Документ описывает изобретение штамма вируса бешенства av-0172, использующегося для изготовления инактивированной сорбированной вакцины против бешенства сельскохозяйственных животных. Штамм обладает высокой иммуногенной эффективностью и способен репродуцироваться в культурах клеток и мозге мышей, что делает его пригодным для применения в ветеринарной практике. Вакцина, основанная на этом штамме, позволит эффективно контролировать эпизоотическую ситуацию по бешенству среди сельскохозяйственных животных.

1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 28576
(51) C12N 7/00 (2006.01)
A61K 39/205 (2006.01)
КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2013/1184.1
(22) 10.09.2013
(45) 16.06.2014, бюл. №6
(72) Кутумбетов Леспек Бекболатович;
Мырзахметова Балжан Шайзадаевна; Даутпаева
Зауреш Жумагановна
(73) Товарищество с ограниченной
ответственностью "Казахский научно-
исследовательский ветеринарный институт"
(56) RU 2287343 C1, кл. А61K 39/205, 2005
(54) ШТАММ ВИРУСА БЕШЕНСТВА AV-0172,
ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ
ИНАКТИВИРОВАННОЙ СОРБИРОВАННОЙ
ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БЕШЕНСТВА
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
(57) Изобретение относится к ветеринарной
вирусологии и может быть использовано для
специфической профилактики бешенства
сельскохозяйственных животных.
Технический результат обспечиваемый
изобретением, выражается в получении штамма
вируса бешенства, пригодного для изготовления
инактивированной сорбированной вакцины против
бешенства сельскохозяйственных животных.
Штамм вируса бешенства AV-0172 ЛБП 141
КазНИВИ депонирован в лаборатории генофонда
микроорганизмов ТОО "Казахский научно-
исследовательский ветеринарный институт",
используемый для изготовления инактивированной
сорбированной вакцины против бешенства
сельскохозяйственных животных.
(19)KZ(13)A4(11)28576

2. 28576
2
Изобретение относится к области ветеринарной
вирусологии и может быть использовано при
изготовлении вакцины против бешенства
сельскохозяйственных животных.
Известен штамм вируса бешенства «Щелково-
51», культивируемый на перевиваемых клетках
ВНК-21, используемый для изготовления вакцины
против бешенства сельскохозяйственных животных
[Патент Российской Федерации №2287343 кл. А61K
39/205 (2006.01), 2005].
Недостатком известного штамма вируса является
то, что он не обладает способностью
репродуцироваться в культуре клеток тестикулов
ягнят и мозге мышей-сосунков.
Задачей изобретения является получение штамма
вируса бешенства, способного репродуцироваться в
культуре клеток и обладающего высокой
иммунногенностыо.
Технический результат, обспечиваемый
изобретением, выражается в получении штамма
вируса бешенства, пригодного для изготовления
слабореактогенной, иммунологически эфективной
инактивированной вакцины.
Штамм вируса бешенства AV-0172 ЛБП 141
КазНИВИ депонирован в лаборатории генофонда
микроорганизмов ТОО "Казахский научно-
исследовательский ветеринарный институт",
используемый для изготовления инактивированной
сорбированной вакцины против бешенства
сельскохозяйственных животных.
Штамм получен из вирулентного вируса
бешенства, выделенного из мозга трупа коровы,
доставленного из приусадебного хозяйства
Алматинской области, путем фиксации
принудительными последовательными и
перемежающимися пассажами в мозге мышей и
культуре клеток ТЯ-КК 49.
Полученный штамм характеризуется
следующими признаками.
Назначение штамма: штамм вируса бешенства
AV-0172 ЛБП 141 КазНИВИ фиксированный,
обладает патогенностью по отношению к животным
при интрацеребралыюм заражении, активно
репродуцируется в мозге мышей-сосунков и
культуре клеток ТЯ-КК 49.
Штамм вируса обладает высокой иммуногенной
эффективностью и используется для изготовления
инактивированной вакцины. Штамм вируса AV-
0172 ЛБП 141 КазНИВИ получают путем
культивирования в культуре клеток ТЯ-КК 49 и
мозге мышей-сосунков.
Морфологические признаки. Размер вирионов от
100 до 430 нм.
Культуральные свойства. Штамм вируса
бешенства AV-0172 ЛБП 141 КазНИВИ
репродуцируется в мозге мышей - сосунков и
культуре клеток ТЯ-КК 49, накапливается в титрах
106,0-107,0МЛД50/Г/ТИД50/Г, вызывающие 50%
летальный эффект у мышей-сосунков и
инфекционный в культуре клеток. Штамм вируса
бешенства AV-0172 ЛБП 141 КазНИВИ
репродуцируется в мозге мышей-сосунков и
культуре клеток ТЯ-КК 49 без дополнительных
адаптационных пассажей и накапливается в
максимальных титрах на 7-9 и 5-7 сутки,
соответственно, после инфицирования.
Антигенные свойства. Штамм вируса бешенства
AV-0172 ЛБП 141 КазНИВИ в инактивированном
виде в организме иммунизированных животных
стимулирует образование вируснейтрализующих,
комплементсвязывающих и преципитирующих
антител в титрах: 1,3±0,3 log2, 4±1 log2, 2±0,5 log2,
соответственно.
Патогенные свойства: Штамм вируса бешенства
AV-0172 ЛБП 141 КазНИВИ обладает
патогенностыо по отношению к восприимчивым
животным при интрацеребральном заражении.
Иммуногенные свойства: Штамм вируса
бешенства AV-0172 ЛБП 141 КазНИВИ,
репродуцированный в мозге мышей-сосунков или
культуре клеток ТЯ-КК49 инактивированной
формальдегидом (0,05%) сорбированной гидратом
окиси аллюминия (1,5%) в дозе 1,0 см3
и более
обладает способностью стимулировать
напряженный иммунитет у сельскохозяйственных
животных, привитых подкожным способом.
Стабильность свойств при пассировании:
Основные иммуннобиологические свойства штамма
вируса бешенства AV-0172 ЛБП 141 КазНИВИ при
пассировании в мозге мышей-сосунков и культуре
клеток ТЯ-КК49 сохраняются на протяжении не
менее 10 пассажей.
Сохраняемость. Штамм вируса бешенства AV-
0172 ЛБП 141 КазНИВИ в виде тканевой и
культуральной суспензий не снижает свою
биологическую активность в течение 10 суток при
температуре 4±1°С, 12 мес - при температуре минус
40°С.
Пример 1. Для приготовления инактивированной
сорбированной вакцины против бешенства в начале
готовят биомассу вируса бешенства из штамма AV-
0172 ЛБП 141 КазНИВИ путем репродукции его в
мозге мышей-сосунков или культуре клеток ТЯ-КК
49. Для этого мышей заражают интрацеребрально
штаммом вируса бешенства А-0172 ЛБП 141
КазНИВИ в дозе 103
-104
ЭИД50/0,01
см3
- За мышами
наблюдают ежедневно. У павших мышей
асептически собирают мозг. Его охлаждают при
температуре минус 40±5°С в течении 12-18 часов.
По истечении указанного времени мозг
размораживают, размельчают до гомогенной массы
с помощью гомогенизатора, разбавляют фосфатно-
буферным раствором до 20% концентрации по
объёму, фильтруют через 4-х слойной марлевой
фильтр. Полученную суспензию подвергают
контролю на стерильность по ГОСТ 28085 и
биологическую активность титрованием на белых
мышах-сосунках. При соответствии полученной
суспензией вируса по стерильности требованием
ГОСТ 28085 и наличии титра вируса в ней не ниже
105,0
МЛД50/см
3
, разливают в стерильных условиях во
флаконы по 1,0 см3
. Суспензию во флаконах в
равных объёмных пропорциях смешивают с
защитной средой, содержащей сахарозу - 8%,
пептон - 6% и желатин - 2%, и замораживают при
температуре минус 50°С и ниже в течение не менее

3. 28576
3
6 часов, а затем подвергают сублимации с помощью
специальной установки, создающей в камере вакуум
менее 100 мм.рт.ст, и температуру конденсатора
ниже минус 70°С. Сублимацию проводят до
достижения остаточной влажности в препарате не
более 5%. Высушенную таким образом суспензию
вируса, после герметизации тары (фасовки)
специальными резиновыми пробками и закатывании
аллюминиевыми колпачками, используют в
качестве матрикса производственного и
контрольного вируса в изготовлении и
стандартизации инактивированной вакцины.
Для приготовления вакцины матриксным
вирусом заражают культуру клеток ТЯ-КК 49,
выращенную в двух-трех 1,5-литровых плоских
матрасах с использованием питательной среды
Игла, содержащей 10% сыворотки крови крупного
рогатого скота. Культуру клеток инкубируют при
температуре 37,0±0,5°С в течении 7-9 суток с
заменой питательной среды через каждые 2-3 суток.
По истечению указанного времени культуру клеток
в матрасах с питательной средой замораживают при
температуре минус 40°С и ниже в течении от 3-х
часов и размораживают при температуре 22-37°С с
использованием механического встряхивания.
Размороженной культуральной суспензией,
содержащей вирус бешенства, заражают
необходимое количество культуры клеток ТЯ-КК
49, выращенной в 1,5-литровых матрасах.
Зараженную культуру клеток инкубируют при
температуре 37,0±0,5°С в течении 7-9 суток, заменяя
питательную среду в матрасах однократно за 3
суток до окончания культивирования. По истечению
срока инкубации культуру клеток в матрасах
замораживают при температуре минус 40°С и ниже
в течении от 6 ч, размораживают при температуре
22-37°С с использованием механического
встряхивания и собирают культуральную суспензию
из матрасов в один стерильный сосуд.
В культуральную суспензию добавляют
формальдегид в конечной концентрации 0,05% и
выдерживают в течении 48 ч при температуре
37±0,5°С при периодическом перемешивании
(3-5 мин через каждые 12 ч).
В культуральную суспензию, обработанную
формальдегидом, добавляют гель гидрата окиси
аллюминия в конечной концентрации по сухому
остатку 1,5%, тщательно перемешивают в течение 5
минут и выдерживают в статическом состоянии в
течение 24 ч при температуре 4-8°С.
После истечения указанного времени смесь
культуральной жидкости, обработанной
формальдегидом и смешанную с гидратом окиси
аллюминия используют в качестве
инактивированной сорбированной вакцины против
бешенства. Препарат фасуют в мелкую тару и
используют после стандартизации
иммунобиологических свойств. Перед фасовкой в
мелкую тару и применением вакцину тщательно
перемешивают. Хранят препарат при температуре 2-
8°С. Вакцину подвергают стандартизации по
стерильности согласно требованиям ГОСТ 28085,
безвредности и иммуногенности.
Для проверки безвредности вакцину тщательно
перемешивают и вводят в дозе 2,0 см3
внутримышечно 3-м кроликам живой массой
2-2,5 кг. За кроликами наблюдают в течении
10 суток. У всех привытых кроликов не должны
развиваться какие-либо патологии местного и
общего характера в течение всего периода
наблюдения.
Для проверки иммуногенности вакцину в дозе по
0,5 см3
вводят внутримышечно 4-м кроликам живой
массой 2,0-2,5 кг. Столько же кроликов
аналогичного возраста оставляют в контроле без
прививки вакциной.
Через 21 сутки у всех 4 голов кроликов,
подвергнутых вакцинации и всех 4-х кроликов,
находящихся в контроле собирают кровь, получают
из нее сыворотку. Сыворотку инактивируют в
течение 30 мин при температуре 56°С и используют
в реакции нейтрализации.
Реакцию ставят на мышах-сосунках против
вируса бешенства в титре 100 МЛД50.
Вакцина считается иммуногенной, если в
сыворотке крови привитых кроликов будут
выявлены антитела в титре не ниже 1 ME при
отсутствии таких антител в сыворотке крови
контрольных животных.
Имеющиеся иммунобиологические свойства
штамма AV-0172 ЛБП 141 КазНИВИ вируса
бешенства позволяют производить
высокоиммуногенную, безвредную,
инактивированную сорбированную вакцину,
применение которой на практике позволит
эффективно регулировать эпизоотическую
ситуацию по бешенству среди
сельскохозяйственных животных.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Штамм вируса бешенства AV-0172 ЛБП 141
КазНИВИ, депонирован в лаборатории генофонда
микроорганизмов ТОО «Казахский научно-
исследовательский ветеринарный институт»,
используемый для изготовления инактивированной
сорбированной вакцины против бешенства
сельскохозяйственных животных.
Верстка Ж. Жомартбек
Корректор Е. Барч