Dokumen ini membahas tentang elektroforesis protein. Metode ini memanfaatkan perbedaan muatan dan ukuran molekul protein untuk memisahkannya. Protein akan bergerak di dalam media penyangga sesuai dengan muatannya menuju kutub yang berlawanan. Dokumen ini menjelaskan prinsip, komponen, prosedur, dan pembacaan hasil elektroforesis protein.

1. Tutor Kimia Klinik 15 Maret 2010Elektroforesis ProteinResnaHermawatiDra. Soehartini B.S., MS, Apt

2. 2Tutor kimia klinik

3. Elektroforesis protein3Tutor kimia klinik

4. PrinsipDasarElektroforesisA. Partikelbermuatanpada media penyanggaakanbermigrasimenujuelektrodadenganmuatan yang berlawanan. B. Molekulorganikbanyak yang bersifatamfoterik. MuatandanbesarnyamuatanpartikeldipengaruhipH.Misalnya protein akanbermuatannetralpada pH isoelektrik (pI)bermuatanbermuatan + pH < pIbermuatan - pH > pIPower supply/Wicks4Tutor kimia klinik

5. C. KecepatanMigrasi5Tutor kimia klinik

6. D. Resolusikemampuanmemisahkanfragmen. Makin resolusinyajarakantarfragmen yang miripmakinlebarResolusitergantungbeberapafaktor :6Tutor kimia klinik

7. E. KualitaselektroforesisVoltase, arus,panaspH, kekuatan ion 7Tutor kimia klinik

8. KOMPONEN SISTEM ELEKTROFORESISAlatelektroforesis :Power supplyMedia PenyanggaSampelWicks8Tutor kimia klinik

9. SAMPELTergantung Media penyanggadiataskertas, dilubangi, well9Tutor kimia klinik

10. BUFERFungsi 1. Menentukandanmenjaga pH konstan 2. MengalirkanlistrikSyarat a. Tidakbereaksidengansampel b. pH optimal dantidakmendenaturasipartikel(protein pH 8-9 muatan - ) c. Kekuatan ion bufer(ionic strength)rendahmempercepatmigrasitinggimemperlambatmigrasiresolusitinggi(panas- denaturasi protein)Seringdipakai :Bufer barbital, trisboric acid -EDTA10Tutor kimia klinik

11. Media PenyanggaTidakjernih, pita lebarAbsorpsi proteinUkuranporitidakseragamPita lebar, resolusirendah11Tutor kimia klinik

12. Media Penyangga12Tutor kimia klinik

13. Lanjutan Media…..ENDOSMOSIS.13Tutor kimia klinik

14. Power Supply0- 500 volts0- 100 miliampereVoltaseatauaruskonstanPemisahan < 30 menit : voltasekonstanPemisahanlebih lama : aruskonstan ( minimalisasikenaikansuhu)14Tutor kimia klinik

15. PewarnaMerahterang, serapsinar 525 nm15Tutor kimia klinik

16. Pembacaanhasil. Pita dipotong.Dieluasikan.fotometer. Pita lgsdiukurdlmsistemoptik. Area dibawahpuncakkurva.Otomatis16Tutor kimia klinik

17. Lanjutanpembacaan…Serum electrophoregram normal17Tutor kimia klinik

18. Lanjutanpembacaan…Nilairujukan protein serum( A manual of laboratory and diagnostic test, 2000)18Tutor kimia klinik

19. Lanjutanpembacaan…19Tutor kimia klinik

20. Gambaran abnormal elpPeningkatanα1 : inflamatory state (α1 antiprotease ), kehamilan.Peningkatanα2 : nephrotic syndrome, inflamatory state, terapi steroid, kontrasepsi oral, hipertiroidisme, hemolisis in vivo, penyakit liver.Peningkatan ß : hiperlipidemia, hemoglobinemia,anemiadefisiensibesi.Peningkatan Ƴ polyclonal gammopathies : penyakitliver,sirosis, infeksikronis, penyakitautoimun.Peningkatan Ƴ monoclonal gammopathies : multiple myeloma, waldenstormmacroglobulinemia, lymphoid malignancies.20Tutor kimia klinik

21. LanjutangbranabnPenurunanα1 : defisiensiα1 antiproteasePenurunanα2: hemolisis in vivo, penyakit liverPenurunanß : hypo ßlipoproteinemia.Penurunan Ƴ : Defisiensiimun21Tutor kimia klinik

22. Lanjutangambaranabn…B22Tutor kimia klinik

23. Lanjutangambaranabn…23Tutor kimia klinik

24. ELEKTROFORESIS DI LAB PKAlat : SebiaHydragel Protein (E) K 20 K 20 electroporesis chamber Applicators applicators carriers24Tutor kimia klinik

25. Lanjutanalat…Media penyangga : Agarose gel (agarose 0,8 g/dl)&Tris barbital buferpH :basaFilter paper thin25Tutor kimia klinik

26. Lanjutanalat…Bufer : Tris barbital bufer, pH 8,5 ± 0,3A. Fixative solutionetanol, as asetat, aquabidestB. Staining :AmidoblackC. Destaining as sitratCCCBA26Tutor kimia klinik

27. Lanjutanalat…Power supplyIncubator dryer IS 8027Tutor kimia klinik

28. Lanjutanalat…Scanner ג 570 nm atau filter kuningKomputer28Tutor kimia klinik

29. PROSEDUR4 tahap :29Tutor kimia klinik

30. MIGRASI30Tutor kimia klinik

31. Lanjutanmigrasi…Terendam 1 cmWaktu 15`, 165 V, 7 ± 2 mA(set alat 60 mA) Volbufer 300 ml pH 8,5 ± 0,331Tutor kimia klinik

32. FIKSASIBiarkandingin ± 1`32Tutor kimia klinik

33. Staining-destainingGel menghadapkebawah, λ 570 nm33Tutor kimia klinik

34. Hasil scanningkonsentrasirelatif (persentase).34Tutor kimia klinik

35. DaftarPustaka 1. Bishop ML, Fody EP, Schoeff LE. Clinical chemistry: Principles, procedurs, correlations. 5th edition. Baltimore: Lippincott Williams&Wilkins; 2005. 105-07, 207-11.2. Word KM, Lehmann CA, Leiken AM. Clinical laboratory instrumentation and automation : principles, application and selection. Philadelphia: WB Sunders Company; 1994. 158-70.I. 3. Merck E. Clinical laboratory. 11th edition. Germany; 1974. 145-60.4. Henry JB. Clinical diagnosis and management by laboratory methods. 20th edition. Philadelphia : WB Saunders Company;2001. 249-61.5. Sebia. Instruction manual. Sebia. 2002.

36. TERIMAKASIH

37. Quality controlKomersial kit (assayed control serum, Sebia PN 4783).Membuatsendiridari 90 orangdewasasehat (priadanwanita) mencarinilaimean± 2 SD37Tutor kimia klinik

38. TambahanTris barbital buffer: pH 8,5 ± 0,3 0,92 % barbital 5,15 % Na barbital 0,10 % sodium azide 1 vial dilarutkandalam I liter aquadesttahanhingga 1 tahun, suhuruangan.Amidoblack stain, PH 2Amidoblack0,4 g/dl danEthylene glycol 6,7 %Gantitiap staining 10 gelLarutkan 1 vial dengan 300 ml aquadest. Working solution stabilhinggasetahun.38Tutor kimia klinik

39. Destaining solution 0,05 g/dl citric acid 1 ml stock solutiondalam 1 liter Working solution stabil 1 minggudalamsuhuruangan, padabotoltertutupBilaterjadiperubahanwarnakontaminasibakteri + 5 uL/dl Proclin 300Fixation solution 60 % etanol 10 % asamasetat 30 % aquadestTutuprapatuntukmencegahevaporasi. Gantisetiap 3 bulan. Janganmencampur > 4 gel dalamfixation solution.39Tutor kimia klinik

40. Endosmosisketika media penyanggabermuatannegatifMuatan - menarikmuatan + daribufer. Ketikadialirilistrik ion + kekatoda, berlawananarahdengangerakanmuatan - (misalnya protein) yang bergerakkearahanoda. Gerakanmenjadilebihlambat, tidakbergerakatauterdorongkearahkatoda.40Tutor kimia klinik

41. Wick flowWick flow :1.Gerakan keatasdarilarbufermelaluikeduatepimembran yang terendam2.Menggantikan kelembaban yang hilangakibatpemanasan3.Memperlambat gerakanpartikelpada media penyangga41Tutor kimia klinik

42. Konsentrasi normal protein serumα1 globulin : 0,1 – 0,3 g/dl α1 Globulin : α1 antiprotease(90 %),α1 acid glycoprotein, α1 lipoproteinα2 globulin : 0,6-1,0 g/dl α2 globulin : α2macroglobulin, haptoglobin, ceruloplasmin.β globulin : 0,7-1,4 g/dl ß globulin : transfferin, hemopexin, complement C3, ß lipoprotein.γ globulin : 0,7-1,6 g/dlƳ globulin : immunoglobulin G, A, D, E, dan M42Tutor kimia klinik

43. TahapPersiapanPreparasireagenpada The Hydragel protein(E) K20 kits Agarose gelsSiappakaiDisimpanpadaposisi gel horizontal danmenghadapkeatasBisadisimpanpadasuhuruang/refrigeranated (2-8 ⁰C) Tris Barbital Buffer a. Setiap vial stock buffer solution diencerkansampai 1 L denganaquabidest. b. Contoh 50 ml stock diencerkansampai 500 cc aquabidest c. Vial yang sudahdiencerkandapattahanselama 1 tahunpadasuhuruang43Tutor kimia klinik

44. d. Setelahpemakaian(di chamber), larutaninidisimpanpadatempat lain untukmenghindarikerusakanelektrodapada chamber.e. Ganti buffer pada chamber setelah 1 minggupemakaianatausetiap 1 kali migrasi( 1 full gel agarose) f. 0,05 M Na barbital 10,309 gram o,o1 M Barbital 1,842 gramAqaudest 1 liter. Amidoblack Stain a. Setiap vial stock amidoblack stain(botolcoklat) ditambahkandengan staining solution diluents(60 cc) laludiencerkansampai 200 cc denganaquabidest. b. Stabilselama 1 bulan44Tutor kimia klinik

45. c. Menggantiamidoblack stain setiapbuka kit baru.Destaining solution a. Setiap vial sock destaining solutiondiencerkansampai 100 L denganaquabidest b. Contohuntuk 1 ml stock solution diencerkansampai 1 L denganaquabidest. c. Working reagenstabilsampai 1 minggubiladisimpanpadasuhuruangdandisimpanpadabotoltertutup. e. Digantisetiapselesaidestaininguntuk 1 kali migrasi(chamber I)45Tutor kimia klinik

46. Applicators a. Siappakai b. Disimpanpadatempat yang keringpadasuhuruang Filters papers thinSiappakaiFixative solution a. Etanol 180 ml, acetic acid 30 ml, aquabidest 90 ml b. Disimpanpadasuhuruang, ganti 3 bulan/ setelahpemakaian 4-6 gel untuktiap 300 cc46Tutor kimia klinik

47. MigrasiTempatkanHydragel K-20 aplicatorcarierpadapermukaan yang datarTambahkan 10 μl serum padasumuranaplicators, patahkanujungaplictor47Tutor kimia klinik

48. Buka pack hydragelagarose plateSerap buffer padaagarose gel dengan paper filter thin secukupnya(harus rata) janganterlalukering48Tutor kimia klinik

49. Tempatkanagarose gel padahydragel K-20 aplicatordenganposisikutub (+) beradadiatasTempatkanaplicator yang telahberisi serum padaaplicator carrier diposisi 649Tutor kimia klinik

50. Turunkanaplicatorsampaimenyentuhpermukaanagarose gel denganmemutar switch perlahan-lahanSetelah 40 detik, angkatperlahan-lahanaplicator50Tutor kimia klinik

51. Pindahkanagarose gel ke chamber denganposisikutub(+) kearahkutub(+) pada chamber. Agarose gel harusterendam 1 cm padamasing-masingujungnyadidalambufer51Tutor kimia klinik

52. Nyalakan power supply dengan setting sbb : Volume bufer per compartement 150 ml Total volume bufer 300 mlWaktumigrasi 15 menitVoltase 165 voltArus 7 ± 2 mA ( set padaalat 60 mA)52Tutor kimia klinik

53. FIKSASISetelahmigrasi, pindahkan gel untukdifiksasiFiksasi gel dalamlarutanfiksasiselama 15 menit53Tutor kimia klinik

54. Keringkan gel dalaminkubator IS 80 padasuhu 80 selama 10 menit(sampaikering)Biarkandinginsekitar 1 menit54Tutor kimia klinik

55. Staining-destainingLakukanpewarnaanpadalarutan staining selama 4 menitLakukandestainingpadalardestainingdlm 3 kali rendamansampaibenar-benarbersih55Tutor kimia klinik

56. Keringkan pd IS 80 incubator dryer 56Tutor kimia klinik

57. ScanningLakukanpembacaanhasilpadascanner denganposisi gel menghadapkescanner(kebawah) dengan λ 570 nm atau filter kuning.57Tutor kimia klinik

58. 58Tutor kimia klinik

59. Sampel : serum yang baru, bisadisimpansuhu 20 – 80 C segerasetelah sampling maksimalsatuminggu. Sampel plasma: fibrinogen memberigambaranmonoclonal gammopathydanmerubahpersentasedari zone ELPFraksi beta 2 akanhilangsetelah 3 hari.Penyimpananbekustabilsampai 1 bulan (sodium azide0,02 g/dl).Sampel yang hemolisis me alpha 2 dan beta zonesSampel serum yang mengandungcryoglobulinataucryogelsangatkentalmengganguprosesdifusi. + fluidil 25 uLuntuk 75 ul serum.59Tutor kimia klinik

60. 60Tutor kimia klinik

61. 61ELP protein urine (Sebia K20)Prosedur pemeriksaan sama dengan ELP protein serum, hanya sampel urine (24 jam) harus dikonsentrasikan sebelum aplikasi pemeriksaan kecuali bila menggunakan metode staining yang sensitif (gold or silver stain). Agarose gel yang digunakan hydragel proteinuriaAnderson (1979) : 1/3 bagian albumin, 2/3 terdiri dari α,ß, ƳglobulinTutor kimia klinik

62. 62Tabel 3. Interpretasi ELP protein urineTutor kimia klinik

63. 63Interpretasi…….Tutor kimia klinik

64. 64Media Penyangga1. Paper Terdiri dari serabut-serabut selulose,murah dan mudah, perlu waktu >16 jam, memisahkan fraksi protein serum menjadi 5 fraksi 2. Starch gel (tepung kanji) Perlu persiapan, harus dipurifikasi (pemurnian dulu), mempunyai pori-pori tertentu sehingga dapat memisahkan 20 fraksi, endosmosis flow besarAgarose gel Mengandung agarose dan agar opectin. Tidak mengandung asam sulfat dan carboxylic acid sehingga efek endosmosis kecil. Agarose Sebia K20 mengandung agarose 0,8 g/dl, 0,61 % barbital. Penyimpanan suhu ruangan atau 2 – 8 C. stabil hingga tanggal kadaluarsa. Jangan digunakan bila ada cristal, pertumbuhan bakteri, cairan eksudasi dari gel.Tutor kimia klinik

65. 653. Agar gel Perlu persiapan, lebih murni dari starch gel, endosmosis flow besar, waktu separasi protein ± 60 menit.4. Polyacrylamide gel Inert, muatan netral sehingga endosmosis flow -, pori - pori yang bermacam – macam (25 fraksi protein), interpretasi sukar.5. Cellulose acetat Banyak dipakai, tanpa persiapan khusus, sampel sedikit, waktu separasi 30 menit, pemisahan fraksi baik, dapat dibuat trasnparan, hasil dibaca dengan densitometer.Tutor kimia klinik

66. 66b.Sellulosaasetathasilreaksiantaracellulosedanacetic anhydride. Keuntunganband lebihtajam, protein terpisahlebihcepat, dapatdisimpandalamwaktu lama.Kerugiannya hasilakhirburamharusditambahkancairan yang melarutkanseratcellulose asetatfraksi protein yang tercatdenganlatarbelakangtransparan.Tutor kimiaklinik

67. 67c.Starch gel  amilosedanamilopectin.Kerugian hasilburamdanharusdirendamsemalamuntukhasil yang jernih ,kuantitasterkadangmasihtidakakurat.d.Poliacrylamide gel pemisahanalkalinphospataseisoenzimKeuntungan : stabilpadapemanasan,transparan, tidakbermuatanmenghilangkanefek endosmosis.Kerugiannyaacrylamideberpotensikarsinogenik.Tutor kimia klinik

68. 68e. Agar gel agarosedanagaropectinbermuatannegatif. - Agarosefraksiimmobile. - Agaropectinberikatansecarareversibledengansebagianasam amino dan hemoglobin padapermukaanluar. Hemoglobin-agaropectinkompleksbermigrasikeanoda, hemoglobin yang tidakterikatbergerakkekatoda.Tutor kimia klinik

69. 69f. Agarose gel lebihmurnidibanding agar gel karenatidakmengandungagaropectin. Keuntunganefek endosmosis kecil,resolusibaik ,hasilakhirjernih , waktulebihsingkat.Kerugiannya tidakdapatdisimpan lama.Tutor kimia klinik

70. 70Tutor kimia klinik

71. 71Tutor kimia klinik

72. 72Endosmosis flowEndosmosis (electroendosmosis/wick flow) terjadiketika media penyanggabermuatannegatifakibatadsorbsi ion hidroksildari buffer. Muatan - menarikmuatan + dari buffer, ketikadialirilistrik ion + bergerakkekatoda yang berlawananarahdenganpergerakanmuatan -. Gerakanmenjadilebihlambat, tidakbergerak.Efekinidapatdikurangi : penambahansukrosaatausorbitol yang meningkatkanosmolalitasdan gel hampirbebasdari endosmosis (agarose gel).Tutor kimia klinik

73. 73Teknik ElusiTanpa dilakukan clearing, masing –masing band dipotong, masukkan tablet elusi (larutan Na2CO 3 0,5 %). Masing – masing larutan elusi baca dengan fotometer 590 nm, kolorimeter dengan filter oranye. OD (optical density) sesuai dengan konsentrasi protein.Kesalahan teknik ini besar: Pemotongan band, elusi yang tidak sempurna, pembacaan fotometer.Tutor kimia klinik

74. 74Barbital bufferTidak mengadakan interaksi dengan protein, tidak menyebabkan denaturasi dari protein0,05 M Na barbital 10,309 gram o,o1 M Barbital 1,842 gramAqaudest 1 liter.Tutor kimia klinik

75. 75Staining solutionYang sering dipakai: Ponceau, Sudan Black, Coomasie, Brilliant blue.Ponceau S 0,5 gram Trichloracetic acid 5 gram Aquadest 100 mlTutor kimia klinik

76. 76Prosedur ELP cellulose acetatAlat dan reagensia :Cellulose acetat membranKertas saringApplicator/mikropipetBeberapa kotak pengecatanKotak kaca untuk clearing solutionObyek glassOven/hair dyer8. Power supply9. Electrophoresis chamber.10. Densitometer Tutor kimia klinik

77. 77Prosedur….Running phase.Penjenuhan cell. Acetat membran dalam larutan buffer PH 8,6 selama 5 menit.

78. Persiapan sampel, serum dengan sedikit bromphenol blue dengan applicator letakkan pada 1/3 tepi cell. Acetat membran

79. Letakkan pada supporting plate dalam electrophoresis chamber

80. Pengaturan power supply voltage 20 V (panjang strip), 0,8 mA (lebar strip) selama ± 20 menitTutor kimia klinik

81. 782. Staining phase. 1 2 3 4 5 6 7 Ponceauacetic acid dehydration clearing solution solutionProsedur….Tutor kimia klinik

82. 79Prosedur….cell. Acetat membran direndam dalam staining solution 5 menit.Lakukan destaining (2,3,4 dan 5) untuk melarutkan sisa cat yang tidak terikat oleh proteinMasukkan dalam dehydration solution (6)Tempelkan cell. Acetat membran pada obyek glass (hindari gelembung udara)Masukkan dalam clearing solution (7) sehingga menjadi trasparan3. Pembacaan (kualitatif dan kuantitatif)Tutor kimia klinik

83. 80Tris barbital buffer: PH 9,2 ± 0,30,92 % barbital5,15 % Na barbital0,10 % sodium azide1 vial dilarutkan dalam I liter aquadest tahan hingga 1 tahun, suhu ruangan.Tutor kimia klinik

84. 81Amidoblack stain, PH 2,Amidoblack 0,4 g/dl dan Ethylene glycol 6,7 %Ganti tiap staining 10 gelLarutkan 1 vial dengan 300 ml aquadest.Working solution stabil hingga setahun.Destaining solution0,05 g/dl citric acid1 ml stock solution dalam 1 literWorking solution stabil 1 minggu dalam suhu ruangan, pada botol tertutupBila terjadi perubahan warna kontaminasi bakteri+ 5 uL/dl Proclin 300Tutor kimia klinik

85. 82Fixation solution60 % etanol10 % asam asetat30 % aquadest Tutup rapat untuk mencegah evaporasi. Ganti setiap 3 bulan. Jangan mencapur > 4 gel dalam fixation solution.Tutor kimia klinik

86. 83PROTEINCONC.RANGE (g/L)M.WEIGHTACTIONSCHARACTERISTIC OF MAJOR PLASMA PROTEINSPrealbuminAlbumin 1-Antitrypsin2-MacroglobulinHaptoglobin -LipoproteinTransferrinC3FibrinogenIgAIgDIgE IgGIgM0.15-0.3639-51 2.0-4.01.5-3.50.4-2.9 2.7-7.42.0-4.00.6-1.41.0-4.00.4-3.50.1-0.450-600(g/L) 7-150.25-2.062,00066,000 54,000725,000100,000type1-1380,00080,000185,000340,000160,000180,000180,000 150,000850,000Binds thyroxine: transport vit.AOncotic pressure: amino acid reservoir: carries small moleculesProtease inhibitorProtease inhibitorBinds hemoglobin Lipid transportTransport IronComponent of complement systemClot formationSurface immunity Binds to mast cell: hypersensitivity reactionsHumoral immunityHumoral immunity primary response Tutor kimia klinik

87. 84pendahuluanHemoglobin merupakan konjugasi komplek protein yang mempunyai BM mendekati 64.500.Hemoglobin: - Heme : komplek dari fe (II) dan protoporphyrin. - Globin : 2 pasang rantai polipeptida dari asam amino.Tutor kimia klinik

88. 85Tutor kimia klinik

89. 86pendahuluanKelainan Hemoglobin terdiri: 1. Kualitatif -> struktural, substitusi asam amino dari rantai polipeptida ( Hemoglobinopati ). Hb S -> α2β26 glutamic->valin Hb C -> α2 β26 glutamic -> lysinTutor kimia klinik

90. 872. Kuantitatif : Penurunan sintesis dari 1 atau beberapa rantai globin. Talasemia α, kelainan pada rantai alfa. Talasemia β, kelainan pada rantai beta. Tutor kimia klinik

91. 88Elektroforesis dalam suasana asam memakai media agar gel (Citrate agar electrophoresis pH 6,2 ) dapat memisahkan Hb S dari Hb D dan Hb G juga Hb C dari Hb E dan Hb O. Tutor kimia klinik

92. 89ELEKTROFORESIS HEMOGLOBIN( Indikasi )Anamnesis : mempunyai riwayat Anemi dan ikterik serta kelainan yang berhubungan dengan darah.Riwayat keluargaPemeriksaan fisik didapati Hepatosplenomegali.Anemia,MCV↓, MCHC↓,MCH↓,RDW↑.Tutor kimia klinik

93. 90prinsipHemoglobin bersifat amfoter ( dapat bermuatan positif dan negatif ).Pada pH basa akan bermuatan negatif dan akan bergerak ke kutub positif ( anoda ).Pada PH asam akan bermuatan positif dan akan begerak ke kutub negatif ( katoda ).Tutor kimia klinik

94. 91Macam – macam metode pemisahan hemoglobin Elektroforesis basa -> starch gel, polyacrylamide gel, cellulose asetat, agarose gel. Pada pH 8,6.Elektroforesis pada suasana asam -> agarose gel dan agar gel/ agar citrat. Pada pH 6,2.Tutor kimia klinik

95. 92Macam – macam metode pemisahan hemoglobin Globin chain elektroforesis -> cellulose asetat, agar citrat. Pada pH basa dan asam.Isoelectric focusing ( IEF ) -> polyacrilamide gel dan agarose gel. Pada pH gradient.Tutor kimia klinik

96. 93PROSEDUR KERJA 1. Pembuatan sampel 2. Fase migrasi 3. Fase fiksasi 4. Staining dan Destaining 5. ScanningTutor kimia klinik

97. 94SAMPELDarah + antikoagulan ( EDTA, Citrat, Heparin ).Dibuat Hemolisat : 1. Sentrifuse sampel 5000 rpm, 5 menit. 2. Buang plasmanya. 3. Cuci eritrositnya 2 x dengan 10 volume saline, sentrifuse 5000 rpm, 5 menit. 4. Buat hemolisat 10 µl sel darah merah dengan 130 µl Hemolizing solution. 5. Letakkan pada vortex 10 detik dan inkubasi 5 menit pada suhu ruangan.Tutor kimia klinik

98. 95Elektroforesis Hemoglobin (Sebia K20)Sampel : darah + antikoagulan (EDTA, Citrat, atau heparin). Penyimpanan maksimal 5 hari 20 – 80 C. Persiapan hemolisat :1. Sentrifus sampel 5000 rpm ,5 menit.2. Buang bagian plasma.3. Cuci eritrosit 3 X dengan 10 volume saline;sentrifus masing – masing 5000 rpm, 5 menit.4. Buat hemolisat 10 uL sel darah merah dengan 130 uL Hemolizing solution.(1 : 13)5. Letakkan pada vortex 10 detik dan inkubasi suhu ruangan 5 menit.Tutor kimia klinik

99. 96Prosedur ELP Hb (Sebia K20)1. Tempatkan hydragel K20 applicator carrier pada permukaan datar.2. + 120 uL aquabidest pada applicator carrier.3. Tempatkan aplikator pada permukaan datar.4. + 10 uL hemolisat pada masing sumuran pada aplikator, patahkan ujungnya5. Buka bungkus hydragel agarose gel plate.6.Serap buffer pada agarose gel dengan filter paper .7. Tempatkan agarose gel pada hydragel K 20 applicator dengan posisi kutub + diatasTutor kimia klinik

100. 97Lanjutan……. 8. Tempatkan applicator pada applicator carrier diposisi no 4.9. Turunkan applicator sampai menyentuh permukaan agarose gel dengan memutar switch perlahan –lahan,10.Tunggu 1 menit, kemudian angkat perlahan – lahan.11.Pindah agarose gel ke chamber dengan posisi kutub + kearah kutub + pada chamber. Posisi agarose gel menghadap kebawah.12. Nyalakan power supply dengan kondisi: - volume buffer per compartement 150 ml - total volume buffer 300 mlTutor kimia klinik

101. 98Lanjutan…….. - waktu migrasi 5 menit - Voltage 165 Volt - Arus ampere 7 ± 2 mA13. Pindah gel untuk difiksasi 15 menit.14. Keringkan gel (inkubator IS 80),suhu 800 C, 10 menit. Biarkan dingin selama 1 menit.15. Pewarnaan (staining) selama 5 menit.16. Destaining 3 tahap .17. Keringkan pada inkubator IS 80.18. Pembacaan hasil (posisi menghadap kebawah)Tutor kimia klinik

102. 99Hasil ELP Hb (Sebia K20)Gambar 14.Tutor kimia klinik

103. 100Nilai normal Hb electrophoresis Dewasa Hb A : >95 % Hb A2 : 1,5 – 3,5 % Hb F : < 2 %Quality control Assayed blood sample berisi Hb A, F, C dan S ataupopulasi sehat 200 dewasa (laki dan wanita) untukmencari mean ± 2 SDTutor kimia klinik

104. 101Hasil ELP protein serumTutor kimia klinik

105. 102Tutor kimia klinik

106. 103Tutor kimia klinik

107. 104Tutor kimia klinik

108. 105Tutor kimia klinik

109. 106Tutor kimia klinik

110. 107Quality ControlKontrol dari sampel patologis yang sudah diketahui.Kontrol komersial yang mengandung Hb A, Hb F, Hb C, Hb S.Tutor kimia klinik

111. ScanningScan dengan densitometer/scanner pada 570 nm ataudengan filter kuning.QUALITY CONTROLPadasetiapserianalisisdianjurkanuntukmemakaidarahkontrolassayed (misalnyakontrolHb A2 normal, Sebia, PN 4778 ataukontrolHb A2 patologis, Sebia, PN 4779) atausampeldarahassayed yang mengandungHb A, F, S dan C (misalnyakontrolHb AFSC, Sebia, PN 4792).108Tutor kimia klinik

112. 109Sampel bertahan 1-2 hari pada suhu 4ºC atau – 20 ºC selama 1 bln.Tutor kimia klinik

113. 110Agarose gel dan agar gelAgar gel tediri dari: agarose dan agaropectinAgarose gel td : bentuk murni dari agar dimana agaropectinnya sudah tidak ada..Untung agarose gel: mengurangi efek endosmosis ok agaropectinnya tidak ada.Tutor kimia klinik

114. 111EL. Hb pada agar gel ph 6,2Agar gel : agarose dan agaropectin. Agarose menjadi zat yang immobile,agaropectin akan berikatan dengan hemoglobin. Hb S terletak dipermukaan punya afinitas tinggi thdp agaropectin. Hb D,G terletak lebih dalam lagi punya afinitas rendah thdp agaropectin.Hb C punya afinitas yang tinggi thdp agaropectin, Hb E tidak.Tutor kimia klinik

115. 112GLOBIN CHAIN ELEKTROFORESIS- Pemisahan rantai globin sangat berguna jika hasil antara cellulose asetat dan agar citrat mempunyai hasil yang sama ( Hb E dan O ). - Penggunaan mercaptoetanol dan urea dapat memisahkan heme dan globin, serta memisahkan rantai α dan non α. - Rantai globin mempunyai muatan yg beda dan migrasi yg beda antara asam dan basa.Tutor kimia klinik

116. 113Metode IEFMirip elektroforesis, kec pemisahan partikel partikel pada pH gradien dengan penambahan amfolites. Kutub anoda dilakukan pada cairan asam dan kutub katoda diletakkan pada cairan basa. Pada pH gradienProtein akan bergerak sesuai isoelektrik point.Tutor kimia klinik

117. 114Teknik ElusiTanpa clearing, masing-masing band dipotong, masukkan tablet elusi ( larutan Na2 CO3 0,5%) kedalam tabung. Masing- masing larutan dibaca denagn fotometer 590 nm, kolorimeter denag filter oranye.Kesalahan: pemotongan band, elusi tidak sempurna, baca fotometer.Tutor kimia klinik

118. 115ELP protein urine (Sebia K20)Prosedur pemeriksaan sama dengan ELP protein serum, hanya sampel urine (24 jam) harus dikonsentrasikan sebelum aplikasi pemeriksaan kecuali bila menggunakan metode staining yang sensitif (gold or silver stain). Agarose gel yang digunakan hydragel proteinuriaAnderson (1979) : 1/3 bagian albumin, 2/3 terdiri dari α,ß, ƳglobulinTutor kimia klinik

119. 116InterpretasiTutor kimia klinik

120. 117Interpretasi…….Tutor kimia klinik

121. ELP protein cerebrospinal fluidBahan cerebrospinal fluid perlu disentrifus 400 – 500 rcf 5 menitAgarose gel : hidragel HR K20Reference value: Protein 15 – 45 mg/dl Prealbumin 2- 7 % albumin : 56 – 76 %α1 globulin: 2 – 7 %α2 globulin : 4 – 12 % ß globulin: 8 – 18 % Ƴ globulin : 3 – 12 %118Tutor kimia klinik

122. 119ELP protein synovial fluidProtein 1 – 3 g/dl albumin : 55 – 70 %α1 globulin: 6 – 8 %α2 globulin : 5 – 7 % ß globulin: 8 – 10 % Ƴ globulin : 10 – 14 %Tutor kimia klinik

123. 120Hasil ELP protein urine Tutor kimia klinik

124. 121Hasil ELP protein urineTutor kimia klinik

125. Tutor kimia klinik122Sejarah Elektroforesis1900 Michaelis - pergerakan ion dalammedanlistrik1937 Tiselius – moving boundary, larutanbebas.1946 Consden – silica gel.1950an Starch gel, agar gel, celulose acetate, Polyacrylamide gel, immunoelectrophoresis.

126. Tutor kimia klinik1231960an Isoelectric focusing1990an Capillary electrophoresis / teknikotomatis2000 Electrophoresis microchip multichannel.

127. Tutor kimia klinik124Perkembangan Tehnis BaruIsoelectric FocusingHigh Resolution Protein ElectrophoresisCapillary Electrophoresis

128. Tutor kimia klinik125Isoelectric focusing (IEF)Resolusisangattinggi.Prinsipkerja: molekulbermigrasimelaluigradienpH. Anode: larutanasam; padakatode: larutanbasa, ruangdiantaranyadiisiampholyte. AmpholytemenujupI.Media pilihan: polyacrylamide gel.Aplikasiklinis: isoenzymacid phosphatase, isoformcreatininekinasedan alkaline phosphatase, deteksi pita oligoclonalcairanserebrospinal.

129. Tutor kimia klinik126High Resolution Protein Electrophoresis (HRE)Agarose gelpadavoltasetinggi (> 250 volts), dalamsuatusistem water cooled. Dapatmendeteksi 15 pita ataulebih, tergantungkemurnian media, komponen buffer, macam cat, misalnya:amido black 10B mendeteksi protein > 30 – 50 mg/dL. Pengecatanperakmendeteksi protein 100μg/dLtanpakonsentrasisampel.

130. Tutor kimia klinik127Aplikasi klinis HREelektroforesiscairanserebrospinalpadapenyakitdemyelinisasi,deteksi pita oligoklonalpada multiple sclerosis, deteksi monoclonal gammopathy, separasidankarakterisasi protein urindariglomerulusmaupundaritubulus.

131. Tutor kimia klinik128Capillary Electrophoresis (CE)Terdiridari: Sebuahkapilerfused silica, Duapenampung buffer elektrolit, Sumbertenagabertegangantinggi(10 – 30 kV) denganmedanlistriktinggi (100 – 1000 V/cm) Sebuahdetektor yang dihubungkandenganalatpengolah data.

132. Tutor kimia klinik129Gambar CE

133. Tutor kimia klinik130Sampelmasukkedalamkapilerdengancaraelectrokinetic injectionatauhydrostatic injection.Volume sampelhanyasedikitsekali (nanoliterataupicoliter). Sample dipisahkanolehpengaruhaliranelektrosomotik.Kelebihan CE : cepat, resolusitinggi, otomatisasi.

134. Tutor kimia klinik131Gambar elektroosmotik

135. Tutor kimia klinik132

136. Tutor kimia klinik133Gambar cara sampel masuk (sample injection)

137. KESALAHAN DAN KETERBATASAN :Janganmenggunakansampel yang sudahlisis.Aplikasisampel :Hindariaplikasisampel yang berlebihan. Sampel yang berlebihandapatmenyebabkandistorsi pita yang terbentuk. Beberapaprosedurmembutuhkanjumlahsampel yang spesifik yang bisadidapatkandenganmenggunakanmikropipet. Cara lain denganmemakaiaplikator. Pemakaianaplikatorharusbersihdanlurusdanpastikanmemakaiukuran yang tepat.134Tutor kimia klinik

138. Bufer :Bufer yang terkontaminasiatausudah lama, akanmenghasilkanpolamigrasi yang pendek. Jikasedangtidakdigunakan, buferharusdidinginkanuntukmenghindaritumbuhnyamikroorganisme.Media penyangga :Perlakukan media penyanggadenganhati-hati. Hindarisidikjariataukontaminasilainnyasebelum media dibersihkandandikeringkan. Memasukkan media kedalambuferharusperlahansehinggatidakadagelembungudara yang terperangkap. Mengeringkan gel padakertas filter untukmengurangikelebihancairan, karenameletakkansampelpada gel yang terlalubasahakanmenghasilkan pita yang melebar.135Tutor kimia klinik