Bước Đầu Thử Nghiệm Nuôi Cấy Dunaliella Salina Trên Giá Thể Bacterial Cellulose

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
************
BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY
Dunaliella salina
TRÊN GIÁ THỂ BACTERIAL CELLULOSE
Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
Th.S NGUYỄN THỊ MỸ LAN VÕ THỊ THANH HƯƠNG
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 12/2009

LỜI CẢM ƠN
  
Trước hết con xin cảm ơn Ba, Mẹ và tất cả mọi người trong gia đình. Mọi
người luôn bên cạnh, yêu thương và che chở cho con, là nguồn động viên lớn lao nhất
cho con vững bước trên đường đời. Không có mọi người sẽ không có con như ngày
hôm nay. Con sẽ mãi ghi nhớ công ơn sinh thành và dưỡng dục này.
Trong suốt thời gian học tập và thực hiện Luận văn tốt nghiệp, em đã nhận
được rất nhiều sự yêu thương và giúp đỡ từ các Thầy cô, Anh chị, các bạn và từ gia
đình.
Đầu tiên em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Mỹ Lan, người đã trực tiếp
hướng dẫn, khích lệ, định hướng và tạo điều kiện thuận lợi cho em để em có thể hoàn
thành đề tài tốt nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn chị Phương, anh Hoàng, anh Hùng trong phòng thí
nghiệm Chuyển hóa sinh học đã giúp đỡ, cho em những lời khuyên bổ ích trong quá
trình làm đề tài.
Em xin gửi đến các Thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học – trường Đại học
Tôn Đức Thắng đã hết lòng truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong những
năm trên giảng đường Đại học. Chính những kiến thức Thầy cô giảng dạy đã là nền
tảng cho em trong quá trình thực hiện đề tài.
Tp. Hồ Chí Minh 12/2009
Võ Thị Thanh Hương

Luận văn tốt nghiệp Mục lục
SVTH : Võ Thị Thanh Hương i
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC........................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Danh mục chữ viết tắt......................................................................................... v
Danh mục bảng................................................................................................... v
Dang mục hình.................................................................................................... vi
Danh mục đồ thị.................................................................................................. vii
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................. 2
1.2. Mục đích và phạm vi đề tài....................................................................... 3
1.3. Yêu cầu ...................................................................................................... 4
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về Dunaliella salina ............................................................... 6
2.1.1. Phân loại ......................................................................................... 6
2.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố .............................................................. 6
2.1.3 Đặc điểm về hình thái-cấu tạo-sinh sản............................................ 6
2.1.3.1. Cấu trúc tế bào ................................................................... 7
2.1.3.2. Sinh sản ............................................................................. 9
2.1.4 Thành phần hóa học ........................................................................ 10
2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của Dunaliella salina........ 12
2.1.6 Nhu cầu dinh dưỡng của Dunaliella salina...................................... 13
2.1.7 Ứng dụng Dunaliella salina ............................................................ 16
2.1.7.1 Sử dụng vi tảo trong dinh dưỡng và thực phẩm................ 16
2.1.7.2 Khai thác các hoạt chất từ tảo ........................................ 16
2.1.7.3 Sắc tố............................................................................... 16
2.1.7.4 Carbohydrate................................................................... 17
2.1.7.5 Sản xuất các nguyên liệu giàu năng lượng ....................... 17

SVTH : Võ Thị Thanh Hương ii
2.2. Tổng quan về Bacterial Cellulose (BC):................................................... 18
2.3. Tổng quan về Acetobacter xylinum........................................................... 18
2.3.1. Phân loại ......................................................................................... 18
2.3.2. Đặc điểm hình thái .......................................................................... 19
2.3.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa............................................................... 19
2.3.4. Quá trình tổng hợp Cellulose........................................................... 20
2.4. Quá trình lên men ..................................................................................... 22
2.4.1. Nguyên liệu lên men........................................................................ 22
2.4.2. Phương pháp lên men...................................................................... 23
2.4.2.1. Nhân giống ...................................................................... 23
2.4.2.2. Lên men (lên men tĩnh)..................................................... 23
2.5. Sản phẩm Bacterial Cellulose................................................................... 24
2.5.1. Cấu trúc Bacterial Cellulose ............................................................. 24
2.5.2. Tính chất ......................................................................................... 25
2.5.2.1. Độ tinh khiết .................................................................... 25
2.5.2.2. Độ bền ............................................................................. 26
2.5.2.3. Khả năng hút nước........................................................... 26
2.5.2.4. Lắp ráp màng trực tiếp trong suốt quá trình
sinh tổng hợp ................................................................... 26
2.5.2.5. Biến đổi cellulose trực tiếp trong suốt quá trình
hình thành....................................................................... 26
2.5.2.6. Biến đổi gen tạo thành Cellulose ..................................... 26
2.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến cấu trúc và tính chất của BC................... 26
2.5.3.1 Điều kiện lên men ............................................................ 26
2.5.3.2 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng ................................... 27
2.5.3.3. Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, nồng độ muối ..................... 27
2.6 Ứng dụng của Bacterial Cellulose ............................................................ 27

SVTH : Võ Thị Thanh Hương iii
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm............................................. 30
3.1.1. Địa điểm.......................................................................................... 30
3.1.2 Thời gian......................................................................................... 30
3.2 Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 30
3.3 Vật liệu và hóa chất................................................................................... 30
3.3.1 Thu mẫu .......................................................................................... 30
3.3.2 Trang thiết bị thí nghiệm ................................................................. 30
3.3.3 Hóa chất .......................................................................................... 31
3.4 Phương pháp thí nghiệm........................................................................... 33
3.4.1 Khảo sát sự tăng trưởng của Dunaliella salina................................. 33
3.4.1.1 Dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục
huyền phù và mật độ tế bào tảo ....................................... 33
3.4.1.2. Dựng đường cong tăng trưởng của Dunaliella salina ...... 34
3.4.2. Lên men Acetobacter xylinum và thu nhận
Bacterial Cellulose (BC).................................................................. 34
3.4.2.1. Hoạt hóa giống ................................................................ 34
3.4.2.2. Nhân giống ...................................................................... 34
3.4.2.3 Sản xuất BC..................................................................... 34
3.4.2.4 Xử lý BC .......................................................................... 35
3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ phối hợp giữa khối lượng BC và
thể tích môi trường lên sự tăng trưởng của Dunaliella salina........... 35
3.4.3.1. Xác định mật độ sinh khối tảo.......................................... 36
3.4.3.2 Xác định độ đậm.............................................................. 36
3.4.4. Nhân sinh khối tảo trong môi trường lỏng và trên giá thể BC .......... 37
3.4.4.1. Xác định trọng lượng khô của tảo trên
hai môi trường nhân giống .............................................................. 37
3.4.4.2. Khảo sát độ đậm chlorophyll của bột............................... 37
3.4.4.3. Xác định hàm lượng protein trong bột ............................. 38
3.4.5. Thử nghiệm khả năng tái sử dụng của BC trong
nuôi cấy Dunaliella salina............................................................... 40

SVTH : Võ Thị Thanh Hương iv
3.4.6. Điều kiện thí nghiệm ....................................................................... 40
3.4.7. Xử lý kết quả thu được.................................................................... 40
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
4.1. Khảo sát sự tăng trưởng của Dunaliella salina....................................... 42
4.1.1. Dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục huyền phù
và mật độ tảo................................................................................... 42
4.1.1.1. Nồng độ sinh khối ............................................................ 42
4.1.1.2. Dựng đường tương quan giữa độ đục huyền phù và
nồng độ sinh khối ............................................................ 42
4.1.2. Dựng đường cong tăng trưởng của Dunaliella salina....................... 43
4.2. Lên men Acetobacter xylinum và thu nhận Bacterial Cellulose (BC) .... 44
4.3. Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ phối hợp giữa khối lượng BC và
thể tích môi trường lên sự tăng trưởng của Dunaliella salina................. 45
4.3.1. Xác định mật độ sinh khối D.salina................................................. 45
4.3.2. Xác định OD sắc tố chlorophyll....................................................... 47
4.3.2.1. Phổ hấp thu ánh sáng của chlorophyll trong D.salina...... 47
4.3.2.2. Xác định OD sắc tố của sinh khối ở độ ẩm khác nhau...... 48
4.4. Nhân sinh khối tảo trong môi trường lỏng và trên giá thể BC ................ 52
4.5 Thử nghiệm khả năng tái sử dụng của BC trong
nuôi cấy Dunaliella salina................................................................................... 56
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận ....................................................................................................... 58
5.2. Đề nghị......................................................................................................... 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt................................................................................................ 59
Tài liệu tiếng Anh ............................................................................................... 60
Tài liệu Internet .................................................................................................. 64
PHỤ LỤC

Luận văn tốt nghiệp Danh mục bảng biểu
SVTH : Võ Thị Thanh Hương v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
D.salina Dunaliella salina
A.xylinum Acetobacter xylinum
BC Bacterial Cellulose
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 So sánh thành phần dinh dưỡng .......................................................... 11
Bảng 2.2 So sánh khoáng chất trong các loại thực phẩm xanh............................ 12
Bảng 2.3 Cấu trúc BC ở một số loài vi khuẩn .................................................... 18
Bảng 2.4 Thành phần của nước dừa.................................................................... . 22
Bảng 2.5 Một số ứng dụng của BC..................................................................... . 28
Bảng 3.1 Tỷ lệ kết hợp giữa khối lượng BC và thể tích môi trường
nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng của Dunaliella salina............... 36
Bảng 3.2 Các thành phần bổ sung trong ống nghiệm.......................................... . 39
Bảng 4.1 Khối lượng và nồng độ sinh khối của các chủng khảo sát.................... . 42
Bảng 4.2 Mật độ sinh khối (mg/ml) của tảo ở các độ ẩm khác nhau
trong 10 ngày khảo sát......................................................................... . 45
Bảng 4.3 Kết quả OD của dịch chiết sắc tố ở các bước sóng khác nhau.............. . 47
Bảng 4.4 OD sắc tố của sinh khối ở các độ ẩm khác nhau trong
10 ngày khảo sát.................................................................................. . 49
Bảng 4.5 Số liệu đường chuẩn albumin .............................................................. . 54
Bảng 4.6 Tổng kết các chỉ tiêu của bột D.salina thu được trên giá thể BC và môi
trường lỏng.......................................................................................... 55

SVTH : Võ Thị Thanh Hương vi
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Vi tảo Dunaliella salina ...................................................................... 6
Hình 2.2. Vi khuẩn Acetobacter xylinum............................................................. 19
Hình 2.3. Con đường tổng hợp Cellulose của Acetobacter xylinum..................... 21
Hình 2.4. Quá trình lên men thu BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum.............. 23
Hình 2.5. So sánh cấu trúc của cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật.............. 24
Hình 2.6. Mô phỏng cấu trúc của cellulose I (a) và cellulose II (b)...................... 25
Hình 4.1 Các sản phẩm của quá trình nhân giống và tạo sản phẩm BC............... 44
Hình 4.2. Dịch chiết sắc tố của D.salina ............................................................. 48
Hình 4.3. Sinh khối tảo trên các nghiệm thức sau
10 ngày nuôi cấy ................................................................................. . 51
Hình 4.4. D.salina trên giá thể BC và môi trường lỏng sau 3 ngày nuôi cấy....... . 52
Hình 4.5. D. salina trên giá thể BC và môi trưởng lỏng sau 10 ngày nuôi cấy.... . 52
Hình 4.6. D.salina trước và sau khi sấy.............................................................. . 52
Hình 4.7. D.salina trên giá thể BC sử dụng lần 1 và lần 2.................................. . 56

SVTH : Võ Thị Thanh Hương vii
DANH MỤC ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1 Đường tương quan tuyến tính giữa OD660 và nồng độ sinh khối tảo... 43
Đồ thị 4.2 Đường cong tăng trưởng của D.salina .............................................. 43
Đồ thị 4.3 So sánh mật độ sinh khối tảo (mg/l) trung bình theo thời gian ........... 46
Đồ thị 4.4 Phổ hấp thu ánh sáng của chlorophyll trong D.salina ........................ 48
Đồ thị 4.5 OD sắc tố chlorophyll của D.salina trong các nghiệm thức................ 50
Đồ thị 4.6 Khối lượng bột D.salina của môi trường có giá thể BC
và môi trường lỏng............................................................................ 53
Đồ thị 4.7 OD của dịch chiết chlorophyll trong bột D.salina trên
hai loại môi trường BC và lỏng.......................................................... 53
Đồ thị 4.8 Đường chuẩn albumin ....................................................................... 54
Đồ thị 4.9 Hàm lượng protein của D.salina ở hai loại
môi trường BC và lỏng...................................................................... 55

Luận văn tốt nghiệp Mở đầu
SVTH : Võ Thị Thanh Hương 1
CHƯƠNG 1
MỞ ĐẦU

1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ:
Hơn 80% năng lượng sử dụng hiện nay trên thế giới là từ nhiên liệu hóa thạch
(dầu mỏ, than đá, khí thiên nhiên,…). Đây là những nguồn năng lượng không tái sinh
được và có giới hạn. Theo Bộ Năng lượng Mỹ và Ủy ban năng lượng thế giới dự báo
nguồn năng lượng hóa thạch không còn nhiều: dầu mỏ còn 39 năm, khí thiên nhiên 60
năm, than đá 111 năm. Trong khi đó nhu cầu năng lượng của cả thể giới ngày càng gia
tăng. Chính vì thế, các nhà khoa học đã lên tiếng cảnh báo cộng đồng quốc tế rằng thời
điểm khủng hoảng năng lượng thế giới đang đến gần khi mà các nguồn cung cấp dầu
mỏ và khí đốt trên thế giới đang cạn kiệt nhanh với tốc độ 4-5% hàng năm. Bên cạnh
đó, các vấn đề môi trường như: ô nhiễm không khí, sự gia tăng hàm lượng CO2 trong
không khí rất đáng báo động dẫn đến hiệu ứng nhà kính,…Do đó, yêu cầu cần thiết
được đặt ra là tìm những nguồn nhiên liệu mới để thay thế nguồn nhiên liệu hóa thạch
đang ngày càng cạn kiệt. Cả thế giới đang đổ xô vào cuộc chạy đua tìm nguồn nhiên
liệu thay thế này. Những nguồn năng lượng tái sinh như năng lượng mặt trời, năng
lượng gió, năng lượng nước, năng lượng hạt nhân,… nhận được sự quan tâm đặc biệt
trở lại của con người và được tăng cường khai thác. Nhưng những nguồn năng lượng
này có một số ưu và nhược điểm nhất định và vẫn chưa thể đáp ứng nổi như cầu về
năng lượng của con người.
Từ những yêu cầu như vậy, người ta hướng sự chú ý đến một nguồn nhiên liệu
mới mà có khả năng thay thế vai trò cua nhiên liệu hóa thạch và phải có một ưu thế nổi
bật là có khả năng tái tạo lại được, đồng thời là nguồn năng lượng “sạch”, không độc
và dễ phân giải trong tự nhiên. Không nguồn nhiên liệu nào thích hợp hơn nhiên liệu
từ sinh vật. Từ đó, thuật ngữ nhiên liệu sinh học –biofuel- ra đời, cho đến nay đã có 3
thế hệ nhiên liệu sinh học ra đời:
 Nhiên liệu sinh học thế hệ I: cồn sinh học (ethanol sinh học) được sản xuất
từ sự lên men sinh khối.
 Nhiên liệu sinh học thế hệ II: - Biodiesel: Diesel sinh học được sản xuất từ
các chất béo, dầu thực vật như dầu đậu nành, dầu mè, dầu dừa, cọ dừa, hạt cải dầu, hạt
hướng dương, hạt lanh , hạt Jatropha…, mỡ cá, mỡ động vật…

 Nhiên liệu sinh học thế hệ III:-Biodiesel từ tảo (tảo dầu)- là một sự thay thế
hòan hảo cho các nhiên liệu hóa thạch không tái tạo do có một số ưu điểm nội trội như:
 Hiệu suất dầu từ tảo thì cao hơn nhiều (10 – 100lần) so với những
cây trồng năng lượng cạnh tranh.
 Tốc độ tăng trưởng nhanh.
 Không cạnh tranh đất trong với cây lương thực.
 Hấp thu CO2.
 Phần sinh khôi sau khi chiết lấy dầu là nguồn lợi kinh thế rất lớn.
Dunaliella salina là loài tảo chịu mặn tốt nhất, phổ biến ở các ruộng muối. Nó
có thể chịu được nồng độ muối từ 3-31% (nồng độ bão hòa). Dunaliella salina còn
được biết đến đầu tiên như là một nguồn lipid tự nhiên bởi Ben-Amotz và cộng sự
(1982). Trong một số điều kiện Stress, lượng lipid tích trữ trong tế bào Dunaliella
salina có thể lên đến 47% trọng lượng khô.
Ngòai ra, Dunaliella salina được đề nghị là một nguồn -carotene thương mại
bởi Massyuk (1996), và sau này được xem như là một nguồn -carotene tự nhiên giàu
có nhất. Hàm lượng -carotene tích trữ trong tế bào Dunaliella salina có thể lên đến
14% trọng lượng khô và có hoạt tính cao gấp nhiều lần so với -carotene từ thực vật.
Hiện nay -carotene từ Dunaliella salina đang được sản xuất thương mại ở Australia,
Mỹ và Isarel, và cũng đang sản xuất quy mô pilot ở Trung Quốc, Nhật Bản…
Chi phí cho sản xuất tảo Dunaliella salina hiện nay khá tốn kém, vì vậy giá sản
phẩm Dunaliella salina trên thị trường vẫn còn cao. Chính vì thế mà nhiều cơ sở sản
xuất vẫn đang nỗ lực tìm các phương pháp giảm bớt các khâu sản xuất để hạ giá thành
sản phẩm mà giữ nguyên chất lượng sản phẩm.
Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành thí nghiệm “ Bước đầu thử nghiệm
nuôi cấy Dunaliella salina trên giá thể Bacterial Cellulose”.
1.2. MỤC ĐÍCH VÀ PHẠM VI ĐỀ TÀI:
 Nhân sinh khối Dunaliella salina.
 Lên men Acetobacter xylinum và thu nhận Bacterial Cellulose (BC).
 Bước đầu thử nghiệm nuôi cấy Dunaliella salina trên giá thể BC.

1.3. YÊU CẦU:
 Khảo sát sự tăng trưởng của Dunaliella salina.
 Tìm tỷ lệ phối hợp giữa khối lượng BC và thể tích môi trường thích hợp
cho sự tăng trưởng của Dunaliella salina.
 So sánh hiệu suất thu nhận sinh khối Dunaliella salina thu được từ môi
trường BC và môi trường lỏng.

Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu
CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN
TÀI LIỆU

2.1. TỔNG QUAN VỀ Dunaliella salina:
2.1.1. Phân loại
Lĩnh giới (Domain) Eukaryota Woese, 1980 – Sinh vật nhân thật
Giới (Kingdom) Phantae Haecket, 1866 – Thực vật
Giới phụ (Subkingdom) Viridaeplantae Cavalier – Smith, 1981- Thực vật lục
Ngành (Phylum hay Division) Chlorophyta A. Pascher, 1914 - Tảo lục
Lớp (Class) Chlorophyceae Wille, 1884 – Tảo lục
Bộ (Order)Volcocales Oltmanns, 1904
Họ (Family) Dunaliellaceae T.Christensen, 1967
Chi (Genus) Dunaliella E.C. Teodoresco, 1904
Loài (Species) Dunaliella salina Teodoresco, 1905
2.1.2. Nguồn gốc và sự phân bố :
Dunaliella salina lần đầu tiên được công nhận bởi Teodoresco (1905)[35]. Tảo
này thường được tìm thấy trong các hồ muối ở tất cả các nơi trên thế giới từ nhiệt đới
đến ôn đới, thậm chí vùng cực. Nó còn có thể được phân lập từ nước biển, mặc dù
chúng không phải rất dồi dào trong tự nhiên (Borowitzka 1988b)[15].
2.1.3. Đặc điểm về hình thái-cấu tạo-sinh sản:
Hình 2.1. Vi tảo Dunaliella salina
Dunaliella salina là một loài vi tảo đơn bào có hình dạng tế bào thay đổi từ elip,
hình trứng, hình trụ, hình quả lê, và hình thoi đến gần như hình cầu. Có kích thước
5,0-29,0µm dài x rộng 2,5 – 21,0 µm. Các tế bào của một loài nhất định có thể thay
đổi hình dạng khi điều kiện thay đổi, thường trở thành hình cầu trong các điều kiện bất

lợi. Kích thước tế bào cũng có thể khác nhau tùy theo điều kiện tăng trưởng và cường
độ ánh sáng[3].
2.1.3.1. Cấu trúc tế bào:
Các tế bào Dunaliella salina có các loại bào quan điển hình của tảo lục: màng-
liên kết nhân, ti thể, không bào, bộ máy Golgi và một điểm mắt (Ben-Amotz and
Avron 1989a)[10]. Tế bào được bao quanh chỉ bởi một màng sinh chất đàn hồi bao
phủ bởi lớp áo bề mặt nhầy.
 Lớp áo tế bào :
Không có thành tế bào cứng, nhưng có lớp áo nhầy tế bào đặc biệt. Nó được
xem là lớp điện tử - dày hữu hình bất thường bao phủ bên ngoài màng sinh chất. Nó
bao gồm các sợi dài 25-200nm và xuất hiện lượng lớn glycoprotein trong tự nhiên[29].
Co lại hoặc giãn ra khi tiếp xúc điều kiện ưu trương và nhược trương. (Ben-Amotz and
Avron 1990; Ben-Amotz 1993)[11],[12].
 Lông roi ( flagella ):
Tế bào của tảo vận động được là nhờ lông roi.
Hai lông roi được gắn trên đầu, dài bằng nhau, và thường biểu hiện cùng nhịp.
Cấu trúc của lông roi rất phức tạp. Lông roi có thể gốc. Hai thể gốc gần nhau ở hướng
1/7 h và mang vi ống gốc lông roi. Các góc được hình thành giữa hai sợ lông roi
thường từ 90-130o
và dường như không đổi chiều. Chúng được kết nối với nhau bởi
một ngoại biên và 2 sợi tơ ở gần tâm. Cũng có thể có thêm 2 thể gốc không kết nối với
lông roi. Hệ thống vi ống gốc lông roi chéo chữ thập và ở dạng X-2-X-2. Hai gốc bao
gồm hai vi ống nằm dưới bởi sự nổi lên của hệ thống sợi I, hai cái khác bao gồm 4 vi
ống và cũng được kết hợp với hệ thống sợi I. Các vi ống của các phần đối diện liên kết
đoạn cuối vỏ. Hệ thống sợi rễ I kết thúc khoảng nữa chặng xuôi tế bào. Chúng là
những vân ngang với hệ vân mẫu theo sự sắp xếp từ 25-32 nm. Khi các sợi được tách
ra từ rễ những vi ống, ví dụ như trong sự biệt lập của cơ cấu lông roi, những hệ vân
mẫu của chúng thay đổi. Hệ sợi rễ II (sợi rễ) có thể xuất hiện, kéo dài từ những thể gốc
đến nhân)[29].

 Lục lạp (chloroplast):
Lục lạp đơn chiếm hầu hết thể bào. Nó có dạng chén, đĩa, hoặc dạng chuông và
có vùng đậm đặc có chứa nhân tinh bột hay nhân protein (pyrenoid). Trong lục lạp có
các thể đặc biệt gọi là hạt tạo bột (pyrenoid), là những thể protein hình cầu hay có góc,
xung quanh tập trung các hạt tinh bột hay hydrat cacbon là chất dự trữ chính của
Dunaliella salina. Lục lạp đôi khi được rạch thành nhiều thùy. Trong tế bào sống, nó
có một cấu trúc nhăn nheo, đặc biệt trong các tế bào già. Đôi khi những thylakoid của
lục lạp được xếp chồng dày đặc đến hơn 10 đơn vị. Đặc biệt trong những tế bào đã
phát triển ở cường độ ánh sáng cao và nồng độ muối cao. Những cặp thylakoid có thể
nhập với nhân tinh bột một khoảng cách ngắn, nhưng không bao giờ đi ngang qua chất
nền của nhân tinh bột. Các hạt tinh bột thường xuyên bao quanh nhân tinh bột, nhưng
có thể ở những nơi khác của lục lạp (đặc biệt nhiều trong các môi trường cũ).
Dunaliella salina cũng có thể tích lũy số lượng lớn của β-carotene trong phạm vi một
giọt dầu nằm giữa các thylakoid, cho nên các tế bào có màu đỏ cam hơn là xanh lá cây.
Những giọt β-carotene của D.salina được tìm thấy thực tế chỉ bao gồm các chất béo
trung tính, hơn một nửa trong số đó là β-carotene. Hầu hết các dạng đo đỏ có thể mất
màu đỏ của chúng khi phát triển trong cường độ ánh sáng thấp yếu[29].
 Điểm mắt (stigma hoặc eyespot):
Nằm ở vị trí trước ngoại biên trong các lục lạp.Điểm mắt có thể khó tìm thấy
dưới ánh sáng kính hiển vi. Nó bao gồm một hay hai hàng giọt lipid, có nhiều ở tế bào
già. Có thể các giọt có hình lục giác, nhưng sự đóng gói thường không theo quy luật và
các đơn vị khá đồng nhất về kích thước. Ở Dunaliella salina chúng liên kết chặt chẽ
với các thylakoid[29].
 Nhân (Nucleus):
Nhân thường bị che khuất trong thời gian tồn tại bởi một lượng hạt nhỏ. Nó
chiếm phần lớn phần trước của tế bào và thường được bao quanh bởi các thùy trước
của lục lạp. Nghiên cứu kết cấu siêu vi cho thấy rằng nó có một lớp màng xốp và một
hạch nhân đơn nổi lên, được bao quanh bởi cụm dị nhiễm sắc thể[29].
 Ty thể (mitochondria):
Ty thể thường tìm thấy ở gần thể gốc và tại nhiều vị trí ngoại vi giữa các lục lạp
và màng sinh chất hoặc xung quanh nhân. Klut và các cộng sự cho thấy rằng số lượng

và kích thước của ti thể có thể khác nhau giữa những tế bào ở các giai đoạn khác nhau
của sự tăng trưởng [21].
 Thể Golgi (Golgi bodies):
Gồm nhiều túi dịch nhỏ dẹp giới hạn bởi một màng xếp như chồng dĩa
(Dictyosomes). Thường gồm có 2-4 chồng đĩa, mỗi cái gồm 10-15 túi dịch. Chúng ở
giữa trước cực của nhân và thể gốc, bề mặt tạo thành nằm hướng về phía màng sinh
chất, được liên kết với mạng lưới nội chất[29].
 Lưới nội chất (Endoplasmic reticulum)
Lưới nội chất thường làm nền tảng màng sinh chất trên hầu hết các phần của tế
bào. Ngoài ra, một chuỗi của màng sinh chất liên kết màng nhân với phần gốc của bộ
lông roi. Trong giai đoạn tạo stress nồng độ thẩm thấu cao, có thể tăng rõ rệt ở lưới nội
chất . Lưới nội chất như nguồn dự trữ tạm thời của màng vật chất trong giai đoạn gây
stress vượt mức khi những gian tế bào chính co lại[29].
 Không bào (Vacuole)
Ở Dunaliella salina không có không bào co bóp. Những giọt lipid lớn và những
không bào chứa những giọt lipid nhỏ tương tự lục lạp có thể xuất hiện ở những nơi
khác nhau của tế bào (đặc biệt là những tế bào trong pha ổn định). Lượng mật độ điện
tử của không bào của D.salina đã được phân tích bởi laser microprobe (1 que thăm dò
siêu nhỏ dùng để xác định các thành phần hóa học của bề mặt rắn), phân tích X-quang
cho thấy chứa một lượng cao silicon, phospho, lưu huỳnh và clorua[29].
2.1.3.2. Sinh sản [3]:
 Sinh sản sinh dưỡng:
Sinh sản sinh dưỡng phân chia theo chiều dọc ở trạng thái di động. Sự gián
phân và sự phân bào biểu lộ các đặc tính của Chlorophyceae – lớp tảo lục (trụy kỳ cuối
thoi và sự xuất hiện của phycoplast – 1 loại vi sợi tìm thấy trong quá trình phân bào).
Tại kỳ đầu sớm, hạt nhân chuyển về hướng thể gốc tại phần trước của tế bào.
Sự sao chép của thể gốc xảy ra tại cuối kỳ đầu sớm. Thoi trong nhân phát triển trong
suốt kỳ trước trong khi màng nhân thì bền. Tại pha giữa, thoi kéo dài giữa 2 lỗ đối
nhau xuất hiện ở màng nhân. Những thể gốc không nằm ở những cực của bộ thoi,
nhưng nằm gần màng nhân ở khu vực trung gian giữa mặt phẳng kỳ giữa và các cực
của thoi. Mối liên hệ chặt chẽ giữa nhân và thể gốc bị mất ở kỳ cuối. Tại cuối kỳ cuối,

vỏ ngoài nhân được đóng xung quanh 2 nhân con và sự suy yếu của thoi. Sự phân bào
được thực hiện bởi các rãnh phân cắt của màng tế bào ở phycoplast (nghĩa là một đĩa
của những vi ống ở các mặt phân chia). Sự phân chia của lạp lục bắt đầu tại kỳ đầu
sớm bằng sự phân chia của nhân tinh bột, nhưng phân hạch hoàn toàn của lục lạp chỉ
diễn ra trong giai đoạn phân bào.
Những nang vô tính (những giao tử bất động) có thể được hình thành dưới điều
kiện khắc nghiệt như môi trường loãng nhiều hoặc môi trường khô hạn. Có những giai
đoạn không di động, tựa hình cầu, vách dày, và có thể có bề mặt mấp mô. Giai đoạn
quần keo, trong đó các tế bào bất động được bọc trong dịch nhầy như chất keo, cũng
có thể được hình thành trong điều kiện nhất định.
 Sinh sản hữu tính:
Sinh sản hữu tính là bởi sự đẳng giao, với sự dung hợp giao tử bắt đầu tương tự
trong Chlamydomonas ( bởi sự dính kết lông roi và kích hoạt cấu trúc sinh sản đặc
biệt). Các giao tử có cùng kích thước và tính năng cấu trúc giống như các tế bào phát
triển của cùng một loài. Một vài loài của Dunaliella xảy ra đồng tản, trong khi
D.salina dị tản. Các hợp tử màu xanh hoặc đỏ và được bao quanh bởi vách dày và mịn.
Sau giai đoạn nghỉ, các hạt nhân hợp tử phân chia tạo thành 32 tế bào, được giải phóng
thông qua sự vỡ thành tế bào mẹ. Sự phân bào giảm nhiễm diễn ra trong giai đoạn nảy
mầm bào tử.
2.1.4. Thành phần hóa học:
Những tế bào Dunaliella salina được biết đến là những nguồn giàu beta-
carotene nhất, bao gồm 8-10% trọng lượng khô (đôi khi nhiều hơn). Dunaliella salina
giàu dinh dưỡng, bao gồm những vitamin, khoáng chất, chất đạm và các acid amin,
chất béo, carbohydrate, chlorophyll … [31].
 Khoáng chất
Dunaliella salina đặc biệt giàu chất dinh dưỡng và khoáng chất chống oxi hóa,
đặc biệt là Selenium (Se) và Magie. Se là một chất chống oxy hoá mạnh mẽ nhằm hỗ
trợ trong cai nghiện và sức khỏe miễn dịch. Magie là rất quan trọng trong chuyển hóa
tế bào, sản xuất năng lượng và chức năng các cơ bắp và dây thần kinh[31].

 Vitamin
Dunaliella salina chứa một loạt các chất dinh dưỡng bao gồm cả vitamin E,
cobalamin (vitamin B12) và provitamin A. Vitamin A đóng vai trò thiết yếu cho thị
lực, sự tăng trưởng, sinh sản và sự điều khiển hệ thống miễn dịch. Nó cũng giúp duy
trì các sức khỏe,da và niêm mạc. Cobalamin là cần thiết cho sự chuyển hóa năng lượng
thích hợp, chức năng miễn dịch và chức năng thần kinh[31].
 Chlorophyll
Dunaliella salina giàu chất diệp lục, có khả năng loại trừ chất độc hại của cơ thể[31].
 Các axit béo thiết yếu (EFAs)
Dunaliella salina chứa EFAs, nồng độ cao chất béo không no giúp làm giảm
mức cholesterol và chất béo trong máu, ngăn ngừa bệnh tim, giảm viêm trong viêm
khớp, cải thiện chức năng miễn dịch và não, và hỗ trợ sức khỏe sinh sản và kinh nguyệt.
Những chất béo, bao gồm cả Omega 3, Omega 6, axit linoleic và alpha linoleic
axít là rất cần thiết cho việc hấp thu carotenoids, vitamin E và chất béo-chất dinh
dưỡng khác hòa tan[31].
 Amino axit
Dunaliella salina có chứa hàm lượng acid amin cao. Amino axit là những vật
liệu xây dựng cơ bản của cuộc sống, cần thiết cho sự tổng hợp của cơ bắp, da và liên
kết mô, hormon, các enzyme và chất dẫn truyền thần kinh (neurotransmitter)[31].
Bảng 2.1 So sánh thành phần dinh dưỡng [31]
Dinh dưỡng Dunaliella salina
(/100g)
Spirulina
(/100g)
Cà rốt
(/100g)
Protein 7,4 g 57 g 1,0 g
Béo (tổng) 7,0 g 8,0 g 0,0 g
Carbohydrates 29,7 g 24 g 10 g
Chất xơ 0,4 g 4,0 g 3,0 g
Khoáng (tro) 49 g 6,2 g 1,0 g
Năng lượng 893 kJ 1214 kJ 180 kJ
Beta-carotene 2100 mg 0,342 mg 5,8 mg
Alpha-carotene 102,4 mg 0,0 mg 2,8 mg
Lutein và Zeaxanthin 97,6 mg 0,0 mg 0,2 mg
Cryptoxanthin 46,5 mg 0,0 mg 0,1 mg
Chlorophyll 2210 mg 1000 mg Chưa biết

Bảng 2.2 So sánh khoáng chất trong các loại thực phẩm xanh [31]
Khoáng
chất
(mg/100g)
Dunaliella
salina
Spirulina Chlorella Cỏ mạch
(Wheat
grass)
Lá xanh
barley
(Green
barley)
Canxi 213 547 201 937 384
Magie 4591 330 211 83 186
Kali 2 5 5 6 6
Đồng 0,3 1,1 0,1 0,4 0,6
Kẽm 3 2 1 2 2
Phospho 119 857 1040 290 281
Sắt 40,3 50,5 214 13,7 8,4
Mangan 5,13 2,62 4,06 5,08 3,85
Crom 0,29 0,53 0,06 0,09 0,11
Selenium 1,04 0,03 0,01 0,04 0,15
Bo 14 0,25 0,03 0,33 1,05
Cobolt 0,04 0,131 0,038 0,005 0,004
Molybdenum 0,033 0,105 0,042 0,05 0,066
Lưu huỳnh 2185 <2000 <2000 <2000 <2000
Lithi 0,491 0,093 0,01 0,008 0,023
2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của Dunaliella salina:
D. salina có lợi thế là có khả năng phát triển mạnh trong môi trường nồng độ
muối cao nên có thể nuôi cấy trong những ao mở cũng như hệ thống nuôi cấy khép
kín. Tuy nhiên, phải thêm một số dinh dưỡng và yếu tố hạn chế sinh lý cho sự phát
triển tối ưu.
 Ánh sáng:
Vì D.salina là một vi tảo quang tự dưỡng bắt buộc, ánh sáng là nguồn năng
lượng duy nhất cho sự chuyển hóa của nó (Borowitzka và Borowitzka 1989)[17].
Trong hệ thống những ao mở, nguồn ánh sáng duy nhất là ánh sáng mặt trời, trong khi
trong các lò phản ứng sinh quang hóa (photobioreactor) thì ánh sáng có thể cung cấp
bằng cách sử dụng ánh sáng trắng đèn huỳnh quang hoặc ánh sáng mặt trời.

 Nhiệt độ:
D. salina có khả năng phát triển mạnh khoảng nhiệt độ từ 0-45o
C. Trong phòng
thí nghiệm các mẻ cấy, nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng D.salina từ 25-35o
C (Ben-
Amotz 1995)[13]. Do hạn chế kỹ thuật, nhiệt độ trong các ao mở là không thể điều
khiển. Ngoài ra nhiệt độ cao hơn 40o
C gây lò rỉ glycerin trong môi trường (Wegmann và
các cộng sự, 1980)[37], mà nó có thể cung cấp nguồn cacbon hữu cơ chủ đạo cho vi
khuẩn và nấm sợ nhỏ (Ben-Amotz 1995)[13]. Nhiệt độ lớn hơn 40o
C thường gây chết.
Đây có thể là vấn đề chính trong việc nuôi D.salina ngoài trời, đặc biệt là ở những vùng
nắng nóng. So với các khu vực ẩm ướt, tốc độ bốc hơi cao hơn ở các vùng khô cằn có
thể dẫn đến giảm nhiệt độ đáng kể trong các ao và do vậy các khu vực này là thích hợp
nhất cho nuôi cấy ngoài trời của D.salina và các vi tảo khác. Không giống như các ao
mở, nhiệt độ trong các lò phản ứng sinh quang hóa được điều khiển chính xác.
 Độ pH:
Độ pH tối ưu cho D.salina là 9-11. Trong nuôi cấy tảo tự dưỡng, độ pH tăng vì
sự kìm hãm quang hợp của CO2 và NO‫־‬
3 hấp thu góp phần tăng sự giải phóng OH-
(Ben-Amotz và Avron 1989a)[10]. Trong nhiều nguồn nước thiên nhiên, nguy cơ của
một số lượng mưa muối can xi và keo tụ của sinh khối tảo lúc độ pH cao hơn, đặc biệt
là khi nồng độ của Ca2+
cao. Điều này có thể dẫn đến giảm tăng trưởng tảo và vì thế để
tránh tăng pH trên 8 trong nuôi cấy (Ben-Amotz và Avron 1989a)[10]. Trong chế độ
hoạt động chuyên sâu của ao mở, pH thường được duy trì ở 7,5 ± 0,2 bởi kiểm soát
gấp đôi 2 khí CO2 và HCl nơi đầu tiên thường là chảy đến các mẻ cấy và thứ hai là
thỉnh thoảng được thêm vào khi trên ngưỡng kiểm soát (Ben-Amotz 1995)[10]. Trong
một số ao mở và lò phản ứng sinh quang hóa nơi mà các nguồn chính của cacbon vô
cơ là bicarbonate ion (HCO‫־‬3), pH được điều khiển bằng cách cho thêm HCl.

2.1.6. Nhu cầu dinh dưỡng của Dunaliella salina:
 Nguồn cacbon:
Vì D.salina là một sinh vật quang tự dưỡng, nó có thể chỉ sử dụng carbon
dioxid (CO2) và bicarbonate (HCO3) là nguồn cacbon vô cơ. Việc thiếu một nguồn
cacbon vô cơ thích hợp là nhân tố hạn chế phát triển phổ biến nhất dưới những điều
kiện có trong nuôi cấy D.salina như độ mặn cao, giảm pH và nhiệt độ cao (Borowitzka
và Borowitzka 1989)[17]. Các thiết bị bơm các bọt CO2 nhỏ vào mẻ cấy. Khí đưa qua
ống nhựa xốp cố định ở phía dưới các ao hồ và thiết bị kỹ thuật số đo lưu lượng khối
được dùng chỉnh tốc độ lưu lượng khí ở 0,4 l ml-1
( Garcia-Gonzlez và các cộng sự
2003)[23]. Ngoài ra, 10 mmol l-1
NaHCO3 có thể được sử dụng như nguồn cacbon cho
sự tăng trưởng tốt giữa pH 7,5 và 9,5. Tuy nhiên, tảo sẽ phát triển tốt khi lên đến pH
11 khi cao hơn nồng độ bicarbonate ban đầu được cung cấp, vì ở độ pH cao hơn, việc
cung cấp carbon dioxide hòa tan sẽ bị giới hạn (Ben-Amotz và Avron 1989a)[10].
Ngoài ra, 5mmol l-1
NaHCO3 được bổ sung hằng ngày cho vào nồi phản ứng sinh học
(bioreactor) sau khi khử trùng bằng sodium bicarbonate (NaHCO3) đặc ở 1200
C trong
một lò dưới bóng tối và sau đó được trộn với nước khử trùng (Hejazi và các cộng sự
2003)[25].
Việc cung cấp cacbon vô cơ đặc biệt quan trọng đối với nuôi cấy D.salina, ở độ
mặn rất cao mà tảo này phát triển, sự hòa tan các chất vô cơ cacbon là rất thấp; tức là ở
25% NaCl sự hòa tan của cacbon vô cơ là <50% tại độ mặn nước biển (3% NaCl).
Hơn nữa, trong nước biển tự nhiên với nhiệt độ cao và độ pH, phần lớn các cacbon vô
cơ (>99%) là ở dạng CO3
2-
và vì thế không có sẵn để tảo hấp thu. Sự hiện diện của
enzyme ngoại bào anhydrase carbonic mà xúc tác chuyển đổi HCO-
3 từ CO2 có nghĩa
là tảo có thể sử dụng HCO -
3 dưới những điều kiện này[35].
 Nguồn nitơ:
Nguồn nitơ tốt nhất cho D.salina là nitrat. Trong thực nghiệm, 5mmol l-1
NaNO3 hoặc KNO3 được thêm vào môi trường cho sự phát triển tối ưu của tảo. Mặt
khác, hạn chế nitrat là một trong những cách phổ biến nhất để giảm tốc độ tăng trưởng
dẫn đến cảm ứng sản xuất chất carotene. Tuy nhiên, kéo dài thời gian hạn chế nitơ
trong mẻ nuôi cấy cuối cùng có thể dẫn đến tỷ lệ tử vong cao của các tế bào cũng như
giảm nghiêm trọng lượng carotene trên một đơn vị thể tích nuôi cấy. Những nguồn

nitơ khác như muối ammonium và ure không thích hợp. Ví dụ, thực nghiệm cho thấy
ammonium nitrate ức chế sự hình thành β-carotene, và tích cực phát triển hấp thu
ammonium của mẻ nuôi cấy dẫn đến một quá trình acid hóa môi trường và kết quả
cuối cùng là gây chết cho tảo (Borowitzka, MA &Borowitzka, 1988b)[15]. Ure có thể
sử dụng như là nguồn nito, đặc biệt là trong các môi trường đệm. Tuy nhiên trong mẻ
nuôi cấy quy mô lớn ngoài trời ure có thể dẫn đến tử vong do có nồng độ cao của
amoni được giải phóng trong sự chuyển hóa của ure (Massyuk, 1966)[26]. Nó cũng
cho thấy rằng sử dụng NH4NO3 hay (NH4)2 CO3 như nguồn nitơ có ảnh hưởng độc hại
đến D.salina (Borowitzka và Borowitzka 1987)[14].
 Phosphor:
Phosphor trong các dạng KH2PO4 hoặc NaH2PO4 cho kết quả tốt nhất. Lượng
photphat tối ưu cho sự tăng trưởng là 0,2 µg l-1
KH2PO4 (Gibor 1956)[24]. Ở các ao
mở, nồng độ cao hơn có thể ức chế sự phát triển bởi vì sự xuất hiện đồng thời của
photphat và canxi đặc biệt tại pH cao hơn 8, có thể dẫn đến tủa Ca3PO4 và kết tụ tảo
(Sukenik và Shelef 1984)[34].
Sulfate:
D.salina cũng cần nồng độ cao sulphate cho sự phát triển tối đa, nhưng điều này
hiếm khi cần thiết thêm vào các ao môi trường thương mại vì nguồn nước tự nhiên như
nước biển hoặc nước máy có lượng sulfate cao, khoảng 30 mmol l-1
(Ben-Amotz và
Avron 1989a)[10].
 Magie và canxi:
Cả hai cation này là cần thiết cho sự tăng trưởng và D.salina có thể chịu tỉ lệ
Mg2+
: Ca2+
từ 0,8-20,0[35].
 Natri:
Tất cả các loài thực vật ưa mặn và biển của Dunaliella đều cần Natri [35].
 Sắt:
Nồng độ sắt thấp trong một dạng có thể được đồng hóa là rất cần thiết cho sự
tăng trưởng D.salina. Nồng độ tối ưu cho sắt trong D.salina là 1,25-3,75mg.1-1
(Mil’ko, 1962)[28] và cần được cung cấp dạng như sắt citrate hoặc Fe-EDTA
(Borowitzka, MA & Borowitzka, 1988b)[16]. Nồng độ sắt cao ức chế tăng trưởng.

 Các nguyên tố và Vitamin:
Những nguyên tố như Zn, Co, Cu, Mo và Mn thường được thêm vào môi
trường D.salina, tuy nhiên rất biết rất ít đến các yêu cầu thực tế của tảo này. D.salina
không yêu cầu bất kỳ các vitamin ngoại sinh cho sự tăng trưởng[35].
2.1.7. Ứng dụng Dunaliella salina:
2.1.7.1. Sử dụng vi tảo trong dinh dưỡng và thực phẩm:
Trong gần ba thập kỉ qua, sử dụng vi tảo và các vi sinh vật khác làm nguồn
protein đơn bào (SCP) đã thu hút sự chú ý của các nhà khoa học và sản xuất. Một số
đặc điểm nổi bật của D.salina là sinh khối có hàm lượng protein cao, trung bình 40-
60% trọng lượng khô.
Dùng vi tảo làm thức ăn và trao đổi khí hô hấp trong các chuyến bay vũ trụ
cũng kích thích các nhà nghiên cứu sử dụng vi tảo cho dinh dưỡng của người [7].
2.1.7.2. Khai thác các hoạt chất từ tảo
D.salina chứa nhiều chất béo và lượng dầu tương tự thành phần dầu thực vật.
Trong một số điều kiện nhất định, tảo có thể chứa lipid tới 85% trọng lượng khô.
Nhưng nhìn chung, hàm lượng của lipid trong sinh khối tảo dao động từ 20-40% chất
khô.
Ở vi tảo, lipid là ester cua glycerol và các acid béo mạch dài C14, C12.
Triglycerid là nguồn lipid dự trữ quan trọng và có thể chiếm tới 80% tổng lượng lipid.
Những acid béo mạch dài chưa bão hòa được coi là rất quan trọng trong khẩu phần ăn
của người và động vật. Cũng nhờ có hàm lượng protein và các acid éo mạch dài chưa
no cao mà D.salina đã trở thành thức ăn tươi sống không thể thiếu cho ấu trùng một số
thủy đặc sản[7].
2.1.7.3. Sắc tố:
Ngoài Chlorophyll (a, b), D.salina còn chứa sắc tố bổ trợ như carotenoid.
Các carotenoid có gam màu từ vàng đến đỏ và có bản chất izoprenoid polyene
dẫn xuất từ lycopen. Các loại carotenoid thông thường chiếm tới 14% trọng lượng khô.
Carotenoid đượic sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau. Ví dụ, chúng được coi là
chất màu thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên, là tác nhân làm tăng màu sắc cho thịt cá
hồi và lòng đỏ trứng gà cũng như tăng thể trạng và khả năng sinh sản ở gia súc nuôi

nhốt. β-carotene còn được coi là chất kích thích sinh trưởng, ngăn ngừa ung thư và làm
sáng mắt. Hiện nay chúng ta biết khoảng 400 loại carotenoid, nhưng trong số này chỉ
có một ít loại được thương mại hóa dưới dạng chất màu thực phẩm như β-carotene,
lycopene, cryptoxanthin, zeaxanthin và lutein.
Trong cơ thể vi tảo, carotenoid đóng vai trò như sắc tố bổ trợ quang hợp và là
tác nhân bảo vệ tế bào khỏi tác hại của cường độ ánh sáng quá cao [7].
2.1.7.4. Carbohydrate:
D.salina chứ khối lượng lớn carbohydrate dưới dạng sản phẩm dự trữ (tinh bột,
glycogen) hoặc các chất điều hòa thẩm thấu (glycerol, trehalose, mannitol, sorbitol…).
Lượng glycerol có thể đạt tới 50% trọng lượng khô trong điều kiện bão hòa muối.
2.1.7.5. Sản xuất các nguyên liệu giàu năng lượng:
D.salina được coi là nguồn cung cấp nguyên liệu sinh học tiềm năng trong
tương lai. Một số ưu điểm nổi bật khi sử dụng D.salina để sản xuất nguyên liệu sinh
học là:
 Hiệu suất dầu và nhiên liệu từ tảo thì cao hơn nhiều (10-100 lần) so với
những cây trồng năng lượng cạnh tranh.
 Hầu như tảo có thể phát triển ở bất kỳ đâu, vì vậy chắc chắn sẽ không có sự
cạnh tranh đất trồng với những cây lương thực khác.
 Tảo là những tác nhân “trị liệu sinh học” tuyệt vời, chúng có khả năng hấp
thụ một lượng CO2 rất lớn và đóng vai trò quan trọng trong việc xử lý nước thải.
 Tảo đang được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp và các ứng dụng khác,
nhiều ứng dụng đang được khám phá. Đối với tảo thì “không có thứ gì bị lãng phí, mọi
thứ đều được sử dụng”. Chẳng hạn như nhiều công ty có thể sử dụng đến tận cùng
nguồn nguyên liệu tảo để sản xuất các sản phẩm nguyên liệu và không phải nhiên liệu.
Ví dụ, glycerol thu được trong quá trình làm biodiesel từ D.salina có thể dùng làm xà
phòng, lượng sinh khối tảo sau khi chiết tách dầu có thể dùng làm chất đất và làm phân
bón hữu cơ rất tốt [39],[40],[41].

2.2. TỔNG QUAN VỀ BACTERIAL CELLULOSE (BC):
BC được tổng hợp bởi một số loài vi khuẩn (bảng 2.3). Con đường tổng hợp và
cơ chế điều hòa tổng hợp BC ở các loài có lẽ giống nhau, nhưng cấu trúc BC ở mỗi
loài thì khác nhau (Ross và cộng sự, 1991, Jonas và Farah, 1998). Có các đặc điểm
khác biệt đáng kể về thuộc tính vật lý của các sản phẩm cellulose, chủ yếu là chiều dài
của chuỗi glucan (được đặc trưng bởi mức độ polymer hóa), tính kết dính và trạng thái
kết tinh của nó. Tùy thuộc vào mỗi loài mà trạng thái kết tinh của cellulose khác nhau,
từ đó xác định các tính chất vật lý của sản phẩm như là độ bền, độ hòa tan trong các
dung môi, tính chịu ảnh hưởng của các tác nhân biến tính.
Bảng 2.3. Cấu trúc BC ở một số loài vi khuẩn [5]:
Giống Cấu trúc cellulose
Acetobacter Lớp màng ngoại bào tạo thành các dải
Achromobacter Sợi
Aerobacter Sợi
Agrobacterium Sợi ngắn
Alcaligen Sợi
Pseudomonas Các sợi không tách biệt
Rhizobium Sợi ngắn
Sarcina Cellulose dị hình
Zoogloea Chưa xác định rõ cấu trúc
2.3. TỔNG QUAN VỀ Acetobacter xylinum:
2.3.1. Phân loại
Theo hệ thống phân loại Bergey, Acetobacter xylinum thuộc [2]:
Lớp : Shizomycetes
Bộ : Pseudomonadicae
Bộ phụ : Pseudomonadicae
Họ : Pseudomonadaceae

2.3.2. Đặc điểm hình thái
Acetobacter xylinum có dạng hình que, kích thước khoảng 2µm thay đổi tùy
chủng, khi trưởng thành có dạng cầu có vỏ nhày bao quanh, có thể di động hay không di
động, không sinh bào tử. Tế bào Acetobacter xylinum có dạng sắp xếp đặc trưng là riêng
lẽ hay xếp thành chuỗi, chúng có khả năng tạo váng dày trên môi trường nuôi cấy.
Hình 2.2. Vi khuẩn Acetobacter xylinum
Acetobacter xylinum thuộc loại Gram âm, nhưng dạng gram của chúng có thể
bị biến đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường [36].
Khi Acetobacter xylinum phát triển trên môi trường thiếu thức ăn hay môi
trường nuôi cấy lâu, chúng biến đổi thành những dạng có hình thái đặc biệt như tế bào
phình to, kéo dài, phân nhánh hay không phân nhánh và dần dần bị thoái hóa, tổng hợp
cellulose giảm, sản phẩm cellulose tạo ra có độ kết hợp không chặc chẽ, nhũn và mềm
[2],[9].
2.3.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Vi khuẩn Acetobacter xylinum là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc và thường thấy
trong trái cây, rau giấm, nước trái cây và đồ uống có cồn, cho phản ứng catalase dương
tính, có khả năng oxi hóa ethanol thành CH3COOH, CO2, và H2O. Có thể chuyển hóa
glucose thành acid, glycerol thành dihydroxyaceton, tổng hợp cellulose nhưng không
có khả năng tăng trưởng trên môi trường Hoyer và không có sắc tố nâu [8].
Trong môi trường lỏng, Acetobacter xylinum có khả năng hình thành màng
cenllulose khá dày. Khi nhuộm màng bằng Iod và acid sulfuric sẽ cho màu xanh.

Chúng có thể tích tụ được 4,5% acid acetic, đôi khi được dùng kết hợp với nấm men
để sản xuất đồ uống có độ rượu thấp[3].
Nguồn carbohydrate mà Acetobacter xylinum sử dụng tạo ra cellulose cao là:
glucose, fructose, manitol và sorbitol. Hiệu suất thấp hơn nếu sử dụng glycerol,
galactose, lactose, sucrose và maltose. Acetobacter xylinum không có khả năng sử
dụng sorbose, manose, cellobiose, erithritol và acetate [3],[36].
2.3.4. Quá trình tổng hợp Cellulose:
Cellulose được tổng hợp bởi Acetobacter xylinum là sản phẩm cuối cùng của
quá trình chuyển hóa carbon, phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của tế bào có liên quan
đến chu trình pentose phosphate và chu trình Krebs gắn liền với con đường sinh
glucose. Trong Acetobacter xylinum, sự sinh tổng hợp cellulose liên quan tới quá trình
dị hóa của quá trình oxi hóa và tiêu thụ hơn 10% năng lượng từ phản ứng dị hóa. Sự
sản xuất BC không gây trở ngại cho quá trình đồng hóa gồm sự tổng hợp protein.
Acetobacter xylinum có thể chuyển hóa nhiều hợp chất carbon khác nhau như hexose,
glycerol, dihydroxyacetone, pyruvate, dicarboxylic acid thành cellulose với hiệu suất
khoảng 50% [4]
Vi khuẩn Acetobacter xylinum sản xuất cellulose tinh sạch. Một tế bào đơn có
thể polymer hóa trên 200.000 gốc glucose thành chuỗi β-1,4-glucan trong một phút.
Thuận lợi của việc sử dụng vi khuẩn sản xuất cellulose là vi khuẩn tăng trưởng nhanh
trong điều kiện kiểm soát và sản xuất cellulose từ nhiều nguồn cacbon khác nhau gồm
có glucose, ethanol, sucrose và glycerol.
Cellulose được tổng hợp từ bề mặt tế bào Acetobacter xylinum. Vị trí tổng hợp
cellulose trên bề mặt tế bào được tạo thành những lỗ 3,5nm liên kết với nhau thành
những dãy dài. Mỗi lỗ bao phủ một tiểu phần 10 nm gồm có những enzyme tổng hợp
cellulose liên quan đến phản ứng polymer hóa và những protein phụ liên quan tới
những chức năng khác. Mỗi tiểu phần 10 nm tạo ra một lượng lớn chuỗi glucan để
hình thành sợi phụ cơ bản 1,5 nm. Những sợi phụ cơ bản tập hợp lại thành vi sợi. Tiếp
theo là sự ghép chặt các vi sợi thành dải [19]
Con đường sinh tổng hợ cellulose từ cơ chất glucose thành cellulose gồm nhiều
phản ứng trong đó đầu tiên glucose biến đổi thành glucose-6-phosphate bằng enzyme
kinase. Bước thứ hai, glucose-6-phosphate biến đổi thành glucose-1-phosphate bằng

enzyme phosphoglucomutase. Bước tiếp theo, glucose-1-phosphate biến đổi thành
UDP-glucose khi có sự hiện diện của UTP và enzyme UDPG pyrophosphorylase.
UDP-glucose sản xuất được dùng như cơ chất bởi enzyme cellulose synthase. Trong
Acetobacter xylinum, enzyme này được hoạt hóa bằng chu trình nucleotide, c-di-GMP.
Chất hoạt hóa cellulose synthase c-di-GMP trong Acetobacter xylinum được tổng hợp
bằng enzyme diguanylate cyclase và nồng độ của chất hoạt hóa này được điều chỉnh
bằng hoạt động của phosphodiesterase [19].
Hình 2.3. Con đường tổng hợp Cellulose của Acetobacter xylinum [22]
CS: cellulose synthase
FBP: fructose-1,6-biphosphate phosphatase
GK: glucokinase.
G6PDH: glucose-6-phosphate dehydrogenase
1PFK: fructose-1-phosphate kinase.
PGI: phosphoglucoisomerase.
PGM: phosphoglucomutase.

PTS: hệ thống của phosphotransferase.
UGP: UDP-glucose pyrophosphorylase.
Fru-bi-P: fructose-1,6-bi-phosphate.
Fru-6-P: fructose-6-phosphate.
Glc-6-P: glucose-6-phosphate.
Glc-1-P: glucose-1-phosphate.
PGA: phosphogluconic acid.
UDPGlc: uridine diphosphoglucose.
FK: fructokinase.
2.4. Quá trình lên men
2.4.1. Nguyên liệu lên men: nước dừa
Nước dừa là một môi trường thuận lợi để nuôi cấy vi khuẩn vì có nhiều chất
dinh dưỡng. Thành phần của nước dừa già bao gồm [5].
Bảng 2.4. Thành phần của nước dừa
Nước: 90,81%
Chất rắn tổng số: 4,17%
Đường tổng số: 2,56%
Tro: 0,46%
Dầu: 0,74%
Protein: 0,55%
Clorua: 0,17%
Các vitamin
Acid ascorbic: 2,2-3,7 mg/ml
Acid nicotianic: 0,64 µg/ml
Acid pantothenic: 0,52 µg/ml
Acid folic: 0,03 µg/ml
Riboflavin: 0,01 µg/ml
Chất kích thích
sinh trưởng
1,3 diphenyllurea
Hexitol
Phyllocosine
Cytokinin
Myo-inositol
Scycle-inositol
Sorbitol
Dừa sau khi thu hoạch thường được bảo quản 3 ngày rồi đem sử dụng làm môi
trường lên men. Nếu để lâu lượng đường trong nước dừa giảm, chất lượng dinh dưỡng
cũng không đảm bảo.

2.4.2. Phương pháp lên men
2.4.2.1. Nhân giống:
Ống giống được giữ đem hoạt hóa bằng cách lấy một khuẩn lạc đơn đem huyền
phù vào môi trường nhân giống, sau đó hoạt hóa giống bằng cách lắc ở nhiệt độ thích
hợp.
2.4.2.2. Lên men (lên men tĩnh)
Môi trường dinh dưỡng được cho vào khay, các khay nuôi cấy có bề mặt rộng,
thoáng. Trong quá trình lên men, các khay được đậy bằng giấy báo xốp tạo độ thông
khí giữa môi trường lên men và môi trường bên ngoài để chủng phát triển và tránh khả
năng nhiễm khuẩn [22]. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 28-30o
C. Sợi cellulose hình
thành sẽ di chuyển lên bề mặt môi trường tạo thành một lớp màng cellulose ở mặt
phân cách của môi trường lỏng và khí. Đây là phương pháp cổ điển nhưng vẫn được
sử dụng rộng rãi trên thế giới do quy trình đơn giản.
Sơ đồ quá trình lên men:
Hình 2.4. Quá trình lên men thu BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum

2.5. Sản phẩm Bacterial Cellulose
2.5.1. Cấu trúc Bacterial Cellulose
Bacterial cellulose là chuỗi polymer không phân nhánh của các nhóm glucose
liên kết với nhau qua nối β-1,4-glucan. Chuỗi đơn phân tử glucan liên kết với nhau
bằng liên kết Van de Waals. Các chuỗi BC mới tạo thành liên kết với nhau hình thành
nên các sợi sơ cấp (subfibril), các sợi sơ cấp kết lại thành vi sợi (microfibril) (Jonash
và Farash, 1989). Các vi sợi nằm trong các bó (bundle) và cuối cùng hình thành các
dải (ribbon) (Yamanaka và cộng sự, 2000). Các dải có chiều dày 3- 4 nm x chiều rộng
70-80 nm (Zarr, 1997); 3,2 x 133 nm (Brown và cộng sự, 1976); 4,1 x 117 nm
(Yumanaka và cộng sự, 2000). Trong khi chiều rộng của các sợi cellulose được tạo ra
từ gỗ thông là 30.000 – 75.000 nm hay gỗ Bulo (Betula) là 14.000 – 40.000. Những
dải vi sợi cellulose vi khuẩn mịn có chiều dài thay đổi từ 1 – 9 µm làm thành nên cấu
trúc lưới dày đặc, được ổn định bởi các nối hydrogen. Các tế bào của vi khuẩn
Acetobacter xylinum phân bố khắp hệ thống dải cellulose [18],[33].
BC và cellulose thực vật (PC) có cùng cấu trúc hóa học nhưng khác nhau về
tính chất vật lý và hóa học. Mức độ polymer hóa khác nhau ở thực vật khoảng 13.000-
14.000, ở BC là 2.000-6.000. BC được sản xuất bằng vi khuẩn sinh acid acetic và
đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực vật [42].
Cellulose thực vật (x 200) Cellulose vi khuẩn (x 20.000)
Hình 2.5. So sánh cấu trúc của cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật [42]
Cấu trúc BC tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy. Trong nuôi cấy tĩnh sản phẩm
BC thu được ở dạng màng, trong nuôi cấy lắc BC dạng hạt nhỏ có thớ phân tán trong
môi trường.

Có hai dạng cellulose kết tinh phổ biến là cellulose I và cellulose II được phân
biệt bằng tia X, cộng hưởng từ hạt nhân, kính phổ Raman, và phân tích tia hồng ngoại.
Cả hai đều được tổng hợp trong tự nhiên, nhưng cellulose I phổ biến hơn, không tế bào
nhân thực nào được biết có thể tổng hợp in vitro cellulose II. Cellulose I có thể chuyển
hóa trực tiếp thành cellulose II những cellulose II thì không thể chuyển hóa thành
cellulose I [33],[ 32].
Cellulose I là dạng chuyển hóa nhiệt học của cellulose, được tổng hợp chủ yếu
bởi thực vật và cũng được tổng hợp bởi Acetobacter xylinum trong điều kiện nuôi cấy
tĩnh. Các chuỗi β-1,4-glucan của cellulose I song song với nhau và xếp dọc một trục.
Có hai dạng đơn vị điển hình của cellulose I và Iα và Iβ, trong đó Iβ là dạng nhiệt động
lực học ổn định hơn.
Cellulose II được tạo thành từ Acetobacter xylinum trong điều kiện nuôi cấy lắc.
Các chuỗi β-1,4-glucan của cellulose II sắp xếp ngẫu nhiên hay đối song song với
nhau bằng một lượng lớn liên kết hydro làm cho cellulose II là dạng cellulose ổn định
nhất về nhiệt động lực.
(a) (b)
Hình 2.6. Mô phỏng cấu trúc của cellulose I (a) và cellulose II (b)
2.5.2. Tính chất
2.5.2.1. Độ tinh khiết:
BC là polymer sinh học duy nhất được tổng hợp không có lignin hay
hemicellulose. BC được phân hủy hoàn toàn bởi vi khuẩn và là nguồn tài nguyên có
thể phục hồi và tái tạo.

2.5.2.2. Độ bền:
BC có trọng lượng nhẹ, ổn định về kích thước, sức căng cao, độ bền cao. Đặc
biệt là cellulose I có độ bền cao.
2.5.2.3. Khả năng hút nước:
Khả năng giữa nước đặc biệt, điều chỉnh độ xốp, độ ẩm cao và chứa dung tích
bề mặt cao. Tính chất này đặc biệt quan trọng trong nuôi cấy in vitro thực vật vì có thể
bổ sung môi trường khi cạn kiệt.
2.5.2.4. Lắp ráp màng trực tiếp trong suốt quá trình sinh tổng hợp:
Không cần bước trung gian trong quá trình làm giấy từ bột giấy cũng như trong
quá trình dệt từ sợi. Tổng hợp được các màng rất mỏng, sạch và cực nhỏ.
2.5.2.5. Biến đổi cellulose trực tiếp trong suốt quá trình hình thành:
Làm chậm quá trình kết tinh bằng cách cho thuốc nhuộm vào môi trường. Kiểm
soát tính chất vật lý của cellulose về trọng lượng phân tử và kết tinh trong suốt quá
trình hình thành.
2.5.2.6. Biến đổi gen tạo thành cellulose:
Tổng hộp trực tiếp dẫn xuất cellulose như: acetate cellulose,
carboxymethylcellulose, methyl cellulose. Kiểm soát được trọng lượng phân tử
cellulose, cellulose kết tinh dị hình (cellulose I và II)[30]
2.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến cấu trúc và tính chất của BC
2.5.3.1. Điều kiện lên men:
Sự hình thành cấu trúc BC phụ thuộc hoàn toàn vào điều kiện nuôi cấy.
Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn tích lũy cellulose ở bề mặt canh trường
dinh dưỡng. Các tiền sợi cellulose được đẩy ra từ các lỗ trên bề mặt tế bào vi khuẩn,
kết tinh thành vi sợi bị đẩy xuống sâu hơn trong môi trường. Do đó hình thành lớp
màng có sự chồng và xoắn của dải cellulose và có tế bào vi khuẩn[8].
Trong điều kiện nuôi cấy lắc, BC hình thành dạng hột nhỏ không đều, các sợi
có thớ hình sao, phân tán trong môi trường theo hướng song song hay vuông góc. Sợi
cellulose nuôi cấy lắc uốn cong và có chiều rộng lớn hơn sợi cellulose nuôi cấy
tĩnh[42].

2.5.3.2. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng:
Quá trình lên men bề mặt BC tạo lớp màng là mạng cellulose xen lẫn với tế bào
vi khuẩn Acetobacter xylinum. Yếu tố dinh dưỡng khác nhau ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng và phát triển của Acetobacter xylinum và khả năng sản sinh ra cellulose khác
nhau. Do đó, yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến cấu trúc của lớp màng BC [22].
2.5.3.3. Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, nồng độ muối
BC có hàm lượng ẩm cao (96,5-99%) và khả năng giữ nước cao.
Hàm lượng ẩm của BC giảm khi thêm NaCl (0-5%) và tăng khi pH từ 2 -
10.Việc tăng nồng độ NaCl và nhiệt độ làm giảm khả năng giữ nước.
Tác động của nhiệt độ không ảnh hưởng đáng kể đến độ ẩm của BC, khi đun sôi
hay ở -200C thì độ ẩm của BC không thay đổi. Nhiệt độ cao không thay đổi đáng kể
cấu trúc sợi BC, còn nhiệt độ lạnh làm tăng tính đàn hồi của sợi BC[38].
2.6. Ứng dụng của Bacterial Cellulose
Với những ưu điểm nổi trội, BC ngày càng được nghiên cứu nhiều và được ứng
dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm (sản phẩm chính hoặc chất phụ gia), dược
phẩm và mỹ phẩm, chăm sóc sức khỏe, môi trường, dầu mỏ, quần áo và giày dép, thể
thao và các sản phẩm khác [6].

Bảng 2.5: Một số ứng dụng của BC
Lĩnh vực ứng dụng Sản phẩm
Thực phẩm  Món ăn tráng miệng (thạch dừa, snack…)
 Món ăn kiêng (kem ít calo và salad)
 Thịt nhân tạo.
 Vỏ bao xúc xích và thịt.
 Nước uống siro không có cholesterol.
 Trà Kombucha và Manchurian.
Chăm sóc sức khỏe  Lớp màng trị bỏng.
 Tác nhân vận chuyển thuốc.
 Da nhân tạo.
Dược phẩm, mỹ phẩm  Chất làm co mạch.
 Móng nhân tạo.
 Đánh móng dày và mỏng hơn.
Môi trường  Miếng xốp làm sạch những vết dầu tràn.
 Hấp thu chất độc.
 Quần áo và giầy dép có thể tự phân hủy.
Dầu mỏ  Thu hồi dầu.
Dệt  Sản xuất sợi nhân tạo.
 Y phục quân đội.
Thể thao  Lều lắp ráp
Công nghiệp gỗ  Gỗ nhân tạo.
 Giấy đặc biệt để lưu trữ hồ sơ.
 Container có độ bền cao
Các lĩnh vực khác  Làm màng lọc.
 Tả lót có thể tái chế.
 Màng rung động âm thanh
 Môi trường nuôi cấy mô thực vật

Luận văn tốt nghiệp Vật liệu và phương pháp
CHƯƠNG 3
VẬT LIỆU VÀ
PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm
3.1.1 Địa điểm
Phòng thí nghiệm Chuyển hóa sinh học (B13), Bộ môn Công nghệ sinh
học thực vật và Chuyển hóa sinh học, Khoa Sinh, Trường Đại Học Khoa Học
Tự Nhiên tp HCM.
3.1.2 Thời gian.
Đề tài được thự hiện từ tháng 09/2009 đến tháng 12/2009
3.3 Nội dung nghiên cứu
- Nhân sinh khối Dunaliella salina.
- Lên men Acetobacter xylinum và thu nhận Bacterial Cellulose (BC).
- Bước đầu thử nghiệm nuôi cấy Dunaliella salina trên giá thể BC.
3.3 Vật liệu và hóa chất
3.3.1 Thu mẫu
Giống Dunaliella salina được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Chuyển
Hóa Sinh Học Bộ môn Công nghệ Sinh học.
Giống Acetobacter xylinum do phòng thí nghiệm Chuyển Hóa Sinh Học
Bộ môn Công nghệ Sinh học cung cấp.
3.3.2 Trang thiết bị thí nghiệm
Máy đo pH, máy đo OD, cân điện tử, tủ cấy vô trùng, nồi hấp, máy lạnh,
tủ lạnh, máy cất nước, kẹp cấy, dao cấy, chai lọ, ống nghiệm, đĩa petri…

3.3.4 Hóa chất:
 Môi trường nhân giống Dunaliella salina:[MT1]
NaCl (lượng tùy theo yêu cầu)
MgCl2.6H2O 1,5 g
MgSO4.7H2O 0,5 g
KCl 0,2 g
CaCl2.2H2O 0,2 g
KNO3 1,0 g
NaHCO3 0,43 g
KH2PO4 0,035 g
Dung dịch vi lượng F2 10 ml
Dung dịch vitamin F2 10 ml
Nước biển vừa đủ 1 lít
a. Dung dịch vi lượng F2:
FeCl3·6H2O 3,15 g
Na2EDTA·2H2O 4,36 g
CuSO4·5H2O 9,8 g/L dH2O 1,0 ml
Na2MoO4·2H2O 6,3 g/L dH2O 1,0 ml
ZnSO4·7H2O 2,.0 g/L dH2O 1,0 ml
CoCl2·6H2O 10,0 g/L dH2O 1,0 ml
MnCl2·4H2O 180,0 g/L dH2O 1,0 ml
Nước cất 1,0 lít
b. Dung dịch vitamin F2:
Vitamin B12 1,0 g/L dH2O 1,0 ml
Biotin 0,1 g/L dH2O 10,0 ml
Thiamine HCl 200,0 mg
Nước cất 1,0 lít

 Môi trường nhân giống Acetobacter xylinum:[MT2]
(NH4)2 SO4 (Amonium sulphate: SA) 8g
(NH4)2 HPO4 ( Diamonium phosphate: DAP) 2g
Glucose 10g
Cao nấm men 2g
Acid ascorbic 2g
Nước dừa già 1lít
pH 4,5
(được điều chỉnh bằng acid acetic đậm đặc)
Môi trường nhân sinh khối được hấp vô trùng trong nồi autoclave ở
1atm, 1210
C, trong 15 phút.
 Môi trường tạo Bacterial Cellulose [MT3]
Môi trường nước dừa già:
(NH4)2 SO4 (Amonium sulphate: SA) 8g
(NH4)2 HPO4 ( Diamonium phosphate: DAP) 2g
Sucrose 20g
Nước dừa già 1 lít
pH 4,5
(được điều chỉnh bằng acid acetic đậm đặc)
 Hóa chất dùng định lượng protein [MT4]
 Dung dịch albumin 0,1mg/ml: cân chính xác 10mg albumin pha
trong 1ml nước cất. Lắc đều cho tan. Giữ ở nhiệt độ lạnh, khi dùng
pha loãng 100 lần, được dung dịch albumin có nồng độ 0,1 mg/ml.
 Dung dịch thuốc thử Bradford:
 Coomassie Brilliant Blue 0,002 g
 Ethanol 990
4,7 g
 Acid phosphoric 85% 8,5 g

3.4 Phương pháp thí nghiệm
3.4.1. Khảo sát sự tăng trưởng của Dunaliella salina
 Mục đích: Khảo sát sự tăng trưởng của vi tảo D. salina trong môi
trường lỏng và trên giá thể BC, từ đó xác định thời điểm cần để tiến
hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.1.1. Dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục huyền phù
và mật độ tế bào tảo:
Mục tiêu: Thiết lập đường tuyến tính giữa nồng độ sinh khối và độ
đục huyền phù dùng cho các thí nghiệm sau.
o Lấy dung dịch D. salina để đo độ đục.
o Tiến hành pha loãng dung dịch ban đầu có nồng độ X thành
các nồng độ khác nhau 0,9X; 0,8X; 0,7X; 0,6 X; 0,5X; 0,4X;
0,3X; 0;2X và 0,1 X.
o Ở mỗi nồng độ pha loãng, hút 40 ml mẫu.
o Mỗi mẫu chia làm hai phần bằng nhau.
o Một phần đo OD các dung dịch trên với bước sóng 660 nm.
Sử dụng môi trường [MT1] làm ống chuẩn khi đo, phần còn lại
dùng để xác định mật độ sinh khối của D.salina.
o Việc xác định mật độ sinh khối được làm như sau:
 Lọc 20 ml mẫu ở mỗi độ pha loãng bằng giấy lọc.
 Sấy giấy lọc chứa sinh khối ở tủ sấy 70o
C, sấy đến khối
lượng không đổi (khối lượng giữa 2 lần cân không lệch quá
0,5%).
msk = m – mg
Trong đó: msk (g): khối lượng sinh khối.
m (g): khối lượng giấy lọc chứa sinh khối.
mg (g): khối lượng giấy lọc.
Từ khối lượng sinh khối ta tính nồng độ sinh khối X (mg/ml) trong dung
dịch ban đầu.
V
m
X sk

Thí nghiệm được thực hiện trên 3 ống nghiệm, lấy giá trị trung bình.

Từ các giá trị OD tảo khác nhau và các nồng độ sinh khối khác nhau, dựng
đường tương quan tuyến tính biểu diễn nồng độ sinh khối (mg/ml) theo giá trị OD.
3.4.1.2. Dựng đường cong tăng trưởng của Dunaliella salina
 Hút 20 ml dịch tảo có giá trị OD từ 1,1-1,2 vào một erlen có chứa
sẵn 80 ml môi trường [MT1], lắc đều. Thí nghiệm được thực hiện
đồng thời trên 3 bình.
 Cho vào 20 ống nghiệm, mỗi ống 5 ml dịch huyền phù, nuôi cấy
lắc ở nhiệt độ phòng.
 Đo OD ở bước sóng 660 nm của dịch cấy theo từng ngày liên tục
trong 20 ngày.
 Dựa vào đường tương quan tuyến tính được xây dựng trong thí
nghiệm trên suy ra mật độ tảo trong ống nghiệm.
 Vẽ đường cong tăng trưởng của D. salina bằng đồ thị biểu diễn
hàm số của nồng độ (tb/ml) theo thời gian.
3.4.2. Lên men Acetobacter xylinum và thu nhận Bacterial Cellulose (BC).
3.4.2.1. Hoạt hóa giống:
Cấy một khuẩn lạc A. xylinum từ ống thạch nghiêng sang các ống
nghiệm có chứa 5ml môi trường hoạt hóa. Nuôi cấy lắc ở nhiệt độ phòng
(30o
C-32o
C) trong 24 giờ.
3.4.2.2. Nhân giống:
 Nhân giống cấp 1: Chuyển các ống giống đã được hoạt hóa sang
môi trường nhân giống trong các Erlen 100 ml, đem lắc 120
vòng/phút, ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
 Nhân giống cấp 2: Bình ống giống cấp 1 được cho vào Erlen 500
ml chứa môi trường nhân giống. Nuôi cấy lắc 120 vòng/phút, ở nhiệt
độ phòng trong 24 giờ.
3.4.2.3. Sản xuất BC:
 Tạo sinh khối BC: Lấy mỗi 30 ml giống từ môi trường nhân giống
cấp II sang các khay nhựa (d x r x h: 15 x 11 x 5) chứa 270 ml nước
dừa già để sản xuất BC, thực hiện thí nghiệm với 20 khay nhựa, đậy
kín, đặt trong điều kiện nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng.

 Thu sinh khối BC: Sau 7 ngày tiến hành thu BC.
3.4.2.4. Xử lý BC:
 Làm sạch BC bằng cách rửa nước nhiều lần
 Cân khối lượng tươi của BC.
 Ép các miếng BC cho ráo nước và sấy trong tủ sấy ở 700
C. Cân
các miếng BC.
3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ phối hợp giữa khối lượng BC và thể tích
môi trường lên sự tăng trưởng của Dunaliella salina.
 Mục tiêu: Xác định tỷ lệ phối hợp giữa khối lượng BC và thể tích môi
trường thích hợp cho sự tăng trưởng của D. salina.
 So sánh trọng lượng của các miếng BC trước và sau khi sấy. Thí
nghiệm được thực hiện ở các tỷ lệ phối hợp giữa khối lượng BC với thể
tích môi trường là 1:1; 1:1.5; 1:2; 1:2.5; 1:3 và 1:3.5.
 Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
 Các bước thực hiện:
 Miếng BC có kích thước phù hợp với đáy của Erlen 250 ml và có
trọng lượng 10g. 10g BC có thể chiếm một thể tích khoảng 10ml do
đó tùy theo từng tỷ lệ kết hợp ta bổ sung môi trường với các nồng độ
khác nhau để sau khi kết hợp với BC tất cả các môi trường đều có
nồng độ 1X nhưng có độ ẩm khác nhau.
 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy tảo có nồng độ 2X, bổ sung vào các
Erlen với các thể tích khác nhau, được biểu diễn trong bảng.
 Hút 5ml dịch tảo có độ đục OD từ 0.3-0.4 trải đều lên môi trường
nuôi cấy có giá thể BC có độ ẩm khác nhau. Sử dụng môi trường
nhân giống lỏng làm mẫu đối chứng.
 Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành ghi nhận liên tục trong 10 ngày ở 6
tỷ lệ kết hợp với các chỉ tiêu: mật độ sinh khối tảo và hàm lượng
chlorophyll thông qua giá trị OD sinh khối và OD của sắc tố
chlorophyll.

Bảng 3.1: Tỷ lệ kết hợp giữa khối lượng BC và thể tích môi trường nuôi cấy thích
hợp cho sự tăng trưởng của Dunaliella salina.
Nghiệm
thức
Tỷ lệ
phối hợp
Khối lượng
BC (g)
Môi trường nuôi cấy
V2X (ml) VH2O
Nồng độ sau khi
kết hợp
1 1: 1 10 10 0 1X
2 1: 1,5 10 12,5 2,5 1X
3 1: 2 10 15 5 1X
4 1: 2,5 10 17,5 7,5 1X
5 1: 3 10 20 10 1X
6 1: 3,5 10 22,5 12,5 1X
3.4.3.1. Xác định mật độ sinh khối tảo:
 Thu sinh khối tảo trên BC ở tất cả các lô thí nghiệm.
 Pha loãng sinh khối tảo bằng 100 ml nước cất, được dung dịch
huyền phù tảo.
 Đo mật đột sinh khối tảo của các huyền phù.
 Phần dịch còn lại được dùng để xác định độ đậm của chlorophyll.
3.4.3.3 . Xác định độ đậm:
o Xác định bước sóng hấp thu cực đại của chlorophyll
 Lọc thu lấy sinh khối Dunaliella salina từ dịch huyền phù bằng
giấy lọc.
 Ly trích sinh khối bằng cồn 96o
C nhiều lần cho đến khi giấy lọc
không còn màu xanh của tảo. Định mức dịch chiết thành 100ml.
 So màu dịch chiết ở các bước sóng từ 360 đến 700 nm, ta được
phổ hấp thu và bước sóng cực đại của chlorophyll.
o Xác định độ đậm chlorophyll.
 Lọc thu sinh khối tảo bằng vải lọc.
 Cân cùng khối lượng sinh khối tảo ở các lô thí nghiệm, tiến hành
thu dịch chiết sắc tố tương tự như thí nghiệm trên.
Tải bản FULL (89 trang): bit.ly/2YngNlk
Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net

 Đo OD của các dịch chiết ở bước sóng hấp thu cực đại.
3.4.4. Nhân sinh khối tảo trong môi trường lỏng và trên giá thể BC.
Mục tiêu: khảo sát sự tăng trưởng và một số đặc tính biến dưỡng của
D. salina trên môi trường BC và môi trường lỏng.
D. salina được tăng sinh trên môi trường BC có tỷ lệ phối hợp giữa
khối lượng BC và thể tích môi trường tối ưu được xác định trong thí nghiệm
3.4.3.
Chỉ tiêu khảo sát: trọng lượng khô, hàm lượng chlorophyll và protein
trong D. salina thu được từ hai loại môi trường.
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
3.4.4.1. Xác định trọng lượng khô của tảo trên hai môi trường nhân
giống:
 Cấy dịch huyền phù D. salina vào các hộp chứa (d x r x h : 15 x 11
x 5cm) có chứa trong môi trường BC và môi trường lỏng, trong đó
hàm lượng các thành phần trong môi trường của hai nghiệm thức bằng
nhau.
 Chọn thời điểm thích hợp thu được từ thí nghiệm 3.4.3 để tiến hành
thu hoạch sinh khối.
 Đối với môi trường BC: dùng dao cạo nhẹ lớp sinh khối ở trên
bề mặt BC.
 Đối với môi trường lỏng: Thu sinh khối tảo bằng vải lọc.
 Sấy sinh khối ở 65o
C trong 5 giờ.
 Nghiền nhuyễn sinh khối vừa sấy thu được bột D. salina.
 Cân khối lượng bột thu được.
3.4.4.2. Khảo sát độ đậm chlorophyll của bột
Lặp lại thí nghiệm xác định độ đậm chlorophyll với mẫu bột
khô D. salina.
Tải bản FULL (89 trang): bit.ly/2YngNlk
Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net

3.4.4.3. Xác định hàm lượng protein trong bột
Hàm lượng protein trong bột được xác định bằng phương pháp
Bradford.
 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford:
a. Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực
đại của thuốc nhuộm Coomassie Blue khi tạo phức với protein. Trong
dung dịch mang tính acid, khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm
có bước sóng hấp thu cực đại ở 465nm, khi kết hợp với protein thì
thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595nm. Độ hấp thu ở bước
sóng 595nm có liên hệ trực tiếp đến nồng độ protein.
b. Thực hiện thí nghiệm:
 Xây dựng đường chuẩn với dung dịch albumin:
 Lập 2 dãy ống nghiệm, mỗi dãy 6 ống được đánh số
theo thứ tự 0a, 0b, 1a, 1b, …, 5a, 5b.
 Bổ sung các thành phần vào ống nghiệm theo bảng.
 Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút, cho
5ml dung dịch thuốc thử vào ống nghiệm 0a. Lắc đều rồi
để yên.
 Ở thời điểm 1 phút, cho 5ml dung dịch thuốc thử vào
ống nghiệm 0b. Lắc đều và để yên. Thực hiện việc bổ
sung 5ml dung dịch thuốc thử tuần tự vào các ống 1a, 1b,
2a, 2b… ở các thời điểm cách nhau 1 phút. Đến thời
điểm 11 phút, cho 5ml dung dịch thuốc thử vào ống 6b.
Lắc đều rồi để yên.
 Tính thời gian ống 0a được 20 phút, tiến hành đo độ
hấp thu của dung dịch ở bước sóng 595 nm.
 Tính thời gian ống 0b được 21 phút, thiến hành đo
OD595. Tương tự thực hiện ở các thời điểm cách nhau 1
phút.
3485861

Bước Đầu Thử Nghiệm Nuôi Cấy Dunaliella Salina Trên Giá Thể Bacterial Cellulose

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Bước Đầu Thử Nghiệm Nuôi Cấy Dunaliella Salina Trên Giá Thể Bacterial Cellulose

Similar to Bước Đầu Thử Nghiệm Nuôi Cấy Dunaliella Salina Trên Giá Thể Bacterial Cellulose (20)

More from nataliej4

More from nataliej4 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Bước Đầu Thử Nghiệm Nuôi Cấy Dunaliella Salina Trên Giá Thể Bacterial Cellulose