Download to read offline
29372ip
- 1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН (19) KZ(13) A4 (11) 29372 (51) A61K 39/02 (2006.01) C12N 1/20 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ (21) 2014/0133.1 (22) 04.02.2014 (45) 25.12.2014, бюл. №12 (72) Жиеналиева Айнур Акадиловна; Айтжанов Батырбек Досхожаевич; Хусаинов Дамир Микдатович; Мусоев Асылбек Маилибаевич; Сиыршыбек Алтын (73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения "Казахский национальный аграрный университет" Министерства образования и науки Республики Казахстан (56) KZ 26356 А4, 2012 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СИБИРЕЯЗВЕННОГО ДИАГНОСТИЧЕСКОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА ДЛЯ РЕАКЦИИ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ (57) Изобретение относится к микробиологии, иммунологии и биотехнологии, и касается получения сибиреязвенного диагностического иммуноглобулина для реакции иммунофлуоресценции. Способ получения сибиреязвенного диагностического иммуноглобулина для реакции иммунофлуоресценции включает выращивание вегетативной сибиреязвенной культуры, приготовлении ее суспензии, дезинтеграции суспензии ультразвуком при частоте 22 КГц, мощности 60 Вт/см2 в течение 8-12 минут, с последующим центрифугированием дезинтеграта при 8000-10000 об/мин в течение 20-30 мин и сбором надосадочной жидкости, ресуспендированием осадка с повторной дезинтеграцией центрифугата при тех же параметрах, повторением процедуры до полного истощения осадка (5-6 раз), введение ультразвукового лизата лошадям-продуцентам с последующим забором крови и отделением сыворотки, выделением иммуноглобулина методом ультрафильтрации, при этом на первом этапе работ сыворотку пропускают через ультрафильтрационную кассету, имеющую размер пор 200 кД (килодальтон), на втором этапе фракцию ниже 200 кД пропускают через кассету, имеющую размер пор 20 кД, получая частицы диапазоном 20- 200 кД, содержащие иммуноглобулитн, и мечение их флуорохромом. Предлагаемый способ обеспечивает повышение выхода и снижение себестоимости получения сибиреязвенного диагностического иммуноглобулина для реакции иммунофлуоресценции. (19)KZ(13)A4(11)29372
- 2. 29372 2 Изобретение относится кмикробиологии, иммунологии и биотехнологии, и касается получения сибиреязвенного диагностического иммуноглобулина для реакции иммунофлуоресценции. Известен способ получения сибиреязвенного диагностического иммуноглобулина для реакции иммунофлуоресценции путем иммунизации животных-продуцентов сибиреязвенным антигеном, взятием крови, отделением сыворотки, выделение иммуноглобулина и мечение его флуорохромом (Инновационный патент РК (А4) №26356, бюл. №11.- 2012-11-15. МПКИ А61K 39/02, C12N 1/20). Недостатком способа является недостаточный выход целевого продукта и дороговизна способа (при выделении иммуноглобулина используют дорогой спиртовый метод). Задачей изобретения является повышение выхода и снижение себестоимости получения сибиреязвенного диагностического иммуноглобулина для реакции иммунофлуоресценции. Способ получения сибиреязвенного диагностического иммуноглобулина для реакции иммунофлуоресценции включает выращивание вегетативной сибиреязвенной культуры, приготовлении ее суспензии, дезинтеграции суспензии ультразвуком при частоте 22 КГц, мощности 60 Вт/см2 в течение 8-12 минут, с последующим центрифугированием дезинтеграта при 8000-10000 об/мин в течение 20-30 мин и сбором надосадочной жидкости, ресуспендированием осадка с повторной дезинтеграцией центрифугата при тех же параметрах, повторением процедуры до полного истощения осадка (5-6 раз), введение ультразвукового лизата лошадям-продуцентам с последующим забором крови и отделением сыворотки, выделением иммуноглобулина методом ультрафильтрации, при этом на первом этапе работ сыворотку пропускают через ультрафильтрационную кассету, имеющую размер пор 200 кД (килодальтон), на втором этапе фракцию ниже 200 кД пропускают через кассету, имеющую размер пор 20 кД, получая частицы диапазоном 20- 200 кД, содержащие концентрированный иммуноглобулин, и мечением их флуорохромом. Штамм сибиреязвенный вакцинный (Bacillus anthracis - 55 ВНИИВ-ВиМ) используется для изготовления «Вакцины ВНИИВВиМ (Всесоюзный научно- исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии) против сибирской язвы животных», (Коллекция культур микроорганизмов лаборатории контроля и стандартизации сибиреязвенных и листериозных препаратов Всесоюзного (Всероссийского) Государственного научно-контрольного института ветпрепаратов МСХ СССР (Российская Федерация), №Д/7-1). Предлагаемый способ обеспечивает повышение выхода и снижение себестоимости получения сибиреязвенного диагностического иммуноглобулина для реакции иммунофлуоресценции. Способ осуществляется следующим образом А. Техника получения антигена Расплодку из штамма 55-ВНИИВВиМ засевают на мясо-пептонный агар (МПА). Культивируют в термостате при 36-37°С в течение 24 часов. После истечения времени проверяют на чистоту и типичность роста. Смывают физиологическим раствором. Определяют концентрацию живых микробов в 1 см3 методом Коха. Суспензию подвергают дезинтеграции ультразвуком при частоте 22 КГц, мощности 60 Вт/см2 в течение 8-12 минут, с последующим центрифугированием дезинтеграта при 8000-10000 об/мин в течение 20-30 мин и сбором надосадочной жидкости, ресуспендированием осадка с повторной дезинтеграцией центрифугата при тех же параметрах, повторением процедуры до полного истощения осадка (5-6 раз),смешиванием партии надосадочной жидкости, которую используют в составе иммунизирующего антигена. Б. Техника иммунизации животных Для иммунизации, при получения сибиреязвенной сыворотки, отбирают клинически здоровых, полученных из благополучных по инфекционным и инвазионным заболеваниям хозяйств, упитанных лошадей. Отобранных животных после грундиммунизации начинают гипериммунизировать, применяя в качестве иммунизирующего антигена ультразвуковой лизат из однодневной вегетативной культуры штамм 55-ВНИИВВиМ. Начиная с седьмой инъекции у животных- продуцентов проводят пробное взятие крови, а полученные из нее сыворотки исследуют на активность. Когда пробная сыворотка дает положительную реакцию в реакции иммунофлуоресценции с диагностическим сибиреязвенным антигеном, гипериммунизацию считают законченной. Через 7-10 дней после введения последней дозы антигена производят производственное взятие крови. Отделяют сыворотку путем дефибринизации и сепарирования. Полученную сыворотку после консервирования 0,5% фенолр, отстаивают два месяца в сухом темном помещении при 12-15°С. В. Техника получения сибиреязвенного иммуноглобулина Сибиреязвенный иммуноглобулин выделяют методом ультрафильтрации из высокоактивной без следов гемолиза сибиреязвенной сыворотки, используя кассетную систему "Pellicon". На первом этапе работ сыворотку пропускают через кассету, имеющую размер пор 200 кД. В результате процесса ультрафильтрации в сыворотке будут находиться вещества, имеющие массу до 200 кД, а в концентрате - свыше 200 кД. Таким образом, происходит разделение сыворотки на фракцию иммуноглобулинов (ниже 200 кД) и фракцию других высокомолекулярных белков (свыше 200 кД).
- 3. 29372 3 На втором этапеработы, полученный фильтрат сыворотки, содержащий фракцию иммуноглобулинов ниже 200 кД, пропускают через кассету, имеющую размер пор 20 кД получая частицы диапазоном 20-200 кД. В результате этого процесса происходит получение иммуноглобулинов с концентрацией 1:8- 1:12 по отношению к первоначальному содержанию в сыворотке. Высокоактивные сыворотки концентрируют в меньшем, а низкоактивные сыворотки в большем соотношении. В фильтрат уходят низкомолекулярные соединения, которые не оказывают влияния на активность полученной фракции иммуноглобулинов. Г. Приготовление флуоресцирующих антител Для конъюгации (метки) антител предпочтительнее применять не нативные сыворотки, а их глобулиновые фракции. Необходимое количество флуорохрома для конъюгации расчитывают по концентрации в препарате белка (0,5-5 мг флуорохрома на 100 мг белка). В качестве флуорохрома используют изотиоционат флуоресцина (ФИТЦ), максимально поглощающий фиолетово-синие лучи и дающий ярко-зеленую флуоресценцию. Для проведения конъюгации фракцию глобулина доводят с помощью 0,01 М забуференного раствора поваренной соли до содержания белка, равного 1%, а с помощью 0,5 М карбонатного буфера доводят pH до 9,0. Суспензию охлаждают до 4°С и очень медленно прибавляют к ней при постоянном перемешивании красящее вещество. ФИТЦ применяют в количестве 7,5 мг красителя на 10 мл 1%-ного белка. После добавления красителя смесь следует оставить на несколько часов (18-22 ч) при температуре 4°С для достижения полной конъюгации. Для удаления неспецифических флуоресцирующих компонентов осуществляют фильтрацию через сефодекс G - 25. Сефодекс кладут в колонку и промывают его 0,01 М забуференным раствором поваренной соли. Предварительно отцентрифугированный конъюгат осторожно помещают на сефодекс и заливают соответствующим количеством 0,01 М забуференного раствора поваренной соли. Очищенный конъюгат собирают в соответствующий сосуд. Раствор флуоресцирующего иммуноглобулина доводят до 5%-ной концентрации 0,15 М раствором хлористого натрия, консервируют мертиолатом 1:5000, исследуют на специфичность и флуоресцирующую активность и подвергают лиофильной сушке. Д. Определение флуоресцирующей активности и специфичности сибиреязвенного глобулина Флуоресцирующая активность диагностического флуоресцирующего сибиреязвенного иммуноглобулина определяется прямым методом иммунолюминесцентной микроскопии. При диагностике сибирской язвы отпечатки готовят из свежего или свежемороженного материала, селезенки, печени, мышц и др., используя при этом тщательно обезжиренные эфиром или спирт-эфиром предметные стекла (лучше специальные для люминесцентной микроскопии, толщиной 1,5 мм). Отпечатки должны быть тонкими, разнослойными. Это достигается тем, что с кусочка ткани, легко прикрепляющегося к фильтровальной бумаге или тонкой деревянной досточке-шпателю, делают 1-2 грубых отпечатка на отдельном стекле (они не используются в работе), а затем с той же поверхности кусочков делают отпечатки на отдельные предметные стекла, используемые для люминесцентной микроскопии. С каждого исследуемого кусочка исследуемой ткани необходимо сделать не менее 4 отпечатка на 2 стекла. Для контроля аналогично приготавливают препараты из тканей здоровых животных (можно использовать для этого ткани всяких животных, не болевших сибирской язвой). Препараты после высушивания на воздухе в течение 3-5 минут фиксируют в ацетоне при + 12°С в течение 4 часов - при работе с патогенным материалом и 10 минут - при работе с материалом от вакцинированных животных. По мере надобности вскрывают ампулу с диагностическим флуоресцирующим сибиреязвенным иммуноглобулином, ее содержимое растворяют в 1 см3 дистиллированной воды (основное разведение, pH 7,2-7,4), а затем постепенно добавляя физиологический раствор хлорида натрия, или фосфатно-буферный раствор (pH 7,2-7,4), доводят общий объем иммуноглобулина до объема, создающего «рабочее разведение». Рабочее разведение диагностического флуоресцирующего сибиреязвенного иммуноглобулина не должно содержать даже мельчайших количеств визуально видимого осадка или хлопьев препарата. Рабочее разведение диагностического флуоресцирующего сибиреязвенного иммуноглобулина годно к применению в течение 2-х недель после приготовления, при условии хранения в темном месте при температуре +4°С - (+2°С) в хорошо укупоренной склянке и при условии сохранения исходной полной его растворенности. На фиксированные в ацетоне препараты- отпечатки наносят каплями приготовленный в «рабочем разведении» диагностический флуоресцирующий сибиреязвенный иммуноглобулин, покрывая им весь препарат (отпечаток). Затем препараты (предметные стекла) помещают во влажную камеру, например, чашку Петри или закрытый эмалированный лоток, обычный стерилизатор, с увлажненным дном и тампонами влажной ваты и выдерживают 20-30 минут при температуре от +25 до +37°С, затем в течение 1 часа отмывают в 2 сменах 0.01 М фосфатно-буферного раствора (pH 7,2- 7,4), осторожно ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. После такой подготовки
- 4. 29372 4 препараты-отпечатки вполне готовыдля исследования. Примечание: Указанное на этикетке «рабочее разведение» диагностического флуоресцирующего сибиреязвенного иммуноглобулина установлено на день выпуска препарата и определяется по мере хранения через каждые 3 месяца или при возникающей в этом надобности в связи с возможностью снижения препаратом активности. «Рабочее разведение» указывает, во сколько раз надлежит развести 1 см3 основного разведения диагностического флуоресцирующего сибиреязвенного иммуноглобулина, чтобы его раствор был годен к использованию в работе. Указанное на этикетке «рабочее разведение» в 2-3 раза более концентрированное, в сравнении с «красящим титром». Красящий титр- максимальное разведение исходного разведения диагностического флуоресцирующего сибиреязвенного иммуноглобулина, сообщающее сибиреязвенному антигену в препаратах отпечатках, специфическое свечение интенсивностью в 3-4 креста. При установлении «красящего титра» раствора диагностического флуоресцирующего сибиреязвенного иммуноглобулина препараты- отпечатки из ткани животных (кроликов, морских свинок, белых мышей), павших от заражения контрольного сибиреязвенного штамма, красят в течение 30 минут при +37°С. Микроскопия проводится с помощью люминесцентного микроскопа любого типа - MЛ-1, MЛ-2, МЛ-4 и др. с возбуждающими фильтрами ЖС-18 + ЖЗС-19. Препараты просматривают под иммерсией. При этом используют нелюминесцирующее масло. Учитывают результаты визуально на основе оценки интенсивности свечения и морфологических особенностей светящегося комплекса «антиген-антитело». Обычно наблюдают следующую картину: непораженная свежая ткань (свободная от бацилл сибирской язвы) светится тусклым серовато-желтым или слегка зеленоватым цветом: интенсивно светящихся желто-зеленых гранул нет. В препаратах, содержащих бациллы сибирской язвы, наблюдаются разной величины и формы гранулы, которые желто-зеленые интенсивно светятся. Интенсивность свечения оценивают в крестах: «4+» - яркая, светящаяся желто-зеленая люминесценция гранул; «3+» - отчетливо выраженная желто-зеленая люминесценция; «2+» - неяркая люминесценция желтого цвета; «1+» - слабая люминесценция; «- «- отсутствие специфической люминесценции. Диагноз на сибирскую язву считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа обнаруживается достаточное количество (не менее 10) типичных гранул (средних или крупных) с ярким желто-зеленым свечением, при условии отсутствия в контроле подобных светящихся гранул. При отрицательном диагнозе на сибирскую язву, устанавливаемом методом иммунолюминесцентной микроскопии, ставят биопробу. Достижение положительного эффекта при диагностике сибирской язвы прямым методом иммунолюминесцентной микроскопии с применением сибиреязвенного флуоресцирующего иммуноглобулина, полученного по предлагаемой методике, подтверждена более чем в 85 исследованиях препаратов из посевов, а также мазков- отпечатков тканей животных. При этом была установлена высокая диагностическая активность диагностического флуоресцирующего сибиреязвенного иммуноглобулина, превышающая активность аналогичного коммерческого препарата. Метод прямой иммунолюминесцентной микроскопии с использованием диагностического флуоресцирующего сибиреязвенного иммуноглобулина обладает высокой диагностической чувствительностью и специфичностью, позволяет выявлять минимальные количества сибирязвенного антигена, независимо от того, что связан он с посевным материалом или тканями животных. Эффективность способа заключается в получении высокоактивного диагностического флуоресцирующего сибиреязвенного иммуноглобулина безопасным недорогим способом. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения иммуноглобулина диагностического сибиреязвенного флуоресцирующего, включающий иммунизацию животных-продуцентов сибиреязвенным антигеном, взятие крови, отделение сыворотки, выделение иммуноглобулина и мечение его флуорохромом, отличающийся тем, что выделение сибиреязвенного иммуноглобулина, последующую очистку и концентрирование его осуществляют методом ультрафильтрации, при этом на первом этапе работ сыворотку пропускают через ультрафильтрационную кассету, имеющую размер пор 200 кД, на втором этапе фракцию ниже 200 кД пропускают через кассету, имеющую размер пор 20 кД, получая частицы диапазоном 20-200 кД. Верстка Ж. Жомартбек Корректор К. Нгметжанова