1. TUGAS PRESENTASI KELOMPOK BIOMOL
DNA-Based Species Level Detection Of Glomeromycota:
One PCR Primer Set For All Arbuscular Mycorrhizal Fungi
Oleh :
Kelompok 3
DANDY EKO PRASETIYO P2BA11005
MIA AZIZAH P2BA11021
FEBRIAN KUSUMA A. P2BA11025
ARIE AMELIA P2BA11033
MAGISTER ILMU BIOLOGI
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
PURWOKERTO
2011

2. DNA-Based Species Level Detection Of Glomeromycota:
One PCR Primer Set For All Arbuscular Mycorrhizal Fungi
LATAR BELAKANG
Arbuskular Micorrhizal Fungi (AMF) berasosiasi dengan 70-90% tanaman tanah dalam
sebuah simbiosis yang disebut arbuskular micorrhiza (AM) dan telah ada sejak 400 juta
tahun. AMF memindahkan nutrient inorganik dan air ke tanaman dan menerima karbohidrat
dalam pertukarannya. Dari studi ekologi molekuler, diketahui bahwa spesies menunjukkan
hanya sebagian kecil diversitas AMF.
Untuk mengungkapkan aspek-aspek fungsional dan ekologi dari jarak hubungan AMF
dengan tumbuhan berbeda atau kondisi lingkungan yang berbeda, maka perlu dideteksi
komunitas AMF pada level spesies. Namun ada metode untuk tujuan ini yang tidak hanya
untuk identifikasi morfologi tetapi juga untuk metode molekuler. Prisipnya, metode dasar
sekuens DNA berguna untuk mendeteksi organisme pada level komunitas berbeda, tetapi
untuk ekologi dibutuhkan juga database dan alat.
Karakterisasi molekuler AMF kebanyakan diperoleh dengan PCR pada DNA dari
akar tanaman inang, spora atau sampel tanah. Beberapa primer penargetan daerah rDNA
sebagai penanda molekuler diklaim sebagai AMF tertentu. Kebanyakan dari amplifikasi ini
hanya dibatasi pada sejumlah taksa Glomeromycotan atau DNA dari organisme nontarget.
Kebanyakan takson sampling paling komprehensif untuk Glomeromycota meliputi subunit
kecil/small subunit (SSU) daerah rDNA. Baru-baru ini, sepasang primer yang spesifik untuk
AMF telah diketahui yaitu : AML1 dan AML2.
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui primer yang sesuai untuk amplifikasi DNA
dari seluruh anggota garis keturunan Glomeromycota dan untuk mengembangkan ilmu
pengetahuan untuk analisa molekuler dari komunitas Arbuskular Micorrhizal Fungi (AMF).
BAHAN DAN METODE
Jamur dan bahan tanaman untuk tes primer
Diuji sampel yang berbeda sebagai DNA template PCR, untuk menguji spesifisitas rancangan
primer baru. diantaranya memasukkan plasmid , ekstraksi DNA dari spora CMA tunggal dan
sampel akar dari Andes (Ekuador) dan Pegunungan Spessart (Jerman). Primer diuji untuk
spesifitas oleh PCR dengan plasmid yang membawa fragmen rDNA dengan urutan yang
dikenal. Semua plasmid telah diamplifikasi dari satu ekstrak DNA spora dengan SSU primer

3. rDNA SSUmAf, dijelaskan di sini, dan LSU rDNA LR4 primer 2 (dimodifikasi dari LR4;
www.aftol.org). Karena spesifisitas SSUmAf tidak bisa diuji secara langsung.
Ekstraksi DNA untuk tes primer
Semua peralatan yang digunakan disterilisasi dan DNA bebas. Dibersihkan, spora tunggal
AMF DNA diekstraksi dengan DNA Dynabead Universal Kit (Invitrogen, Karlsruhe, Jerman)
seperti dijelaskan dalam Schwarzott & Schüßler (2001). Akar berpotensi terdapat AMF
dipotong sepuluh 0,5 cm dan dikumpulkan dalam tabung Eppendorf tunggal 1,5 ml yang
mengandung satu tungsten karbida (diameter 3 mm; Qiagen, Hilden, Jerman). Kemudian
dibekukan dalam N2 cair dalam tabung tertutup, ditempatkan di N2 cair. Untuk CTAB,
ekstraksi larutan penyangga (750 ml untuk 75 jaringan mg) ditambahkan ke setiap sampel
beku, jaringan tanah, diikuti oleh inkubasi pada 60 ° C selama 30 menit. Selanjutnya volume,
ditambahkan campuran kloroform-isoamylalcohol dengan perbandingan (24: 1). Sampel-
sampel tersebut disentrifugasi selama 5 menit pada 2570 g dan bagian fase atas dipindahkan
ke dalam tabung yang baru. Setelah penambahan 2,5 ml RNase (10 mg ml-1) ini diinkubasi
pada suhu 37 ° C selama 30 menit. Satu volume kloroform-isoamylalcohol (24: 1) kemudian
ditambahkan dan tabung disentrifugasi seperti di atas. Supernatan dikumpulkan dan dua
pertiga volume isopropanol ditambahkan. Sampel diinkubasi pada suhu 4 ° C selama 15
menit. Setelah sentrifugasi (10.290 g selama 10 menit) pelet dicuci pada 70% etanol, udara
kering, dan dielusi dalam 100 ml H2O. Volume 2-5 ml dari masing-masing ekstrak DNA
digunakan sebagai template PCR.
Kondisi PCR
DNA Polymerase pada PCR menggunakan pasangan primer SSUmAf–LSUmAr or
SSUmCf–LSUmBr. Reaksi menggunakan campuran yang terdiri dari 0.02 U µl−1 Phusion
polymerase, 1× Phusion HF Buffer dengan 1.5 mm MgCl 2, 200 µm dari tiap dNTP and 0.5
µm tiap-tiap primer. Kondisi PCR yang pertama disesuaikan menurut Eppendorf
Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg,Germany), yaitu masing-masing 5menit
denaturasi pada suhu 990C, 40 siklus dalam 10 detik pada suhu 990C, 30 detik annealing pada
60°C and 1 menit elongasi pada 72°C; and a 10 menit elongasi terakhir. Kondisi yang sama
juga digunakan pada nested PCR, kecuali suhu annealing 63°C dan hanya terjadi 30 siklus.
Produk PCR akan memuat 1 % gel agarose dengan 1x sodium borate buffer dan visualisasi
akan terlihat setelah pemberian ethidium bromide (1 µg ml−1).
Kloning, RFLP dan sequencing Produk reaksi polymerase chain diklon dengan Nol
Blunt TOPO PCR Kit Kloning (Invitrogen) sesuai dengan instruksi, untuk mengurangi biaya
yang digunakan hanya sepertiga dari volume tertentu dari semua komponen digunakan.

4. Hanya media SOC untuk pertumbuhan bakteri awal setelah transformasi digunakan dalam
volume sesuai petunjuk. Dari kloning dapat dianalisis sampai dengan 48 klon untuk sisipan
plasmid yang sesuai. Dalam beberapa kasus lebih sedikit klon yang tersedia karena efisiensi
kloning rendah. Koloni-PCR dilakukan dengan DNA Polymerase GoTaq (5 U ml-1;Promega,
Mannheim, Jerman) dan dimodifikasi dengan M13F dan M13R. Untuk mendeteksi
intrasporal dan intersporal pada urutan variabilitas di klon, RFLP dilakukan dengan Volume
10 reaksi ml, 5 ml mengandung koloni-produk PCR. Satu atau dua klon untuk masing-masing
pola pembatasan disekuensing, menggunakan primer M13, oleh Unit Layanan Sequencing
LMU pada ABI kapiler sequencer dengan BigDye v3.1 (Terapan Biosystems, Foster City,
CA, USA) sekuensing kimia. Urutan yang dirakit dan diedit di seqassem dan disimpan di
EMBL / GenBank / DDBJ database dengan nomor aksesi FM876780 untuk FM876839.
Desain primer
Untuk desain primer baru CMA urutan tertentu keselarasan didirikan dengan menyelaraskan
program (www.sequentix.de) dan ARB (Ludwig et al, 2004.). Secara total > 1000 urutan
AMF,mencakup semua garis keturunan filogenetik yang diketahui, dianalisis untuk desain
SSU dan LSU rDNA primer. Untuk keselarasan dalam ARB yang database kombinasi dataset
baru kita dan 94 rilis versi dari database SILVA (Pruesse et al., 2007,www.arb-silva.de)
digunakan. Oligonukleotida yang kemudian disintesis sebagai standar primer (25 nmol) oleh
Invitrogen.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Design Primer
Memiliki kecocokan untu tempat mengikat primer yang sesuI dengan sekuen AMF tetapi
tidak cocok terhadap tanaman dan urutan jamur non-AM (non-AMF) yang diidentifikasi
untuk SSU rDNA dan LSU rDNA. Mereka berada pada posisi 1484 dan 1532 pada SSU dan
di posisi 827 dan 928 pada LSU rDNA (berdasarkan pada Glomus sp. "intraradices" sekuen
DAOM 197198 gambar 1 C).glomeromycota . variasi sekuern membuatnya tidak mungkin
untuk memperoleh individu sekuen primer yang khusus meng aplifikasi Glomeromycota.
Dengan demikian , satu set dari empat primer campuran didesain, setiap target mengikat satu
situs ( Tabel 2, fig .1). Ketidaksesuaian tempat tertentu pada non-3 ' hanya sedikit mengubah
titik temperatur dan beberapa ketidaksesuaian lain (Glomus etunicatum) yang mungkin
disebabkan oleh kualitas sekuen yang rendah yang diterima oleh desain primer (Gambar 1).

5. Untuk menghilangkan ketidaksesuaian nontarget organisme pada ujung 3 'maka primer
dimasukkan. Pencarian BLAST menunjukkan spesifisitas yang tinggi dari pasangan-
pasangan primer baru untuk AMF.
Sekuen Glomeromycota yang mewakili variabilitas dikenali pada lokasi yang
mengikat primer, ditunjukkan pada Gambar. 1. Kami juga memasukan gambaran beberapa
garis keturunan dengan filogenetik (Gambar 2) untuk desain primer yang memungkinkan.
Namun, taksa berikut ini tidak bisa dimasukkan untuk mengikat LSU rDNA dalam analisis :
Entrophosporaceae, berisi dua spesies yang tidak memiliki data sekuens; Archaeosporaceae,
karena urutan yang tersedia tidak menutupi tempat mengikat LSU rDNA ; Otospora yang
hanya dua non overlapping parsial pada sekuen SSU rDNA yang diketahui, Intraspora,
diwakili oleh satu database sekuen SSU rDNA.
Primer specificity – discrimination against plants
Diskriminasi primer SSUmAf1 terhadap tanaman tingkat 'rendah' sangat lemah dan
dicontohkan oleh hanya satu ketidakcocokan pada urutan database dari lumut
(Polytrichastrum, Leptodontium dan Pogonatum), liverwort (Trichocoleopsis), hornwort
(Phaeoceros) dan clubmoss (Selaginella). Burmannia, Phaseoleae sp. dan beberapa sekuen
tanaman lainnya juga menunjukkan hanya satu ketidakcocokan. Semua sekuen pada tanaman
lainnya memiliki minimal dua ketidaksesuaian, terutama pada ujung 3 'dari primer. Untuk
SSUmAf2 setidaknya ada dua ketidaksesuaian untuk semua sekuen tanaman, kecuali lumut
(Archidium) dengan hanya satu ketidakcocokan. Untuk primer forward SSUmCf1 minimal
memiliki tiga ketidaksesuaian untuk semua tanaman, kecuali untuk satu sekuen Phaseoleae
lingkungan dengan dua ketidaksesuaian, yang diamati. SUUmCf2 tidak Cocok di satu tempat
pada sekuen Phaseoleae yang sama dan pada liverworts (radula, Ptilidium dan Porella),
hornwort (Anthoceros) dan spesies Taxus.Sekuen tanaman lainnya ditampilkan minimal
memiliki dua ketidaksesuaian, setidaknya satu pada ujung 3'. Untuk sekuen SSUmCf3 yang
disebutkan di atas yang menunjukkan ketidakcocokan Phaseoleae tidak ada, tetapi semua
urutan Phaseoleae lingkungan lainnya setidaknya memiliki satu ketidakcocokan di daerah
ujung 3'primer. SSUmCf3 juga menunjukkan hanya satu ketidaksesuaian untuk urutan
liverworts (radula, Ptilidium dan Porella), hornwort (Anthoceros) dan satu sekuen Liliopsida
dan Taxus. Sisa blas hits ditampilkan dua ketidaksesuaian (Taxus spp, Pinus. Dan
Haplomitrium liverwort) atau lebih. Hasil ini menunjukkan bahwa untuk campuran primer
SSUmAf dan SSUmCf diskriminasi 'rendah' terhadap tanaman kurang dari untuk tanaman
vaskular.

6. LSU rDNA primer memiliki setidaknya dua ketidaksesuaian dengan sekuens
tanaman. Minimum untuk LSUmAr1 empat ketidaksesuaian dengan urutan Brassica.
LSUmAr2 dan LSUmAr3 menunjukkan empat ketidaksesuaian untuk urutan Medicago,
dalam kasus LSUmAr2 ini berlaku juga berlaku untuk Vitis vinifera dan Oryza sativa. Semua
urutan tanaman lainnya menunjukkan ketidaksesuaian lebih untuk LSUmAr1, LSUmAr2 dan
LSUmAr3.
LSUmAr4, yang dirancang untuk menargetkan Paraglomeraceae, dua ketidaksesuaian
yang ditemukan untuk Solanum Lycopersicum diikuti oleh setidaknya tiga untuk semua
urutan tanaman lainnya. Set primer LSUmBr memiliki minimal tiga ketidaksesuaian untuk
sekuens tanaman. LSUmBr1 menunjukkan lebih dari tiga ketidaksesuaian ke Lotus dan
urutan Brassica. Setidaknya tiga ketidaksesuaian (untuk ephedra dan Larix) terjadi untuk
LSUmBr2. Ada tiga ketidaksesuaian untuk LSUmBr3 untuk Selaginella, diikuti oleh
liverwort (Trichocoleopsis) dan lumut (Bryum) spesies dengan empat. LSUmBr4 memiliki
tiga ketidaksesuaian untuk V. vinifera dan setidaknya lima untuk semua urutan tanaman
lainnya. LSUmBr5 ditampilkan lebih dari empat ketidaksesuaian untuk setiap urutan
tanaman.

7. Gambar. 3 Polymerase chain reaction amplifikasi dengan primer SSUmAf-LSUmAr (sekitar
1800 bp amplikon) dan SSUmCf-LSUmBr (sekitar 1500 bp amplikon). (a) PCR pada
fragmen DNA clone, menggunakan temperatur annealing yang berbeda dan konsentrasi
template dari 1 ng ml-1. Seperti, Acaulospora sp; Gs, glomus sp;.. Gl, glomus korpus, Ps,
Pacispora scintillans, Kk, Kuklospora kentinensis; Gi, intraradices glomus, Sh, Scutellospora
heterogama; N, kontrol negatif. Annealing suhu: 1, 55 ° C, 2, 55,7 ° C; 3, 57,8 ° C, 4, 60,5 °
C; 5, 63,1 ° C; 6, 65 ° C; 7, 55,2 ° C; 8, 56,6 ° C ; 9, 59,1 ° C, 10, 61,8 ° C; 11, 64,2 ° C; 12,
65,5 ° C. (b) PCR menggunakan 1 ml dari pengenceran 10 kali lipat plasmid (100 pg - 0,01
ml fg-1) sebagai template, sesuai dengan 5 × 107-5 molekul plasmid dalam 20 ml Volume
reaksi PCR. Annealing suhu: SSUmAf-LSUmAr 60 ° C; SSUmCf-LSUmBr 63 ° C N,
kontrol negatif; Marker, NEB 2-Login DNA Tangga (bp: 10 000, 8000, 6000, 5000, 4000,
3000, 2000, 1500, 1200, 1000 (panah), 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100).
Tes efisiensi Primer pada plasmid dan ekstrak DNA spora tunggal
Pasangan primer baru yang dirancang untuk mengamplifikasi fragmen 1800 bp (primer
SSUmAf-LSUmAr) dan 1500 bp (SSUmCf-LSUmBr). Dalam tes amplifikasi PCR pertama,
sampel yang dipilih meliputi garis keturunan filogenetik Glomeromycota yang berbeda.
Kloning rDNA digunakan dari spesies AMF Acaulospora sp. dan Kuklospora kentinensis
(Acaulosporaceae), Glomus korpus, Gl. intraradices dan sp glomus. (Glomeraceae),
Pacispora scintillans (Pacisporaceae), dan Scutellospora heterogama (Gigasporaceae) (Tabel
1, Gambar. 3a). Sebagai tambahan, fragmen-fragmen rDNA diamplifikasi dari ekstrak DNA
spora tunggal dari pyriformis Geosiphon (Geosiphonaceae), Gl. mosseae (Glomeraceae), Gl.
eburneum dan Gl. versiforme (Diversisporaceae), sp Paraglomus. (Paraglomeraceae), dan
Gigaspora sp. (Gigasporaceae) (tidak ditunjukkan). Semua spesies AMF yang diuji berhasil
diamplifikasi dengan primer baru.
Untuk menguji sensitivitas potensial primer baru, digunakan plasmid yang sama seperti
dalam tes PCR pertama dan tambahan sisipan plasmid dari Gigaspora sp, Gl.. versiforme dan
Ge. pyriformis (Tabel 1, Gambar. 3b). Mereka diencerkan selama beberapa magnitudo
(konsentrasi) yang mengandung 100 pg, 10 pg, pg 1, 100 fg, fg 10, 1 fg, fg 0,1 dan 0,01 ml fg
DNA-1. Satu mikroliter digunakan sebagai template untuk PCR, sedangkan empat
konsentrasi terendah menyesesuaikan dengan 5000, 500, 50 dan 5 molekul plasmid dalam 20
µml volume reaksi PCR. Kedua set primer diuji secara independen. Perbedaan spesifitas
antara set primer pertama dan primer bersarang (gabungan) diamati pada Pacispora,

8. Kuklospora, dan Geosiphon. Untuk Pacispora PCR dengan SSUmAf dan LSUmAr
dihasilkan, bahkan dengan konsentrasi DNA terendah, sebuah pita jelas terlihat, sedangkan
PCR dengan SSUmCf dan LSUmBr menghasilkan pita-pita yang lebih lemah, yang
menunjukkan spesifisitas rendah. Pita lemah juga diamati pada amplifikasi rDNA Ku.
kentinesis dengan primer SSUmCf-LSUmBr dan Ge. pyriformis dengan SSUmAf-LSUmAr.
Namun, perbedaan-perbedaan ini mungkin dalam rentang-error pengukuran konsentrasi DNA
plasmid fotometrik dari saham-solusi. Hanya sedikit atau tidak terjadi perbedaan antara
plasmid template lainnya, ketika membandaingkan intensitas pita, kecuali untuk Gl.
versiforme. Pita di sini, jelas terlihat hanya ditemukan konsentrasi DNA yang lebih tinggi,
tetapi dengan pola yang sama untuk kedua pasangan-pasangan primer. Namun, hal tersebut
disebabkan oleh integritas DNA template yang rendah. seri pengenceran selanjutnya dengan
persiapan plasmid segar (juga dari Diversisporaceae lain) tidak dapat dibedakan dari yang
diperoleh dengan spesies lain yang ditunjukkan pada Gambar. 3 (b). Untuk Ku. kentinensis
tidak ada amplikon dapat diamati setelah PCR dengan primer SSUmAf-LSUmAr, karena
kloning fragmen awalnya amplifikasi dengan primer bersarang (gabungan). Oleh karena itu
plasmid hanya berfungsi sebagai kontrol negatif dalam PCR pertama dan sebagai kontrol
positif untuk PCR dengan primer bersarang (gabungan)
Tes efisiensi Primer di lapangan dan pembibitan sampel pada akar dan spora
Untuk menguji apakah primer baru yang dirancang berlawanan terhadap jamur
nonglomeromycotan dan tanaman, kita menggunakan mereka, yaitu dengan mengekstrak
DNA spora tunggal pot kultur, sampel akar lingkungan, dan sampel akar dari pembibitan
pohon, dengan menggunakan pendekatan PCR. Kami mengamati tidak ada sekuens
kontaminan non-AMF tunggal di 12 akar lingkungan dan 40 sampel spora tunggal yang
diproses. Diskriminasi terhadap tanaman diuji dengan ekstrak DNA dari akar AMF host
potensial. Spesies yang dikumpulkan terdiri Poa cf. annua, Ranunculus lih. repens, dan
Rumex acetosella dari lapangan di Jerman, dan Podocarpus cf. macrostaqui, Heliocarpus
americanus dan bibit pohon Cedrela montana dari pembibitan pohon di Ekuador. Dari
sejumlah besar pendekatan PCR, hanya pada satu kesempatan, diperoleh tiga klon identik
membawa urutan tanaman (R. acetosella). Database sekuens Rumex terkait (AF189730, 630
bp) mencakup wilayah ITS, tapi tidak berikatan pada situs primer. Primer baru juga berhasil
digunakan pada DNA ekstraksi dari spora AMF tunggal dari pot kultur dan root organ
cultur (ROC). Hal ini menunjukkan amplifikasi PCR dengan cakupan luas filogenetik dari
AMF, sementara secara efisien mendiskriminasi non-AMF dan tanaman (Tabel 3)

9. DAFTAR PUSTAKA
Kruger M., Stockinger, H., Claudia K. and Arthur S. 2009. DNA-based species level
detection of Glomeromycota: one PCR primer set for all arbuscular mycorrhizal
fungi.Jurnal New Phytologis 183: 212–223