно
растворённый в этиловом спирте ректификованном.
Полученную смесь облучают фиолетовым светом в
открытом стеклянном или фарфоровом сосуде при
комнатной температуре в течение трех суток.
Раствор краски фильтруют через фильтровальную
бумагу №1, добавляют дозы метилового спирта и
глицерина. Полученную смесь оставляют при
комнатной температуре в открытой бутыли на 3-4
недели для созревания, затем фильтруют и хранят в
закрытой емкости. Краска должна иметь
красновато-малиновый цвет и может быть пригодна
для применения в течение пяти лет. Перед
употреблением раствор краски фильтруют через
бумажный фильтр.
Перед окрашиванием бактерийную взвесь
протравливают; добавляя к каждому литру взвесь
раствора сернокислого железа, смешивают и
прогревают в водяной бане при температуре 45-
50°С в течении 20-25 мин.
Бактерийную суспензию окрашивают красящим
раствором гематоксилина, взятых в оптимальной
дозе, которую устанавливают титрацией. Для этого
в шесть центрифужных пробирок наливают по 1 мл
испытуемой протравленной взвеси бруцелл и
микропипеткой добавляют красящий раствор в
возрастающих дозах: в первую пробирку 0,01, во
вторую -0,015, в третью - 0,02 и т. д. Пробирки
встряхивают, ставят в водяную баню при
температуре 40-45°С на 10 мин и центрифугируют
при 3000 об/мин в течение 10 мин. По цвету
жидкости над осадком определяют оптимальное
количество красящего раствора. Жидкость под
осадком не должна быть окрашенной, допускается
незначительный, синеватый оттенок. Для
окрашивания всей серии берут такую дозу краски, с
которой надосадочная жидкость после
центрифугирования остается прозрачной или
сохраняет ее следы.
Бактерийную взвесь окрашивают
гематоксилином, взятым в оттитрованной дозе,
прогревают в водяной бане при 40°С 10-15 мин.

3. 28666
3
Окрашенную суспензию центрифугируют при
5000 об/мин в течении 30 мин, полученную
надосадочную жидкость удаляют, а осадок
взвешивают и по его результатам ресуспендируют
до 7% концентрации в молочнокислом буфере с рН
3,6 и шуттеллируют в течении 2 ч.
Приготовленный антиген разливают во флаконы
объемом 10-20 см из нейтрального стекла,
закупоривают резиновыми пробками и закатывают
металлическими колпачками.
Контроль антигена.
Приготовленный антиген проверяют на
стерильность, специфичность и активность.
Стерильность препарата определяют высевом
содержимого 2-3 флаконов каждой серии на
питательные среды, элективные для аэробной и
анаэробной микрофлоры и грибов.
На специфичность и активность каждую серию
препарата проверяют контрольной серией антигена
на десяти пробах свежего молока от здоровых
коров. Молоко каждой пробы наливают по 2 мл в
пробирки и добавляют по 0,2 мл 20%-ного раствора
хлористого натрия. Пробирки встряхивают и вводят
в них позитивную бруцеллезную сыворотку в
следующих дозах: в первую пробирку 0,15 мл, во
вторую - 0,1 мл и в третью - 0,05 мл. Пробирки
встряхивают, в каждую добавляют по 0,15 мл
антигена, снова тщательно встряхивают и ставят в
термостат или водяную при 37-38°С на 2 ч. После
этого учитывают реакцию. Контролем служит
четвертая пробирка.
Все пробы молока, в которые не добавляли
позитивную сыворотку (четвертый ряд пробирок),
должны дать четкий отрицательный результат. Во
всех трех пробирках или в первых двух с дозой
сыворотки ОД 5 и 0,1 мл в слое сливок должно
появиться отчетливое синее кольцо. Активность
антигена не быть ниже активности контрольной
серии антигена, полученной из штамма 19.
Срок годности антигена 2 года со дня
приготовления при условии хранения при
температуре не выше 15°С. Антиген, подвергшийся
замораживанию, для применения непригоден.
Диагностическую ценность восстановленного
антигена, полученного описанным способом,
изучали в сравнении с невосстановленным
антигеном для постановки кольцевой реакции с
молоком при исследовании молока крупного
рогатого скота в производственных условиях.
Результаты этих исследований отражены в таблице.
Таблица 1
Сравнительные данные по восстановлению утраченной диагностической активности и специфичности
бруцеллезного антигена для постановки кольцевой реакции с молоком
Титр антигена Количество проб До восстановления После восстановления
Молоко от больных
коров
25 - 25
Молоко от здоровых
коров
25 - -
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ восстановления утраченной
диагностической активности и специфичности
единого бруцеллезного антигена для постановки
кольцевой реакции с молоком, включающий
центрифугирование бактериальной массы бруцелл
антигена для кольцевой реакции с молоком при
15000 об/мин в течении 5 минут, удаление
надосадочной жидкости, добавление к осадку 1%
раствора твина-20 в соотношении 1:5, с
последующим выдерживанием при помешивании в
течении 30 минут, центрифугированием
бактериальной массы бруцелл при 15000 об/мин в
течение 5 минут с последующим удалением
надосадочной жидкости, концентрат антигена
протравливают и окрашивают гематоксилином,
центрифугируют окрашенную суспензию при
5000 об/мин в течении 30 мин, удаляют
надосадочную жидкость, взвешивают осадок и
ресуспендируют до 7% концентрации в
молочнокислом буфере с рН 3,6, шуттеллируют в
течении 2 ч и разливают во флаконы.
Верстка Ж. Жомартбек
Корректор Е. Барч