1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 28670
(51) A61K 39/145 (2006.01)
A61B 10/00 (2006.01)
КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2013/1190.1
(22) 11.09.2013
(45) 15.07.2014, бюл. №7
(72) Матвеева Валентина Михайловна; Кошеметов
Жумагали Каукарбаевич; Строчков Виталий
Михайлович; Богданова Марина Ивановна;
Сейсенбаева Мадина Сагадатовна; Нурабаев
Сергазы Шуратбаевич; Сансызбай Абылай
Рысбайулы; Сандыбаев Нурлан Тамамбаевич
(73) Республиканское государственное предприятие
на праве хозяйственного ведения "Научно-
исследовательский институт проблем
биологической безопасности" Комитета науки
Министерства образования и науки Республики
Казахстан
(56) Quinlivan, M., E. Dempsey, F. Ryan, S. Arkins,
and A. Cullinane. Real-time reverse transcription PCR
for detection and quantitative analysis of equine
influenza virus // J. Clin. Microbiol. 2005. 43:5055-
5057
(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСА
ГРИППА ЛОШАДЕЙ СУБТИПА H7 МЕТОДОМ
ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С
ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО
ВРЕМЕНИ
(57) Изобретение относится к области ветеринарной
вирусологии и биотехнологии, в частности к
применению методов полимеразной цепной реакции
(ПЦР) для выявления штаммов (изолятов) вируса
гриппа лошадей, и может быть использовано в
научно- исследовательских учреждениях и
лабораториях с целью эпизоотологического
контроля и мониторинга болезни.
Предлагаемый способ диагностики
предусматривает выделение вирусной РНК, синтез
кДНК, синтез праймеров и зонда и постановку ПЦР-
амплификации на вирусный ген гемагглютинина с
детекцией в режиме реального времени с
использованием синтезированных специфических
праймеров и олигонуклеотидного зонда.
Предложенный способ диагностики вируса
гриппа лошадей методом ОТ-ПЦР-РВ является
высокочувствительным и специфичным к субтипу
Н7 и позволяет достоверно определять наличие РНК
ВГЛ данного субтипа в биологических пробах за 2
часа, без предварительного накопления
тестируемого вируса и может быть использован для
экспресс-идентификации.
(19)KZ(13)A4(11)28670

2. 28670
2
Изобретение относится к области ветеринарной
вирусологии и биотехнологии, в частности к
применению методов полимеразной цепной реакции
(ГІЦР) для выявления штаммов (изолятов) вируса
гриппа лошадей (ВГЛ), и может быть использовано
в научно- исследовательских учреждениях и
лабораториях с целью эпизоотологического
контроля и мониторинга болезни.
Известен способ дифференциальной диагностики
респираторных вирусных инфекций методом
мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме
реального времени (Патент Россия №2460803,
опублик. 10.09.2012). Способ позволяет
дифференциально выявлять в биологических
образцах нуклеиновые кислоты основных
возбудителей ОРВИ - вирусов гриппа А и В,
коронавирусов, вирусов парагриппа 1, 2, 3, 4 типов,
аденовирусов, респираторно-синцитиального
вируса, риновирусов и энтеровирусов. Наличие в
изучаемой пробе нуклеиновых кислот того или
иного респираторного вируса определяется ростом
сигнала флуоресценции определенного красителя в
одной из реакционных смесей. Изобретение может
быть использовано в эпидемиологических службах
для мониторинга эпидемиологической обстановки и
быстрой расшифровки вспышек ОРВИ.
Известен метод диагностики ВГЛ, с
применением ПЦР-РВ, разработанный Quinlivan, М.,
Е. Dempsey, F. Ryan, S. Arkins, and А. Cullinane
(Real-time reverse transcription РСR for detection аnd
quantitative analysis of equine influenza virus//
J. Сlin. Місrobiol. 2005. 43 : 5055-5057). В котором
описано применение ПЦР-РВ по обнаружению ВГЛ
в носовых смывах, взятых в течение двух лет от
подозреваемых на вирусные заболевания
дыхательных путей лошадей в сравнении с
различными методами вирусовыделения. Вирус был
выделен от восьми лошадей а антиген был
обнаружен в тест-системе Directigen А грипп в 14
смывах. Нуклеиновые кислоты вируса гриппа
лошадей были обнаружены в носовых мазков от 35
лошадей, т. е. общий уровень обнаружения составил
20%, по сравнению с 8% и 5% для Directigen А
грипп и выделения вируса, соответственно. ПЦР-РВ
оказался на 17% и 29% более чувствительным, чем
выделение вируса в РКЭ и культуре тканей,
соответственно.
Описаны методы ПЦР-РВ диагностики ВГЛ,
разработанные Zhengchun Lu1
, Thomas М.
Chambers1
, Saikat Boliar1
, Adam J. Branscum2
, Tracy
L. Sturgill1
(Development and Evaluation of One-Step
TaqMan Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays
Targeting Nucleoprotein, Matrix, and Hemagglutinin
Genes of Equine Influenza Virus // J. Clin. Microbiol.
December 2009 47:12 3907-3913). В данной работе
представлены исследования по разработке и оценке
новых методов ТаqMаn проб - обратной
транскрипции ПЦР в режиме реального времени
(ОТ-ПЦР-РВ) с использованием зонда для
обнаружения широкого спектра штаммов ВГЛ,
включающих подтипы вируса Н3N8 и Н7N7. В общей
сложности были разработаны восемь ПЦР анализов,
ориентированных на обнаружение нуклеопротеида
(ИР), матричного белка (М), и гена гемагглютинина
(НА) двух подтипов. Все методы ПЦР- анализа
показали высокую специфичность и
чувствительность, по сравнению с выделением
вируса путем инокуляции в РКЭ (например 93%,
89% и 87% для EqFlu NР, ЕqFlu М и EqFlu НА3
анализов соответственно). Ни один из восьми тестов
не показал перекрестных взаимодействий с любыми
другими известными респираторными вирусами
лошадей.
Признаками, отличающими предлагаемое
изобретение от перечисленных аналогов, являются
специфические компоненты реакции, методические
подходы и нуклеотидные последовательности
праймеров и зондов, приведенные в перечне
последовательностей.
Сущность изобретения заключается в том, что
разработан способ выявления ВГЛ субтипа Н7
методом совмещенной реакции обратной
транскрипции и ОТ-ПЦР-РВ, предназначенный для
качественного выявления и исследования іn vitro
ВГЛ субтипа Н7. В качестве образцов для
исследования могут быть использованы
носоглоточные аспираты, назальные смывы,
мокрота, образцы культуральной жидкости.
Разработка способа экспресс-идентификации
ВГЛ субтипа Н7, на основе ОТ-ПЦР-РВ. Способ
диагностики ВГЛ высокочувствительным и
специфичным методом ОТ-ПЦР-РВ позволяет точно
и быстро (до 2 часов) выявлять РНК ВГЛ данного
субтипа в биологических пробах без
предварительного накопления тестируемого вируса,
что особенно важно при работе с патогенными
штаммами. При этом возможно одновременное
исследование большого количества проб.
Поставленная задача решается путем подбора
пар олигонуклеотидных праймеров и зонда,
специфичных для ВГЛ субтипа Н7. Для
идентификации ВГЛ субтипа Н7 методом ПЦР в
качестве мишени нами был выбран ген
гемагглютинина (НА-ген) ВГЛ.
Отсутствие гомологии с другими вирусами
семейства Orthomyxoviridae и с другими подтипами
вируса гриппа А являлось основным критерием
отбора олигонуклеотидов.
Таким образом, для гена НА ВГЛ подтипа Н7
была подобрана пара праймеров и зонд, которые
являлись высоко консервативными и специфичными
к своему подтипу и не имели гомологии с другими
подтипами вируса гриппа А и с другими
родственными вирусами. Предложенный способ
включает в себя реакцию ОТ-ПЦР в режиме
реального времени с праймерами, специфичными к
участку гена гемагглютинина Н7 ВГЛ. Матрицей для
этой реакции служит к ДНК вируса гриппа, а
затравкой - праймеры F-Н7, состоящий из 24
звеньев: СОССАОТТТТСТААОАООТАААТС и К.-
Н7, состоящий из 25 звеньев:
АТТААТОТТТТОАААОООСААОТТО, а также
зонд (система ТаqМan): 6FАМ-
САОАОТОАСОСАСААСТТОАСААСА-ВНО.
Реакцию анализируют по интенсивности роста
кривых флуоресценции. Кривые реакции, которые

3. 28670
3
пересекают пороговую линию до 35 цикла
считаются положительными, указывают на наличие
в исходном материале РНК ВГЛ субтипа Н7.
Техническим результатом изобретения является
повышение экономичности, сокращение времени
проведения диагностической идентификации ВГЛ
подтипа Н7 с помощью ОТ-ПЦР-РВ. Изобретение
может быть использовано для обнаружения ВГЛ
субтипа Н7, основанного на детекции генетического
материала возбудителя и предназначено для
массовых анализов с возможной автоматизацией
процесса.
Способ выполняется следующим образом:
1. Выбор последовательности праймеров.
Учитывая большую вариабельность генома
вируса гриппа типа А, при его обнаружении
необходимо использовать праймеры,
соответствующие наиболее консервативным
участкам вирусного генома. Основой для поиска
мест отжига праймеров стало сопоставление
нуклеотидных последовательностей гена
гемагглютинина всех вирусов гриппа,
представленных в международной базе данных.
Поиск в базе Генбанка показал наличие 2993
полных нуклеотидных последовательностей данного
гена ВГЛ. При выборе мест посадки праймеров
учитывались следующие требования:
специфичность праймеров для всех
последовательностей вирусов субтипа Н7 отсутствие
мест отжига праймеров на последовательности
вирусов других субтипов. Эта работа выполнялась с
помощью опііпе программы "Рrimer3", а также
приложения "РrimerDesign. Характеристики
праймеров устанавливали с помощью программы
"ОligoAnalises". В качестве дополнительных
критериев, определяющих пригодность праймеров,
учитывались следующие: отсутствие дуплексов
праймеров и отжига их друг на друга, отсутствие
мест ложного отжига на матрицы геномов
различных штаммов вируса гриппа А и родственных
вирусов. Этим критериям удовлетворяют все
отобранные праймеры. Основными факторами,
рассматриваемыми при разработке ТаqMan-проб и
праймеров, служили:
Параметры зонда: сумма гуанина и цитозина (ГЦ
состав) - 20-80%; температура плавления (Тпл) - 68-
70°С; Тпл примерно на 10°С выше, чем у
праймеров; минимум одинаковых нуклеотидов
подряд (особенно Г, не более 4-х подряд); на 5’-
конце не должно быть Г; н.п. пробы должна
содержать больше Ц чем Г.
Параметры праймеров: Тпл - 58-60°С; длина 20-
30 н.п.; ГЦ состав 20-80%; размер ампликона не
должен превышать 150 п.о.; минимум Г/Ц на 3’-
конце (не более трех из пяти последних
нуклеотидов).
2. Синтез опигонуклеотидов.
Моделированные последовательности праймеров
и зонда были синтезированы в необходимом
количестве на синтезаторе олигонуклеотидов
"Ехреdite 8909" ("АррliedBiosystems", США),
согласно протоколам производителя и
испытывались в экспериментах для постановки
ПЦР-РВ и используются для постановки метода
ПЦР-РВ.
3 .Выделение РНК из образцов.
Выделение РНК проводят с использованием
набора QIAamp® Viral RNA Mini Kit в соответствии
с наставлением по применению данного набора.
4. Проведение ОТ-ПЦР с праймерами,
специфичными кучасткам гена Н7.
В отдельной пробирке готовят общую
реакционную смесь на N образцов, в число которых
входят положительный и отрицательный контроли.
Реактивы вносят в следующей последовательности.
Ферменты добавляют в последнюю очередь.
5×буфер (Мg 2+ 2,5 мМ) 4 мкл
Мg 2+ 1 мкл (3,5 мМ)
дНТФ 0,8 мкл
праймер Н7K923 0,5 мкл
праймер Н7F797 0,5 мкл
проба Н7 0,3 мкл
еnzyme 0,8 мкл
Н2О до 12 мкл
РСRmіх: общий объем 20 мкл.
Смесь перемешивают и раскапывают в лунки
капилляров, следя за тем, чтобы не допустить
образование пузырьков воздуха в смеси. Затем в них
вносят отдельным наконечником с фильтром по 8
мкл РНК соответствующих анализируемых или
контрольных образцов (K+
и K-
) - Центрифугируют
стрип, чтобы собрать со стенок все капли. Реакцию
проводят в термоциклере Light Cycler 2.0 фирмы
Rосһе. Проводят ОТ - ПЦР-РВ при следующих
параметрах:
Режим Температура Время Число циклов
Синтез кДНК 50°С 30 мин
95°С 15мин
Денатурация 95°С 0 сек 40 циклов
Отжиг 55°С 5 сек
Элонгация 72°С 20 сек
В каждой серии анализов ставят два
контрольных образца: положительный контроль
(РНК ВГЛ субтипа Н7) и отрицательный контроль (с
деионизированной водой). Смеси для контрольных
образцов готовят по той же прописи, что и для
исследуемых образцов.
6. Детекция продуктов амплификации.
Учет результатов реакции проводят на каждом
цикле. Прибор определяет уровень флуоресценции и
строит кинетическую кривую в координатах:
уровень флуоресценции - цикл амплификации. В
случае присутствия в исследуемой пробе

4. 28670
4
специфической матрицы, кинетическая кривая
имеет экспоненциальную зависимость. Программа
определяет пороговый цикл реакции (Сt - threshold
сyсle), на котором достигается пороговая
флуоресценция.
При стандартных условиях проведения
исследований и при условии равной эффективности
реакции, значение Сt прямо пропорционально
логарифму количества субстрата, что позволяет
проводить сравнение количества субстрата.
Результат считается достоверным только в
случае прохождения положительных и
отрицательных контролей амплификации и
отрицательного контроля выделения РНК.
Положительными считаются образцы, для
которых значение Сt менее 35 циклов.
Отрицательными считаются образцы, для
которых значение Сt cоотсутствует.
Результаты анализа не подлежат учету в
следующих случаях:
- Отсутствие положительного сигнала в пробах с
положительными контролями ПЦР может
свидетельствовать о неправильно выбранной
программе амплификации и о других ошибках,
допущенных на этапе постановки ПЦР. В таком
случае необходимо провести ПЦР еще раз.
- Если значение Сt больше 35, требуется
повторить ПЦР и считать его вероятно
положительным в случае повторения результата или
получения значения Сt менее 35.
- Появление любого значения Сt в таблице
результатов для отрицательного контроля этапа
выделения (на канале JOE) и для отрицательного
контроля этапа ПЦР (на любом из каналов)
свидетельствует о наличии контаминации реактивов
или образцов. В этом случае результаты анализа по
всем пробам считаются недействительными.
Требуется повторить анализ всех проб, а также
предпринять меры по выявлению и ликвидации
источника контаминации. Фиг.1 и 2 демонстрируют
конечный результат предлагаемого способа
диагностики. Для определения специфичности ПЦР-
метода использовали РНК близкородственных
вирусов семейства Оrthomyxoviridae.
При определении чувствительности
отработанной ПЦР в реальном времени
использовали 10-кратные разведения РНК субтипа
Н7 ВГЛ. Для анализа результатов, исходные
пикограммы вирусной РНК переводили в копии
ДНК по следующей формуле:
Число копий = 6×1023
(копий/моль) x
концентрация (g/µ1)/ МW(g/моль), где концентрация
(g/µ1) - концентрация образца, МW(g/моль) -
молекулярный вес геномной РНК ВГЛ.
Предложенный способ диагностики ВГЛ
методом ОТ-ПЦР-РВ является
высокочувствительным и специфичным к субтипу
Н7 и позволяет достоверно определять наличие РНК
ВГЛ данного субтипа в биологических пробах без
предварительного накопления тестируемого вируса
и может быть использован для экспресс-
идентификации.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ диагностики вируса гриппа лошадей
субтипа H7 методом полимеразной цепной реакции
с детекцией в режиме реального времени,
предусматривающий проведение реакции обратной
транскрипции с РНК вируса, ПЦР-амплификацию
на вирусный ген гемагглютинина с детекцией в
режиме реального времени, отличающийся тем,
что в качестве праймеров для проведения реакции
обратной транскрипции и амплификации в ПЦР,
используют специфические праймеры следующего
состава:
F-H7 - CGCCAGTTTTCTAAGAGGTAAATC
R-H7 - ATTAATGTTTTGAAAGGGCAAGTTG
зонд - 6FAM - CAGAGTGACGCACAACTTGACAACA-BHQ,
при этом выявление в анализируемых образцах
кривых флуоресценции, которые пересекают
пороговую линию до 35 цикла указывают на
наличие в исходном материале РНК ВГЛ субтипа
Н7.

5. 28670
5
Верстка Ж. Жомартбек
Корректор Е. Барч