Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ
: https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
HOẶC
https://www.facebook.com/garmentspace/
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Thử nghiệm quy trình sản xuất sinh khối bào tử vi nấm phân hủy cellulose và protein
1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
THỬ NGHIỆM QUY TRÌNH SẢN XUẤT SINH KHỐI
BÀO TỬ VI NẤM PHÂN HUỶ CELLULOSE VÀ
PROTEIN
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : Ts. Nguyễn Hoài Hương
Sinh viên thực hiện : Kha Tôn Huy
MSSV: 1191111022 Lớp: 11HSH02
TP. Hồ Chí Minh, 2013
2. 1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Trong những năm gần đây, cùng với xu hướng phát triển một nền nông nghiệp
sạch và bền vững, các loại phân bón bảo vệ thực vật hữu cơ hoặc có nguồn gốc sinh
học được đề cao, tập trung nghiên cứu và phát triển. Trong đó, phổ biến và hiệu quả
nhất là việc sử dụng chế phẩm sinh học có chứa vi nấm Trichoderma sp., là loại vi
nấm có tác dụng cao trong việc thúc đẩy quá trình phân huỷ chất hữu cơ,
Ngày nay, theo sự phát triển của khoa học, công nghệ sinh học, việc sử dụng
chế phẩm Trichoderma sp. ủ phân hữu cơ để bón cho cây trồng sẽ giúp tăng cường
hệ vi sinh vật có ích trong đất, phân giải nhanh các chất hữu cơ thành dạng dễ tiêu,
phân huỷ cellulose thành các acid mùn, cung cấp dinh dưỡng cho cây, phòng một số
bệnh hại cho cây trồng, chất lượng phân được cao hơn.
Các chế phẩm sinh học chứa nấm Trichoderma sp. này còn là chế phẩm sạch,
tạo ra các sản phẩm cây trồng an toàn cho người tiêu dùng, không làm mất đi quần
thể thiên địch có ích trong tự nhiên, không gây ảnh hưởng đến sức khoẻ con người.
Vì những lý do trên, nên em chọn đề tài: “Thử nghiệm quy trình sản xuất sinh
khối bào tử vi nấm phân huỷ cellulose và protein”.
2. Mục đích nghiên cứu
Sản xuất sinh khối bào tử vi nấm Trichoderma sp. và Aspergillus sp. SD4.
3. Mục tiêu nghiên cứu
Thử nghiệm quy trình lên men thể rắn thu bào tử vi nấm Trichoderma sp. và
Aspergillus sp. SD4 phân huỷ cellulose và protein.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào.
Xác định độ ẩm nguyên liệu.
4. 3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về ủ compost
1.1.1. Khái niệm khoa học về ủ compost
Hình 1.1. Chu trình ủ compost.
Ủ compost được hiểu là quá trình phân hủy sinh học hiếu khí các chất thải hữu
cơ được biến đổi thành các chất mùn ổn định do hoạt động của các tổ chức có thể
sống trong điều kiện tự nhiên hiện diện trong chất thải. Các tổ chức này bao gồm các
loại vi sinh vật, như vi khuẩn, nấm, chất thải hữu cơ được phân huỷ ban đầu từ sinh
5. 4
vật tiêu thụ bậc một như vi khuẩn, nấm. Quá trình diễn ra chủ yếu giống như phân
hủy trong tự nhiên, nhưng được tăng cường và tăng tốc bởi tối ưu hóa các điều kiện
môi trường cho hoạt động của vi sinh vật.
Lịch sử quá trình ủ compost đã có từ rất lâu, ngay từ khi khai sinh của nông
nghiệp hàng nghìn năm trước Công nguyên, ghi nhận tại Ai Cập từ 3000 năm trước
Công nguyên như là một quá trình xử lý chất thải nông nghiệp đầu tiên trên thế giới.
Người Trung Quốc đã ủ chất thải từ cách đây 4000 năm, người Nhật đã sử dụng
compost làm phân bón trong nông nghiệp từ nhiều thế kỷ. Tuy nhiên đến năm 1943,
quá trình ủ compost mới được nghiên cứu một cách khoa học và báo cáo bởi Giáo sư
người Anh, Sir Albert Howard thực hiện tại Ấn Độ. Đến nay đã có nhiều tài liệu viết
về quá trình ủ compost và nhiều mô hình công nghệ ủ compost quy mô lớn được phát
triển trên thế giới. Compost là sản phẩm giàu chất hữu cơ và có hệ vi sinh vật dị
dưỡng phong phú, ngoài ra còn chứa các nguyên tố vi lượng có lợi cho đất và cây
trồng. Sản phẩm compost được sử dụng chủ yếu làm phân bón hữu cơ trong nông
nghiệp hay các mục đích cải tạo đất và cung cấp dinh dưỡng cây trồng. Ngoài ra,
compost còn được biết đến trong nhiều ứng dụng, như là các sản phẩm sinh học trong
việc xử lý ô nhiễm môi trường, hay các sản phẩm dinh dưỡng, chữa bệnh cho vật nuôi
và cây trồng.
Phương pháp ứng dụng vi sinh vật rất quan trọng trong quá trình ủ compost.
Thực tế, hệ vi sinh vật cần thiết cho quá trình ủ compost đã có sẵn trong vật liệu hữu
cơ, tự thích nghi và phát triển theo từng giai đoạn của quá trình ủ compost. Các thành
phần bổ sung thông thường có thể là sản phẩm sau ủ compost hay các thành phần
giúp điều chỉnh dinh dưỡng (C/N). Việc bổ sung các chế phẩm có bản chất là vi sinh
vật ngoại lai hay enzyme là không cần thiết mà vẫn có thể ủ compost thành công.
Kiểm soát tốt các điều kiện môi trường ảnh hưởng tới hoạt động của vi sinh vật chính
là nhân tố quyết định sự thành công của quá trình ủ compost. Kiểm soát tốt quá trình
ủ compost cũng giúp giảm phát sinh mùi ô nhiễm và loại bỏ các mầm vi sinh vật gây
bệnh. Vì vậy các giải pháp kỹ thuật trong công nghệ ủ compost hiện đại đều hướng
6. 5
tới mục tiêu kiểm soát tối ưu các điều kiện môi trường cùng với khả năng vận hành
thuận tiện.
Đặc điểm cần lưu ý đối với ủ compost từ chất thải rắn đô thị là phân loại để loại
bỏ các kim loại nặng hay các hóa chất độc hại khác vì chúng cản trở quá trình chuyển
hóa và có nguy cơ gây ô nhiễm cho sản phẩm compost.
1.1.2. Mục đích của quá trình compost
Ổn định chất thải: các phản ứng sinh học xảy ra trong quá trình compost sẽ
chuyển hoá các chất hữu cơ dễ thối rửa sang dạng ổn định chủ yếu là các chất vô cơ
ít gây ô nhiễm môi trường khi thải ra đất hoặc nước.
Làm mất hoạt tính vi sinh vật: nhiệt của chất thải sinh ra từ quá trình phân huỷ
sinh học có thể đạt khoảng 50-60o
C, đủ để làm mất hoạt tính của vi khuẩn gây bệnh,
virus có hại nếu như nhiệt độ này được duy trì ít nhất 3 ngày. Do đó, các sản phẩm
của quá trình compost có thể loại bỏ an toàn trên đất sử dụng làm chất bổ sung dinh
dưỡng cho đất.
Thu hồi dinh dưỡng và cải tạo đất: các chất dinh dưỡng (N, P, K) có trong chất
thải ở dạng hữu cơ phức tạp, cây trồng khó hấp thụ. Sau quá trình compost các chất
này được chuyển hoá thành các chất vô cơ như NO3
-
và PO4 thích hợp cho cây trồng.
Sử dụng sản phẩm của quá trình chế biến compost bổ sung dinh dưỡng vô cơ tồn tại
chủ yếu ở dạng không tan. Thêm vào đó, lớp đất trồng cũng được cải tiến nên giúp rễ
cây phát triển tốt hơn.
Tăng khả năng kháng bệnh cho cây trồng: đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới
chứng minh cho khả năng kháng bệnh của cây được trồng trong đất có bón compost.
Cho đến nay, ở Việt Nam compost chưa được ứng dụng rộng rãi trong nộng nghiệp.
Với hàm lượng dinh dưỡng cao dễ hấp thụ và chũng loại vi sinh vật đa dạng, phân
hữu cơ không những làm tăng năng suất cây trồng mà còn có khả năng kháng bệnh
cao.
7. 6
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến ủ compost
Hiệu quả của quá trình ủ compost phụ thuộc vào nhóm các tổ chức cư ngụ và
làm ổn định trong chất thải hữu cơ. Do đó quá trình ủ sẽ không đạt kết quả mong
muốn mà nguyên nhân chính là do sự mất cân bằng về thành phần hoá học và điều
kiện lý học trong quá trình ủ. Chính vì vậy cần chú ý đến các yếu tố ảnh hưởng đến
quá trình ủ compost như nhiệt độ, độ ẩm, pH, vi sinh vật, oxy, tỷ lệ C/N và các cấu
trúc chất thải.
1.1.3.1. Các yếu tố vật lý
Các yếu tố vật lý ảnh hưởng đến quá trình ủ gồm: nhiệt độ, độ ẩm, kích thước
nguyên liệu, độ rỗng, thổi khí.
a. Nhiệt độ
Nhiệt độ là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính của vi sinh vật trong
quá trình chế biến phân hữu cơ và cũng là một trong các thông số giám sát và điều
khiển quá trình ủ CTR. Trong luống ủ, nhiệt độ cần duy trì là 55-65o
C , vì ở nhiệt độ
này, quá trình chế biến phân vẫn hiểu quả và mầm bệnh bị tiêu diệt. Khi nhiệt độ tăng
lên ngưỡng này sẽ ức chế hoạt động của VSV. Ở nhiệt độ thấp hơn, phân hữu cơ
không đạt tiêu chuẩn về mầm bệnh. Nhiệt độ trong luống ủ có thể điều chỉnh bằng
nhiều cách khác nhau như hiệu chỉnh tốc độ thổi khí và độ ẩm, cô lập khối ủ với môi
trường bên ngoài bằng cách che phủ hợp lý.
b. Độ ẩm
Độ ẩm là một yếu tố cần thiết cho hoạt động của VSV trong quá trình chế biến
phân hữu cơ. Vì nước cần thiết cho quá trình hoà tan chất dinh dưỡng vào nguyên
sinh chất của tế bào.
Độ ẩm tối ưu cho quá trình ủ phân CTR nằm trong khoảng 50-60o
C. Các VSV
đóng vai trò quyết định trong quá trình phân huỷ CTR thường tập trung tại lớp nước
mỏng trên bề mặt của phân tử CTR. Nếu độ ẩm quá nhỏ (<30%) sẽ hạn chế hoạt động
8. 7
của VSV, còn khi độ ẩm quá lớn (>65%) thì quá trình phân huỷ sẽ chậm lại, sẽ chuyển
sang chế độ phân huỷ kỵ khí vì quá trình thổi khí bị cản trở do hiện tưởng bít kín các
khe rỗng không cho không khí đi qua, gây mùi hôi, rò rĩ chất dinh dưỡng và lan truyền
VSV gây bệnh.
Độ ẩm ảnh hưởng đến quá trình thay đổi nhiệt độ trong quá trình ủ vì nước có
nhiệt dung riêng cao hơn tất cả các vật liệu khác.
Trong trường hợp độ ẩm của khối ủ thấp, có thể điều chỉnh bằng cách thêm
nước vào. Còn khi độ ẩm của khối ủ cao có thể điều chỉnh bằng cách trộn với vật liệu
độn có độ ẩm thấp hơn như mạt cưa, rơm rạ…
Độ ẩm của phân bắc, bùn, phân động vật thường cao hơn giá trị tối ưu, do đó
cần bổ sung thêm các chất phụ gia để giảm độ ẩm đến giá trị cần thiết. Đối với hệ
thống làm compost vận hành liên tục, độ ẩm có thể được khống chế bằng cách tuần
hoàn sản phẩm compost.
c. Kích thước nguyên liệu
Kích thước nguyên liệu ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ phân huỷ. Quá trình phân
huỷ hiếu khí xảy ra trên bề mặt hạt, hạt có kích thước nhỏ sẽ có tổng diện tích bề mặt
lớn nên sẽ tăng sự tiếp xúc với oxy, gia tăng vận tốc phân huỷ. Tuy nhiên, nếu kích
thước hạt quá nhỏ và hạn chế sự lưu thông khí trong đống ủ, điều này sẽ làm giảm
oxy cần thiết cho các VSV trong đống ủ và giảm mức độ hoạt động của VSV. Ngược
lại, hạt có kích thước quá lớn sẽ có độ xốp cao và tạo ra các rãnh khí làm cho sự phân
bố khí không đều, không có lợi cho quá trình chế biến phân hữu cơ.
Đường kính hạt tối ưu cho quá trình chế biến khoảng 3-50mm. Kích thước hạt
tối ưu có thể đạt được bằng nhiều cách như cắt, nghiền và sàng vật liệu thô ban đầu.
9. 8
d. Độ rỗng
Độ rỗng của khối vật liệu ủ là một yếu tố quan trọng trong quá trình chế biến
phân hữu cơ. Độ rỗng tối ưu sẽ thay đổi tuỳ loại vật liệu chế biến phân. Thông thường,
để quá trình chế biến diễn ra tốt khoảng 35-60%, tối ưu là 32-36%.
Độ rỗng của CRT ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình cung cấp oxy cần thiết cho
sự trao đổi chất, hô hấp của VSV hiếu khí và sự oxy hoá các phân tử hữu cơ hiện diện
trong lớp vật liệu ủ. Độ rỗng thấp sẽ hạn chế sự vận chuyển oxy, nên hạn chế sự giải
phóng nhiệt và làm tăng nhiệt độ trong khối ủ. Ngược lại, độ rỗng cao có thể dẫn đến
nhiệt độ trong khối ủ thấp, mầm bệnh không bị tiêu diệt.
Độ rỗng có thể được điều chỉnh bằng cách sử dụng vật liệu cấu trúc với tỷ lệ
trộn hợp lý.
e. Thổi khí
Khối ủ được cung cấp không khí từ môi trường xung quanh để VSV sử dụng
cho sự phân huỷ chất hữu cơ, cũng như làm bay hơi nước và giải phóng nhiệt. Nếu
khí không được cung cấp đầy đủ thì trong khối ủ có thể có những vùng kỵ khí, gây
mùi môi.
Lượng khí cung cấp cho khối phân hữu cơ có thể được thực hiện bằng cách: đảo
trộn, sử dụng ống khí, đổ chất thải từ tầng lưu chất trên cao xuống thấp, thổi khí.
Quá trình đảo trộn cung cấp khí không đủ theo cân bằng tỷ lệ. Điều kiện hiếu
khí chỉ thoả mãn đối với lớp trên cùng, các lớp bên trong hoạt động trong môi trường
tuỳ tiện hoặc kỵ khí. Do đó, tốc độ phân huỷ giảm và thời gian cần thiết để quá trình
ủ phân hoàn tất bị kéo dài.
Cấp khí bằng phương pháp thổi khí đạt hiệu quả phân huỷ cao nhất. Tuy nhiên,
lưu lượng khí phải khống chế thích hợp. Nếu cấp quá nhiều khí sẽ dẫn đến chi phí
quá cao và gây mất nhiệt của khối phân, kéo theo sản phẩm không đảm bảo an toàn
vì có thể chứa VSV gây bệnh. Khi pH của môi trường trong khối phân lớn hơn 7,
10. 9
cùng với quá trình thổi khí sẽ làm thất thoát nito dưới dạng NH3. Trái lại, nếu thổi khí
ít quá môi trường bên trong khối phân trở thành kỵ khí. Vận tốc thổi khí cho quá trình
ủ compost thường trong khoảng 5-10m3
khí/ tấn nguyên liệu/ giờ.
1.1.3.2. Các yếu tố hoá sinh
a. Tỷ lệ C/N
Có rất nhiều nguyên tố ảnh hưởng đến quá trình phân huỷ do VSV, trong đó C
và N là cần thiết nhất, tỷ lệ C/N là thông số dinh dưỡng quan trọng nhất, quan trọng
kế tiếp là nguyên tố photpho, lưu huỳnh, canxi. Các nguyên tố vi lượng khác cũng
đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất tế bào.
Khoảng 20-40% của chất thải hữu cơ cần thiết cho quá trình đồng hoá thành tế
bào mới, phần còn lại chuyển hoá thành CO2, C cung cấp năng lượng và sinh khối cơ
bản để tạo ra khoảng 50% khối lượng tế bào VSV. N là thành phần chủ yếu của
protein, axit nucleic, axit amin, enzyme, co-enzyme cần thiết cho sự phát triển và hoạt
động của tế bào.
Tỷ lệ C/N tối ưu cho quá trình ủ phân khoảng 30:1. Ở tỷ lệ thấp hơn, N sẽ thừa
và sinh ra khí NH3 gây ra mùi khai. Ở mức tỷ lệ cao hơn hạn chế sự phất triển của
VSV do thiếu N. Chúng phải trải qua nhiều chu kỳ chuyển hoá, oxy hoá phần dư C
cho đến khi đạt tỷ lệ C/N thích hợp. Do đó, thời gian cần thiết cho quá trình làm phân
bị kéo dài hơn và sản phầm thu được chứa ít mùn hơn. Theo nghiên cứu cho thấy nếu
tỷ lệ C/N ban đầu là 20, thời gian cần thiết cho quá trình làm phân là 12 ngày, nếu tỷ
lệ này dao động trong khoảng 20-50, thời gian cần thiết là 14 ngày và nếu tỷ lệ C/N
là 78, thời gian cần thiết sẽ là 21 ngày. Mặc dù vậy, tỷ lệ này cũng có thể được hiệu
chỉnh theo giá trị sinh học của vật liệu ủ, trong đó quan trọng nhất là cần quan tâm
tới các vật liệu ủ có hàm lượng lignin cao.
Khi bắt đầu quá trình ủ phân, tỷ lệ C/N là 30:1 và giảm dần còn 15:1 ở các sản
phẩm cuối cùng do 2/3 C được giải phóng tạo ra CO2 khi các hợp chất này bị phân
huỷ bởi VSV.
11. 10
Trong thực tế, việc tính toán và hiệu chỉnh chính xác tỷ lệ C/N tối ưu gặp phải
khó khăn vì những lý do sau:
-Một phần các chất như cellulose và lignin khó bị phân huỷ sinh học, chỉ bị
phân huỷ sau một khoảng thời gian dài.
-Một số chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV không sẵn có.
b. Oxy
Oxy cũng là một trong những thành phần cần thiết cho quá trình ủ phân. Khi
VSV oxy hoá C tạo năng lượng, oxy sẽ được sử dụng và khí CO2 được sinh ra, khi
không có đủ oxy thì sẽ trở thành quá trình yếm khí và tạo mùi hôi như mùi trứng gà
thối của khí H2S.
Các VSV hiếu khí có thể sống được ở nồng độ oxy bằng 5%. Nồng độ oxy lớn
hơn 10% được coi là tối ưu cho quá trình ủ phân hiếu khí.
Tổng lượng khí cần cung cấp và do lưu lượng dòng khí là các thông số quan
trọng đối với hệ thống ủ phân trong thùng kín. Nhu cầu oxy thay đổi theo tiến trình ủ
gián đoạn, do đó cần xác định nhu cầu oxy tối đa để chọn máy thổi khí và thiết kế
ống phân phối khí phù hợp.
c. Dinh dưỡng
Ngoài một số nguyên tố đa lượng, quá trình chuyển hoá các chất hữu cơ nhờ
hoạt động VSV cũng cần một số nguyên tố vi lượng khác như P, K, Ca, Fe, Bo, Cu…
Thông thường, các chất dinh dưỡng này không có giới hạn bởi chúng có mặt nhiều
trong các vật liệu làm nguyên liệu cho quá trình ủ phân.
d. pH
Giá trị dinh dưỡng trong khoảng 5,5-8,5 là tối ưu cho các VSV trong quá trình
ủ phân. Các VSV, nấm, tiêu thụ các hợp chất hữu cơ và thải ra các axit hữu cơ. Trong
giai đoạn đầu của quá trình ủ phân, các axit này bị tích tụ và kết quả làm giảm pH,
kìm hãm sự phát triển của nấm và VSV, kìm hãm sự phân huỷ của lignin và cellulose.
12. 11
Các axit hữu cơ sẽ tiếp tục bị phân huỷ trong quá trình ủ phân. Nếu hệ thống trở nên
yếm khí, việc tích tụ các axit có thể làm pH giảm xuống đến 4,5 và gây ảnh hưởng
nghiêm trọng đến hoạt động của VSV.
1.1.4. Chất lượng của compost
Chất lượng của compost được đánh giá dựa trên bốn yếu tố sau đây:
- Mức độ lẫn tạp chất (thuỷ tinh, plastic, đá, kim loại nặng, chất thải hoá học,
thuốc trừ sâu…).
- Nồng độ các chất dinh dưỡng (dinh dưỡng đa lượng N, P, K, dinh dưỡng
trung lượng Ca, Mg, S, dinh dưỡng vi lượng Fe, Zn, Cu, Mn, Mo, Co, Bo).
- Mật độ VSV gây bệnh ( thấp đến mức không ảnh hưởng đến cây trồng).
- Độ ổn định (độ chín) và hàm lượng chất hữu cơ ( độ ổn định liên quan đến
nhiệt độ, độ ẩm và nồng độ oxy trong quá trình chế biến phân hữu cơ, độ ỏn định
thường tỷ lệ nghịch với hàm lượng chất hữu cơ, khi thời gian ủ phân kéo dài, độ ổn
định của phân sẽ tăng, tức là hàm lượng hữu cơ trong phân giảm).
1.1.5. Tính cấp thiết của compost
Cải tạo cơ cấu.
Quân bình độ pH trong đất.
Tạo ra sự màu mỡ trong đất.
Duy trì độ ẩm cho đất.
Tạo ra môi trường tốt cho VSV có lợi sống trong đất.
1.1.6. Những lợi ích và hạn chế của quá trình làm compost
1.1.6.1. Lợi ích của quá trình làm compost
13. 12
Ổn định chất thải rắn: các phản ứng sinh học xảy ra trong quá trình làm phân
hữu cơ sẽ chuyển hoá chất hữu cơ dễ thối rữa sang dạng ổn định, chủ yếu là các chất
vô cơ ít gây ô nhiễm môi trường khí thải và nước.
Làm mất hoạt tính VSV gây bệnh: Nhiệt độ của chất thải sinh ra từ quá trình
phân huỷ sinh vật có thể đạt đến 60o
C, đủ để làm mất hoạt tính của VSV gây bệnh,
virus và trứng giun sán nếu nhiệt độ này duy trì ít nhất một ngày. Do đó, sản phẩm
của quá trình làm phân hữu cơ có thể thải bỏ trên đất hoặc sử dụng làm chất bổ sung
dinh dưỡng cho đất.
Thu hồi dinh dưỡng và cải tạo đất: các chất dinh dưỡng (N. P, K) có trong chất
thải ở dạng hữu cơ phức tạp, cây trồng khó hấp thụ. Sau quá trình làm phân hữu cơ,
các chất này được chuyển hoá thành các chất vô cơ như NO3
-
, PO4
3-
thích hợp cho
cây trồng. Sử dụng sản phẩm của quá trình chế biến phân từ CTR hữu cơ bổ sung
dinh dưỡng cho đất, có khả nặng làm giảm sự thất thoát dinh dưỡng do rò rĩ các chất
dinh dưỡng vô cơ tồn tại chủ yếu dưới dạng không tan. Thêm vào đó, lớp đất trồng
cũng được cải tiến nên giúp rễ cây phát triển tốt hơn.
Làm khô bùn: phân người, phân động vật và bùn chứa khoảng 80-95% nước,
do đó chi phí thu gom, vận chuyển và thải bỏ cao. Làm khô bùn trong quá trình ủ
phân là phương pháp lợi dụng nhiệt của chất thải sinh ra từ quá trình phân huỷ sinh
học làm bay hơi nước chứa trong bùn.
Tăng khả năng kháng bệnh cho cây trồng: với hàm lượng dinh dưỡng cao, dễ
hấp thụ và chủng loại VSV đa dạng, phân hữu cơ không những làm tăng năng suất
cây trồng mà còn làm giảm thiểu bệnh trên cây trồng. Đối với các loại phân hoá học
khác cây trồng chỉ hấp thụ được một phần chất dinh dưỡng nhưng đối với phân hữu
cơ cây trồng có khả năng hấp thụ hầu hết các chất dinh dưỡng, đồng thời cây trồng
phát triển tốt và có khả năng kháng bệnh cao.
14. 13
1.1.6.2. Hạn chế của quá trình làm compost
Hàm lượng chất dinh dưỡng trong phân hữu cơ không thoã mãn yêu cầu.
Do đặc tính của chất hữu cơ có thể thay đổi rất nhiều theo thời gian, khí hậu và
phương pháp thực hiện, nên tính chất của sản phẩm cũng khác nhau. Bản chất vật liệu
làm phân thường làm cho sự phân bố nhiệt độ trong đống phân không đồng đều. Do
đó khả năng làm mất hoạt tính của VSV gây bệnh trong phân cũng không hoàn toàn.
Quá trình làm phân hữu cơ thường tạo mùi hôi, gây mất mỹ quan...
1.2. Vai trò của giống khởi động trong ủ compost
1.2.1. Trichoderma spp
1.2.1.1. Giới thiệu
a. Phân loại
Hình 1.2. Nấm Trichoderma spp.
23. 22
b. Hình thái
Giống Aspergillus do Michelli mô tả lần đầu tiên vào năm 1729. Năm 1901
Wehmer đã cho ra đời một chuyên luận phân loại giống nấm bất toàn này.
Hình thái Aspergillus có khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, bào tử đính không
nằm trong bọc bào tử, cuống sinh thể bình phình ra rõ rệt ở đầu tạo thành bọng lớn
hình cầu 5-6 x 20-30 µm, đôi khi 6-10 x 60-70 µm, màu đen.
Thể bình gồm hai lớp, lớp thứ nhất hình tam giác cân ngược, lớp thứ hai hình
chai, bào tử đính xoè ra, có hình cầu xù xì, có gai nhọn, có màu nâu đen đến đen than,
đường kính 4-5 µm.
c. Đặc điểm sinh học
Aspergillus sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu 6-8o
C và tối đa 45-47o
C; tối
ưu 28-35o
C, trong môi trường có độ ẩm tối thiểu là 23%. Độ ẩm môi trường thích
hợp để lên men bán rắn là 60-65%; nó chỉ sinh trưởng và phát triển khi có mặt O2 ở
pH tối ưu là 4-6,5; tuy nhiên, theo Patt (1981) cũng có những chủng sinh trưởng được
ở pH 2. Sự thay đổi pH môi trường nuôi cấy từ 3 đến 6,5 làm thay đổi đáng kể hình
thái của Aspergillus.
d. Đặc điểm sinh hoá
Khả năng lên men đường: Aspergillus có khả năng đồng hoá tốt các loại đường
đơn và đôi như glucose, fructose, maltose, xylose, manose, saccharose.
Khả năng tổng hợp enzyme:
+α-amylase: có khả năng tổng hợp α-amylase ngoại bào để thuỷ phân nhanh
tinh bột tạo dextrin và một ít maltose và glucose.
+Protease: Theo Lương Đức Phâm, Aspergillus có khả năng tạo hai loại
protease. Loại thứ nhất phân giải protein thành polypeptid, pepton, còn loại thứ hai
tiếp tục chuyển hoá cản sản phẩm trên thành acid amin. pH và nhiệt độ tối thích cho
hoạt động của chúng tương ứng là 3 – 4 và 50o
C.
24. 23
+Cellulase: là một phức hợp enzyme, chủ yếu là cellulase C1, cellulase Cx
và β-glucosidase hay cellobiase. Cellulase có tác dụng thuỷ phân cellulase thành
cellbiose rồi thành glucose.
+Pectinase: Aspergillus có khả năng tạo pectinase ở nhiệt độ tối thích 25o
C
và pH 5,6. Tuy nhiên enzyme thể hiện hoạt tính trong khoảng pH 2,5-6,8.
1.2.2.2. Vai trò giống khởi động
Từ lâu, người ta đã dùng một số loại như Aspergillus niger để sản xuất các chế
phẩm sinh học như acid hữu cơ, các loại enzyme, các chế phẩm giàu protein…, phục
vụ phát triển công nghệ thực phẩm, dược phẩm chăn nuôi…
Trong đó enzyme là nhân tố quan trọng giúp Aspergillus có khả năng đối kháng
dễ dàng lên cơ chất cũng như khả năng tấn công trực tiếp lên nấm bệnh.
Các loại enzyme do Aspergillus sp. tiết ra là:
Amylase.
Glucoamylase.
Pectinase.
Protease.
Celullase
Chitinase…
Do vách tế bào hầu hết các loài nấm đều được cấu tạo bởi chitin và glucan nên
tác động đồng thời của 2 loại enzyme này sẽ làm tăng khả năng đối kháng của nấm
Aspergillus spp (Margolles Clark và ctv., 1995).
25. 24
1.3. Quy trình sản xuất bào tử nấm làm giống khởi động
1.3.1. Giới thiệu các quy trình và phân tích ưu nhược điểm
Để sản xuất chế phẩm bào tử quy mô công nghiệp, người ta có thể áp dụng các
hai phương pháp lên men thể rắn, lên men thể lỏng và lên men bề mặt.
Ưu nhược điểm của lên men thể rắn.
Ưu điểm:
Sản xuất được ở quy mô nhỏ đến trung bình.
Ít tốn chi phí lao động.
Khối lượng nấm thu được cao.
Tận dụng được nguồn nguyên liệu rẻ.
Nhược điểm:
Không sản xuất được trên quy mô công nghiệp lớn.
Ưu nhược điểm của lên men thể lỏng.
Ưu điểm:
Kiểm soát được quá trình lên men.
Tiết kiệm được nguồn nguyên liệu.
Sử dụng các loại máy móc thiết bị như bơm, ống dẫn có khả năng sản xuất
với quy mô công nghiệp lớn.
Nhược điểm:
Khối lượng nấm thu được ít.
Tốn nguồn lao động.
26. 25
Kết hợp lên men xốp và lên men thể lỏng: giai đoạn nhân giống quy mô nhỏ
thực hiện nhờ lên men thể lỏng, lên men chính áp dụng lên men rắn.
Lên men bề mặt không vô trùng tạo chế phẩm: phương pháp lên men bề mặt
không vô trùng tạo chế phẩm nấm đã được thực hiện bởi Evlacchova (1968). Môi
trường dinh dưỡng được nấu sôi ở 100o
C, và khi nguội cho thêm chất kháng sinh
Streptomycine (0,01%) để ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình lên
men. Tuy nhiên với phương pháp này bào tử chỉ phát triển trên bề mặt chất lỏng, nên
hiệu quả sử dụng thiết bị kém, khó tăng quy mô sản xuất.
1.3.2. Sản xuất bào tử bằng phương pháp lên men bề mặt hay lên men xốp
Lên men xốp được gọi là lên men xốp là do đặc tính xốp của môi trường nuôi
cấy để thông khí và độ ẩm vừa đủ để nấm phát triển. Phương pháp lên men xốp tạo
chế phẩm nấm là phương pháp được áp dụng rộng rãi nhất vì đây là quá trình lên men
đơn giản, dễ thành công hơn các quy trình khác. Dưới đây là sơ đồ công nghệ tổng
quát quy trình sản xuất bào tử bằng lên men xốp.
35. 34
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2.1.1. Các chủng nấm dùng trong nghiên cứu
Chủng nấm Trichoderma sp. và Aspergillus sp. SD4 được phòng thí nghiệm
cung cấp.
2.1.2. Thành phần môi trường nuôi cấy nấm trong phòng thí nghiệm và lên
men xốp
D-glucose.
Agar.
Khoai tây.
Cám gạo.
Trấu.
Các khoáng thông dụng.
2.1.3. Bình tam giác để lên men thể rắn
Bình tam giác thể tích 250 ml, nút bông.
2.2. Dụng cụ và thiết bị
2.2.1. Dụng cụ
Các dụng cụ thuỷ tinh thông dụng dùng cho phân tích của phòng thí nghiệm.
2.2.2. Thiết bị
Tủ sấy MEMMERT, Germany.
Tủ cấy ESCO AIRS TREAM, Indonesia.
Nồi hấp HL-340 SPEEDS AUTOCLAVE.
2.3. Phương pháp
-Mục đích: sản xuất sinh khối bào tử vi nấm Trichoderma sp. và Aspergillus sp
SD4.
36. 35
-Mục tiêu: thử nghiệm quy trình lên men thể rắn thu bào tử vi nấm Trichoderma
sp. và Aspergillus sp. SD4 phân huỷ cellulose và protein.
-Nội dung như sau:
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm.
2.3.1. Nuôi cấy và quan sát hình thái của nấm
2.3.1.1. Quan sát hình thái đại thể
Dùng que cấy móc vô trùng gạt nhẹ lên bào tử đính của nấm sợi chuyển sang
đĩa petri chưa môi trường PGA, cắm đầu que xuống mặt thạch 1-3 điểm. Quan sát
khuẩn lạc của nấm sợi (hình dạng, màu sắc) ở mặt trên và mặt dưới của khuẩn lạc.
2.3.1.2. Quan sát hình thái vi thể (phương pháp phòng ẩm)
-Nguyên tắc:
Sử dụng thuốc nhuộm có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợp
với các thành phần khác của tế bào thành những hợp chất màu đặc trưng bền vững.
Khảo sát hình thái và hoạt tính enzyme ngoại bào tử
của vi nấm
Thử nghiệm quy trình lên men thể rắn thu bào tử vi
nấm Trichoderma sp. và Aspergillus sp. SD4
Kiểm tra chất lượng bào tử thu được bằng phương
pháp lên men xốp
Thí nghiệm kiểm tra khả năng nảy mầm
37. 36
Thường để quan sát hình thái cấu trúc sợi nấm và các cơ quan sinh sản của nấm ở
trạng thái tự nhiên có thể làm phương pháp phòng ẩm.
-Cách thực hiện:
Dùng kẹp đặt giấy lọc vô trùng có đường kính 9cm vào đĩa petri đã hấp
khử trùng.
Đặt thanh thủy tinh hình chữ U vô trùng lên trên giấy lọc
Đổ 4ml nước cất vô trùng lên giấy lọc để tạo độ ẩm
Dùng kẹp đặt lame lên thanh chữ U
Dùng dao mổ vô trùng cắt một miếng thạch hình vuông khoảng 5mm từ
đĩa thạch.
Cấy bào tử nấm mốc lên cả mặt trên và đáy của miếng thạch. Đặt miếng
thạch lên lame sao cho có một mặt cấy bào tử được đặt xuống mặt lame.
Đậy lamel lên bề mặt khối thạch.
Đậy nắp đĩa petri và ủ ở nhiệt độ phòng trong 48h.
Hình 2.2. Đĩa petri được thực hiện phương pháp phòng ẩm.
38. 37
2.3.2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme ngoại bào
2.3.2.1. Xác định hoạt tính cellulase ngoại bào
a. Môi trường
NaNO3 0,4 g
K2HPO4 0,2 g
MgSO4 0,1 g
KCl 0,1 g
CMC 1g (0,5%)
Peptone 0,04 g
Agar 2,5 g
Nước 200ml
b. Tiến hành
Pha 200ml môi trường CMC cho vào chai thuỷ tinh 200ml, rồi đậy kính nắp
đem hấp khử trùng với 6 đĩa petri sạch đã được gói kỹ.
Sau khi hấp khử trùng lấy ra chờ nguội, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn
cồn, ta lần lượt đổ môi trường vào 6 đĩa, sau đó chờ cho môi trường nguội và đặc lại.
Sau đó, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn cồn, lấy 6 đĩa môi trường CMC
tiến hành dùng que cấy nhọn đã khử trùng lấy 1 bào tử nấm phân lập được trong ống
nghiệm môi trường PDA, cấy bào tử vi nấm lên điểm giữa của đĩa môi trường. Bảo
quản ở nhiệt độ phòng, sau 2 ngày lấy ra quan sát.
39. 38
2.3.2.2. Xác định hoạt tính chitinase ngoại bào
a. Môi trường MSM (g/l)
MgSO4.7H20 0,2 g
K2HPO4 0,9 g
KCl 0,2 g
NH4NO3 1 g
FeSO4.7H2O 0,002 g
MnSO4 0,002 g
ZnSO4 0,002 g
Đệm phosphate 50mM pH 6.3.
Nguồn C phát hiện: Colloidiol chitin 0,5% + Glucose 0,5%.
b. Tiến hành
Pha 200ml môi trường MSM cho vào chai thuỷ tinh 200ml, rồi đậy kính nắp
đem hấp khử trùng với 6 đĩa petri sạch đã được gói kỹ.
Sau khi hấp khử trùng lấy ra chờ nguội, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn
cồn, ta lần lượt đổ môi trường vào 6 đĩa, sau đó chờ cho môi trường nguội và đặc lại.
Sau đó, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn cồn, lấy 6 đĩa môi trường MSM
tiến hành dùng que cấy nhọn đã khử trùng lấy 1 bào tử nấm phân lập được trong ống
nghiệm môi trường PDA, cấy bào tử vi nấm lên điểm giữa của đĩa môi trường.
2.3.2.3. Xác định hoạt tính amylase ngoại bào
a. Môi trường MSM (g/l)
MgSO4.7H20 0,2 g
K2HPO4 0,9 g
40. 39
KCl 0,2 g
NH4NO3 1 g
FeSO4.7H2O 0,002 g
MnSO4 0,002 g
ZnSO4 0,002 g
Đệm phosphate 50mM pH 6.3.
Nguồn C phát hiện: Tinh bột 0,5% + Glucose 0,5%.
b. Tiến hành
Pha 200ml môi trường MSM cho vào chai thuỷ tinh 200ml, rồi đậy kính nắp
đem hấp khử trùng với 6 đĩa petri sạch đã được gói kỹ.
Sau khi hấp khử trùng lấy ra chờ nguội, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn
cồn, ta lần lượt đổ môi trường vào 6 đĩa, sau đó chờ cho môi trường nguội và đặc lại.
Sau đó, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn cồn, lấy 6 đĩa môi trường MSM
tiến hành dùng que cấy nhọn đã khử trùng lấy 1 bào tử nấm phân lập được trong ống
nghiệm môi trường PDA, cấy bào tử vi nấm lên điểm giữa của đĩa môi trường.
2.3.2.4. Xác định hoạt tính protease ngoại bào
a. Môi trường MSM (g/l)
MgSO4.7H20 0,2 g
K2HPO4 0,9 g
KCl 0,2 g
NH4NO3 1 g
FeSO4.7H2O 0,002 g
MnSO4 0,002 g
41. 40
ZnSO4 0,002 g
Đệm phosphate 50mM pH 6.3.
Nguồn C phát hiện: Casein 0,5% + Glucose 0,5%.
b. Tiến hành
Pha 200ml môi trường MSM cho vào chai thuỷ tinh 200ml, rồi đậy kính nắp
đem hấp khử trùng với 6 đĩa petri sạch đã được gói kỹ.
Sau khi hấp khử trùng lấy ra chờ nguội, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn
cồn, ta lần lượt đổ môi trường vào 6 đĩa, sau đó chờ cho môi trường nguội và đặc lại.
Sau đó, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn cồn, lấy 6 đĩa môi trường MSM
tiến hành dùng que cấy nhọn đã khử trùng lấy 1 bào tử nấm phân lập được trong ống
nghiệm môi trường PDA, cấy bào tử vi nấm lên điểm giữa của đĩa môi trường.
2.3.2.5. Xác định hoạt tính pectinase ngoại bào
a. Môi trường
NaNO3 0,4 g
K2HPO4 0,2 g
MgSO4 0,1 g
KCl 0,1 g
Pectin 1g (0,5%)
Peptone 0,04 g
Agar 2,4 g
Nước 200ml
42. 41
b. Tiến hành
Pha 200ml môi trường Pectin cho vào chai thuỷ tinh 200ml, rồi đậy kính nắp
đem hấp khử trùng với 6 đĩa petri sạch đã được gói kỹ.
Sau khi hấp khử trùng lấy ra chờ nguội, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn
cồn, ta lần lượt đổ môi trường vào 6 đĩa, sau đó chờ cho môi trường nguội và đặc lại.
Sau đó, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn cồn, lấy 6 đĩa môi trường Pectin
tiến hành dùng que cấy nhọn đã khử trùng lấy 1 bào tử nấm phân lập được trong ống
nghiệm môi trường PDA, cấy bào tử vi nấm lên điểm giữa của đĩa môi trường. Bảo
quản ở nhiệt độ phòng, sau 2 ngày lấy ra quan sát.
2.3.3. Xác định độ ẩm nguyên liệu
2.3.3.1. Nguyên tắc
Dùng sức nóng làm bay hơi hết nước trong mẫu. Cân trọng lượng mẫu trước và
sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong mẫu.
2.3.3.2. Dụng cụ và vật liệu
Tủ điều chỉnh nhiệt độ (100o
C – 105o
C).
Cân phân tích.
Bình hút ẩm phía dưới để chất hút ẩm (CaCl2, Na2SO4 khan, H2SO4 đậm đặc
hoặc Silicagen…).
Cốc sứ.
43. 42
2.3.3.3. Cách tiến hành
Lấy cốc sứ và cốc đem cân, sau đó bỏ 10 g mẫu vào cốc cân.
Cho tất cả vào tủ sấy ở 100-103o
C, cho vào tủ sấy 6h.
Sấy xong, làm nguội trong bình hút ẩm (20-25 phút) và đem cân ở cân phân
tích.
Cho lại vào tủ sấy 100-103o
C trong 30 phút, lây ra làm nguội trong bình hút ẩm
(20 - 25 phút) và đem cân như trên tới khi trọng lượng không đổi. Kết quả giữa hai
lần cân liên tiếp không được cách nhau quá 0,5mg cho mỗi gam mẫu thử.
2.3.3.4. Tính kết quả
Độ ẩm theo phần trăm tính theo công thức:
m
m
m
m
X
1
100
).
2
1
(
Trong đó:
m: trọng lượng cốc và nắp (g).
m1: trọng lượng cốc có nắp và mẫu trước khi sấy (g).
m2: trọng lượng cốc có nắp và mẫu sau khi sấy (g).
Sai lệch giữa hai lần xác định song song không được lớn hơn 0,5%.
Kết quả cuối cùng là trung bình của 2 lần lặp lại song song.
44. 43
2.3.4. Quy trình lên men thu sinh khối bào tử
Hình 2.3. Quy trình lên men thu bào tử.
Giống thạch nghiêng
Nhân giống
Lên men thu sinh
khối bào tử
Đo mật độ quang
Khả năng nảy
mầm
45. 44
2.3.4.1. Môi trường nuôi cấy Trichoderma sp.
a. Môi trường PDA (potatoe D-gulocose agar)
Khoai tây 200 g
D-glucose 20 g
Agar 20 g
Nước cất 1000 ml
Kháng sinh chloramphenycol
Hấp khử trùng 121o
C trong 15 phút.
Cách tiến hành:
Khoai tây gọt vỏ, cắt vỏ và nấu chín. Chiết lấy dịch khoai tây. Cho agar vào
dich khoai tây từ từ và khuấy liên tục, sau đó cho D-glucose vào và tiếp tục khuấy,
cho thêm 1 ít kháng sinh chloramphenycol. Đổ vào ống nghiệm, đậy nút bông và khử
trùng ở 121o
C trong 15 phút. Để thạch nghiêng, chờ nguội, cấy giống.
b. Nhân giống
Giống gốc được giữ trong ống nghiệm sau đó tiến hành cấy truyền qua đĩa petri
môi trường PDA.
2.3.4.1. Môi trường lên men xốp
Cám gạo độ ẩm 72% 21 g
Trấu 9 g
MT Czapek 13,5 ml
46. 45
MT Czapek:
NaNO3 3 g
K2HPO4 1 g
MgSO4.7H2O 1 g
FeSO4.7H2O 0,1 g
Saccharose 30 g
KCl 0,5 g
Nước cất đủ 1000 ml
Hấp khử trùng 121o
C trong 15 phút.
Hình 2.4. Chuẩn bị môi trường trong bình tam giác có nút bông để lên men thể
rắn.
47. 46
a. Cách tiến hành
Tiến hành cân cám và trấu. Trộn đều cám và trấu với môi trường Czapek. Sau
đó cho vào bình tam giác và nhét nút bông, đem khử trùng ở 121o
C trong 15 phút.
b. Cấy giống
Giống bào tử trên đĩa petri sau 7 ngày ủ, được phân thành các cạnh bằng nhau
bằng cách kẻ dưới đáy các ô vuông có cạnh là 1 cm.
Trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn cồn, lấy 5 đĩa petri môi trường PDA tiến
hành dùng dao cắt vào môi trường theo các đường kẻ dưới đáy đĩa, nhẹ nhàng dùng
dao lấy từ 3-4 lát môi trường PDA đã có giống nấm Trichoderma sp. cấy vào bình
tam giác đã có môi trường, sau đó nhanh chóng dùng que thuỷ tinh đã khủ trùng trộn
nhẹ môi trường trong bình tam giác.
Ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng, nơi thoáng mát, không có ánh sáng trực tiếp, sau
12 ngày lấy ra quan sát và đo mật độ quang.
Hình 2.5. Bào tử Trichoderma sp. (trái) và Aspergillus sp.SD4 (phải) sau 12
ngày nuôi cấy.
49. 48
2.4. Nội dung nghiên cứu
2.4.1. Khảo sát hình thái và hoạt tính enzyme ngoại bào tử của vi nấm
Làm tương tự như phương pháp nêu ở mục 3.3.1.
2.4.2. Thử nghiệm quy trình lên men thể rắn thu bào tử vi nấm Trichoderma
sp. và Aspergillus sp. SD4
Ta thực hiện lên men thể rắn dựa vào quy trình sau đây:
Hình 2.7. Quy trình lên men thu bào tử.
Giống thạch nghiêng
Nhân giống
Lên men thu sinh
khối bào tử
Đo mật độ quang
Khả năng nảy
mầm
50. 49
2.4.3. Kiểm tra chất lượng bào tử thu được bằng phương pháp lên men xốp
Sau khi đã lên men thể rắn thu sinh khối bào tử vi nấm Trichoderma sp. và
Aspergillus sp. SD4, ta tiến hành đo mật độ quang để đo số bào tử vi nấm thu được.
2.4.4. Thí nghiệm kiểm tra khả năng nảy mầm
Cấy bào tử nấm Trichoderma sp. từ ống nghiệm qua đĩa petri. Cấy bào tử nấm
Trichoderma sp. trong bình tam giác qua đĩa petri. Sau đó đem so sánh bán kính
khuẩn lạc nảy mầm.
51. 50
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
3.1. Khảo sát hình thái và hoạt tính enzyme ngoại bào của nấm
Vi nấm Trichoderma sp. và Aspergillus sp. SD4 được ứng dụng để làm phân ủ
compost, có khả năng sinh tổng hợp các enzyme cellulase, chitinase, protease,
pectinase, amlylase nên có khả năng phân giải tốt các chất xơ, chitin, lignin, pectin
trong phụ phế phẩm nông nghiệp. Chính vì vậy các giống này thường được sử dụng
để sản xuất giống khởi động ủ phân compost.
Bước đầu tiên trong quy trình sản xuất giống khởi động là khảo sát hình thái
xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi nấm Trichoderma sp. và Aspergillus sp.
SD4 có bị nhiễm hay thoái hóa giống hay không
3.1.1. Khảo sát hình thái của nấm
3.1.1.1. Hình thái Trichoderma sp
Hình thái khuẩn lạc Trichoderma sp. được trình bày trên hình 3.1
2 ngày 4 ngày 6 ngày
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc Trichoderma sp. sau 2, 4, 6 ngày nuôi cấy.
Qua hình trên, ta thấy được nấm Trichoderma sp. có tốc độ phát triển nhanh chỉ
trong vòng 6 ngày nó đã lan ra khắp bề mặt của đĩa petri. Sợi tơ màu trắng xuất hiện
trong những ngày đầu sau đó xuất hiện bào tử màu xanh.
52. 51
A) B)
Hình 3.2. Bào tử Trichoderma sp. quan sát dưới kính hiển vi A) Hệ số phóng
đại X100; B) Hệ số phóng đại X1000.
Quan sát dưới kính hiển vi sau khi nuôi cấy phòng ẩm ta thấy cuống bào tử phân
nhánh nhiều, bào tử xuất hiện dày đặc, bào tử hình oval.
3.1.1.2. Hình thái Aspergillus sp. SD4
Hình thái khuẩn lạc Aspergillus sp. SD4 được trình bày ở trên hình 3.3.
2 ngày 4 ngày 6 ngày
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc Aspergillus sp. SD4 sau 2, 4, 6 ngày nuôi cấy.
53. 52
Qua hình trên, ta thấy nấm Aspergillus sp. SD4 cũng tương tự như Trichoderma
sp., chỉ trong vòng 6 ngày nó đã lan nhanh khắp bề mặt của đĩa petri. Thời gian đầu
tơ nấm màu trắng, sau đó xuất hiện bào tử màu đen.
A) B)
Hình 3.4. Bào tử Aspergillus sp. SD4 quan sát dưới kính hiển vi A) Hệ số phóng
đại X 100; B) Hệ số phóng đại X1000.
Qua quan sát dưới kính hiển vi, ta thấy Aspergillus sp. SD4 sinh bào tử đính, hình
cầu màu đen.
54. 53
3.1.2. Phát hiện enzyme ngoại bào
Bằng phương pháp cấy điểm trên môi trường cảm ứng enzyme ngoại bào, ta có
thể phát hiện khả năng tiết enzyme ngoại bào của nấm sợi. Các enzyme quan tâm là
cellulase, chitinase, amylase, pectinase, protease.
Sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường cảm ứng enzyme, ta dùng lugol làm chất
hiện màu. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng nấm mốc
Trichoderma sp. và Aspergillus sp. SD4 được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Vòng phân giải enzyme (nếu d=0 thì hoạt tính là không có ký hiệu 0,
d≤30 thì hoạt tính là yếu, ký hiệu +; d=30-40 hoạt tính là trung bình, ký hiệu
++; d>40 hoạt tính là mạnh, ký hiệu +++)
Vòng phân giải Đường kính
vòng phân giải
(mm)
Đánh giá hoạt
tính
Trichoderma sp.
Cellulase 40 ++
72. 71
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu là sách
Burgess LW., Knight TE., Tesoriero L., Phan HT., Diagnostic manual for plant
Diseases in Vietnam. Australian Centre for International Agricultural Research
Canberra 2008.
Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, (1997). Bảo vệ cây trồng
bằng các chế phẩm từ vi nấm. NXB Nông nghiệp TP.HCM.
Lê Hùng (2011). Hoàn thiện môi trường lên men xốp sản xuát bào tử
Trichoderma T40 đối kháng nấm bệnh cây Rhizoctonia solani. Đại học kỹ thuật công
nghệ TPHCM.
Tài liệu là bài báo trong tạp chí
Asran-Amal A., Abd-Elsalam KA. , Omar MR., Aly AA. Antagonistic potential
of Trichoderma spp. against Rhizoctonia solani and use of M13 microsatellite-primed
PCR to evaluate the antagonist genetic variation. Journal of Plant Diseases and
Protection, 2005, 112 (6), 550–561.
Benistez T., Rincosn AM., Limón MC., Codosn AC. Biocontrol mechanisms of
Trichoderma strains. INTERNATIONAL MICROBIOLOGY (2004) 7:249-260.
Bailey B. A & Lumsden R. D., 1998. Direct effects of Trichoderma &
Glioladium Volume 2: 185 – 201.
Cook R.J., and Baker K. F. 1983. The Nature and Practice of Biological Coltrol
of plant Pathogens. American Phythopathological Society, St. Paul, MN. 539 pp.
Degenkolb T, , Graefenhan T., Berg A., Nirenberg HI., Gams W., Brueckner H.
Peptaibiomics: Screening for Polypeptide Antibiotics (Peptaibiotics) from Plant-
Protective Trichoderma Species. CHEMISTRY & BIODIVERSITY – Vol. 3 (2006).
73. 72
Ghildiyal A. and A. Pandey A. Isolation of Cold Tolerant Antifungal Strains of
Trichoderma spp. from Glacial Sites of Indian Himalayan Region. Research Journal
of Microbiology, 2008, Vol 3, 559-564.
Hadar Y, Harman G. E., Tavlor A. G. (1984) Evaluation of Trichoderma
koningii and T. harzianum from New York soils for biological control of seed rot
caused by Pythium spp. Phytopathology 74, 106-110.
Newsham et al. Arbuscular mycorrhizae protect an annual grass from root
pathogenic fungi in the field, J. Ecol. 1995, 83:991-1000
Pieterse CMJ., Leon-Reyes A., Van der Ent S. & Van Wees SCM. Networking
by small-molecule hormones in plant immunity. Nature Chemical Biology, 2009, 5,
308 – 316.
Rachid Lahlali & Mohamed Hijri. Screening, identicationand evaluation of
potential biocontrol fungal endophytes against Rhizoctonia solani AG3 on potato
plants. FEMS Microbiol Lett 311 (2010) 152–159.
Tài liệu trích dẫn từ Internet:
http://www.mycobank.org/