Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 HOẶC https://www.facebook.com/garmentspace/ https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Đề tài :
NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ VI KHUẨN
CÓ HOẠT TÍNH PHÂN GIẢI PROTEIN CAO ỨNG
DỤNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI GIÀU ĐẠM
NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN : CN. NGUYỄN HOÀNG MỸ
SINH VIÊN THỰC HIỆN : NGUYỄN PHẠM HUYỀN
MSSV : 107111072 LỚP : 07DSH3
TP. HỒ CHÍ MINH, 2011

2. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 1
MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
1.1 Đặt vấn đề
Hiện nay, Việt Nam đang trong công cuộc xây dựng kiến thiết đất nước theo
hướng công nghiệp hóa, hiện đại hóa với sự phát triển dân số và tốc độ đô thị hóa
cao. Cùng với các ngành nghề khác ngành nuôi trồng và chế biến thủy sản đang
giữ vai trò quan trọng trong sự phát triển kinh tế của cả nước. Tuy nhiên, bên cạnh
đó cũng gia tăng các vấn đề về môi trường, đặc biệt là ô nhiễm nguồn nước thải từ
các nhà máy chế biến. Việc tìm ra phương pháp xử lý nước thải sao cho hiệu quả
giảm tình trạng ô nhiễm môi trường đang là vấn đề đang được quan tâm không chỉ
của các doanh nghiệp mà cả các nhà quản lý. Xử lý sinh học bằng các chủng vi
sinh vật với ưu điểm là phù hợp điều kiện tự nhiên, giảm chi phí năng lượng, hóa
chất, đơn giản, có khả năng tận dụng các sản phẩm phụ sau xử lý đang là phương
pháp có tiềm năng. Trong đó hoạt động của các vi sinh vật giữ vai trò rất quan
trọng, ảnh hưởng đến hiệu quả xử lý của toàn bộ hệ thống.
Trong nước thải thủy sản và chế biến thịt thì một số vi sinh vật có khả năng
phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa nitơ được quan tâm, đặc biệt là vi khuẩn thuộc
chi Bacillus. Các chủng vi sinh vật này đã có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực
khác nhau như: công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp thực phẩm và được
chú ý hơn cả là trong lĩnh vực xử lý nước thải chứa nhiều đạm. Việc phân lập và
tuyển chọn các chủng vi khuẩn này được chúng tôi tiến hành trong đề tài: "Nghiên
cứu tuyển chọn một số vi khuẩn có hoạt tính phân giải protein cao ứng dụng
trong xử lý nước thải giàu đạm"với mục đích từ nước thải ngành chế biến thủy
sản và thịt sẽ tìm ra được các chủng vi sinh vật nâng cao hiệu quả xử lý và góp
phần bảo vệ môi trường.
1.2 Ý nghĩa đề tài
1.2.1 Ý nghĩa khoa học

3. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 2
Giúp bổ sung thêm một số chủng vi khuẩn mới phân lập được có hoạt tính
protease mạnh có thể ứng dụng vào xử lý nước thải giàu đạm
1.2.2 Ý nghĩa thực tiễn
Giúp xử lý nước thải giàu protein đạt hiệu quả, góp phần bảo vệ môi trường
ngành thủy sản nói riêng và môi trường nước nói chung.
Hình thành một vài chế phẩm sinh học phù hợp xử lý nước thải giàu đạm.
2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU
Lĩnh vực sử dụng vi sinh vật trong xử lý nước thải hiện nay chưa được
nghiên cứu và công bố phổ biến. Tuy nhiên đã có nhiều tài liệu nghiên cứu về
enzyme protease và vi sinh vật có khả năng phân hủy protein đặc biệt về vi khuẩn
Bacillus. Nhiều công trình nghiên cứu đã được công bố và biết đến như:
 Trên thế giới
Năm 2002, B. Aslin, N. Saglam và Y. Beyatli đã nghiên cứu về một số đặc
điểm của Bacillus phân lập từ đất.
Năm 2005, tác giả S. Sharmin, Md. Towhid Hossain và M.N. Anwar thuộc
trường đại học Chittagong đã nghiên cứu các đặc điểm của protease từ Bacillus
amovivorus và tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng điều kiện sinh tổng hợp enzyme
protease.
 Ở Việt Nam
Năm 2004, Đỗ Thị Bích Thủy và Trần Thị Xô đã công bố đề tài về nghiên
cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme protease từ một số chủng
Baciilus.
Tác giả Ngô Tự Thành, Bùi Việt Hà, Vũ Minh Đức và Chu Văn Mẫn đã
nghiên cứu về hoạt tính enzyme protease ngoại bào của một số chủng Bacillus mới
phân lập và khả năng ứng dụng chúng trong xử lý nước thải.
3. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI
Phân lập các vi khuẩn có hoạt tính phân giải protein từ một số nguồn nước
thải thủy sản và chế biến thịt.
Khảo sát hoạt tính protease của các chủng vi khuẩn phân lập được.

4. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 3
4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp tổng hợp tài liệu:
Nghiên cứu, thu thập tài liệu tham khảo, tài liệu internet liên quan đến đề tài
Phương pháp thực nghiệm:
 Phương pháp phân lập các vi khuẩn có khả năng phân giải protein từ một
vài nguồn nước thải từ nhà máy chế biến thủy sản và thịt
 Phương pháp thử nghiệm sinh hóa các chủng vi khuẩn phân lập được
 Phương pháp xác định mật độ tế bào
 Phương pháp xác định hoạt độ protease từ vi sinh vật bằng phương pháp
Amano
 Phương pháp khảo sát hoạt độ protease của các chủng vi khuẩn phân lập
được
5. KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC
Xác định được các đặc điểm hình thái và sinh hóa của 10 chủng có khả năng
phân hủy protein từ nước thải thủy sản và chế biến thịt
Xác định được hoạt độ phân giải protease và mật độ tế bào
Khảo sát được ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt độ protease
6. KẾT CẤU CỦA ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Lời mở đầu
Chương 1: Tổng Quan
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và biện luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị

5. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

6. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 5
1.1 Tổng quan về nước thải giàu đạm
1.1.1 Sơ lược về ngành sản xuất có nước thải giàu đạm
Nuôi trồng và chế biến thủy hải sản được xem là một trong những ngành
công nghiệp mũi nhọn ở Việt Nam. Theo số liệu thống kê của bộ thủy sản, có hơn
1.470.000 hecta mặt nước sông ngòi dùng cho nuôi trồng thủy sản. Ngoài ra còn có
hơn 544.500.000 hecta ruộng trũng, 56.200.000 hecta hồ dùng để nuôi cá.
Mặt khác, nước ta nằm trong vùng có địa lý thuận lợi với bờ biển dài 3.260
km, vùng biển và thềm lục địa rộng lớn hơn 1 triệu km2
thích hợp cho việc nuôi
trồng thủy hải sản có giá trị kinh tế cao. Tổng trữ lượng cá tầng đáy vùng biển Việt
Nam có khoảng 1,7 triệu loài, khả năng cho phép khai thác khoảng 1 triệu tấn/năm.
Tổng trữ lượng cá tầng trên khoảng 1,2 – 1,3 triệu tấn. Nguồn lợi thủy sản chủ yếu
là tôm, cá, có khoảng 3 triệu tấn/năm nhưng hiện nay mới chỉ khai thác hơn 1 triệu
tấn/năm.
Theo báo cáo của tổng cục thống kê trong 6 tháng đầu năm 2010, xuất khẩu
thủy sản của Việt Nam đạt giá trị 2,047 tỷ USD tăng 17% so với cùng kỳ năm
2009. Trong đó tôm là sản phẩm xuất khẩu chủ lực của chiếm 35% sản lượng xuất
khẩu, còn lại là các sản phẩm khác.
Bảng 1.1: Sản lượng và kim ngạch xuất khẩu thủy sản giai đoạn 2007 – 6th
/2010
Chỉ tiêu
Năm
2007 2008 2009 6th
/2010
Sản lượng (nghìn tấn) 12 1239 1219 597,9
Kim ngạch (triệu USD) 3760 4510 4251 2047
( Nguồn: Hải quan Việt Nam - Tổng cục thống kê)

7. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 6
Bảng 1.2: Sản lượng và kim ngạch các mặt hàng thủy sản xuất khẩu giai đoạn
2007 – 6th
/2010
Mặt hàng
Sản lượng (nghìn tấn) Kim ngạch( triệu USD)
2007 2008 2009 6th
/2010 2007 2008 2009 6th
/2010
Tôm 160,5 192 209 87,2 1500 1630 1692 718
Cá tra và basa 372 644 608 304 - 1460 1357 653
Loại khác 631,5 403 402 61,9 - 1420 1202 256
(Nguồn: Hải quan Việt Nam-Tổng cục thống kê)
Cùng với ngành nuôi trồng và khai thác thủy sản thì ngành chế biến thủy sản
đã có nhiều đóng góp trong thành tích chung của ngành thủy sản Việt Nam. Trong
những năm gần đây, khoảng 35% đầu ra của sản phẩm thủy sản được sản xuất để
xuất khẩu và phần còn lại được bán ra trên thị trường nội địa hoặc ở dạng tươi sống
(34,5%), hoặc đã qua chế biến (45,7%) dưới dạng bột cá, nước mắm, cá khô.
Bên cạnh sự phát triển của ngành thủy sản thì ngành giết mổ gia súc và chế
biến thịt cũng không ngừng lớn mạnh về qui mô cũng như phát triển về kỹ thuật
giết mổ và nó thật sự trở thành một ngành công nghiệp. Ở nước ta có thể thấy việc
giết mổ gia súc đang diễn ra hết sức phức tạp, manh mún, quy trình kỹ thuật giết mổ
từ rất nhỏ đến quy mô lớn dẫn đến chất lượng thịt không đảm bảo không đạt vệ sinh
an toàn thực phẩm. Hiện nay thành phố Hồ Chí Minh có 41 cơ sở giết mổ (số liệu
đến ngày 13.3.2003), trong đó có 3 cơ sở được phép giết mổ trâu bò, có 7 cơ sở giết
mổ có công suất 300-1000 con heo/ ngày đêm.
1.1.2 Tính chất nước thải giàu đạm
 Nước thải chế biến thủy sản
Nước thải ngành chế biến thủy sản chứa nồng độ các chất hữu cơ gây ô nhiễm
cao (các phế phẩm trong và sau chế biến, hóa chất xử lý), nhiều chất có chứa hàm
lượng nitrogen liên kết và lưu huỳnh. Các nhà máy chế biến thủy sản đông lạnh
thường có lượng nước thải lớn so với các cơ sở chế biến hàng khô, nước mắm, đồ
hộp bình quân khoảng 50000m3
ngày.

8. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 7
Giá trị các đặc tính nước thải chế biến thủy sản có phổ phân tán biến động tương
đối rộng nhưng chúng đều có đặc điểm chung là phụ thuộc vào loại nguyên liệu,
quy trình sản xuất và sản phẩm chế biến. Những yếu tố này quyết định thành phần,
đặc tính và mức độ ô nhiễm của cơ sở sản xuất chế biến.
Nhìn chung, hàm lượng chất hữu cơ trung bình dao động từ 300-3000 mg/l
COD, từ 200-2000 mg/l BOD5, từ 9,5-400 mg/l SS, hàm lượng nitơ tổng số từ 90-
270mg/l, photpho tổng từ 30-90mg/l. Trong đó nước thải có hàm lượng chất hữu cơ
cao nhất là nước máu cá và nước dính nhớt từ các cơ sở sản xuất bột cá, COD có
thể lên đến 93.000mg/l, BOD5 lên đến 76.000mg/l.
Tuy nhiên tùy từng giai đoạn mà các giá trị có sự thay đổi đáng kể, nước thải từ
các quá trình rã đông, sơ chế và rửa nguyên liệu cho tới khâu chế biến đồ hộp thủy
sản đông lạnh có độ đậm đặc cao và rất cao. BOD từ 1.000-10.0000 mg/l, SS từ
1.000-2.000 mg/l. Nước thải từ quá trình hấp, luộc có hàm lượng BOD từ 10.000-
20.000 mg/l, SS từ 1.000-10.000 mg/l. Nước thải từ quá trình ngâm và để ráo trong
sản xuất Jam bông, xúc xích thủy sản có COD từ 1.000-3.000 mg/l, SS từ 500-
2.000 mg/l. Nước thải từ quá trình vệ sinh công nghiệp có COD từ 400-2.000 mg/l
BOD từ 10-1.000 mg/l, SS từ 300-3.000mg/l.
Sau đây là một số kết quả phân tích thành phần và tính chất nước thải thủy
hải sản tham khảo tại một vài nhà máy chế biến thủy sản điển hình.
Bảng 1.3: Thành phần và tính chất nước thải tại nhà máy chế biến thuỷ hải sản ở Bà
Rịa - Vũng Tàu
Chỉ tiêu Mức độ
BOD5 1000 – 2000 mg/l
Tổng chất rắn lơ lửng 1500 – 2000 mg/l
Tổng nitơ 75 – 230 mg/l
Tổng photpho 3 – 10 mg/l
pH 6,6 – 7, 9
(Nguồn: CEFINEA, 2002)

9. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 8
Bảng 1.4: Thành phần và tính chất nước thải nhà máy chế biến thuỷ hải sản Ngô
Quyền - Kiên Giang
Chỉ tiêu
Đơn vị
Nước thải
chế biến
mực
Nước thải
chế biến
tôm
Nước thải
phân xưởng
đông lạnh
Nước thải
cống xả
phân xưởng
đông lạnh
pH 6,62 7,32 7,14 7,08
TDS mg/l 1440 1160 1640 1410
Độ đục PTU 121 92 242 152
Độ màu Pt-Co 1674 852 2273 1600
P - PO4 mg/l 21,01 12,56 3,75 12,44
SS mg/l 9,5 55 36 32
N-amoni mg/l 165,19 76 52,71 98
Coliform MPN/100ml 1000 1100 19000 -
COD mg/l 893 336 230 1200
(Nguồn: CEFINEA, 2002)
Bảng 1.5: Đặc trưng thành phần và tính chất nước thải nhà máy chế biến thuỷ sản
STT
Đặc trưng ô
nhiễm
Hàm lượng
Quy chuẩn Việt Nam
11:2008, loại B
1 BOD5 300-2000 50
2 COD 500-3000 80
3 SS 200-1000 100
4 pH 6,5-7,5 5,5-9
5 N 50-200 60
6 P 10-100 -
(Nguồn: CEFINEA, 2002)

10. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 9
 Nước thải chế biến thịt
Ngoài các cơ sở chế biến thủy sản thì các cơ sở giết mổ, chế biến thịt cũng
thải ra môi trường một lượng lớn nước thải có nồng độ ô nhiễm tương đối cao như
BOD5 từ 2.500-7.400 mg/l, COD từ 2.400-9.600mg/l.
Mặt khác nước thải của cơ sở chế thịt thường chứa một lượng lớn vi sinh vật.
Nếu không có biện pháp xử lý thì rất dễ gây ô nhiễm bởi các vi sinh vật gây bệnh,
gây ngộ độc nguồn nước sử dụng.
Ngoài ra ngành giết mổ là một ngành đòi hỏi sử dụng nước rất nhiều, hầu
như các công đoạn xử lý nguyên liệu đều có nhu cầu dung nước như khâu rửa sơ bộ
nguyên liệu, khâu làm rã nước đá đông lạnh, khâu xử lý nguyên liệu, khâu chế biến.
Nước thải của công nghiệp chế biến thịt gần giống như nước thải sinh hoạt
nhưng có mức độ ô nhiễm cao hơn nhiều, với nồng độ dầu, mỡ, axit béo rất cao,
ngoài ra còn có chất tẩy rửa lông.
Bảng 1.6: Đặc trưng thành phần tính chất nước thải chế biến thịt
STT Thông số Đơn vị Hàm lượng
1 pH - 5,3-8,9
2 Độ dẫn điện - 2,8-6,1
3 Clo mg/l 1,1-390
4 Chất rắn qua lọc - 160-580
5 BOD5 mg/l 1500-7400
6 COD mg/l 2400-9600
7 Chất béo - 115-300
8 Axit hữu cơ - 61-350
9 Nitơ amon mg/l 230-1120
10 H2S - 0-20
11 Tổng P mg/l 1,6-53
12 Độ cứng - 35,6-125
13 Độ kiềm - 30-70

11. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 10
1.1.3 Ảnh hưởng nước thải giàu đạm đến môi trường
Hiện nay tình trạng xả thải từ các cơ sở sản xuất thủy sản và thịt chưa qua xử
lý hoặc xử lý chưa đạt tiêu chuẩn đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường
xung quanh, làm mất khả năng tự làm sạch của nguồn nước, ảnh hưởng đến sức
khỏe của người dân và đến sự phát triển bền vững của đất nước. Đối với nước ngầm
tầng nông, nước thải chế biến thuỷ sản có thể thấm xuống đất và gây ô nhiễm nước
ngầm. Các nguồn nước ngầm nhiễm các chất hữu cơ và vi sinh vật gây bệnh rất khó
xử lý thành nước sạch cung cấp cho sinh hoạt.
Đối với các nguồn nước mặt, các chất ô nhiễm có trong nước thải chế biến
thuỷ sản, thit sẽ làm suy thoái chất lượng nước, tác động xấu đến môi trường và
thủy sinh vật.
Các chất hữu cơ trong nước thải như cacbonhydrat, protein, chất béo khi xả
vào nguồn nước làm giảm nồng độ oxy hòa tan trong nước do vi sinh vật sử dụng
oxy hòa tan để phân hủy các chất hữu cơ. Nồng độ oxy hòa tan dưới 50% bão hòa
có khả năng gây ảnh hưởng tới sự phát triển của tôm, cá. Oxy hòa tan giảm không
chỉ gây suy thoái tài nguyên thủy sản mà còn làm giảm khả năng tự làm sạch của
nguồn nước, dẫn đến giảm chất lượng nước sinh hoạt và công nghiệp.
Các chất rắn lơ lửng làm cho nước đục hoặc có màu, hạn chế độ sâu tầng
nước được ánh sáng chiếu xuống, gây ảnh hưởng tới quá trình quang hợp của tảo,
rong rêu...Chất rắn lơ lửng cũng là tác nhân gây ảnh hưởng tiêu cực đến tài nguyên
thủy sinh đồng thời gây tác hại về mặt cảm quan (tăng độ đục nguồn nước) và gây
bồi lắng lòng sông, cản trở sự lưu thông nước và tàu bè.
Nồng độ các chất nitơ, photpho cao gây ra hiện tượng phát triển bùng nổ các
loài tảo, đến mức độ giới hạn tảo sẽ bị chết và phân hủy gây nên thiếu hụt oxy.
Ngoài ra, các loài tảo nổi trên mặt nước tạo thành lớp màng khiến ánh sáng không
tới được các lớp nước bên dưới, cản trở quá trình quang hợp của các thực vật tầng
dưới bị ngưng trệ. Tất cả các hiện tượng trên gây tác động xấu tới chất lượng nước,
ảnh hưởng tới hệ thuỷ sinh, nghề nuôi trồng thuỷ sản, du lịch và cấp nước.

12. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 11
Hình 1.1: Hiện trạng ô nhiễm nước thải thủy sản chưa qua xử lý
(Nguồn: Khoa học và đời sống)
1.1.4 Sự tăng trưởng của vi sinh vật trong nước thải giàu đạm
Sự sinh trưởng của vi sinh vật bao gồm sự tăng kích thước, số lượng tế bào,
phát triển tăng sinh khối của quần thể vi sinh vật.Trong nước thải và các công trình
xử lý nước thải, sự sinh trưởng cũng là sự tăng số lượng tế bào và sự thay đổi kích
thước tế bào. Kích thước tế bào dao động xung quanh một giá trị trung bình thì việc
tính số lượng tế bào cũng phản ánh được sự tăng sinh khối của vi sinh vật.
Các vi sinh vật trong nước thải chủ yếu là vi khuẩn dị dưỡng, có thể đồng
hoá các chất hữu cơ trong nước thải (BOD) làm nguồn dinh dưỡng. Ngoài ra, các
chất dinh dưỡng cần thiết khác là nguồn nitơ (NH4
+
) và nguồn photpho (PO4
3-
), các
nguyên tố khoáng khác như K, Mg, Ca, và các nguyên tố vi lượng (sắt, đồng, kẽm,
mangan). Các chất khoáng và vi lượng này thường rất phong phú trong nước thải
sinh hoạt. Các nguyên tố C, N, P cần cho sinh trưởng của vi khuẩn thường theo tỉ lệ
BOD : N : P = 100 : 5 : 1. Trong quá trình xử lý nước thải công nghiệp, nhiều
trường hợp phải bổ sung các nguồn N và P từ bên ngoài nhằm đảm bảo quá trình
sinh trưởng phát triển của vi sinh vật hoặc phải khử trước các kim loại nặng gây độc
hại cho tế bào vi sinh vật.
Vi sinh vật sinh sản chủ yếu bằng cách phân chia tế bào, quá trình sinh sản phụ
thuộc vào điều kiện môi trường. Khi môi trường cạn kiệt các chất dinh dưỡng, pH
và nhiệt độ thay đổi khả năng sinh sản sẽ bị ngừng lại.

13. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 12
Hình 1.2: Quá trình sinh trưởng của vi sinh vật
(1): Giai đoạn thích nghi
(2): Giai đoạn tăng trưởng logarit
(3): Giai đoạn giảm tốc
(4): Giai đoạn ổn định
(5): Giai đoạn suy vong
Quá trình sinh trưởng chia làm 5 giai đoạn:
 Giai đoạn thích nghi
Vi khuẩn vào môi trường chưa phát triển ngay mà còn cần một thời gian làm
quen với môi trường, cần cảm ứng sinh tổng hợp các enzyme thích hợp với cơ chất.
 Giai đoạn tăng trưởng logarit
Vi sinh vật phát triển theo hàm logarit và tốc độ tăng trưởng riêng đạt giá trị
cực đại. Trong suốt thời kỳ này các tế bào phân chia theo tốc độ xác định bởi thời
gian sinh sản, khả năng thu nhận và đồng hóa thức ăn.
 Giai đoạn giảm tốc
Trong giai đoạn này, cơ chất dinh dưỡng trong môi trường đã giảm dần. Trong
một số trường hợp, phát triển chậm dần là do trong môi trường tích tụ các sản phẩm
ức chế được sinh ra trong quá trình chuyển hoá chất trong tế bào vi khuẩn.
 Giai đoạn ổn định

14. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 13
Mật độ tế bào đạt tới giá trị cực đại, sự sinh trưởng dừng lại ngay cả khi tế bào
vẫn còn hoạt động chuyển hoá nào đó.
 Giai đoạn suy vong
Ở giai đoạn này các chất dinh dưỡng đã hết. Mật độ tế bào giảm do các tế
bào già chết và tỉ lệ chết cứ tăng dần lên. Tế bào vi khuẩn bị phân huỷ nội sinh hoặc
hô hấp nội bào và bị tự phân (autoliz).
Các giai đoạn này diễn ra trong môi trường ở cả điều kiện hiếu khí và kị khí. Giá
trị của các thông số phụ thuộc vào các loài vi sinh vật, hàm lượng cơ chất và nhiệt
độ, pH của môi trường.[2], [7]
1.1.5 Các vi sinh vật tham gia quá trình xử lý nước thải giàu đạm
Theo Nguyễn Đức Lượng (2003), các chất nhiễm bẩn chủ yếu là các chất
hữu cơ hòa tan. Ngoài ra còn có các chất hữu cơ ở dạng keo và phân tán nhỏ ở
dạng lơ lửng. Các dạng này tiếp xúc với bề mặt vi khuẩn bằng cách hấp phụ hay
keo tụ sinh học, sau đó sẽ xảy ra quá trình đồng hóa hay dị hóa. Phương pháp xử lý
sinh học nước thải dựa trên cơ sở hoạt động của vi sinh vật phân hủy các chất hữu
cơ nhiễm bẩn trong nước. Do vậy điều kiện đầu tiên và vô cùng quan trọng là nước
thải phải là môi trường sống của của quần thể vi sinh vật phân hủy các chất hữu cơ
có trong nước thải. Quá trình làm sạch nước thải nhờ vi sinh vật gồm 3 giai đoạn:
(i) Các chất hữu cơ tiếp xúc với bề mặt tế bào vi sinh vật
(ii) Khuếch tán và hấp thụ các chất ô nhiễm nước qua màng bán thấm vào
trong tế bào vi sinh vật
(iii) Chuyển hóa các chất này vào trong nội bào để sinh năng lượng và
tổng hợp vật liệu mới cho tế bào vi sinh vật.
Trong nước thải, thành phần của các chủng vi sinh vật hầu hết là hoại sinh
và dị dưỡng trong đó đa số là các vi khuẩn hiếu khí, kị khí hoặc kị khí tùy tiện như
các vi khuẩn: Bacillus, Alcahgenes, flavobacterium, Cytophag, Micrococcus,
Lactobacillus, Achromobacter. Các giống này thường gặp hầu hết ở các loại nước
thải, chúng có thể đồng hóa được mọi chất hữu cơ kể cả các chất hữu cơ tổng hợp
như polyvinyl alcohol – PVA và sống khá lâu trong môi trường nước. Trong đó

15. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 14
giống Bacillus phân hủy được nhiều dạng các hợp chất hữu cơ, đặc biệt là protein
và tinh bột nhờ hệ enzyme đa dạng và khả năng thích nghi cao. Các giống
Alcaligenes và Flavobacterium cũng khá quan trọng gần như hai giống trên, ở nơi
nào có sự phân hủy của protein là có hai giống này.
A: Vi khuẩn Flavobacterium
B: Vi khuẩn Bacillus
C: Penicillium D: Aspergillus oryzae
Hình 1.3: Một số vi sinh vật trong nước thải giàu đạm
Vi khuẩn Bacillus là trực khuẩn gram dương, đứng riêng rẽ hoặc kết thành
dạng chuỗi. Có khả năng tạo enzyme protease và amylase, có khả năng sinh bào tử

16. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 15
và sống hiếu khí ( hoặc kỵ khí tùy tiện ). Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp là 350
C đến
400
Ctối đa tới 600
C. Ở pH dưới 6,5 chúng ngừng phát triển.
Bên cạnh đó nhiều vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc có enzyme protease đều
phân hủy được protein như Streptomyces, Actinomyces, nhiều loài nấm mốc thuộc
giống Aspergillus, Penicillium.[2], [6]
1.2 Tổng quan về quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ giàu đạm nhờ vi
sinh vật
1.2.1 Quá trình amon hóa
Trong nước và trong đất luôn luôn tồn tại nhiều xác động thực vật. Xác
động vật và thực vật chứa rất nhiều hợp chất hữu cơ chứa nitơ. Các hợp chất hữu cơ
thường không được thực vật sử dụng trong quá trình trao đổi chất, thực vật chỉ có
thể sử dụng các hợp chất vô cơ dạng hòa tan. Do đó các hợp chất hữu cơ khi thải
vào môi trường nước nếu không được vi sinh vật phân hủy thành các hợp chất vô cơ
hòa tan sẽ không được thực vật sử dụng. Như vậy một mặt vi sinh vật như một sinh
vật làm sạch môi trường ô nhiễm bởi các chất hữu cơ chứa nitơ, một mặt như một
tác nhân trung gian chuyển hóa các hợp chất khó tiêu đối với thực vật này thành các
chất dễ tiêu cho thực vật sử dụng. Các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ trong môi
trường nước còn bị phân hủy bởi các động vật khác. Tuy nhiên sự phân hủy này xảy
ra chủ yếu là do vi sinh vật. Vi sinh vật đóng vai trò quyết định trong quá trình
chuyển hóa protein thành các hợp chất vô cơ. Như vậy quá trình amon hóa là quá
trình phân giải các chất hữu cơ chứa nitơ và giải phóng ammoniac.
a. Quá trình phân giải ure
Ure là sản phẩm của quá trình trao đổi chất của con người và động vật. Ure
chủ yếu có trong nước tiểu của người và động vật. Ngoài ra ure được đưa vào môi
trường nước nhiều từ việc sử dụng phân bón hóa học. Thực vật hầu như hoàn toàn
không có khả năng sử dụng ure trực tiếp. Chính vì thế chúng cần chuyển hóa thành
muối amon. Vi khuẩn tham gia quá trình chuyển hóa này gồm các giống thuộc
Urebacterium. Hầu hết chúng thuộc họ Cocoaceae và Bacilacaea . Cụ thể chúng
bao gồm các loài như: Sarcina hansenii, Bacillus pasteurii, Proteus vulgaris.

17. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 16
Cơ chế chuyển hóa của chúng như sau:
CO + H2O CO + 2NH3 (NH4)2CO3
(NH4)2CO3 2 NH3 + CO2 + H2O
b. Quá trình amon hóa protein
Trong các nguồn nước luôn xảy ra quá trình amon hóa protein nhờ các vi
khuẩn amon hóa có enzyme protease ngoại bào phân hủy protein thành các hợp
chất đơn giản hơn là polypeptide, oligopeptide. Qúa trình này có thể xảy ra trong
điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí.
* Cơ chế :
Nhóm vi sinh vật phân hủy protein có khả năng tiết ra enzyme protease bao
gồm proteinase và peptidase. Enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết
liên kết peptide (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide tạo sản phẩm là axit
amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận
chuyển axit amin.
Dưới tác dụng của enzyme proteinase phân tử protein sẽ được phân giải
thành các polypeptide và oligopeptide. Các chất này hoặc tiếp tục phân hủy thành
các axit amin nhờ enzyme peptidase ngoại bào hoặc được tế bào vi khuẩn hấp thụ
rồi sau đó được phân hủy tiếp thành các axit amin trong tế bào. Một phần các axit
amin được tế bào vi khuẩn sử dụng để tổng hợp protein tạo sinh khối. Một phần các
axit amin theo các con đường phân giải khác nhau để sinh NH3, CO2 và các sản
phẩm trung gian khác. Với các protein có chứa S, nhờ enzyme desulfurase của
nhóm vi khuẩn lưu huỳnh và các nhóm dị dưỡng hiếu khí khác, sẽ bị phân hủy tạo
H2S, scatol, indol hay mercaptan .[7], [8]
1.2.2 Enzyme protease của vi sinh vật
Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản
xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung để

18. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 17
làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế
biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp, làm sạch môi
trường… Trong đó, lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng
500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng.
Ưu điểm lớn nhất của protease từ vi sinh vật là phong phú về chủng loại, có tính
đặc hiệu rộng rãi, cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng. Tuy nhiên, hệ
protease vi sinh vật lại phức tạp, bao gồm nhiều enzyme giống nhau về cấu trúc,
khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.
Đối với sinh lý của vi sinh vật, protease đóng vai trò rất quan trọng. Có 2 loại
protease là protease ngoại bào và protease nội bào với các chức năng như sau :
Protease ngoại bào của vi sinh vật tham gia các quá trình phân giải ngoại bào
các protein để tạo ra các axit amin.
Các axit amin này sẽ được đưa vào trong tế bào tham gia tổng hợp sinh khối
hoặc cũng có thể bị phân giải để giải phóng năng lượng và sản phẩm bậc 2.
Hình 1.4: Quá trình phân giải protein ngoại bào
Protease nội bào của vi sinh vật tham gia quá trình cải biến protein,
enzyme, tạo ra các quá trình cung cấp năng lượng, vật liệu xây dựng, và sự tạo
thành bào tử của vi sinh vật.
Protease nội bào có thể tham gia vào việc hoàn thiện các chuỗi polypeptide
đã được tổng hợp như: tách gốc, tách một số gốc axit amin khỏi đầu N của chuỗi
polypeptide đã được tổng hợp. Protease nội bào tham gia phân hủy các protein nội
bào không còn tác dụng trong quá trình sinh lý của vi sinh vật.

19. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 18
Hình 1.5: Quá trình hoạt động protease nội bào
1.2.3 Các vi sinh vật tham gia quá trình amon hóa protein
Bảng 1.7: Một số vi sinh vật tham gia quá trình amon hóa protein
Nhóm vi sinh
vật
Dạng phân hủy
Kiểu gây thối
Kị khí (yếm khí) Hiếu khí
Nhóm các vi
sinh vật có
enzyme đơn
Phân hủy protein
Bacillus putrificus
Bacillus histolytics
Bacillus coligenes
Bacillus pyocyaneum
Bacillus mensentericus
Phân hủy peptide
Bacillus ventriculosus
Bacillus orbiculus
Phân hủy axit
amin
Bacillus faccalis
Algaligenes
Proteus zenkirii
Nhóm các vi
sinh vật có
enzyme hỗn
hợp
Phân hủy protein
Bacillus perfrigenes
Bacillus sporogenes
Streptococus
Straphylococus
Proteus vulgaris
Phân hủy peptide
Bacillus bifidus
Bacillus acidophilus
Bacillus butyricus
Phân hủy axit
amin
Bacillus lactic aerogen
Bacillus aminophilus
Bacillus coligenes

20. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 19
Vi sinh vật tham gia quá trình phân giải protein rất đa dạng. Chúng thuộc các vi
sinh vật hiếu khí, yếm khí và hiếu khí tùy tiện được trình bày ở bảng 1.7 [2], [8]
1.3 Tổng quan về các phương pháp sinh học xử lý nước thải
1.3.1 Mục đích của quá trình xử lý nước thải
Mục đích quan trọng nhất của quá trình xử lý nước thải là làm giảm hàm
lượng chất hữu cơ hoặc loại bỏ những chất ô nhiễm vi lượng khó phân hủy sinh học
và có thể gây độc. Mục đích thứ hai là loại bỏ hoặc giảm bớt chất dinh dưỡng N và
P để hạn chế ô nhiễm cho nguồn nước nhận và nước ngầm nếu nước thải được đổ ra
đất. Mục đích thứ ba là làm bất hoạt những vi sinh vật gây bệnh, virus và các ký
sinh trùng có trong nước thải.
Một cách tổng quát, xử lý sinh học có thể chia thành hai nhóm phương pháp
lớn:
- Nhóm các phương pháp hiếu khí: sử dụng những vi sinh vật hiếu khí hoạt
động trong điều kiện cung cấp oxy.
- Nhóm các phương pháp kỵ khí: sử dụng những vi sinh vật kỵ khí hoạt
động trong điều kiện không có oxy.
1.3.2 Cơ sở lý thuyết của quá trình xử lý sinh học
Cơ sở lý thuyết của các phương pháp xử lý sinh học là quá trình chuyển hóa
vật chất, quá trình tạo cặn lắng và quá trình tự làm sạch nguồn nước của các vi sinh
vật có trong tự nhiên nhờ khả năng chuyển hóa được rất nhiều nguồn cơ chất khác
nhau có trong nước thải.
Các chất hữu cơ hòa tan, các chất keo và các chất phân tán nhỏ trong nước
thải tiếp xúc với tế bào vi sinh vật, sau đó các quá trình chuyển hóa vật chất diễn ra
với ba giai đoạn chính: (i) chuyển các vật chất ô nhiễm từ pha lỏng tới bề mặt tế bào
vi sinh vật, (ii) khuếch tán từ bề mặt tế bào qua màng bán thấm do sự chênh lệch
nồng độ bên trong và bên ngoài tế bào, (iii) chuyển hóa các chất trong tế bào vi sinh
vật, sản sinh năng lượng và tổng hợp tế bào mới.
Trong các nguồn nước luôn xảy ra quá trình amon hóa chất hữu cơ nhờ các
vi khuẩn amon hóa có enzyme protease ngoại bào phân hủy protein thành các hợp

21. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 20
chất đơn giản hơn là polypeptide, oligopeptide. Các chất này hoặc tiếp tục phân hủy
thành các acid amin nhờ enzyme peptidase ngoại bào hoặc được tế bào vi khuẩn hấp
thụ rồi sau đó được phân hủy tiếp thành các acid amin trong tế bào. Một phần các
acid amin được tế bào vi khuẩn sử dụng để tổng hợp protein tạo sinh khối. Một
phần các acid amin theo các con đường phân giải khác nhau để tạo ra NH3, CO2 và
các sản phẩm trung gian khác. Với các protein có chứa sulfure, nhờ enzyme desul-
furase của nhóm vi khuẩn lưu huỳnh và các nhóm dị dưỡng hiếu khí khác, sẽ bị
phân hủy tạo thành H2S.
Theo con đuờng thủy phân trong điều kiện hiếu khí, các vi khuẩn, Bacillus,
Pseudomonas, Actinomyces, và các loài nấm men chuyển hóa nhanh tinh bột thành
đường. Sản phẩm đường này một phần bị phân hủy thành CO2 cùng các sản phẩm
khác, một phần được chuyển hóa tiếp tục theo các quá trình trao đổi chất khác trong
tế bào. Đối với cellulose, Cytophase và Sporocytophaga là hai loài có khả năng
phân hủy trong điều kiện hiếu khí mạnh nhất, tiếp theo là các loài Pseudomonas,
Vibrio, Myxobacterium, Actinomyces… Sản phẩm của quá trình phân hủy này là các
loại đường. Trong bùn lắng, quá trình phân hủy cellulose kỵ khí chủ yếu bởi Clos-
tridium tạo thành các sản phẩm etanol, acid formic, acid lactic và CO2.
Có rất nhiều loài phân hủy chất béo. Quan trọng nhất là các loài, Vibrio,
Bacillus, Sarcine, Pseudomonas … Sản phẩm thủy phân là glycerin và acid béo nhờ
enzyme lipase nội bào và ngoại bào. Sau đó, glycerin và acid béo lại được chuyển
hóa thành nhiều sản phẩm khác.
Cùng với vai trò chuyển hóa vật chất, vi sinh vật còn tham gia tạo cặn lắng.
Nhờ quá trình sinh trưởng lơ lửng hoặc bám dính của vi sinh vật, các hạt chất bẩn
nhỏ liên kết lại thành các hạt chất bẩn lớn hơn và tăng cường quá trình sa lắng. Nấm
sợi và vi khuẩn có tiên mao là các loài đóng vai trò tạo cặn lắng nhiều nhất.
Trong nước thải, vi sinh vật luôn có mối quan hệ rất phức tạp. Quan hệ cạnh
tranh quyết định thành phần vi sinh vật. Quan hệ con mồi – săn mồi ảnh hưởng số
lượng vi sinh vật. Quan hệ cộng sinh, hỗ trợ lẫn nhau trong quá trình chuyển hóa

22. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 21
vật chất làm phong phú và đa dạng cho hệ vi sinh vật trong nước thải. Các mối quan
hệ này quyết định khả năng, tốc độ và hiệu quả xử lý chất ô nhiễm của vi sinh vật.
1.3.3 Các quá trình xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học
Xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học là dựa trên hoạt động sống của
vi sinh vật có khả năng phân hóa các hợp chất hữu cơ và các công trình thường
được áp dụng như sau:
Bùn hoạt tính chủ yếu là vi khuẩn hiếu khí hoạt động trong điều kiện hiếu khí,
cần có oxy. Và quá trình phân huỷ chất hữu cơ dựa vào sự tiếp xúc của chất hữu cơ
với tế bào sinh vật (bông bùn) chuyển động lơ lửng trong nước thải, diễn ra quá
trình tăng trưởng lơ lửng.
Màng sinh học gồm hệ vi sinh vật tuỳ tiện: ở màng hiếu khí, phần ngoài màng là
vi khuẩn hiếu khí, ở giữa là các vi khuẩn tuỳ tiện và trong cùng là các vi khuẩn kị
khí, ở màng kị khí gồm các vi khuẩn kị khí chủ yếu và một số ít là tuỳ nghi. Và quá
trình phân hủy chất hữu cơ của màng sinh học dựa vào cơ chế hấp phụ các thành
phần hữu cơ trong nước thải một cách cố định, diễn ra quá trình tăng trưởng dính
bám.[6], [8]
1.4.3.1 Sinh trưởng lơ lửng – bùn hoạt tính
Bùn hoạt tính là tập hợp các vi sinh vật khác nhau chủ yếu là vi khuẩn, kết lại
thành bông với trung tâm là các hạt chất rắn lơ lửng trong nước. Các bông này có
màu vàng nâu, dễ lắng, có kích thước từ 3 – 150 μm. Các chất keo dính trong khối
nhầy của bùn hoạt tính hấp phụ các chất lơ lửng, vi khuẩn, các chất màu,
mùi,…trong nước thải. Do vậy hạt bùn sẽ lớn dần và tổng lượng bùn cũng tăng dần
lên, rồi từ từ lắng xuống đáy. Kết quả là nước sáng màu, giảm lượng ô nhiễm, các
chất huyền phù lắng xuống cùng với bùn và nước sẽ được làm sạch.
Khi cân bằng dinh dưỡng cho vi sinh vật trong nước thải cần quan tâm tới tỉ số
BOD5 : N : P = 100 : 5 : 1 hoặc 200 : 5 : 1 trong các công trình xử lý hiếu khí. Khi
cân bằng dinh dưỡng người ta có thể dùng NH4OH, ure và các muối amon làm nitơ
và các muối phosphat, supephosphat làm nguồn phospho.

23. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 22
Các nguyên tố vi lượng: K, Mg, Ca, S, Fe, Mn, Zn… đều cần cho vi sinh vật
nhưng ở trong nước thải thường có đủ mặt các chất này và không cần phải bổ sung
thêm. Thiếu các nguyên tố dinh dưỡng sẽ kìm hãm sinh trưởng và ngăn cản các quá
trình oxi hoá - khử trong tế bào vi sinh vật, làm giảm khả năng phân huỷ chất hữu
cơ có trong nước thải:
Nếu thiếu nitơ (dạng NH4
+
là nguồn dinh dưỡng của vi sinh vật) lâu dài sẽ
làm cho vi sinh vật không sinh sản, tăng sinh khối, ngoài ra còn cản trở quá trình
hoá sinh làm cho bùn hoạt tính khó lắng, trôi theo nước ra khỏi bể lắng.
Nếu thiếu phospho sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật sợi phát triển như Nocar-
dia hay Microthrix gây sự cố bung bùn trong bùn hoạt tính, làm cho quá trình lắng
chậm và giảm hiệu suất oxi hoá các chất hữu cơ của bùn hoạt tính.
Số lượng vi khuẩn trong bùn hoạt tính dao động trong khoảng 108
đến 1012
trên
1mg chất khô (chất rắn tách ra từ bùn hoạt tính bằng cách lọc hoặc ly tâm ở 100o
C).
Phần lớn chúng là Pseudomonas, Achromobacter, Micrococcus, Flavobacterium,
Bacillus, Alcaligenes.
Các vi khuẩn tham gia quá trình chuyển hoá NH3 thành N2 thấy có mặt trong
bùn như Nitromonas, Nitrobacter, Acinetobacter, Hyphomycrobium,Thiobacillus
Trong khối nhầy ta thấy có loài Zooglea, đặc biệt là Z.ramizoga rất giống
Pseudomonas. Chúng có khả năng sinh ra một bào nhầy chung quanh tế bào. Bao
nhầy này là một polyme sinh học, thành phần là polysaccarit, có tác dụng kết các tế
bào vi khuẩn lại thành hạt bông.
Trong bùn hoạt tính ta còn thấy các loài nguyên sinh động vật. Chúng đóng vai
trò khá quan trọng trong bùn. Chúng cũng tham gia phân huỷ các chất hữu cơ ở điều
kiện hiếu khí, điều chỉnh loài và tuổi quần thể vi sinh vật trong bùn, giữ cho bùn
luôn luôn hoạt động ở điều kiện tối ưu. Động vật nguyên sinh ăn các vi khuẩn già
hoặc đã chết, tăng cường loại bỏ vi khuẩn gây bệnh, làm đậm đặc màng nhầy nhưng
lại làm xốp khối bùn, kích thích vi sinh vật tiết enzyme ngoại bào để phân huỷ các
chất hữu cơ nhiễm bẩn và làm kết lắng bùn nhanh. Trong bùn hoạt tính thấy có đại
diện của 4 lớp Protozoa là Sarcodina, Mastogophora, Ciliata và Suctoria. Hay gặp

24. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 23
nhất là giống Amoeba thuộc lớp Sarcodina. Các loài Cladocera thì lọc các tế bào vi
khuẩn và cả chất hữu cơ chết, lọc tảo sợi, có ích trong việc làm giảm độ đục của
nước thải sau xử lý. Người ta lấy chỉ tiêu Protozoa để xác định chất lượng bùn hoạt
tính, bùn có chất lượng cao thì cứ 1 triệu tế bào vi khuẩn phải có 10 – 15 protozoa.
1.4.3.2 Sinh trưởng dính bám – màng sinh học
Trong dòng nước thải có những vật rắn làm giá mang, các vi sinh vật (chủ yếu là
vi khuẩn) sẽ dính bám trên bề mặt. Trong số các vi sinh vật có những loài sinh ra
các polysaccharide có tính chất như là các chất dẻo (gọi là polyme sinh học), tạo
thành màng – màng sinh học. Màng này cứ dày dần thêm và thực chất đây là sinh
khối vi sinh vật dính bám hay cố định trên các chất mang. Màng này có khả năng
oxy hoá các chất hữu cơ có trong nước thải khi nước chảy qua hoặc tiếp xúc với
màng, ngoài ra màng này còn khả năng hấp phụ các chất bẩn lơ lửng hoặc trứng
giun sán…
Như vậy, màng sinh học là tập hợp các loài vi sinh vật khác nhau, có hoạt tính
oxy hoá các chất hữu cơ có trong nước khi tiếp xúc với màng. Màng này dày từ 1 –
3mm và hơn nữa. Màu của màng thay đổi theo thành phần của nước thải từ màu
vàng xám đến màu nâu tối. Trong quá trình xử lý, nước thải chảy qua lớp vật liệu
lọc có thể cuốn theo các hạt của màng vỡ với kích thước 15 – 30 mm có màu sáng
vàng hoặc nâu.
Các công trình xử lý nước thải ứng dụng màng sinh học trên để loại bỏ các chất
hữu cơ nhiễm bẩn ra khỏi nước thải. Cơ chế hoạt động của các công trình dựa trên
lớp vật liệu lọc, tạo thành giá đỡ để hình thành màng sinh học. Vật liệu lọc có thể
được thí nghiệm đơn giản với cát, sỏi được xếp như sau: ở dưới cùng là các lớp sỏi
cuội đã rửa sạch có kích thước nhỏ dần theo chiều cao của lớp lọc, ở lớp trên được
trải lớp cát vàng hạt to rồi đến nhỏ. Nước thải đã được lọc qua lớp màng sinh học sẽ
thấm qua lớp cát nhỏ trên cùng rồi thấm dần qua lọc. Màng này được tạo thành từ
hàng triệu đến hàng tỉ tế bào vi khuẩn, các vi sinh vật khác và có cả động vật
nguyên sinh.

25. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 24
Màng sinh học trong các công trình lọc sinh học chủ yếu là các vi khuẩn hiếu
khí, nhưng thực ra phải coi đây là hệ tuỳ tiện, màng còn có các vi khuẩn tuỳ tiện và
kị khí. Ở ngoài cùng lớp màng là lớp hiếu khí, rất dễ thấy các loài trực khuẩn
Bacillus. Lớp trung gian là các vi khuẩn tuỳ tiện như Pseudomonas, Alcaligenes,
Flavobacterium, Micrococcus và cả Bacillus. Lớp sâu bên trong màng là kị khí, có
vi khuẩn kị khí khử lưu huỳnh và khử nitrat là Desulfovibrio. Phần dưới cùng của
lớp màng là lớp quần thể vi sinh vật với sự có mặt của động vật nguyên sinh và một
số vi sinh vật khác. Các loài này sử dụng một phần màng sinh học làm thức ăn tạo
thành các lỗ nhỏ của màng trên bề mặt chất mang. Quần thể vi sinh vật của màng
sinh học có tác dụng như bùn hoạt tính.
1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử lý nước thải bằng phương pháp
sinh học
Nồng độ chất hữu cơ: chất hữu cơ có trong nứơc thải phải là cơ chất dinh
dưỡng nguồn cacbon và năng lượng cho vi sinh vật. Các hợp chất hidrocacbon,
protein, lipit hoà tan thường là cơ chất dinh dưỡng rất tốt cho vi sinh vật.
COD/BOD ≤ 2 hoặc BOD/COD ≥ 0,5 mới có thể đưa vào xử lí sinh học (hiếu khí),
nếu COD lớn hơn BOD nhiều lần, trong đó gồm có xenlulozơ, hemixenlulozơ,
protein, tinh bột chưa tan thì phải qua xử lý sinh học kị khí. Và tỉ tệ chất hữu cơ của
nước thải đầu vào các công trình xử lý sinh học theo tỉ số sau BOD5 : N : P = 100 :
5 : 1 hoặc 200 : 5 : 1 trong xử lý kéo dài. Nếu trong các công trình bùn hoạt tính,
thiếu nitơ lâu dài, ngoài sự cản trở tạo tế bào mới và bùn, cản trở quá trình trao đổi
chất của vi sinh vật và còn làm cho bùn khó lắng, các hạt bông trôi nổi làm cho
nước khó trong. Thiếu phospho tạo sự phát triển của vi khuẩn dạng sợi, là nguyên
nhân chính làm cho bùn phồng lên, khó lắng. Để cân đối dinh dưỡng có thể dùng
các muối amon và phosphat như urê hay supephosphat vào nước thải để tăng nguồn
N và P. Cần loại bỏ bớt các chất hữu cơ khó phân huỷ trong nước thải đầu vào như :
lignin, kitin…, có thể loại bỏ hiệu quả các chất trên ở giai đoạn xử lý hoá lý .
pH của nước thải : có ảnh hưởng đến các quá trình hoá sinh của vi sinh vật.
Quá trình tạo màng sinh học, quá trình tạo bùn và lắng. pH thích hợp cho vi khuẩn

26. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 25
sinh trưởng và phân huỷ hiệu quả chất hữu cơ từ 6.5 – 8.5, tốt nhất là 7.5, pH > 9
hoặc pH < 4 đều ức chế hoạt động sống của vi sinh vật, ảnh huởng đến hiệu quả xử
lý của công trình. Trong thời gian cuối, nước thải trong aerotank có pH chuyển sang
kiềm, có thể là các hợp chất nitơ được chuyển thành NH3 hoặc muối amon, cần điều
chỉnh lại pH của bể.
Nhiệt độ: nhiệt độ của nước thải cũng ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động sống
của vi sinh vật. Hầu hết các vi sinh vật có trong nước thải là các thể ưa ấm
(mesophilic), chúng có nhiệt độ sinh trưởng tối đa là 400
C và tối thiểu là 50
C. Vì
vậy, nhiệt độ xử lý nước thải chỉ trong khoảng 6 – 370
C, tốt nhất là 15 – 350
C. Và
trong các công trình bùn hoạt tính, nhiệt độ còn ảnh hưởng tới quá trình hoà tan oxy
vào nước cũng như khả năng kết lắng của các bông cặn bùn hoạt tính.
Nồng độ các chất lơ lửng (SS) ở dạng huyền phù: sau khi xử lý sơ bộ, tuỳ
thuộc nồng độ chất lơ lửng có trong nước thải mà xác định công trình xử lý cơ bản
như lọc sinh học hoặc aerotank. Nếu nồng độ các chất lơ lửng không quá 100 mg/l
thì loại hình xử lý thích hợp là bể lọc sinh học và nồng độ không quá 150 mg/l thì
xử lý bằng aerotank sẽ cho hiệu quả phân huỷ các chất hữu cơ nhiễm bẩn là cao
nhất. Ngoài ra, nếu nước thải có hàm lượng chất lơ lửng quá lớn có thể được coi
như bùn cặn và được xử lý kị khí bằng bể metan. Tuy nhiên đối với các công trình
xử lý hiếu khí, với lượng chất rắn lơ lửng cao thường làm ảnh hưởng tới hiệu quả
xử lý. Vì vậy, đối với nước thải có hàm lượng chất rắn lơ lửng cao cần phải qua
lắng 1 trong giai đoạn xử lý sơ bộ một cách đầy đủ để có thể loại bỏ các cặn lớn và
một phần các chất rắn lơ lửng.
Nồng độ các nguyên tố vi lượng: nước thải đầu vào cần đòi hỏi không có
chất độc làm chết hoặc ức chế hoàn toàn hệ vi sinh vật trong nước thải. Trong số
các chất độc phải chú ý hàm lương kim loại nặng. Theo mức độ độc hại của kim
loại, xếp theo thứ tự:
Sb >Ag >Cu >Hg >Co >Ni >Pb >Cr3+
>V >Cd >Zn >Fe
Muối của các kim loại này ảnh huởng nhiều tới đời sống của vi sinh vật,
nếu quá nồng độ cho phép, các vi sinh vật không thể sinh trưởng được và có thể bị

27. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 26
chết. Như vậy, không thể tiến hành xử lý sinh học. Nồng độ muối của chúng thấp sẽ
làm giảm tốc độ làm sạch nước, vì các kim loại trên cũng là những chất vi lượng
cần cho vi sinh vật.
Hàm lượng oxy trong nước thải: đối với các công trình xử ký hiếu khí như
aerotank, điều kiện đầu tiên để đảm bảo cho aerotank có khả năng oxy hoá các chất
hữu cơ với hiệu suất cao là phải đảm bảo cung cấp đủ lượng oxy mà chủ yếu là oxy
hoà tan trong môi trường lỏng một cách liên tục, đáp ứng đầy đủ nhu cầu hiếu khí
của vi sinh vật trong bùn hoạt tính. Lượng oxy có thể được coi là đủ khi nước thải
ra khỏi bể lắng 2 có nồng độ oxy hoà tan DO = 2 mg/l. Còn đối với bể lọc sinh học
làm việc trong điều kiện thoáng khí, ngoài việc cấp oxy cho vi sinh vật ở màng sinh
học hoạt động, thoáng khí còn có tác dụng loại ra khỏi lọc các khí tạo thành do quá
trình phân huỷ chất hữu cơ có trong nước, như CO2 và có thể có cả CH4, H2S…Và
đối với các công trình xử lý kị khí, lại đòi hỏi nước thải có hàm lượng oxy hoà tan
thấp, cho vi sinh vật kị khí hoạt động hiệu quả trong điều kiện không có oxy.
Hệ thống xử lý: chế độ thuỷ động như bơm, các thiết bị thông khí nhằm
cung cấp oxy hoà tan cho các công trình xử lý hiếu khí như aerotank, bể lọc sinh
học. Để đáp ứng nhu cầu oxy hoà tan trong aerotank người ta thường chọn giải pháp
là khuấy cơ học (khuấy ngang, khuấy đứng), thổi và sục khí bằng hệ thống phân tán
khí thành các dòng, hoặc tia lớn nhỏ khác nhau, và kết hợp nén khí với khuấy đảo.
Đối với bể lọc sinh học, để thông khí người ta dùng quạt gió thổi vào khoảng trống
ở đáy bể và không khí từ đó đi lên qua các khe của lớp vật liệu lọc.

28. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 27
CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

29. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 28
2.1 Thời gian và địa điểm
2.1.1 Thời gian
Đề tài được thực hiện từ tháng 1 măm 2011 đến tháng 6 năm 2011
2.1.2 Địa điểm
 Địa điểm lấy mẫu
- Mẫu 1: Công ty cổ phần thủy sản số 4, số 320 Hưng Phú, Phường 9, Quận
8, Tp HCM.
- Mẫu 2: Công ty thủy sản khu công nghiệp Đức Hòa, Long An
- Mẫu 3: Công ty kỹ nghệ Vissan 420 Nơ Trang Long, Phường 13, Quận
Bình Thạnh, Tp HCM.
 Địa điểm thực hiện thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm khoa Môi trường và Công
nghệ sinh học Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP. HCM.
2.2 Dụng cụ và hóa chất
2.2.1 Dụng cụ
- Ống nghiệm
- Đĩa petri
- Autoclave
- Pipet, micro pipet
- Bếp đun
- Cốc thủy tinh
2.2.2 Hóa chất
- Môi trường phân lập
Môi trường dinh dưỡng có nguồn protein (NA)
Môi trường ding dưỡng (NB)
Môi trường có sổ sung gelatine (NG)
- Môi trường thử nghiệm sinh hóa
Môi trường Simon citrate agar
Môi trường canh Trypton

30. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 29
Môi trường MR-VP broth
Môi trường Nitrate broth
Môi trương Ure broth
Môi trường có bổ sung tinh bột ( NT)
2.3 Phương pháp nghiên cứu
Đề tài bao gồm các bước chính như sau:
Bước 1
Bước 2
Bước 3
Bước 4
Bước 5
Bước 6
Bước 7
Hình 2.1: Nội dung nghiên cứu
Lấy mẫu nước thải giàu protein ở một số cơ sở thủy sản
và chế biến thịt
Phân lập các vi khuẩn phân giải protein từ nước thải trên
môi trường đặc trưng
Xác định các đặc điểm hình thái
Xác định khả năng phân hủy protein của các chủng vi
khuẩn phân lập được
Xác định đặc điểm sinh hóa và bước đầu định danh
Xác định hoạt độ protease và mật độ tế bào
Khảo sát hoạt độ phân giải protein ở một số điều kiện

31. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 30
2.3.1 Phương pháp lấy mẫu
Mẫu được lấy tại các bể thu gom nước thải trước khi xử lý cho vào bình thủy
tinh đã được khử trùng đưa về phòng thí nghiệm tiến hành phân lập trong 24 giờ.
2.3.2 Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng
phân hủy protein.
(-)
(+)
(-)
( +)
(+)
Hình 2.2: Trình tự phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng
phân hủy protein
Nước thải thủy sản, thịt
Nhuộm gram, nhuộm bào tử
loại
loại
Cấy trang trên môi trường NA
Cấy ria tạo khuẩn lạc riêng rẽ
Thuần nhất các khuẩn lạc
Xác định khả năng phân hủy
protein
Xác định các đặc điểm sinh hóa
Dự đoán chủng vi khuẩn phân
lập được
Tổng hợp kết quả

32. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 31
Việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải pro-
tein được tiến hành trình tự theo các bước ở hình 2.2.
2.3.2.1 Phương pháp phân lập các vi khuẩn phân giải protein từ nước thải
trên môi trường đặc trưng
Môi trường NA là môi trường có chứa nguồn C, N cơ bản và một lượng pro-
tein làm chất cảm ứng cho vi sinh vật phân giải protein phát triển. Phân lập các
chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy protein bằng cách sau:
Mẫu nước thải lấy từ nhà máy thủy sản và chế biến thịt được xử lý bằng cách
đun ở 800
C trong 15 phút. Sau đó tiến hành pha loãng ở ba độ pha loãng khác nhau
10-1
, 10-2
, 10-3
và cấy trang trên môi trường dinh dưỡng NA bổ sung 2% agar  ủ
24 giờ ở 370
C. Sau đó tiến hành cấy ria từng loại khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường
dinh dưỡng đến khi thu được các khuẩn lạc thuần nhất.
2.3.2.2 Phương pháp xác định các đặc điểm hình thái
Mỗi loài vi khuẩn đều có các đặc điểm mang tính chất đặc trưng về hình
dáng, kích thước, khả năng di động, sự hình thành bào tử, sinh sản. Vì vậy muốn
phân lập được chủng vi khuẩn mong muốn cần tiến hành xác định các đặc điểm trên
bằng các phương pháp ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: Các phương pháp xác định hình thái vi khuẩn
STT Tên thử nghiệm Thuốc nhuộm Kết quả
1 Nhuộm Gram
Tím tinh thể, lugol,
fucshin
Gram dương: màu tím
Gram âm: màu hồng
2 Bào tử Malichite, fucshin
Tế bào màu hồng
Bào tử màu lục
2.3.2.3 Phương pháp xác định khả năng phân hủy protein
Để xác định khả năng phân hủy protein chúng tôi tiến hành song song 2
phương pháp: Kiểm tra lượng NH3 sinh ra và khả năng tan chảy gelatine.

33. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 32
 Xác định khả năng tạo thành NH3
Nguyên tắc:
NH3 là sản phẩm quá trình phân hủy protein. Để xác định khả năng tạo thành
NH3 vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường NB ở 370
C trong 24 giờ. Kết quả
được ghi nhận dựa trên phản ứng màu đặc trưng của NH3 sinh ra trong quá trình
phân giải protein với thuốc thử Nessler. Độ màu phụ thuộc hàm lượng NH3 sinh ra
và có dãy biến thiên màu từ vàng đến vàng nâu sậm.
Cách tiến hành:
- Cấy 1ml dịch tăng sinh sau 24 giờ vào ống nghiệm chứa môi trường NB, ủ
370
C trong 24 giờ
- Nhỏ 1 giọt thuốc thử Nessler vào 1ml dịch tăng sinh
- Nếu xuất hiện kết tủa màu vàng nâu là phản ứng dương tính
- Ghi nhận độ màu của phản ứng
 Thử nghiệm gelatine
Nguyên tắc:
Một số vi sinh vật có thể tổng hợp được nhóm enzyme protease ngoại bào
có khả năng xúc tác sự thủy phân của gelatine thành polypeptide và axit amin.
Để nhận biết khả năng phân hủy gelatine của vi sinh vật, cơ chất này được bổ
sung vào môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh vật có khả năng phân giải protein
sẽ làm tan chảy môi trường trong ống thạch sâu.
Cách tiến hành:
Chuẩn bị môi trường NG có chứa 5% gelatine trong các ống nghiệm, tiến
hành cấy một lượng sinh khối vi khuẩn phân lập được vào các ống trên đem ủ 370
C
trong 48 giờ. Trước khi quan sát cho mẫu vào tủ lạnh 40
C trong 30 phút. Nếu vi
khuẩn phân giải gelatine thì gelatine bị phân hủy này dù ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt
độ 200
C vẫn không đông.
Thực hiện ủ song song một ống môi trường đối chứng không được cấy vi
sinh vật.

34. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 33
Đọc kết quả: trong ống thạch sâu, thử nghiệm là dương khi môi trường bị tan chảy,
thử nghiệm là âm tính khi môi trường vẫn đông đặc.
2.3.2.4 Phương pháp xác định các đặc điểm sinh hóa
Bảng 2.2: Các thử nghiệm sinh hóa xác định vi sinh vật
STT
Thử
nghiệm
Môi trường Thuốc thử Kết quả (+) Kết quả (-)
1 Di động
NA 0,5%
agar
-
Vi khuẩn mọc
lan rộng quanh
vết cấy
Vi khuẩn chỉ mọc
theo vết cấy
2 Catalase NA 2 % agar H2O2 Có sủi bọt Không sủi bọt
3 Nitrate Nitrat broth
Sunfanilamide
0,2% và
Nnapthylenedi-
amin hydro-
chloride
Môi trường có
hồng
Môi trường không
đổi màu
4 Indol
Canh Tryp-
ton
Kovac’s
Bề mặt môi
trường xuất
hiện vòng đỏ
Bề mặt môi
trường xuất hiện
vòng vàng
5 Urease Urea broth -
Môi trường có
màu đỏ hồng
Môi trường có
màu tím
6
Voges-
proskauer
MR - PV
broth
KOH, - naph-
tol
Môi trường có
màu đỏ
Môi trường có
màu đồng
7 Citrate
Simmon
citrate agar
-
Môi trường có
màu xanh lam
Môi trường có
màu xanh lục
8 Manitol - -
Môi trường có
màu vàng
Môi trường không
đổi màu
9 Tinh bột NT Lugol
Có vòng sáng
xung quanh
Không có vòng
sang xung quanh

35. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 34
vết cấy vết cấy
Dựa vào cơ sở định danh chi Bacillus của Bergey ( Phụ lục 1), chúng tôi tiến
hành thực hiện các phản ứng sinh hóa được trình bày ở bảng 2.2
2.3.3 Phương pháp xác định hoạt độ phân giải protease và mật độ tế bào
 Xác định hoạt độ phân giải protease theo phương pháp Amano
Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất casein bởi enzyme. Sau đó bất
hoạt enzyme và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng acid tricloaxetic. Định lượng
sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, kết quả
phân tích dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine.
Đơn vị hoạt độ protease là lượng enzyme trong 1 phút ở 370
C chuyển hóa
được một lượng casein tương đương với một micromol tyrosine .
Cách tiến hành
- Chuẩn bị dung dịch casein 1%
 Lập đường chuẩn tyrozine
- Dung dịch tyrozine tiêu chuẩn: Cân chính xác 10 mg tyrozine tinh khiết
hòa tan trong một ít dung dịch HCl 0,1M cho vào bình định mức 100ml và thêm
dung dịch HCl 0,1M vào cho tới vạch. Sau đó pha thành các nồng độ sau
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Nồng độ tyrozine (µmol/ml) 0 10 20 30 40 50
Dung dịch tyrozine (ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
HCl 0,1M (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5
Dung dịch Na2CO3 0,4M (ml) 5 5 5 5 5 5
Thuốc thử folin (ml) 1 1 1 1 1 1

36. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 35
Song song thao tác trên, tiến hành ống đối chứng nhưng thay dung dịch tyrozine
bằng 1ml HCl 0,1M và thao tác làm tương tự. Sau đó lập đường chuẩn tyrozine với
trục hoành là µmol tyrozine , trục tung là giá trị OD
 Xác định hoạt độ phân giải protease
Cách tiến hành:
Hoạt độ phân giải của enzyme được khảo sát ở 370
C và pH=7
Cho 1ml cơ chất casein 1% vào ống nghiệm, ủ 370
C trong 10-15 phút. Sau
thời gian ủ cho 1ml dịch enzyem đã ly tâm vào lắc đều. Đem ủ hổn hợp này ở 370
C
trong 60 phút.
Sau đó cho vào 2ml dung dịch tricloaxetic 0,4M để ngừng phản ứng. Để ổn
định 25 phút và lọc để loại tủa. Cho 5ml Na2CO3 vào 1ml dịch lọc, thêm 1ml folin,
lắc đều và để yên ở 370
C trong 20 phút. Khi dung dịch xuất hiện màu xanh đem đo
ở bước sóng 660nm.
Mẫu đối chứng: lấy 1ml nước cất thay cho 1ml enzyme và tiến hành các
bước tương tự.
Tính toán kết quả
Một đơn vị hoạt tính enzyme protease được xác định là lượng enzyme để tạo
ra lượng amino axit tương ứng với 100µg tyrosine trong 1ml dịch lọc dưới điều kiện
thí nghiệm
Trong đó
Am: giá trị đo OD của mẫu
A0: giá trị đo OD của đối chứng
F: Hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosine và độ hấp thụ ở bước sóng 660
N: hệ số pha loãng

37. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 36
1/100 hệ số chuyển đổi
 Xác định mật độ tế bào
Nguyên tắc:
Xác định số lượng tế bào bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc tạo thành bởi các
vi khuẩn sống trong điều kiện sinh trưởng thuận lợi . Sinh khối vi khuẩn sau ly tâm
được pha loãng vào một thể tích nhất định sau đó cấy trang lên môi trường thạch
trong đĩa petri và đếm số khuẩn lạc trên đĩa.
Cách tiến hành:
 Bước 1: Pha loãng mẫu
Sinh khối sau ly tâm ở 72 giờ được pha pha loãng thành các nồng độ 10-1
10-2
, ...., 10-6
theo sơ đồ.
1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
Ống sinh khối
ban đầu và 9ml
nước muối
pha loãng 10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
 Bước 2: Trải đĩa
Từ dung dịch pha loãng ở trên ta hút 0,1 ml ở nồng độ pha loãng cần thiết
cho vào các đĩa có chứa sẵn môi trường nuôi cấy, dùng que trang trang cho đến khi
khô mặt thạch. Sau đó đem ủ các đĩa ở 370
C trong 24 giờ. Mỗi độ pha loãng lặp lại
2 lần.
 Bước 3: Đếm các khuẩn lạc thuần khiết trên mỗi đĩa.
Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu được tính từ số khuẩn lạc đếm được
của mỗi độ pha loãng.
9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml

38. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 37
Trong đó:
Ai : là số khuẩn lạc trung bình trên đĩa
Di : là độ pha loãng
V : là thể tích cho vào mỗi đĩa (ml)
Mật độ tế bào trung bình MI trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các
nồng độ pha loãng khác nhau. [10],
2.3.4 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme protease
Môi trường dịch tăng sinh được điều chỉnh pH nuôi cấy ở pH 3, pH 5, pH 7,
pH 9 bằng dung dịch NaOH 1M hoặc HCl 1M. Sau đó cấy 1ml dịch vi khuẩn vào
mỗi ống nghiệm tương ứng với khoảng pH đã nêu, ủ 24 giờ ở 370
C. Tiến hành ly
tâm thu dịch enzyme để xác định hoạt tính
24h, 370
C
Hình 2.3: Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme protease
2.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme protease
Vi khuẩn được nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ bình thường (370
C), sau 24 giờ
nuôi cấy đem ly tâm thu dịch trong. Sau đó xác định hoạt độ enzyme bằng cách cho
enzyme xúc tác với cơ chất ở các nhiệt độ khác nhau là 300
C, 370
C, 400
C, 500
C,
Xác định hoạt độ
Ly tâm thu dịch trong
pH 5 pH 7 pH 9
pH 3
Môi trường NB

39. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 38
600
C, trong cùng một pH (pH tối ưu xác định ở thí nghiệm trên). Ở nhiệt độ nào
hoạt độ của enzyme cao nhất thì đó là nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme .
Hình 2.4: Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease
Căn cứ vào kết quả xác định hoạt độ của các chủng sau 24 giờ nuôi cấy để
xác định khoảng pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt độ enzyme protease cao nhất.
T=37 T=40 T=50
T=30 T=60
Tăng sinh trên môi
trường NA
Chủng vi khuẩn
ủ 24h, 370
C
Dịch enzyme protease
T=60
Tăng sinh trên môi
trường NA
Chủng vi khuẩn
Dịch enzyme protease
Xác định hoạt độ
T=37 T=40 T=50
T=30 T=60
Tăng sinh trên môi trường NB
Chủng vi khuẩn
Ly tâm thu dịch enzyme

40. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 39
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN
LUẬN

41. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 40
3.1Kết quả phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải protein
3.1.1 Phân lập các chủng vi khuẩn trên môi trường NA
Phân lập là quá trình tách riêng vi sinh vật từ mẫu hoặc từ quần thể ban đầu
để thu nhận giống ở dạng thuần khiết. Tùy vào mục đích và đối tượng phân lập mà
cần các loại môi trường khác nhau. Do đó việc lựa chọn môi trường phân lập đóng
vai trò rất quan trọng quyết định hiệu quả phân lập. Môi trường NA là môi trường
đặc trưng chỉ chứa protein là nguồn cacbon và năng lượng duy nhất chỉ những vi
sinh vật có hệ enzyme protease có khả năng phân hủy protein mới có thể phát triển
trên môi trường này.
Nhiều vi khuẩn có hệ enzyme protease phong phú và có khả năng thích nghi
cao phần lớn đều thuộc chi Bacillus. Mặt khác các vi khuẩn này có nhiều ứng dụng
rộng rãi trong lĩnh vực xử lý nước thải và cho hiệu quả xử lý rất cao. Do đó trong
quá trình phân lập chúng tôi tập trung vào các loài thuộc chi này.
Dựa vào hệ thống phân loại của Bergey(1989), đặc trưng đầu tiên của
Bacillus là trực khuẩn, gram dương, sinh bào tử. Vì thế trước khi phân lập, các mẫu
nước thải đều được đun 800
C trong 15-30 phút để diệt các tế bào sinh dưỡng. Sau
khi đun, mẫu được cấy trên môi trường NA bằng phương pháp cấy trang.
Căn cứ vào sự khác nhau của hình thái khuẩn lạc, đã chọn lựa được 30 chủng
vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường chứa protein là nguồn cacbon duy
nhất. Hầu hết các khuẩn lạc đều có hình dạng và kích thước khác nhau. Để có cơ sở
tuyển chọn chúng tôi tiến hành xác định các đặc điểm hình thái của chúng.
3.1.2 Kết quả xác định các đặc điểm hình thái
 Kết quả nhuộm gram

42. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 41
Mục đích phân lập là tập trung vào các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải
protein, mà trong đó chiếm ưu thế là chủng Bacillus. Bacillus là trực khuẩn, gram
dương, có bào tử, có vài loài gram âm nhưng không đóng vai trò quan trọng. Vì
vậy, dựa vào các đặc điểm hình thái này có thể loại bỏ các chủng vi khuẩn mà hình
thái của chúng khác với hình thái của chủng Bacillus bằng phương pháp nhuộm
gram.
Bảng 3.1: Kết quả nhuộm gram của các chủng vi khuẩn
Hình thái Kết quả Kết quả Hình thái
Vi khuẩn hình
que, thon, ngắn
M1 M6
Vi khuẩn hình
que, dài thon,
xếp chuỗi
Vi khuẩn hình
que
M2 M7
Vi khuẩn hình
que, tế bào
ngắn, nhỏ
Vi khuẩn hình
que, xếp chuỗi
đơn
M3
V1
Vi khuẩn hình
que, tế bào nhỏ
xếp chuỗi

43. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 42
Dựa vào hình thái quan sát được dưới kính hiển vi chúng tôi chọn được 10
chủng vi khuẩn, 7 chủng phân lập từ nước thải thủy sản được ký hiệu M1 đến M7
và 3 chủng phân lập từ nước thải chế biến thịt được ký hiệu V1 đến V3. Kết quả
nhuộm gram được trình bày ở bảng 3.1
 Kết quả nhuộm bào tử
Sự hình thành bào tử là hình thức đổi mới tế bào khi vi khuẩn sống trong môi
trường bất lợi không phù hợp cho việc sinh trưởng, phát triển bình thường của
chúng. Một số vi khuẩn như Bacillus và Clostridium có khả năng tạo thành bào tử
và chúng tồn tại trong môi trường thiếu dinh dưỡng, nhiệt độ cao. Vì vậy, việc đun
mẫu nước thải trước khi tiến hành phân lập cùng với việc nhuộm bào tử, nhằm
khẳng định chắc chắn những chủng vi khuẩn phân lập được đều sinh bào tử giống
với đặc điểm của chủng Bacillus. Tiến hành nhuộm bào tử đối với 10 chủng trực
khuẩn gram dương phân lập được và kết quả là cả 10 chủng vi khuẩn đều sinh bào
tử. Như vậy bước đầu cả 10 chủng chúng tôi phân lập được đều mang đặc điểm của
Bacillus.
Vi khuẩn hình
que
M4 V2
Vi khuẩn hình
que, ngắn
Vi khuẩn hình
que,tế bào dài,
thon
M5 V3
Vi khuẩn hình
que, xếp chuỗi

44. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 43
Hình 3.1: Kết quả nhuộm bào tử của chủng M1
3.1.3 Kết quả xác định khả năng phân hủy protein
 Khả năng tạo thành NH3
Các vi khuẩn phân giải chất hữu cơ có chứa nitơ có khả năng tiết enzyme
protease phân giải protein vào môi trường, thủy phân protein thành các amino axit.
Khi đó, vi khuẩn sử dụng các amino axit này trong quá trình dị hóa và đồng hóa.
Các sản phẩm đặc trưng của quá trình phân giải protein là NH3 và H2S.
Dựa trên những phản ứng màu, phản ứng kết tủa của NH3 trong quá trình
phân giải protein với thuốc thử Nessler để xác nhận sự có mặt của NH3 trong các
quá trình này. Màu sắc tạo thành tùy thuộc lượng NH3 có trong mẫu thử, NH3
càng nhiều tủa tạo thành có màu càng đậm dần. [3],[4]
- Màu vàng nhạt – ít NH3 (+)
- Màu vàng sậm – nhiều NH3 (+ +)
- Màu nâu – rất nhiều NH3(+ + + )
Sau 24 giờ nuôi cấy, cả 10 chủng vi khuẩn đều cho phản ứng màu dương tính
với thuốc thử Nessler, trong đó chủng M5, V2, V3 có màu nâu sậm hơn cả, chủng
M1 có màu vàng nhạt so với các chủng còn lại được thể hiện ở hình 3.2
Hình 3.2: Khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ của các chủng vi khuẩn

45. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 44
thứ tự từ trái đến phải M1-V3
Chủng
Phản ứng với
thuốc thử Nessler
Chủng
Phản ứng với
thuốc thử Nessler
M1 + M6 + +
M2 + + M7 + +
M3 + + V1 + +
M4 + + V2 + + +
M5 + + + V3 + + +
 Khả năng phân hủy gelatine
Gelatine là một dạng protein có kích thước phân tử lớn, vi sinh vật muốn sử
dụng các protein này như một nguồn cung cấp năng lượng hay vật liệu xây tổng
hợp các thành phần khác của tế bào, chúng phải có khả năng tổng hợp enzyme
protease ngoại bào. Dựa vào đặc điểm này chúng tôi tiến hành thử nghiệm khả
năng tan chảy gelatine trong môi trường thạch sâu đối với 10 chủng vi khuẩn phân
lập được. Kết quả thử nghiệm tất cả 10 chủng vi khuẩn phân lập được đều làm tan
chảy gelatin sau 24giờ nuôi cấy. [3]
Hình 3.3: Kết quả thử nghiệm gelatine của 10 chủng vi khuẩn
3.1.4 Kết quả xác định các đặc điểm sinh hóa và bước đầu định danh
Bảng 3.2: Kết quả thử nghiệm sinh hóa của các chủng vi khuẩn
Thử Ký hiệu chủng vi khuẩn

46. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 45
nghiệm M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 V1 V2 V3
Di động + + + + + + + + + +
Catalase + + + + + + + + + +
VP - - - - + + + + + +
Indol - - - - - - - - - -
Urease - - - - - - - - - -
S.citrate + - - + + - + + - +
Nitrate + + + + - - + + + +
Tinh bột - - + + - - + + + +
Manitol - - - + - - - + + +
NaCl 7% - - - - - + + - - +
Để có cơ sở bước đầu định danh 10 chủng vi khuẩn này, chúng tôi tiến hành
một số thí nghiệm sinh hóa kết quả được trình bày ở bảng 3.2.
Các kết quả thử nghiệm sinh hóa được mô tả bằng hình ảnh ở hình 3.4
A: Thử nhiệm Indol B : Thử nghiệm ure
C: Thử nghiệm S.citrate D: Thử nghiệm VP

47. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 46
E: Thử nghiệm Nitrate F: Thử nghiệm Manitol
Hình 3.4: Kết quả một số thử nghiệm sinh hóa của 10 chủng
Dựa trên kết quả phân tích các đặc điểm hình thái và phản ứng sinh hóa có
được chúng tôi tiến hành so sánh với hệ thống phân loại của Bergey và bước đầu
định danh các chủng vi khuẩn như sau: [3], [4], [9].
Theo hình thái quan sát dưới kính hiển vi chúng tôi phân làm 2 nhóm
Nhóm І: Các vi khuẩn có bào tử không phồng lên rõ rệt bao gồm chủng M2,
M4, M6, M7, V1, V3
Căn cứ vào kết quả sinh hóa chủng M2 khi quan sát dưới kính hiển vi có
đường kính thể sinh dưỡng nhỏ hơn 0,9µm, có khả năng phân hủy gelatine mạnh.
Mặt khác khi tiến hành nuôi cấy trong môi trường có chứa NaCl tăng dần chúng
không phát triển ở nồng độ muối 7%. Do đó chúng tôi dự đoán đây là chủng
Bacillus badius.
Chủng M4 có đường kính thể sinh dưỡng lớn hơn 0,9µm, có khả năng sinh
manitol, đồng thời có hệ enzyme phân hủy tinh bột nên đây có thể là chủng
Bacillus megaterium.
Chủng M6 có đường kính thể sinh dưỡng nhỏ hơn 0,9µm. Chúng có thể tồn
tại trong môi trường chứa NaCl 7% nhưng chủng vi khuẩn này không có hệ
enzyme thủy phân tinh bột đồng thời không tạo thành nitrite từ nitrate, căn cứ vào
đặc điểm trên chúng tôi dự đoán đây là chủng Bacillus pumilus.
Tương tự chủng M7, V3 cũng có đường kính thể sinh dưỡng nhỏ hơn 0,9µm,
chúng có hệ enzyme thủy phân tinh bột và quan trọng là chúng phát triển được trên
môi trường chứa 7% NaCl, có khả năng tạo thành nitrite từ nitrate. Từ những thông

48. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 47
tin trên chúng tôi chỉ có thể dự đoán đây là Bacillus licheniformis nếu chúng phát
triển được ở điều kiện kỵ khí có pH 5,2 và tạo thành khí từ nitrate. Ngược lại là
chủng Bacillus subtilis. Vì thí nghiệm vừa nêu chúng tôi không có điều kiện thực
hiện nên không có cơ sở xác định.
Cuối cùng ở nhóm này thì chủng V1 cũng có đường kính thể sinh dưỡng nhỏ
hơn 0,9µm, chúng không có khả năng phát triển trên môi trường chứa 7% NaCl,và
khả năng phân hủy gelatine yếu nên chúng tôi nhận định đây là chủng Bacillus
coagulans
Nhóm ІІ: Các vi khuẩn có bào tử phồng lên rõ rệt bao gồm chủng M1, M3,
M5, V2
Đầu tiên chủng M1 không có khả năng thủy phân tinh bột nhưng chúng có
thể tạo thành nitrite từ nitrate, có phản ứng dương tính với thí nghiệm catalase. Từ
các đặc điểm trên có thể nhận định dây là chủng Bacillus pasteurri.
Chủng M3 có hệ enzyme thủy phân tinh bột nhưng không tạo thành indol.
Chúng tôi cho rằng đây là chủng Bacillus stearothermophilus nếu chủng này phát
triển được ở 650
C và là chủng Bacillus circulans khi không phát triển được ở 650
C.
Chủng M5 có tế bào phồng lên rõ rệt nhưng chúng không có khả năng phân
hủy tinh bột, đồng thời không phát triển được trên môi trường chứa 10% NaCl , do
đó dự đoán đây là chủng Bacillus sphaericus.
Cuối cùng thì chủng V2 có đặc điểm gần giống các chủng khác cũng có khả
năng phân hủy tinh bột có sinh manitol dự đoán đây là chủng Bacillus polymyxa.
Như vậy bước đầu có thể xác định 10 chủng phân lập được là các loài
Bacillus được tóm tắt ở bảng 3.3
Bảng 3.3: Kết quả dự đoán các loài Bacillus phân lập được
Chủng Kết quả dự đoán
Ghi chú
(thí nghiệm cần thực hiện thêm)
M1 B. pasteurii
M2 B. badius
M3 B.stearothermophilus Nuôi ủ ở 650
C ( phát triển )

49. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 48
B. circulans Nuôi ủ ở 650
C (không phát triển)
M4 B. megaterium
M5 B. sphaericus
M6 B. pumilus
M7
B. licheniformis Nuôi ủ ở điều kiện kỵ khí, pH<5,2 ( phát triển)
B. subtilis Nuôi ủ điều kiện kỵ khí, pH<5,2 (không phát triển)
V1 B. coagulans
V2 B. polymyxa
V3
B. licheniformis Nuôi ủ ở điều kiện kỵ khí, pH<5,2 ( phát triển)
B. subtilis Nuôi ủ điều kiện kỵ khí, pH<5,2 (không phát triển)
3.2 Kết quả xác định hoạt độ phân giải protease và mật độ tế bào
 Hoạt độ phân giải protease
Enzyme là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học
khác nhau. Mỗi enzyme xúc tác cho một phản ứng nhất định, hoạt độ xúc tác của
enzyme càng mạnh lượng cơ chất bị chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm phản ứng
được tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn. Vì vậy việc xác định hoạt độ
phân giải của enzyme protease nhằm định lượng hoạt tính enzyme của các chủng
phân lập được. Dịch nuôi cấy 10 chủng sau 24, 48, 72, 96 giờ sẽ được ly trích loại
bỏ sinh khối tế bào và xác định hoạt độ phân giải bằng phương pháp Amano. Kết
quả được trình bày ở bảng 3.4 [7], [9].
Bảng 3.4: Hoạt độ phân giải protease của 10 chủng vi khuẩn
STT
Chủng
vi khuẩn
Hoạt tính enzyme (U/ml)
24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ
1 M1 0,67 0,69 0,78 0,70
2 M2 0,79 0,82 0,85 0,76
3 M3 0,62 0,65 0,7 0,67
4 M4 0,73 0,76 0,82 0,77

50. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 49
5 M5 0,8 0,82 0,9 0,84
6 M6 0,67 0,69 0,75 0,65
7 M7 0,76 0,79 0,83 0,74
8 V1 0,62 0,67 0,78 0,7
9 V2 0,75 0,79 0,85 0,75
10 V3 0,77 0,8 0,87 0,73
Theo kết quả bảng 3.4 cho thấy tất cả 10 chủng vi khuẩn phân lập được đều
có hoạt độ phân giải protease tăng dần theo thời gian nuôi cấy và cho kết quả cao
nhất là ở 72 giờ. Vượt quá thời gian này hoạt độ enzyme sẽ giảm. Trong đó chủng
M5 có hoạt độ phân giải mạnh nhất (0,9 U/ml) ngược lại thấp nhất là chủng M3 (0,7
U/ml). Tuy nhiên mức độ tăng hoạt độ protease giữa các chủng không giống nhau
như chủng V1 có mức độ tăng cao nhất 20% từ 0,62 U/ml ở 24 giờ đến 0,78 U/ml
sau 72 giờ, và chủng M2 có mức độ tăng thấp nhất 7% so với ở 24 giờ.

51. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 50

52. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 51
Hình 3.5: Hoạt độ phân giải enzyme protease của 10 chủng
 Xác định mật độ tế bào
Việc xác định mật độ tế bào nhằm thiết lập mối tương quan giữa hoạt độ
enzyme và số lượng tế bào có trong dịch nuôi cấy. Về mặt lý thuyết xác định mật
độ tế bào phải tương ứng với từng thời gian đo hoạt tính, tuy nhiên vì điều kiện thời
gian có hạn nên chúng tôi chỉ thực hiện xác định mật độ tế bào tại thời điểm có hoạt
độ cao nhất là 72 giờ. Sinh khối sau ly tâm được pha loãng với nước muối sinh lý
đến độ pha loãng 10-4
, 10-5
, 10-6
, mỗi độ pha loãng được lặp lại 2 lần. Kết quả được
trình bày ở hình 3.6.[9]
Bảng 3.5: Kết quả xác định mật độ tế bào
STT Chủng vi khuẩn Mật độ tế bào (cfu/ml)
1 M1 0,66x108
2 M2 0,93x108
3 M3 0,78x108
4 M4 3,9x108
5 M5 1,9x108
6 M6 1,3x108
7 M7 1,1x108
8 V1 3,1x108
9 V2 1,4x108
10 V3 1,7x108

53. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 52
Hình 3.6: Mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn
Theo kết quả hình 3.6 cho thấy sau 72 giờ nuôi cấy mật độ tế bào đạt trung
bình là 1,68x108
(cfu/ml). Trong đó thấp nhất là chủng M1(0,66x108
cfu/ml) và cao
nhất là chủng M4 (3,9x108
cfu/ml). Đặc biệt là chủng V1 và M4 có số lượng tế bào
vượt trội hơn 8 chủng còn lại.
Khi vi sinh vật phát triển được trong môi trường thích hợp, quá trình phân
hủy cơ chất và tổng hợp sản phẩm của tế bào diễn ra mạnh mẽ. Cùng với sự gia
tăng số lượng, kích thước tế bào thì lượng enzyme tiết ra cho quá trình chuyển hóa
cũng gia tăng.
So sánh với kết quả hoạt tính enzyme, chúng tôi nhận thấy chủng có hoạt độ
cao nhất là M5 (0,9 U/ml) và mật độ tế bào là 1,9x108
(cfu/ml). Còn chủng M4 có
mật độ tế bào cao nhất nhưng hoạt tính enzyme chỉ đạt 0,82 (U/ml). Riêng chủng
V1 hoạt độ chỉ đạt 0,78 (U/ml) nhưng mật độ tế bào lại khá cao (3,1x108
cfu/ml).
Như vậy, các chủng có mật độ tế bào thấp nhưng hoạt độ enzyme cao chứng tỏ hệ
enzyme protease mạnh, khả năng tổng hợp và sản xuất enzyme là tương đối cao,
thích nghi với nguồn cơ chất trong môi trường. Các chủng có mật độ tế bào cao
nhưng có hoạt tính enzyme thấp cần có các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo nhằm
nâng cao khả năng phân hủy cơ chất của chúng. Mặt khác, để khảo sát mật độ tế
bào có tăng sau các thời gian ủ và xác định thời điểm mật độ tế bào tối ưu thì phải

54. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 53
tiến hành khảo sát mật độ tế bào ở 24, 48, 72, 96 giờ nuôi cấyđể có thêm cơ sở kết
luận.
3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme protease
Enzyme rất nhạy với pH của môi trường. pH thường ảnh hưởng đến mức độ
ion hóa cơ chất và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có
ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng enzyme. Mỗi enzyme thích hợp với một vùng
pH nhất định. Do đó chúng tôi tiến hành xác định pH tối ưu cho hoạt độ phân giải
protease ở các khoảng pH khác nhau cụ thể ở pH 3, pH 5, pH 7, pH 9. Kết quả
được thể hiện ở bảng 3.6 [7]
Bảng 3.6: Kết quả ảnh hưởng của pH đến hoạt đô enzyme protease
STT Chủng
vi khuẩn
Hoạt tính enzyme (U/ml)
pH 3 pH 5 pH 7 pH 9
1 M1 0,6 0,63 0,68 0,52
2 M2 0,65 0,67 0,82 0,69
3 M3 0,63 0,66 0,78 0,57
4 M4 0,7 0,77 0,82 0,69
5 M5 0,65 0,72 0,87 0,76
6 M6 0,65 0,72 0,79 0,66
7 M7 0,53 0,65 0,81 0,62
8 V1 0,52 0,69 0,73 0,54
9 V2 0,56 0,65 0,81 0,7
10 V3 0,69 0,72 0,83 0,75
Qua kết quả ở bảng 3.6 ta thấy pH tối ưu cho hoạt động của protease của hầu
hết các chủng vi khuẩn phân lập được là pH=7. Ở pH thấp hay cao hơn pH tối ưu,
hoạt tính enzyme đều giảm.Ở pH tối ưu thì chủng M5 có hoạt độ protease mạnh
nhất 0,87 U/ml và chủng M1 có hoạt độ phân giải protease yếu nhất 0,68 U/ml.
Tuy nhiên tỷ lệ tăng hoặc giảm của từng chủng không giống nhau điển hình chủng

55. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 54
M5 ở pH 9 có hoạt độ giảm 13% so với hoạt độ ở pH tối ưu. Riêng chủng V1 ở pH
9 hoạt độ protease giảm mạnh nhất 27% so với ở pH tối ưu.

56. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 55
Hình 3.7: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme protease
Từ các kết quả phân tích trên cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập được có
pH tối ưu khá thống nhất với kết quả của Vũ Ngọc Bội (2004) khi nghiên cứu quá
trình thủy phân cá bằng Enzyme protease từ Bacillus subtilis có khoảng pH hoạt
động thích hợp 5,5 -7,0. Mặt khác trong 10 chủng vi khuẩn chúng tôi phân lập
được thì M7 và V3 có khả năng là Bacillus subtilis nên kết quả trên cũng phù hợp.
Đối với nước thải thủy sản và thịt, pH đầu vào thường dao động trong
khoảng 6,5-7,5. Nên các chủng vi khuẩn phân lập được có khoảng pH 7 sẽ thích
hợp cho việc ứng dụng xử lý nước thải. Vì khi bổ sung các chủng vi sinh vật này
vào các công trình xử lý nước thải chúng sẽ rút ngắn được thời gian thích nghi và
phát triển nhanh dần dẫn đến hiệu quả xử lý sẽ cao.
3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của enzyme
Nhiệt độ là một yếu tố vật lý có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme,
chúng liên quan đến khả năng kết hợp giữa enzyme và cơ chất. Mỗi enzyme chỉ
hoạt động trong một khoảng nhiệt độ nhất định, khoảng nhiệt độ này không làm

57. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 56
cho protein bị biến tính, mất hoạt tính sinh học. Khi hoạt độ của enzyme đạt giá trị
cao nhất thì nhiệt độ đạt giá trị tối ưu. Do đó chúng tôi tiến hành xác định nhiệt độ
tối ưu cho hoạt động protease từ 300
C đến 600
C ở cùng điều kiện pH tối ưu.[7]
Bảng 3.7: Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme protease
STT Chủng vi
khuẩn
Hoạt tính enzyme (ĐVHT/ml)
300
C 370
C 400
C 500
C 600
C
1 M1 0,55 0,69 0,71 0,99 0,78
2 M2 0,7 0,82 0,95 1,13 0,8
3 M3 0,6 0,73 0,76 0,69 0,63
4 M4 0,68 0,79 0,82 0,95 0,78
5 M5 0,71 0,86 1,00 1,15 0,88
6 M6 0,64 0,79 0,85 0,92 0,61
7 M7 0,52 0,79 0,84 0,95 0,78
8 V1 0,52 0,73 0,87 0,76 0,69
9 V2 0,63 0,75 0,82 1,13 0,9
10 V3 0,81 0,82 0,96 1,01 0,7
Từ bảng 3.7 cho thấy enzyme protease hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ
500
C. Vượt quá nhiệt độ này hoạt độ enzyme giảm và đặc biệt giảm mạnh ở nhiệt
độ cao hơn 500
C do sự biến tính protein. Trong đó chủng M5 có hoạt độ phân giải
protease mạnh nhất( 1,15 U/ml) và chủng M3 có hoạt độ protease thấp so với các
chủng còn lại. Tuy vậy mức độ tăng giảm giữa các chủng không đồng đều nhau
như ở 600
C chủng V3 có hoạt độ protease giảm thấp nhất 14% so với hoạt độ pro-
tease ở 500
C nhưng chủng M2 lại giảm mạnh nhất 34% so với hoạt độ protease ở
nhiệt độ tối ưu. Riêng chủng M3, V1 lại có hoạt độ protease cao nhất ở 400
C. Điều
này cũng hợp lý vì mỗi enzyme hoạt động ở một nhiệt độ nhất định.

58. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 57

59. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 58
Hình 3.8: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme protease
Từ kết quả phân tích trên cho thấy hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập được
có nhiệt độ tối ưu là 500
C. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Đặng
Văn Hợp (2000) về enzyme protease tách chiết từ Aspergillus oryzae A4 cũng hoạt
động tốt nhất ở 500
C. Tuy nhiên kết quả trên lại thấp hơn kết quả nghiên cứu của
Vũ Ngọc Bội về enzyme protease từ Bacillus subtilis S5 có nhiệt đô hoạt động tối
ưu là 550
C.[1]

60. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 59
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN
NGHỊ

61. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 60
4.1 Kết luận
- Từ mẫu nước thải của nhà máy thủy sản và chế biến thịt cá đã phân lập
được 10 chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy protein. Dựa vào các kết quả nhuộm
gram, bào tử và các đặc điểm sinh hóa bước đầu đã định danh được 10 chủng vi
khuẩn phân lập thuộc chi Bacillus trên cơ sở hệ thống phân loại của Bergey.
- Đã xác định được hoạt độ phân giải protease của các chủng vi khuẩn trên
bằng phương pháp Amano thu được các chủng M2, M5, M4, V2, V3 có hoạt độ
phân giải hơn các chủng còn lại. Hoạt độ phân giải protease của hầu hết các chủng
vi khuẩn phân lập được đều tăng theo thời gian nuôi cấy, kết quả cho cao nhất khi
nuôi cấy trong 72 giờ
- Tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease, cụ thể
là khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ. Kết quả khảo sát cho thấy ở pH=7 các
chủng vi khuẩn cho hoạt độ phân giải protease cao nhất, vượt quá nhiệt độ này hoạt
độ phân giải giảm. Và nhiệt độ tối ưu cho hoạt độ phân giải protease là 500
C.
4.2 Kiến nghị
- Do thời gian tiến hành thí nghiệm có hạn nên đề tài chỉ mới dừng lại ở việc
phân lập các chủng vi khuẩn trong điều kiện nuôi cấy tĩnh. Một số hướng tiếp theo
mà đề tài có thể được nghiên cứu hoàn thiện hơn như:
- Tiếp tục phân lập thêm các chủng vi sinh vật mới có khả năng phân hủy
protein cao từ các nguồn nước thải khác như chế biến sữa, đường.
- Tiếp tục thực hiện các thí nghiệm tiếp theo để định danh chính xác hơn 10
chủng vi khuẩn phân lập được và có cơ sở khoa học trong việc giải thích hoạt tính.
- Cần nghiên cứu thêm ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt độ phân giải
của enzyme để xác định điểu kiện tối ưu nhất cho việc nuôi cấy tạo chế phẩm .
- Cần xác mật mật độ tế bào ở các thời điểm đo hoạt tính 24, 48, 72, 96 giờ
nhằm xác định mối tương quan giữa mật độ tế bào và hoạt độ phân giải protease.

62. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Vũ Ngọc Bội, Nghiên cứu quá trình thủy phân protease cá bằng enzyme
protease từ Bacillus subtilis S5, Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Khoa Học Tự
Nhiên thành phố HCM.
[2]. Đỗ Hồng Lan Chi, Lâm Minh Triết, Vi sinh môi trường . Nhà xuất bản Đại
học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh
[3]. Nguyễn Lân Dũng và cộng sự ,(1976) Một số phương pháp nghiên cứu vi
sinh vật, tập ІІ . Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, 1976
[4]. Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật
học, tập ІІІ. Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, 1978
[5]. Trần Liên Hà, Đặng Ngọc Sâm “Phân lập và tuyển chọn Bacillus để xử lý
nước hồ ô nhiễm” , Viện CNSH – CNTP, Trường đại học Bách Khoa Hà Nội
[6]. Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Thị Thùy Dương,(2003), Công nghệ xử lý
nước thải. Nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
[7]. Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, (2004), Công nghệ enzyme. Nhà xuất bản
Đại học quốc gia thành phố Hồ chí Minh.
[8]. Lương Đức Phẩm, Công nghệ xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học.
Nhà xuất bản Giáo dục.
[9]. Nguyễn Đức Lượng, (2006), Thí nghiệm vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại
học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh
[10]. Trần Linh Thước và cộng sự, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong
nước, thực phẩm, mỹ phẩm. Nhà xuất bản Giáo dục
[11]. S.Sharmin, Md Towhid Hossain and M.N. Anwar (2005), Isolation and
characterization of a Protease Producing bacteria Bacillus amovivorus and Op-
timization of Some Factors of culture Condition for Protease Production, Jomal
of Biologycal Scences 5.
[12]. Do Thi Bich Thuy, Tran Thi Xo, Production, purification and application
of protease from Bacillus subtilis, Joumal of Agricultural Science and Technol-
ogy

63. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền
Trang 62
PHỤ LỤC
1. Bảng hệ thống phân loại của Bergey (1989)
Thể mang bào tử không phình lên rõ rệt. Bào tử hình elip, hình viên trụ tròn đầu.
Bào tử có màng mỏng, gram dương.
A Nguyên sinh chất của tế bào còn non khi phát triển trên thạch glucose có
không bào nếu nhuộm nhạt. Đường kính của thể sinh dưỡng là 0,9µm hay lớn hơn.
1- Tạo thành acid từ manitol, không tạo thành acetylmethyl carbinol
B.megaterium
2- Không tạo thành acid từ manitol, tạo thành acetylmethyl carbinol
a- Hoại sinh một vài nòi gây bệnh nhẹ
b- Khi phát triển trên thạch không có dạng rễ cây, thường di động
B.cereus
bb- Khi phát triển trên thạch có dạng rễ cây, thường không di động
B.cereus var mycodes
aa - Gây bệnh
b- Gây bệnh than, không di động
B.anthracsis
bb- Gây bệnh ở một số côn trùng, thường di dộng
B.thuringiensis
B Nguyên sinh chất của tế bào còn non khi phát triển trên thạch glucose,
không có dạng không bào nếu nhuộm nhạt. Đường kính của thể sinh dưỡng nhỏ
hơn 0,9µm
1- Trên môi trường thạch glucose phát triển tốt hoặc tốt hơn trên môi
trường thạch khô đậu tương.
a- Phát triển được trên môi trường chứa 7% NaCl
b- Thủy phân tinh bột tạo thành nitrite từ nitrate
c- Trong môi trường canh thang glucose phát triển tốt trong điều
kiện kỵ khí pH của dịch nuôi cấy 5,2 hay thấp hơn. Tạo thành
khí từ nitrate dưới điều kiện kỵ khí, kiềm tính