Dokumen tersebut membahas berbagai jenis immunoassay seperti immunoassay berlabel enzim, fluoresens, dan radioisotop. Termasuk didalamnya adalah penjelasan mengenai prinsip kerja dan tahapan melakukan ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) untuk mendeteksi interleukin-5 (IL-5).

1. dr. I Putu Sidhi Rastu K
Pembimbing:
Dr.dr. I Nyoman Wande, SpPK
Immunoassay berlabel (noncompetitive
enzyme immunoassay, competitive
enzyme immunoassay, capture enzyme
immunoassay), ELFA
1

2. Immunoassay berlabel
Assay berlabel fluoresens
Assay berlabel radioisotop
Luminescent immunoassay
Enzyme Immunoassay
Uji Imunoperoksidase
Assay imunokromatografi
2

3. Enzyme Immunoassay
 EIA Homogen  umumnya kompetitif
 EIA Heterogen  kompetitif dan non-kompetitif
3

4. EIA Homogen
 berlabel enzim
 berlabel substrat fluoresens
 Berlabel gugusan prostetik
 Berlabel kofaktor
 Berlabel inhibitor
 Cloned enzyme donor immunoassay (CEDIA)
4

5. EIA berlabel enzim
Antigen berlabel
enzim
Analit
Antibodi pada
reagen
substrat
5

6. EIA berlabel
fluoresens/prostetik/kofaktor
Antigen berlabel
substrat
Analit
Antibodi pada
reagen
substrat Enzim
6

7. EIA berlabel inhibitor
Antigen berlabel
inhibitor
Analit
Antibodi pada
reagen
substrat enzim
Inaktif
7

8. Cloned Enzyme Donor Immunoassay
Antigen berlabel
Enzyme donor
(inaktif)
Analit
Antibodi pada
reagen
Enzim asseptor
aktifinaktif
8

9. EIA homogen
Keuntungan
 Waku lebih cepat
 Dapat diapatasi
dengan auto-analyzer
Kerugian
 Semua komponen
sampel dapat
mempengaruhi hasil
 Perlu fotometer peka
dengan kontrol suhu
yang amat baik
 Terbatas pada analit
dgn berat molekul
kecil
9

10. EIA heterogen
 Perlu pemisahan reagen berlabel enzim yang
terikat (bound/B) dengan reagen berlabel enzim
yang bebas (free/F)
 Cara pemisahan:
 Presipitasi fraksional
 Presipitasi imunologis
 Absorpsi
 Solid phase
10

11. ELISA /EIA HETEROGEN
LABEL ENZIM
PADA ANTIGEN
LABEL ENZIM
PADA ANTIBODI
LABEL ENZIM PADA
ANTI-
IMUNOGLOBULIN
1. ELISA kompetitif
2. ELISA titrasi
3. Untuk penentuan
antibodi
1. Double antibody
sandwich ELISA
2. Inhibition ELISA
1. ELISA tak
langsung
2. Double Antibody
Sandwich
Antiglobulin ELISA
3. Indirect Inhibition
ELISA
11

12. Label enzim pada antigen
12

13. ELISA kompetitif
Antigen berlabel
enzim
Analit
Antibodi pada
reagen
substrat
13

14. ELISA titrasi
Antigen berlabel
enzim
Analit
Antibodi pada
reagen
substrat
14

15. Solid Phase anti IgM ELISA
Antigen berlabel
enzim
IgM (analit)
Anti IgM
substrat
15

16. Label enzim pada antibodi
16

17. Double antibody sandwich/capture
ELISA
Analit
Antibodi konjugat
berlabel
Antibodi dalam
solid phase
substrat
17

18. Inhibition ELISA
Analit
Antibodi konjugat
berlabel
Antibodi dalam
solid phase
substrat
18

19. Label enzim pada anti-
munoglobulin
19

20. ELISA tak langsung
Antigen
Anti-imunoglobulin
berlabel
Analit
substrat
20

21. Double antibody sandwich Anti-
globulin
Analit
Antibodi
konjugat
Antibodi dalam
solid phase
substrat
Anti-imunoglobulin
berlabel
21

22. Indirek Inhibition ELISA
Analit
Antibodi
konjugat
Antibodi dalam
solid phase
substrat Anti-imunoglobulin
berlabel
22

23. ELFA
 Prinsip sama dengan sebelumnya
 Substrat dapat berflouresens setelah reaksi
dengan enzim
23

24. Tahapan dalam ELISA
Pelapisan (coating) antigen atau antibodi
Penambahan sampel dan kondisi asai
Penambahan detektor:
Penambahan konjugat  substrat kromogen 
pembacaan hasil
Reaksi antara: pencucian (washing)
24

25. Contoh : prosedur ELISA untuk
IL-5
Persiapan sampel:
Bahan:
 Supernatan kultur sel
 Serum
 Plasma
25

26. 26

27. Persiapan reagent
 Wash buffer: 20 ml wash buffer + 480
deionised/distilled water
 Substrate solution: 100 mikroliter reagent warna A
+ B dicampur dalam 15 menit saat pemakaian
 standard IL-5 : rekonstitusi standar dengan
deionized water  2500 pg/mL  diamkan 15
menit
27

28. Persiapan kalibrasi
standar
d
2500 pg/mL250 pg/mL125 pg/mL62.5 pg/mL31.3 pg/mL15.6 pg/mL7.81 pg/mL3.98 pg/m
100 µL std
500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL
900 µL
500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL
28

29. Prosedur Assay
 Persiapan reagen, working standar, blanko,
sampel
 Persiapkan microplate
 Tambahkan 100 µL diluent
 Tambahkan 50 µL standar, sampel, atau kontrol
ke well  tutup dengan adhesive strip  inkubasi
3 jam suhu ruang
29

30. 30

31.  Aspirasi setiap well dan wash  3x
 Tambahkan 200 µL Human IL-5 conjugate di tiap
well  tutup dengan adhesive tape  inkubasi 1
jam pada suhu ruang
 Ulangi aspirasi seperti langkah sebelumnya
31

32. 32

33.  Tambahkan 200 µL larutan substrat ke tiap well
 inkubasi 30 menit suhu ruang, hindarkan dari
cahaya
 Tambahkan 50 µL stop solution di setiap well.
Warna akan berubah dari biru ke kuning.
 Ukur absorbans pada panjang gelombang 450
nm dengan microplate reader. Hasil lakukan
koreksi pada panjang gelombang 540/570 nm.
33

34. 34

35. 35

36. Pengukuran konsentrasi
Konsentrasi IL-5 (pg/mL
absorbans
36

37. TERIMAKASIH
37

38. TMB (3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine) gives blue
reaction products upon reaction with HRP. The
products have major absorbance peaks at 370
nm and 652 nm. Addition of either sulfuric acid or
phosphoric acid to those solutions changes the
solution color to yellow, with an absorbance
maximum at 450 nm. The advantage of TMB is
that it is highly sensitive. However, it can produce
significant background signal in the presence of
excess protein or antibody. In addition, TMB is
oxidized more quickly compared to other HRP
substrates, which causes faster color
development.38

39.  Substrat TMB terdiri dari 2 color reagent :
 H2O2 (hidrogen peroxide)
 Kromogen (tetramethylbenzidine)
39

40. Monoclonal antibodi
antigen
Kultur Sel
myeloma
imunisasi
Isolasi sel B dari
limpa tikus
40

41. Produksi Hybridoma
41

42. Screening
ELISA
Cloning sel hybridoma
Produksi monoclonal
antibodi
42

43. Polyclonal antibodi
43

44.  Fraksional presipitasi : pemisahan substansi
campuran berdasarkan kelarutannya. Q = ion
yang diberikan (PEG) Ksp = konstanta
equilibrium substans.
 Q < Ksp – tidak terbentuk presipitasi
 Q ≥ Ksp – terbentuk presipitasi
 Presipitasi imunologis : pemisahan antigen-
antibodi dengan antigen bebas dengan cara
memberi anti-imunoglobulin di ikatan antigen-
antibodi yang disebutkan pertama
44

45. 45
assay Kelebihan Kekurangan
fluoresense Stabil, tidak mudah
terpengaruh pH, suhu
Kompleks, mahal,
tenaga terlatih, susah
untuk otomatis,
reproducibility rendah,
slide harus cepat
dibaca
radioisotop Background staining
tidak mengganggu 
sensitivitas tinggi,
stabil, tidak dipengaruhi
pH, konsentrasi, suhu
Waktu paruh pendek,
tenaga terlatih, mahal,
bahaya karsinogenik
Luminescent Peralatan mudah
didapatkan di pasaran,
konjugasi stabil
Sistem deteksi banyak
dipengaruhi lingkungan
(pH, suhu), adanya
enzim endogen
mengganggu
ELISA Cepat dan mudah,
deteksi antigen tinggi,
aman, digunakan untuk
berbagai tes
Mahal, positif palsu jika
blocking solution tidak
efektif, harus cepat
dilakukan karena reaksi