Dokumen tersebut membahas spesifikasi yang dipersyaratkan dalam Europe Pharmacopoea untuk produk rekombinan erythropoietin (EPO), meliputi ketidakmurnian terkait proses seperti protein sel inang dan DNA sel inang/vektor, identifikasi melalui assay potensi, CZE, SDS-PAGE dan imunoblotting, peptide mapping, analisis sekuens N-terminal, pengujian kadar protein dan dimer/senyawa sejenis, kandungan asam sialat, serta uji potensi d

1. Spesifikasi yang dipersyartakan dalam Europe Pharmacopoea
1. Host Cell Derived Protein
Protein sel inang masuk ke dalam kategori ketidakmurnian terkait proses. Merupakan protein
yang ikut terproduksi pada saat proses overproduksi protein yang diperlukan oleh sel inang
untuk mempertahankan fungsi dan hidupnya seperti pertumbuhan, proliferasi, pertahanan, dan
transkripsi gen. Meskipun pada saat proses purifikasi protein sebagian besar protein inang
akan hilang, namun masih ada kemungkinan sel inang yang tidak termurnikan. Protein inang
yang terbawa dapat berpengaruh terhadap imunogenisitas produk dan menurunkan potensi
serta stabilitas produk sehingga jumlahnya harus dikontrol. (De Zafra, et al. 2015)
2. Host Cell and Vector Derived DNA
DNA dari sel inang maupun dari vektor berasal dari proses upstream produksi protein
rekombinan. Dapat dihasilkan pada saat lisis ataupun mekanisme fisik lain yang merusak sel.
DNA dari sel inang maupun vektor boleh ada dalam batasan 100 pg – 10 ng per dosis sediaan.
Perlu dilakukan pengujian terhadap DNA dari sel inang maupun vektor karena jika terdapat
pada produk dalam jumlah yang cukup banyak dapat menimbulkan respon imun yang tidak
diinginkan.
Identifikasi
1. Assay
Untuk protein EPO assay berkaitan erat dengan aktivitas dari protein sehingga perlu dilakukan
pengujian sesuai dengan prosedur uji potensinya.
2. Capilarry zone electrophoresis
Pada umumnya produk rekombinan dari Epo diproduksi menggunakan sel CHO, merupakan
glikoprotein dengan bobot molekul 30400 Kda dan memiliki kandungan karbohidrat sebanyak 39,5%
dengan bentuk konformasi protein yang sangat mirip dengan bentuk alaminya. Profil glikosilasi yang
dihasilkan pada saat overproduksi menggunakan sel mamalia bisa jadi bebrbeda beda sehingga perlu

2. dilakukan pengujian. CZE dalam pengujian digunakan untuk menganalisis bentuk glikoform dari Epo.
Dengan CZE maka protein rekombinan yang dihasilkan dapat dipisahkan melalui prinsip pemisahan
berdasarkan kromatografi. (Cifuentes, et al. 1999)
3. SDS Page and Immunoblotting
Dilakukan pengujian dengan SDS Page bertujuan untuk mengetahui apakah proteinyang dihasilkan
benar EPO atau bukan berdasarkan pada ukuran yang terbetuk berupa pita-pita yang dibandingkan
dengan marka.Perlu dilakukan karena untuk memastikan bahwa protein yang dihasilkan minimal benar
dulu secara ukuran.
Imunoblotting dilakukan setelah memastikan dari hasil SDS bahwa protein yang diuji memiliki ukuran
yang benar. Pengujian ini bertujuan untuk melihat kualitas dari produk EPO yang dihasilkan. Kualitas
EPO ditentukan berdasarkan kemampuan untuk berikatan dengan antibodi sekunder berlabel yang
ditambahkan saat pengujian. Banyaknya sinyal fluoresens yang terdeteksi berbanding lurus dengan
kualitas dari EPO yang dihasilkan. (Gianoncelli, et al, 2015)
4. Peptide Mapping
Identifikasi berdasarkan pola pemotongan ikatan peptida secara selektif menggunakan enzim tripsin
yang dianalisis menggunakan KCKT dengan membandingkan profil kromatogram sampel dengan
baku (erythropoietin for physicochemical tests CRS). Enzim tripsin dapat memotong rantai polipeptida
pada sisi karboksil dari residu asam amino lisin atau arginin dari protein EPO. (Coffey, A. et al.
2013).
5. N-terminal sequence analysis
Analisis sekuens amino N-terminal digunakan untuk mengidentifikasi urutan dari 15 asam amino awal
pada EPO dimulai dari ujung N menggunakan metode Degradasi Edman. Perlu dilakukan untuk
memastikan bahwa 15 asam amino awal pada ujung N adalah benar.
Test
1. Protein
Pengujian dilakukan untuk menentukan kadar dari EPO yang dipersyaratkan harus memenuhi kadar
80-120% untuk setiapsediaan agar dapat memberikan efek yang diinginkan.
2. Dimer dan senyawa sejenis dengan massa molekul lebih tinggi dari EPO
Dilakukan untuk menganalisis ketidakmurnian terkait produk berupa dimer EPO dan senyawa sejenis
dengan massa molekul lebih tinggi dari EPO menggunakan SEC-HPLC. Dimer dapat terbentuk karena
terdapat ikatan disulfida yang dapat menyebabkan interaksi antar molekul EPO (Matejtschuk, et al.
2019).
3. Asam sialat
Sebagian besar protein terapetik yang diproduksi melalui metode teknologi rekombinan dapat
mengalami sialisasi pada glikoproteinnya, termasuk pada EPO juga glikoproteinnya mengandung
asam sialat. Sialisasi disebabkan oleh adanya asam sialat yang merupakan residu gula pada ujung N
dan O dari rantai glikosilasi.Sialisasi dapat mempengaruhi waktu paruh dari protein rekombinan →
mempengaruhi efikasi (Kwak, CY et al. 2017)
Assay
A. In polycythaemic mice
B. In normocythaemic mice

3. DAFTAR PUSTAKA
 De Zafra, Christina L. Zuch; Quarmby, Valerie; Francissen, Kathleen; Vanderlaan, Martin; Zhu-
Shimoni, Judith (2015). Host cell proteins in biotechnology-derived products: A risk assessment
framework. Biotechnology and Bioengineering, 112(11), 2284–2291. doi:10.1002/bit.25647
 Alejandro Cifuentes; Marı́a Victoria Moreno-Arribas; Mercedes de Frutos; Jose Carlos Dı́ez-Masa
(1999). Capillary isoelectric focusing of erythropoietin glycoforms and its comparison with flat-bed
isoelectric focusing and capillary zone electrophoresis. , 830(2), 453–463. doi:10.1016/s0021-
9673(98)00875-9
 Gianoncelli A, Bonini SA, Bertuzzi M, Guarienti M, Vezzoli S, Kumar R, Delbarba A, Mastinu A,
Sigala S, Spano P, Pani L, Pecorelli S, Memo M. An Integrated Approach for a Structural and
Functional Evaluation of Biosimilars: Implications for Erythropoietin. BioDrugs. 2015
Aug;29(4):285-300. doi: 10.1007/s40259-015-0136-3. PMID: 26334631; PMCID: PMC4562010.
 Kwak CY, Park SY, Lee CG, Okino N, Ito M, Kim JH. Enhancing the sialylation of recombinant EPO
produced in CHO cells via the inhibition of glycosphingolipid biosynthesis. Sci Rep. 2017 Oct
12;7(1):13059. doi: 10.1038/s41598-017-13609-4. PMID: 29026192; PMCID: PMC5638827.
 Matejtschuk, P., Duru, C., Malik, K.P. et al. Development of a stable chemically cross-linked
erythropoietin dimer for use in the quality control of erythropoietin therapeutic products. Anal Bioanal
Chem 411, 2755–2758 (2019). https://doi.org/10.1007/s00216-019-01768-4