Документ описывает способ получения тритерпеноида с антидиабетической активностью из растительного сырья, в частности из надземной массы растения tamarix laxa willd. Технический результат включает расширение ассортимента отечественных лекарственных средств и улучшение методов экстракции, очистки и выделения биологически активных веществ. Изобретение направлено на оптимизацию процессов получения и обработки растительного сырья.

1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 28795
(51) A61K 36/00 (2006.01)
A61P 3/10 (2006.01)
C11B 9/02 (2006.01)
КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2013/1325.1
(22) 08.10.2013
(45) 15.08.2014, бюл. №8
(72) Чаудхари Игбал Мухаммед (PK); Абилов
Жарылкасын Абдуахитович (KZ); Орманбаева
Амангуль Мамыржановна (KZ); Султанова Нургуль
Адайбаевна (KZ); Умбетова Алмагуль Кендебаевна
(KZ)
(73) Республиканское государственное предприятие
на праве хозяйственного ведения "Казахский
национальный университет им. аль-Фараби"
Министерства образования и науки Республики
Казахстан
(56) Патент РФ №2352350, 20.04.2009
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ
ТРИТЕРПЕНОИДА ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО
СЫРЬЯ, ОБЛАДАЮЩЕГО
АНТИДИАБЕТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЕМ
(57) Изобретение относится к области получения
биологически активных природных соединений, в
частности к способу получения тритерпеноида,
обладающего антидиабетическим действием.
Техническим результатом предлагаемого
способа является расширение арсенала
отечественных лекарственных средств, переработка
растительного сырья и получение биологически
активного вещества, обладающего
антидиабетическим действием.
Технический результат обеспечивается путем
экстракции растительного сырья органическим
растворителем, упаривания и очистки на колонке с
силикагельным сорбентом.
Антидиабетическая активность (фермент α-
глюкозидаза) испытана на терпеноиде, выделенном
из надземной массы Tamarix laxa Willd. (TL-11).
(19)KZ(13)A4(11)28795

2. 28795
2
Изобретение относится к области получения
биологически активных природных соединений, в
частности к способу получения тритерпеноида,
обладающего антидиабетическим действием.
Известен способ переработки бересты с
получением тритерпеноидов (Патент РФ №2283655,
МПК6
А61K 36/00, опубл. 20.09.2006 г., бюлл. №26).
Способ осуществляется полярным экстрагентом при
соотношении береста: растворитель - 1:3-1 : 20 при
температуре 18-100°С в течение 0,5-20 часов.
Отделение фильтрованием концентрата
водорастворимых веществ, который может быть
сконцентрирован или переведен в сухое состояние.
Бересту повторно экстрагируют полярным
органическим растворителем при соотношении 1 :
10 - 1 : 20 соответственно. Экстракт отделяют,
концентрируют и выделяют кристаллизацией
концентрат бетулинола с содержанием основного
компонента не менее 10,4-12,2%. Затем из
маточного раствора полностью отгоняют
растворитель и получают концентрат
тритерпеноидов, основными компонентами
которого являются бетулинол и лупеол.
Недостатком способа является то, что
перерабатывается только береста, а также низкий
выход бетулина из бересты (известно, что береста
содержит до 30-35% бетулина).
Известен способ получения тритерпеновых
соединений переработкой березовой коры (Патент
РФ №2305550, МПК6
А61K 36/13, опубл.
10.09.2007 г., бюлл. №25), включающий
последовательное измельчение коры в дробилке;
разделение ее на бересту и луб; экстракцию бересты
растворителем в виде азеотропной смеси
тетрахлорэтилен - вода в течение 0,5-1,4 часа при
температуре 89-115°С, давлении 0,1-1,0 МПа;
отделение раствора от шрота при температуре 80-
100°С; выдерживание фильтра в кристаллизаторе в
течении 1-5 часов при температуре от -5°С до+25°С;
отделение выпавших кристаллов от маточного
раствора; промывание кристаллов
дистиллированной водой или 20%-ным водным
раствором этилового спирта с последующей сушкой
полученного продукта - смеси трех-пяти
тритерпеновых соединений; упаривание маточного
раствора до получения сухого остатка; промывание
его дистиллированной водой с последующей
сушкой полученного продукта - смеси пяти-
семнадцати тритерпеновых соединений. Шрот далее
перерабатывают в лигнин и березовый воск, а луб -
в квас и кормовую добавку.
Недостатком способа является необходимость
предварительного разделения коры на бересту и
луб, что является достаточно трудоемким
процессом. Весь процесс переработки бересты и
луба предусматривает большое количество
дополнительных операций и продолжителен во
времени. При переработке бересты смесь
тритерпеновых соединений, основным из которых
является бетулин, получают в два этапа и с низким
выходом. Кроме того, к недостаткам способа
следует отнести недостаточный ассортимент
получаемых лесохимических продуктов.
Наиболее близким аналогом к предложенному
способу является способ получения смеси
тритерпеноидов из растительного сырья коры
березы (Патент РФ №2352350, МПК6
А61K 36/185,
опубл. 20.04.2009 г., бюлл. №11). Кору березы
измельчают до частиц размером 1-3 мм и
подвергают экстракции неполярным растворителем
(гексаном, бензином БР-1, толуолом, петролейным
эфиром, диэтиловым эфиром), а также
галогенпроизводным углеводородом для выделения
тритерпеновых соединений в аппарате Сокслета.
Далее с целью выделения бетулина тритерпеноиды
кипятят в 20%-ном водном растворе щелочи в
течение 1,5-2,0 часов, затем проводят экстракцию
коры при 75-80°С водно-спиртощелочным
раствором с концентрацией гидроксида натрия 1,5%
и этанола 15-20% в течении 1-1,5 ч и получают
дубильный экстракт. Остаток коры подвергают
карбонизации в реакторе кипящего слоя с
получением углеродного сорбента. Выход бетулина
составляет 9,5% от веса абсолютно сухой коры,
температура плавления полученного бетулина после
перекристаллизации из этилового или
изопропилового спирта - 256-258°С.
Недостатком способа является то, что
переработка растительного сырья предусматривает
большое количество дополнительных операций и
продолжительна во времени.
Задачей настоящего изобретения является
разработка способа выделения тритерпеновых
соединений из растений рода Tamarix (Tamarix laxa
Willd.), обладающего антидиабетическим
действием.
Техническим результатом предлагаемого
способа является расширение арсенала
отечественных лекарственных средств, переработка
растительного сырья и получение биологически
активного вещества, обладающего
антидиабетическим действием.
Технический результат обеспечивается путем
экстракции растительного сырья органическим
растворителем, упаривания и очистки на колонке с
силикагельным сорбентом.
Пример 1. Мелкоизмельченное сырье (надземная
масса - стебли, листья) заливалось 70%-ным водным
раствором этилового спирта и настаивалось в
течение 3 дней. Водно-спиртовый экстракт
отфильтрован и концентрирован под вакуумом
водоструйного насоса при температуре водяной
бане не выше 45°С до полного удаления спирта.
Полученный водный экстракт (0,5 л)
последовательно обработан хлороформом,
этилацетатом, для предварительного разделения
веществ в зависимости от их растворимости. В
результате получены хлороформные, этилацетатные
экстракты и водный раствор исследуемого вида
сырья.
В хлороформном экстракте исследуемых видов
растений реакцией Либермана-Бурхарда и методом
тонкослойной хроматографии (ТСХ) (проявитель
CeSO4, идентифицированы тритерпеноиды.
Хлороформный экстракт растворяют в
минимальном количестве чистого метанола и

3. 28795
3
смешивают с силикагелем (СГ), высушивают в
вакуумном эксикаторе на СаСl2 Образовавшиеся
массы измельчают и получают порошок
коричневого цвета, которые вносят в колонку с СГ.
В качестве системы растворителей используют
гексан-ацетон с повышением градиента полярности
последнего. При элюировании колонок чистым
гексаном смываются липофильные вещества и
хлорофиллы, жирные кислоты. Качественный и
количественный состав жирных кислот в
исследуемых видах растений проанализирован
методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ).
Далее, увеличивая концентрацию ацетона, получают
фракции 4-8. В последующих фракциях 9-18; 19-30
из колонок методом ТСХ обнаружены терпеноиды
(бордовое окрашивание пятен после проявления
сульфатом церия). Повторным
хроматографированием на СГ данных фракций в
индивидуальном состоянии выделено вещество 1.
Схема способа получения тритерпеноида
представлена на фиг.1.
Вещество 1 - аморфный порошок белого цвета с
температурой плавления 198-200°С, отнесено к
пентациклическим тритерпеноидам (фиолетовое
окрашивание с сульфатом церия и положительная
реакция с реактивом Либермана-Бурхарда).
В результате щелочного гидролиза обнаружен
агликон с температурой плавления 270-272°С и
фенолокислота - температура плавления 202-205°С,
идентифицированные методом бумажной
хроматографии (БХ) и ТСХ с достоверными
образцами как эпиалеуритоликовая и кофейная
кислоты, соответственно. Физико-химические
характеристики вещества 1 приведены в таблице 1.
Следует отметить, что вещество 1 на основании
физико-химических методов исследования
идентифицировано с известным веществом: 3-α-
[3",4"-дигидрокси-транс-циннамоил]-окси-Д-
фридоолеан-14-ен-28-овой кислотой -
изотамариксеном. Физико-химические
характеристики соответствуют литературным
данным. Структурная формула вещества 1
представлена на фиг.2.
Таблица 1
Физико-химические характеристики вещества 1
Вещество Спектральные характеристики Вид растений
3-α-[3",4"-
дигидрокси-транс-
циннамоил]-окси-
Д-фридоолеан-14-
ен-28-овая кислота
(вещество 1)
С39Н54О6, белый
аморфный
порошок, т.пл. 198-
200°С (из
метанола), [α]D-22°
(с 0.04, СН3ОН),
Rf 0.40 (VI)
Масс-спектр, м/е, %: 617 (20.0), 438 (37.2), 248 (17.2), 204 (33.8),
189 (23.3), 133 (21.2).
ЯМР 1
Н (500 МГц, CD3COCD3, δ, м.д., J/Гц): 1.30 (2Н, м, Н-1), 1.98
(2Н,м, Н-2), 4.69 (1Н, т, J=2.5, Н-3), 1.35 (1Н, м, Н-5), 1.40 и 1.60
(2Н, м, Н-6), 1.40 и 1.95 (2Н, м, Н-7), 1.55 (1Н, м, Н-9), 1.55 и 1.65
(2Н, м, Н-11), 1.60 и 1.76 (2Н, м, Н-12), 5.54 (1Н, дд, J=11.0, 3.4, Н-
15), 1.96 и 2.37 (2Н, м, Н-16), 2.37 (1Н, м, Н-18), 1.10 и 1.27 (2Н, м,
Н-19), 1.05 и 1.60 (2Н, м, Н-21), 1.50 и 1.70 (2Н, м, Н-22), 0.99 (3Н,
с, Н-23), 0.87 (3Н,с, Н-24), 0.92 (ЗН, с, Н-25), 0.94 (3Н,с, Н-26), 0.94
(3Н, с, Н-27), 0.95 (3Н,с, Н-29), 0.95 (3Н,с, Н-30), 6.30 (1Н, д,
J=15.0, Н-2'), 7.50 (1Н, д, J=15.0, Н-3'), 7.13 (1Н, д, J=2.0, Н-2"), 6.84
(1Н, д, J=8.1, Н-5"), 6.98 (1Н, дд, J=1.9, 8.1, Н-6").
ЯМР 13
С (125 МГц. CD3COCD3): 36.0 (С-1). 23.4 (С-2). 78.2 (С-3),
38.4 (С-4), 51.5 (С-5), 19.2 (С-6), 41.9 (С-7), 39.9 (С-8), 50.0 (С-9),
36.1 (С-10), 18.0 (С-11), 33.8 (С-12), 38.1 (С-13), 161.0 (С-14), 117.1
(С-15), 32.5 (С-16), 51.5 (С-17), 42.5 (С-18), 34.5 (С-19), 32.4 (С-20),
34.3 (С-21), 31.6 (С-22), 28.3 (С-23), 22.2 (С-24), 15.6 (С-25), 26.5
(С-26), 22.6 (С-27), 179.3 (С-28), 30.0 (С-29), 30.1 (С-30), 167.0 (С-
1'), 116.3 (С-2'), 146.3 (С-3'), 127.7 (С-1"), 115.0 (С-2"), 145.3 (С-3"),
148.6 (С-4"), 117.1 (С-5"), 122.3 (С-6").
УФ-спектр (МеОН, λmax, нм): 216. 245. 329.
ИК-спектр (KBr. ν, см-1
): 3417. 1685.1603.1273. 813.
Т.lаха
Биологическая активность вещества 1
исследована в специализированном учреждении:
Исследовательский Институт Химии, Центр
Молекулярной Медицины и Исследования Лекарств
им. доктора Пэйнджвани Университета г. Карачи,
Пакистан.
Антидиабетическая активность (фермент α-
глюкозидаза) испытана на биологически активном
веществе 1 из надземной массы Т.lаха (TL-11).
Испытание проведены на ферменте α-глюкозидазы
при концентрации 30 и 60 µкг/мл. В качестве
стандарта использован 1-диоксинодиримицин.
Данные приведены в таблице 2.

4. 28795
4
Таблица 2
Антидиабетическая активность вещества 1 из надземной массы Т.lаха
Вещества Концентрация (µМ) Процент
ингибирования, (%)
Значение ΙС50, µМ ΙС50 ± sem
0.001562 99
0.000781 94
0.000390 69
0.000195 31
Вещество 1 (TL-11)
0.000097 23
6 6±0.08
Стандарт (425.6 ± 8.14) ) µМ
Acarbose (780 ± 28) µМ
Из приведенных данных следует, что полученное
вещество 1 (TL-11) обладает достаточно высокой,
фактически на уровне стандарта, ингибирующей
активностью фермента α-глюкозидазы при
концентрациях 30 и 60 µкг/мл.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения тритерпеноида, обладающего
антидиабетическим действием, включающий
экстракцию надземной массы растительного сырья
70%-ным водным раствором этилового спирта,
упаривание спиртового экстракта с последующей
обработкой хлороформом, очистку на
силикагельном сорбенте, элюацию целевого
продукта смесью гексан-ацетон (7:3), повторным
хроматографированием, удаление растворителя и
высушивание, отличающийся тем, что в качестве
растительного сырья используют надземную массу
гребенщика рыхлого (Tamarix laxa Willd.).
Верстка Ж. Жомартбек
Корректор Е. Барч