12. Hb diadjust sampai 100g/lJika anemia, gunakan: - > packed cells - < air 5
13. 1. Hemolisat untuk pemeriksaan Hb Makro metode Mikro metode cara pembuatan hemolisat Larutan pelisis Kertas saring Sentrifuse kecepatan tinggi 6
14.
15. Tehnik:Cuci 3x dg NaCL 0,9% Sentrifus 3000rpm Pindahkan supernatan Pindahkan plasma 20 menit Ukur vol Packed cells sentrifus Darah antikoagulan 5 ml Pindahkan Lap. Toluene + 1,4 ml air suling 0,4 ml toluene Goyang 5 menit Sentrifus 3000 rpm 20 mnt (40 C) 7 Sentrifus 3000 rpm 20 mnt, 40 C Pindahkan lar Hb dengan menggunakan pipet pasteur 1 ml sel
21. > baik lagi bila hemolisat disaturasi dengan karbonmonoksida.
22. Jika hemolisat sudah lama, maka Hb akan memisah > jelas jika disentrifus 10.000 rpm, 15 menit, pada T dingin.9
23. b. Mikrometode Reagenpelisis: saponin a. Larutanstok: Saponinpowder 1 g Air dalam gelas ukur 100 ml50 ml larutkan saponin powder + air sampai 100 ml b. Larutankerja: Larutanstok 10 ml Air 90 ml 3% KCN 2 ml 10
24. Tehnik: Sentrifus 5 menit Potong dibwh buffy coat potong Tutup lap.plastik Packed cells Tab. Hematokrit heparin Darah kapiler Masukkan dalam tabung Goyang 5 menit + 6 tetes Reagen pelisis saponin Hemolisat 11 campur
25. c. Kertas saring Tehnik: 1 tetes darah kapiler Setelah kering 2 tetes Reagen hemolisat Lubangi Kertas saring ᶲ 1 cm ᶲ 12 mm Kertas saring Campur & Biarkan 30 menit Pindahkan Kertas saring Hemolisat dapat digunakan segera atau simpan dalam freezer 12
29. Kelemahan: tidak praktis untuk pemeriksaan rutin.Buang Sel debris Dilisiskan dg 1,5-2 vol air suling Pindahkan Lar. Hemoglobin Ke tabung lain Sentrifuse 20.000 rpm 20 menit, (40 C) Packed cells yang sudahdicuci 13
30.
31. Tehnik:+ larutan pelisis Jika hemolisat tersebut cloudy Biarkan 5 menit Masukkan hemolisat kedalam lemari pendingin(freezer) ± 10 menit Packed cells Yang sudah dicuci Saat dicairkan Hemolisat dalam bentuk kristal jernih 14
41. leukosit yang tertinggal mempengaruhi hasil. Resuspensi 3x dengan NaCl 9 g/l Sentrifus 1200-1500 g 5 menit Plasma & lap.buffy coat dipindahkan Darah + Anti koagulan sel 16
42.
43. Hemolisat tidak bisa disimpan > 1-2 hr pada temperatur 40 C atau temperatur ruang (karena akan menjadi gel).
46. Pada tesskrining rutin, melisiskan sel darah yang tidak tercuci dengan EDTA/KCN atau reagen saponin dan KCNmemberihasil cukup baik, terutama untuk sampel yang sedikit.
47. Kejelekan penggunaan sel yang tidak tercuci: pewarnaan komponen protein tidak jelas terpisah oleh karena masihadanya protein plasma.17
53. Cara pembuatan hemolisat untuk pemeriksaan enzim sel darah merah 20 0,7 mmol/l 2-merkaptoethanol (100 mg garam disodium EDTA dan 5 μl 2-mercaptoethanol dalam 100ml air) 2,7 mmol/l EDTA, pH 7,0 1 volume Larutan darah yang sudah dicuci Atau disaring 9 volume larutan pelisis pH diadjust sampai 7,0 (HCl atau NaOH)
63. Antibody Mediated C Dependent Lysis of Virus Infected Cells Participation of the infected Target Cell 1. Viral antigen expression on the plasma membrane 2. Regulation of viral antigen expression 3. Other factors: Membrane fragility, repair, and influence of the cell cycle Participation of Antiviral Antibody 1. Specificity of antiviral antibody 2. Fab'2 fragment initiates C activation 3. Fate of the V-Ab plasma membrane bound immune complexes Participation of C 1. C components and pathways 2. Requirement of alternative C pathway for lysis of virus infected cells in homologous and isologous systems 3. Binding of C components to the plasma membrane 4. Classical and alternative C pathway lysis of virus infected cells in heterologous systems 24
64. Glutathione Glutathione (GSH) is a tripeptide. It contains an unusual peptide linkage between the amine group of cysteine and the carboxyl group of the glutamateside chain. Glutathione, an antioxidant, helps protect cells from reactive oxygen species such as free radicals and peroxides.[2] In effect, glutathione reduces any disulfide bond formed within cytoplasmicproteins to cysteines by acting as an electron donor. In the process, glutathione is converted to its oxidized form glutathione disulfide (GSSG). Glutathione is found almost exclusively in its reduced form, since the enzyme that reverts it from its oxidized form, glutathione reductase, is constitutively active and inducible upon oxidative stress. In fact, the ratio of reduced glutathione to oxidized glutathione within cells is often used scientifically as a measure of cellular toxicity.[3] 25
65. Glutathione has multiple functions: 1. It is the major endogenous antioxidant produced by the cells, participating directly in the neutralization of free radicals and reactive oxygen compounds, as well as maintaining exogenous antioxidants such as vitamins C and E in their reduced (active) forms. 2. Through direct conjugation, it detoxifies many xenobiotics (foreign compounds) and carcinogens, both organic and inorganic. 26
67. Acid Citrate Dextrose Solution (sometimes called Anticoagulant Citrate Dextrose Solution) is a solution of citric acid, sodium citrate and dextrose in water. It is mainly used as an anticoagulant to preserve blood, it is also used during procedures such as plasmapheresis instead of heparin. 28
68. 3. It is essential for the immune system to exert its full potential, e.g. (1) modulating antigen presentation to lymphocytes, thereby influencing cytokine production and type of response (cellular or humoral) that develops, (2) enhancing proliferation of lymphocytes thereby increasing magnitude of response, (3) enhancing killing activity of cytotoxic T cells and NK cells, and (4) regulating apoptosis, thereby maintaining control of the immune response. 4. It plays a fundamental role in numerous metabolic and biochemical reactions such as DNA synthesis and repair, protein synthesis, prostaglandin synthesis, amino acid transport and enzyme activation. Thus, every system in the body can be affected by the state of the glutathione system, especially the immune system, the nervous system, the gastrointestinal system and the lungs. 29
69. KCN Inorganic Compound, Higly soluble in water, Highly toxic KCN can be detoxified most efficiently with hydrogen peroxide:[2]: KCN + H2O2 -> KOCN + H2O Cyanide is a potent inhibitor of cellular respiration, acting on mitochondrial cytochrome c oxidase and hence blocking oxidative phosphorylation. This prevents the body from oxidizing food to produce useful energy. Lactic acidosis then occurs as a consequence of anaerobic metabolism. Initially, acute cyanide poisoning causes a red or ruddy complexion in the victim because the tissues are not able to use the oxygen in the blood. The effects of potassium and sodium cyanide are identical. The person may die within two hours if not treated medically. During this period, convulsions may occur. Death occurs mainly by cardiac arrest. 30
71. Contoh Tes hematologi yang memakai hemolisat Pemeriksaan Hb-Elektroforesis selulose asetat pada pH basa Metode :3 Isi bagian wadah elektroforesis dengan TEB (Tris/EDTA/Borate)buffer. Rendamdanposisikan wick. Padapiringan yang terpisah, rendammembranselulosaasetatdalam TEB buffer selama 5 menit. Keringkanmembrandenganmeletakkannyadiantaradualembarkertassaring, tapitidakbolehkeringsebelumpemberianhemolisat. 32
72. Encerkanhemolisat 1:4 atau 1:5. Letakkansedikitsampelcair (10 µl) dalamsumuransampel. Letakkan sampel hemolisat pada selulosa asetat sekitar 2 cm dari ujung strip. Letakkan strip terbalik diwadah sehingga wick dapat menyentuh buffer dan selulosa asetat. Sehinggagarisaplikasisearahdengankatoda. 33
73. Hidupkanmesindan run pada 250-350 V selama 20 menitatausampaiterpisahsempurna. Matikan mesin, pindahkan strip dari wadah dan warnai dengan Ponceau S selama 3-5 menit. Pindahkan strip dan, keringkan dan eluasi kelebihan warna dengan mencuci menggunakan asam asetat 50 ml/l sebanyak 3 kali berturut. Keringkan dengan metanol absolut selama 3 menit. 34
74. Bersihkandalam 20% asamasetatdalammetanolselama 6-8 menit. Keringkandalam oven dengansuhu 650C selama 4-6 menit. Pastikan strip terlabeldanletakkandalamwadah yang amansepertiamplopplastik. 35
75. Pemeriksaan G6PD Metode: Pemeriksaan dilakukan pada suhu 300C Kuvet berisi ke empat reagen dan air yang sudah diinkubasi selama 10 menit sebelumreaksi dengan menambahkan substrat. Perubahan absorben setelah penambahan substrat diukur pada 5 menit pertama dari reaksi. Nilaitesdikuranginilaiblanko, dapatdiperolehsecaraotomatisataudengankalkulasi. 36
78. Pemeriksaan piruvat kinase Metode: Persiapan hemolisat, buffer dan larutan pelisis sama seperti pemeriksaan G6PD. Penting untuk hilangkan sebanyak mungkin leukosit dan platelet. Prinsip pemeriksaan sebagai berikut:PK PEP + ADP piruvat + ATP LDH Piruvat + NADH laktat + NAD 39
79. Untuk memastikan bahwa reaksi kedua tersebut tidak dibatasi kecepatan, maka LDH ditambahkan untuk melebihi campuran reaksi dan aktivitas piruvat kinase diukur pada kecepatan di panjang gelombang 340 nm. Keadaan reaksi tampak pada 1 ml cuvet pada suhu 300C dengan menambahkan semua reagen yang terdapat dalam tabel kecuali substrat PEP. Diinkubasi selama 300C selama 1menit sebelum memulai reaksi dengan penambahan PEP. 40
81. Perubahan absorben diukur pada 5 menit pertama dan aktivitas enzim dalam mikromol perubahan NADH/menit/ml hemolisat dihitung sebagai berikut: ∆A/ menit x 10 6,22 42
84. GPI deficiency The patients suffer from a typical nonspherocytic hemolytic anemia with hemolytic crises during acute infections. The disease is inherited as an autosomal recessive, half of the patients are homozygotic, the others are double heterozygotes. The biochemical properties of the deficient enzymes vary widely. 45
![Pendahuluan ,[object Object],Hemolisis Gangguan integritas membran eritrositHbterlepas. Dapatdisebabkanolehkarena: ,[object Object]](data:image/gif;base64,R0lGODlhAQABAIAAAAAAAP///yH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAIBRAA7)