Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng của một số chủng nấm purpureocillium lilacium phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở vũng tàu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME
NGOẠI BÀO VÀ KÝ SINH TUYẾN TRÙNG CỦA MỘT
SỐ CHỦNG NẤM Purpureocillium lilacinum PHÂN LẬP
TỪ ĐẤT RỪNG VÀ ĐẤT CANH TÁC Ở VŨNG TÀU
Ngành: Công nghệ sinh học
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Giảng viên hướng dẫn : ThS Lê Thị Mai Châm
Sinh viên thực hiện : Trần Thị Ngọc Hạnh
MSSV: 1151110125 Lớp: 11DSH01
TP. Hồ Chí Minh, 2015

Đồ án tốt nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học thành phố HCM
nói chung và các anh chị công tác tại phòng Vi sinh nói riêng, đã tạo điều kiện cho
em tham gia làm đồ án tốt nghiệp tại đây.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Lê Thị Mai Châm, chị Nguyễn
Thị Thùy Dương đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm trong
quá trình làm đồ án tốt nghiệp của em tại Trung tâm.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu Trường Đại Học Công
Nghệ Tp.HCM và quý thầy cô đã tận tình giảng dạy và cung cấp những kiến thức
cần thiết, bổ ích để chúng em có thể hoàn thành tốt quá trình học tập của mình.
Cuối cùng em xin cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn đồng hành và ủng hộ
em trong suốt quá trình này.
XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN
TP.HCM, ngày 20 tháng 8 năm 2015
Sinh viên thực hiện
Trần Thị Ngọc Hạnh

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của cá nhân. Các kết quả và
số liệu trong đồ án là trung thực.
Ngƣời cam đoan
Trần Thị Ngọc Hạnh

i
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................3
1.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp. ..........................................................................3
1.1.1 Phân loại......................................................................................................3
1.1.2 Vòng đời......................................................................................................3
1.1.3 Cấu tạo trứng của tuyến trùng .....................................................................4
1.1.4 Cấu tạo thành cơ thể con cái của tuyến trùng .............................................5
1.2 Nấm Purpureocillium lilacinum........................................................................5
1.2.1 Phân loại......................................................................................................5
1.2.2 Điều kiện sống.............................................................................................6
1.2.3 Đặc điểm hình thái ......................................................................................7
1.2.4 Đặc điểm dinh dưỡng..................................................................................8
1.2.5 Khả năng tiết enzyme ngoại bào .................................................................8
1.2.6 Độc tố của P. lilacinum.............................................................................10
1.2.7 Quá trình kí sinh........................................................................................11
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...12
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...................................................................12
2.2 Thiết bị, hóa chất, vật liệu nghiên cứu.............................................................12
2.2.1 Dụng cụ, thiết bị........................................................................................12
2.2.2 Vật liệu, đối tượng nghiên cứu..................................................................12
2.2.3 Hóa chất.....................................................................................................14
2.3 Nội dung nghiên cứu........................................................................................16
2.4 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................16
2.4.1 Phương pháp định tính hệ enzyme ngoại bào protease, chitinase của nấm
P. lilacinum ........................................................................................................16
2.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng xâm nhập trứng và con cái tuyến trùng
Meloidogyne spp. của nấm P. lilacinum ............................................................18
2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu.........................................................................19

ii
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.........................................................20
3.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào của các chủng nấm P. lilacinum ......20
3.1.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào protease......................................20
3.1.2 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào chitinase của các chủng nấm P.
lilacinum.............................................................................................................26
3.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh khối trứng và con cái tuyến trùng
Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum...............................................30
3.2.1 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh trên trứng tuyến trùng Meloidogyne
spp. của các chủng nấm P. lilacinum .................................................................31
3.2.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh trên tuyến trùng cái Meloidogyne spp.
............................................................................................................................36
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................39
4.1 Kết luận............................................................................................................39
4.2 Đề nghị.............................................................................................................39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................40

iii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Các chủng nấm P. lilacinum được phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở
Vũng Tàu...................................................................................................................12
Bảng 3.1 Vòng phân giải casein của các chủng nấm phân lập được từ đất rừng ở
Vũng Tàu ở các khoảng thời gian khác nhau............................................................20
Bảng 3.2 Vòng phân giải casein của các chủng nấm phân lập được từ đất canh tác ở
Vũng Tàu ở các khoảng thời gian khác nhau............................................................22
Bảng 3.3 Mức độ tiết enzyme protease của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất
rừng và đất canh tác ở đất Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau ......................25
Bảng 3.4 Vòng phân giải chitin của các chủng nấm phân lập từ đất rừng ở Vũng
Tàu theo các khoảng thời gian khác nhau.................................................................26
Bảng 3.5 Vòng phân giải chitin của các chủng nấm phân lập từ đất canh tác ở Vũng
Tàu theo các khoảng thời gian khác nhau.................................................................27
Bảng 3.6 Mức độ tiết enzyme chitinase của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất
rừng và đất canh tác ở đất Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau ......................30
Bảng 3.7 Tỷ lệ ký sinh trên khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng
nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu.........................32
Bảng 3.8 Mức độ ký sinh khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng
P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở đất Vũng Tàu ở các mốc thời
gian khác nhau...........................................................................................................35
Bảng 3.9 Tỷ lệ ký sinh trên con cái Meloidogyne spp. của các chủng nấm P.
lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu.....................................36
Bảng 3.10 Mức độ ký sinh con cái tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng P.
lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở đất Vũng Tàu ở các mốc thời gian
khác nhau...................................................................................................................38

iv
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1 Vòng phân giải casein trung bình của các chủng nấm P. lilacinum phân
lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu theo thời gian.......................................24
Biểu đồ 3.2 Vòng phân giải chitin trung bình của các chủng nấm P. lilacinum phân
lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu theo thời gian.......................................29
Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ ký sinh khối trứng trung bình của các chủng nấm P. lilacinum
phân lập ở đất rừng và đất canh tác ở các khoảng thời gian khác nhau....................34
Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ ký sinh con cái Meloidogyne spp. trung bình của các chủng nấm
P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở các khoảng thời gian khác nhau.
...................................................................................................................................37

v
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Vòng đời của tuyến trùng ký sinh thực vật. ................................................3
Hình 1.2 Hình thái tuyến trùng cái Meloidogyne sp.. ................................................5
Hình 1.3 Hình thái khuẩn lạc P. lilacinum sau 15 ngày nuôi cấy trên môi trường
PDA.............................................................................................................................7
Hình 1.4 Hình thái cơ quan mang bào tử và bào tử nấm P. lilacinum.......................7
Hình 1.3 Cấu tạo hóa học của độc tố paecilotoxin...................................................11
Hình 3.1 Vòng phân giải casein của chủng PB 2.10 trong các khoảng thời gian 24
giờ; 48 giờ và 72 giờ ................................................................................................21
Hình 3.2 Vòng phân giải casein của chủng PB 1.1, PB 1.10, PB 3.1 ở 48 giờ........21
Hình 3.3 Vòng phân giải casein của chủng KL 5.3 và KL 6.2 và KL 5.2 ở 72 giờ.24
Hình 3.4 Vòng phân giải casein của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất rừng và
đất canh tác sau 24 giờ , 48 giờ, 72 giờ.....................................................................25
Hình 3.5 Vòng phân giải chitin của chủng PB 3.3 sau 24 giờ , 48 giờ , 72 giờ.......27
Hình 3.6 Vòng phân giải chitin của chủng HT 5.1 sau 24 giờ , 48 giờ, 72 giờ . .....29
Hình 3.7 Quá trình khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. bị nấm P. lilacinum ký
sinh. hình dạng khối trứng ban đầu, nấm tiếp xúc khối trứng, khối trứng bị kí sinh.
...................................................................................................................................33
Hình 3.8 Quá trình tuyến trùng cái Meloidogyne spp. bị nấm P. lilacinum ký sinh.
hình dạng con cái ban đầu, nấm bắt đầu ký sinh, con cái bị kí sinh. ........................37

vi
TÓM TẮT
Khảo sát khả năng tiết enzyme ngoại bào của 38 chủng nấm Purpureocillium
lilacinum bằng phương pháp đo vòng phân giải cơ chất trên môi trường thạch. Sau
thử nghiệm, chọn lọc ra các chủng nấm tiêu biểu có khả năng tiết enzyme ngoại bào
protease và chitinase mạnh để thử nghiệm khả năng ký sinh con cái và khối trứng
Meloidogyne spp. trực tiếp trên đĩa Petri.
Kết quả, tất cả các chủng nấm Purpureocillium lilacinum đều có khả năng
tiết enzyme ngoại bào và khả năng tiết enzyme protease mạnh hơn so với chitinase.
Đối với enzyme chitinase, đường kính vòng phân giải cơ chất tối ưu nhất đạt được
sau 48 giờ. Các chủng có khả năng phân hủy chitin mạnh là PB 3.3, HT 5.1, KL 6.2
và KL 5.3. Đối với enzyme protease thì các chủng nấm khảo sát có khả năng tiết
mạnh nhất sau 72 giờ. Các chủng có khả năng phân hủy casein mạnh là PB 2.10, PB
1.3, KL 5.3 và KL 6.2. Không có sự khác biệt về mặt thống kê khả năng tiết enzyme
ngoại bào của các chủng nấm phân lập từ đất rừng và đất canh tác. Kết quả thử
nghiệm ký sinh tuyến trùng cho thấy, tất cả các chủng nấm khảo sát PB 1.1, PB 1.3,
PB 1.10, PB 2.10, PB 3.3 đều có thể ký sinh con cái Meloidogyne spp. nhanh và
mạnh hơn so với khối trứng của nó.

1
MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Tuyến trùng ký sinh trên thực vật gây ra thiệt hại đáng kể về mặt kinh tế đối
với nhiều loại cây trồng có giá trị thương nghiệp. Hàng năm, tuyến trùng gây tổn
thất 11% năng suất các loại cây ngũ cốc, rau ăn lá, chuối, khoai mì, dừa, khoai tây,
củ cải đường, mía đường, khoai lang, làm giảm 15% năng suất các loại cây trồng
kinh tế quan trọng (Agrios, 2005). Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, tuyến
trùng phát triển khá mạnh và gây tác hại nặng nề cho sản xuất nông nghiệp ở nhiều
vùng, đặc biệt là rau và các loại cây công nghiệp trong đó có cây hồ tiêu. Cây hồ
tiêu là cây công nghiệp dài ngày, có giá trị kinh tế, được trồng ở nhiều nơi và có giá
trị xuất khẩu cao trên thế giới. Diện tích đất canh tác ở Vũng Tàu chiếm 9047 ha,
trong đó có khoảng gần 0,5% diện tích đất trồng bị nhiễm bệnh nguyên nhân là do
tuyến trùng gây nên.Việc dùng thuốc hóa học để tiêu diệt tuyến trùng hại thực vật
kéo theo các tác động tiêu cực đến môi trường và an toàn sức khỏe cho con người
và vật nuôi. Bên cạnh đó, nó còn tăng tính kháng thuốc của sâu hại, làm cho việc
phòng trừ ngày càng khó khăn hơn. Vì vậy, hiện nay người ta đang tìm kiếm các tác
nhân sinh học để sử dụng thay thế một phần hoặc hoàn toàn thuốc hóa học trong
kiểm soát tuyến trùng gây hại. Do đó việc nghiên cứu tìm ra các chủng nấm có khả
năng ký sinh tuyến trùng là vấn đề đang được quan tâm hiện nay.
Nấm Purpureocillium đã được chứng minh có khả năng ký sinh tuyến trùng
hiệu quả và sống hoại sinh trong vùng rễ nhiều loại cây trồng. Chúng đã được
nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu phân lập hay xác
định khả năng ký sinh tuyến trùng của nấm Purpureocillium còn rất hạn chế đặc
biệt là các chủng nấm được phân lập ở vùng Đông Nam Bộ. Do đó, năm 2014,
Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Tp. Hồ Chí Minh đã xác định sự phân bố của nấm
này ở các hệ sinh thái đất (đất tự nhiên-đất rừng, đất canh tác-đất trồng) ở vùng này.
Kết quả cho thấy nấm xuất hiện ở hầu hết các vùng, trong đó có hệ sinh thái rừng
ngập mặn ở Vũng Tàu. Việc xác định khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh
tuyến trùng của các chủng nấm này là rất cần thiết có thể giúp ích trong việc kiểm

2
soát bệnh do tuyến trùng gây ra trong tương lai. Do đó dẫn đến lý do chọn đề tài:
“Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng
của một số chủng nấm Purpureocillium lilacium phân lập từ đất rừng và đất
canh tác ở Vũng Tàu”.
Mục tiêu nghiên cứu: So sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào, xâm nhập con cái
và khối trứng Meloidogyne spp. của các chủng nấm Purpureocillium lilacium
(P. lilacinum) phân lập được từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học
Đây là nghiên cứu đầu tiên về xác định khả năng tiết enzyme ngoại bào cũng
như kí sinh tuyến trùng của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng ngập
mặn và đất canh tác ở Vũng Tàu. Từ đó, xác định được hệ sinh thái đất (đất rừng
hay đất canh tác) tồn tại những chủng nấm P. lilacinum có đặc tính tốt.
Ý nghĩa thực tiễn
So sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và khả năng xâm nhập tuyến trùng
của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác giúp chọn lọc
được chủng nấm kí sinh tuyến trùng hiệu quả nhằm ứng dụng chúng để phòng trừ
tuyến trùng gây hại cây trồng.

3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp.
1.1.1 Phân loại
Meloidogyne spp. là tuyến trùng ký sinh thực vật. Chúng tồn tại trong đất ở
nơi có khí hậu nóng hay có mùa đông ngắn. Khoảng 2000 loài thực vật bị nhiễm
loại tuyến trùng này, nó chiếm 5% trong nguyên nhân gây mất mùa trên thế giới
(Sasser, 1985). Ấu trùng xâm nhập vào rễ cây, hình thành những nốt sần ở rễ, hấp
thụ chất dinh dưỡng của thực vật. Gây ra hiện tượng chết ở cây con và giảm năng
suất ở cây trưởng thành khi xâm nhập vào cây. Phân loại theo Goeldi (1889) như
sau:
Giới: Animalia
Nghành: Nematoda
Lớp: Secernentea
Bộ : Tylenchida
Họ: Meloidogynidae
Chi: Meloidogyne
1.1.2 Vòng đời
Hình 1.1 Vòng đời của tuyến trùng ký sinh thực vật.
(Nguồn: www.daf.qld.gov.au)

4
Tuyến trùng rễ bắt đầu vòng đời ở giai đoạn trứng phát triển thành ấu trùng
tuổi 1. Giai đoạn này ấu trùng sống trong túi trứng và lột xác chuyển sang giai đoạn
ấu trùng tuổi 2. Ấu trùng ở thời kỳ này có thể bắt đầu xâm nhập vào rễ thực vật,
chúng tấn công vào chóp rễ rồi đi vào các gian bào. Ấu trùng di chuyển đến các tế
bào đang phân chia để tạo vị trí lấy thức ăn bằng cách tiêm dịch tiết của tuyến thực
quản vào trong các tế bào rễ. Những dịch được tiết ra này là nguyên nhân gây ra sự
thay đổi các chức năng sinh lý của tế bào ký sinh. Ấu trùng tuổi 2 chưa có cơ quan
sinh sản. Giống với giun tròn, tuyến trùng rễ trải qua 4 giai đoạn ấu trùng, trong mỗi
giai đoạn chúng lột xác giống như côn trùng. Nhờ vậy ấu trùng có một vài nét tương
đồng với tuyến trùng đực và cái ở giai đoạn trưởng thành. Ở giai đoạn tuổi 4, là quá
trình từ ấu trùng chuyển sang dạng hình cầu ở con cái trưởng thành hay dạng giun
của con đực trưởng thành có thể nhìn thấy rõ ràng hơn. Con cái trưởng thành có thể
đẻ từ 500 đến hơn 1000 trứng.
Chiều dài của vòng đời tuyến trùng rễ khác nhau tùy theo mỗi loài, nhưng
ngắn nhất là trong khoảng 2 tuần. Các loài ở những vùng lạnh hơn thì vòng đời sẽ
dài hơn. Trứng của tuyến trùng có thể ở nguyên trong rễ hay lẫn vào trong đất.
Trứng nở một cách ngẫu nhiên, không cần tiếp xúc với các dịch chiết ở rễ. Trong
điều kiện thuận lợi, trứng có thể tồn tại trong đất ít nhất trong vòng 1 năm
(Mitkowski và cộng sự, 2003).
1.1.3 Cấu tạo trứng của tuyến trùng
Tuyến trùng cái đẻ trứng vào chất nền gelatin được sản xuất bởi 6 tuyến trực
tràng, và được tiết ra trước và trong suốt quá trình đẻ trứng. Hình dạng chất nền ban
đầu là ống thông qua các lớp ngoài của mô rễ bao quanh trứng, tạo thành một lớp
bảo vệ chống mất nước bằng cách duy trì một mức độ ẩm cao quanh trứng (Bird,
1887).
Cấu tạo của trứng tuyến trùng: lớp vỏ trứng là phần bền nhất của trứng tuyến
trùng, có vai trò trong việc chống lại các tác nhân bất lợi về mặt hóa học và sinh học
(Wharton, 1980). Vỏ trứng của tuyến trùng có thể bao gồm từ một đến năm lớp tùy
thuộc theo từng bộ tuyến trùng. Cấu trúc thường thấy nhất của vỏ trứng gồm: lớp

5
trong cùng là lớp lipid, một lớp chitin ở chính giữa (thành phần chính) và lớp màng
vitelline ở ngoài cùng (Bird và cộng sự, 1976). Lớp chitin đóng vai trò quan trọng
trong việc tạo ra một cấu trúc bền vững để bảo vệ cho lớp lipid trong cùng. Lớp
lipid bao gồm một chuỗi màng lipoprotein và dày nhất trong khoảng 0,02 – 0,04
µm, có vai trò trong việc chống thấm để bảo vệ trứng khỏi các tác nhân hóa học bất
lợi (Wharton, 1980). Nếu lớp chitin bị loại bỏ thì lớp lipid cũng dễ dàng bị phá hủy.
1.1.4 Cấu tạo thành cơ thể con cái của tuyến trùng
Hình 1.2 Hình thái tuyến trùng cái Meloidogyne sp..
(Nguồn: www.lsuagcenter.com)
Con cái của tuyến trùng Meloidogyne spp. hình cầu với cổ ngắn chứa kim hút
(nên gần giống với hình quả lê), diều giữa và tuyến thực quản (Mitkowski và cộng
sự, 2003). Thành cơ thể của tuyến trùng cái được bao bọc bởi lớp cutin chứa rất ít
chitin mà chủ yếu là protein và collagen (Watson, 1965). Lớp cutin Meloidogyne
incognita dày khoảng 1,5 µm bao gồm lớp vỏ, lớp trung gian và lớp cơ bản. Lớp vỏ
được phân tối thiểu thành 5 lớp và có dộ dày khoảng 0,1 µm, lớp giữa thì khoảng
0,4 µm và lớp cơ bản là 0,5 µm (Baldwin và cộng sự, 1975).
1.2 Nấm Purpureocillium lilacinum
1.2.1 Phân loại
P. lilacinum được mô tả lần đầu bởi nhà nghiên cứu nấm người Mỹ Charles
Thom vào năm 1910, dưới tên gọi Penicillium lilacinum (Thom, 1910). Phân loại
giống với chủng Penicillium amethystinum của Wehmer và Spicaria rubidopurpurea

6
của Aoki (Thom, 1974). Năm 1974, Robert A. Samson chuyển tên Penicillium
lilacinum thành Paecilomyces (Samson, 1974). Các ấn phẩm được xuất bản trong
những năm thập niên 20, chỉ ra rằng chi Paecilomyces không phải là một đơn ngành
(Inglis và cộng sự, 2006), và có họ hàng gần với các chủng Paecilomyces
nostocoides, Isaria takamizusanensis và Nomuraea atypicola. Chi mới
Purpureocillium được tạo ra để giữ sự phân loại này (Sung và cộng sự, 2007). là tên
chung dùng để chỉ các loại nấm sản sinh bào tử tím (Luangsa-Ard và cộng sự, 2011).
P. lilacinum được phân loại là nấm sinh sản vô tính bằng bào tử theo loài
Isarioidea, và đã được chấp nhận ở khắp nơi trên thế giới, do dạng sinh sản hữu tính
hiếm khi được tìm thấy. Phân tích phát sinh loài cho thấy P. lilacinum phân lập được
có mối quan hệ gần với Trichoderma, Gliocladium và Hypocrea hơn các loài
Paecilomyces kí sinh côn trùng khác trong bộ Hypocreales (Inglis và cộng sự, 2006).
Nấm này được phân loại theo Samson và cộng sự (2011) như sau:
Giới: Fungi
Nghành: Ascomycota
Lớp: Sordariomycetes
Bộ: Hypocreales
Họ: Ophiocordycipitaceae
Chi: Purpureocillium
Loài: Purpureocillium lilacinum
1.2.2 Điều kiện sống
Nấm P. lilacinum là nấm sợi hoại sinh phổ biến, đã được phân lập từ một loạt
các môi trường sống như đất trồng trọt, đất bỏ hoang, rừng đồng cỏ, sa mạc, trầm
tích ở cửa sông và bùn thải. Nó cũng được tìm thấy trên trứng của tuyến trùng và
con cái của tuyến trùng gây nốt sần ở rễ cây. Bên cạnh đó, nó cũng được tìm thấy ở
vùng rễ của nhiều loại cây trồng.
Nhiều loài có thể phát triển trên một phạm vi nhiệt độ rộng trong khoảng từ
8o
C đến 38o
C và phát triển tối ưu ở nhiệt độ từ 26o
C đến 30o
C. Nấm này có thể chịu

7
được một khoảng pH rộng và có thể phát triển trên nhiều loại môi trường tự nhiên
(Samson, 1974; Anderson và cộng sự, 1995).
1.2.3 Đặc điểm hình thái
Hình 1.3 Hình thái khuẩn lạc P. lilacinum sau 15 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA.
(Nguồn: www.pf.chiba-u.ac.jp)
Khuẩn lạc của P. lilacinum trên môi trường thạch Malt tăng trưởng khá nhanh
đạt đường kính 5 – 7 cm trong vòng 14 ngày ở 25o
C (77o
F), gồm dạng nền bông với
hệ sợi nấm dinh dưỡng tăng trưởng nhanh, ban đầu màu trắng nhưng khi hình thành
bào tử thì chuyển sang màu tím. Mặt khác, có một số chủng đôi khi không có màu
nhưng thường thì đều có màu tím (Samson, 1974).
Hình 1.4 Hình thái cơ quan mang bào tử và bào tử nấm P. lilacinum.
(Nguồn: http://thunder-house4-yuri.blogspot.com/2012_06_01_archive.html)
P. lilacinum tạo thành một hệ sợi nấm dày đặc sản sinh ra cuống bào tử đính.
Sợi nấm sinh dưỡng có vách trơn, trong suốt, rộng từ 2,5 – 4 µm. Cuống bào tử
được sinh ra từ các sợi nấm cơ chất, hoặc những sợi nấm dinh dưỡng, dài khoảng
400 – 600 µm. Thể bình phình ra ở gốc và thon dần về phía ngọn. Bào tử trần được

8
sinh ra tạo thành chuỗi dài, ở phía cuối thể bình gắn trên cuống bào tử. Bào tử nảy
mầm khi có đủ độ ẩm và dinh dưỡng thích hợp. Bào tử trần có dạng elip đến hình
thoi, có vách trơn hơi nhám. Không xuất hiện bào tử đảm (Samson, 1974).
1.2.4 Đặc điểm dinh dưỡng
Nấm không có diệp lục tố nên cần cung cấp dinh dưỡng từ bên ngoài (dị
dưỡng) sống sót và phát triển nhờ khả năng ký sinh (sống ký sinh trong trứng và
tuyến trùng Meloidogyne spp.) hay hoại sinh trên xác bã hữu cơ. Do trứng và tuyến
trùng là nguồn hữu cơ phức tạp nên nấm sẽ tiết ra enzyme ngoại bào (protease,
chitinase) để phân giải các chất khó hấp thụ thành những chất đơn giản dễ sử dụng
(Nguyễn Văn Bá và cộng sự, 2005).
1.2.5 Khả năng tiết enzyme ngoại bào
Vỏ trứng được cấu tạo từ 3 lớp khác biệt và thành phần chính gồm protein và
chitin, đã tạo thành cấu trúc dạng sợi nhỏ chứa glycoprotein ở dạng vô định hình
(Perry, 2002). Chitinase và proteases đóng vai trò quan trọng trong suốt quá trình
xâm nhập vào vỏ trứng, và tác động vào sự phân hủy của vỏ trứng (Morton, 2003;
Segers, 1996). Nấm có khả năng tiết enzyme ngoại bào (đặt biệt là enzyme protease,
chitinase và collagenase) có ảnh hưởng nhiều trong việc ký sinh lên trứng của tuyến
trùng (Huang, 2004).
P. lilacinum có khả năng tiết enzyme serine protease và chitinase để tham gia
vào quá trình phá hủy vỏ trứng của tuyến trùng (Morgan và cộng sự, 1984; Khan và
cộng sự, 2004). Nhiều enzyme được tiết bởi P. lilacinum đã được nghiên cứu.
Enzyme serine protease cơ bản có khả năng phân hủy sinh học trứng Meloidogyne
hapha (Bonants và cộng sự, 1995). Một chủng P. lilacinum đã được phân lập và
nghiên cứu có khả năng tiết enzyme protease và chitinase làm mỏng vỏ trứng tuyến
trùng Meloidogyne javanica để cho móc xâm nhiễm có thể đâm xuyên qua vỏ trứng
(Khan và cộng sự, 2004).

9
Enzyme protease
Enzyme protease (còn gọi là peptidase hay proteinase) là nhóm enzyme có khả
năng phân giải protein. Đó là quá trình chuyển hóa protein bằng cách cắt các liên
kết peptide (-CO-NH-) liên kết các acid amin trong một chuỗi polypeptide. Protease
được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.
Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn
nhóm: Serin proteinase - những proteinase chứa nhóm -OH của gốc serine trong
trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của
enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Các serine
proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ
chất tương đối rộng. Cysteine proteinase - chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt
động. Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc
hiệu cơ chất rộng. Aspartic proteinase - chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt
động. Các aspartic thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. Metallo proteinase -
được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các
metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh
dưới tác dụng của EDTA (Trần Thị Nhã Uyên, 2010).
Nhóm serine protease là nhóm peptidase lớn nhất và được phát hiện ở mọi giới
sinh vật như eukaryote, prokaryote, archaea và virus. Những enzyme này đều có
chung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thông qua hai bước chính (Barrett,
1994). Bước 1 - hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với
nguyên tử carbon trong nhóm carboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm
imidazole từ histidine. Bước 2 (khử acyl hóa) phức hệ acyl-enzyme bị thủy phân bởi
phân tử H2O theo chiều ngược lại của bước một. Trong đó, nhóm imidazole chuyển
proton của gốc -OH từ serine cho nhóm amine để tái sinh lại enzyme.
Enzyme chitinase
Chitinase là enzyme thủy phân liên kết glycoside trong chitin (Jolles, 1999).
Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, 1-4-β- chitobiosidase, N-acetyl-β-
D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase. Endochitinase là enzyme phân cắt

10
nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn olygosaccharides. Chitin 1,4-β-
chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm chính là các dimer
chitobiose. N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) là enzyme phân cắt chitin
từ một đầu cho sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D-glucosamine.
Chitobiase là enzyme phân cắt chitobiose thành hai đơn phân N-acetyl-D-
glucosamine. Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và
chitooligomer, sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân
tử khác nhau, nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính
endochitinase không thể phân cắt thêm được nữa. Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt
chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp lớn hơn hay bằng 3 [(GlcNAc)n với n ≥ 3]
từ đầu không khử và chỉ phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2, β-N-acetyl
hexosaminidase phân cắt các chitooligomer hay chitin một cách liên tục từ đầu
không khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetyl glucosamine (GlcNAc).
Endochitinase, chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase có thể hoạt động trên
cơ chất là dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động kém
hơn trên chitin thô thu từ vỏ tôm (Lê Thị Huệ, 2010).
1.2.6 Độc tố của P. lilacinum
Ngoài khả năng tiết enzyme ngoại bào P. lilacinum còn có khả năng sinh độc tố.
Độc tố chính của nấm P. lilacinum là paecilotoxin (leucinostatins), là một trong các
tác nhân gây ra cái chết cho kí chủ. Paecilotoxin có cấu trúc cực kỳ phức tạp, là một
chuỗi peptide thẳng gồm nhiều acid béo chưa bão hòa ở đầu N và amine ở đầu C.
Paecilotoxin có pháp danh hóa học là (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[2[2-(3-
arbamoylpropylcarbomoyl)propan-2-ylcarbamoyl]propan-2-ylcarbamoy]-3-
methylbutyl]carbomoyl]-3-methyl-butyl]carbomoyl]propan-2-ycarbomoyl]-2-
hydroxy-3-methyl-butul] carbomyl]-5-hydroxy-3-methyl-7-oxo-nonyl]-4-methyl-1-
[(E.4S)-4-methylhex-2-enoyl]pyrrolidin-2-carboxamide (Nevalainen và cộng sự,
1977).
Sản phẩm của paecilotoxin có rất nhiều dạng, nhưng khá giống nhau ở mỗi
chủng, thường thì độc tố chính là Paecilotoxin A hoặc Paecilotoxin B. Tùy từng loài

11
khác nhau mà có sinh ra các độc tố khác như: bysochlamic acid, variotin, ferriubin,
viriditoxin, indole-3-acetic acid, fusigen và patulin. Các hợp chất chuyển hoá thứ
cấp này có thể gây ra tác động diệt tuyến trùng.
Hình 1.3 Cấu tạo hóa học của độc tố paecilotoxin.
1.2.7 Quá trình kí sinh
Nấm xâm nhập vào trứng và con cái của tuyến trùng thông qua chất nền
gelatin của trứng và lỗ sinh dục hay cổ của tuyến trùng cái. Một khi vào bên trong,
sợi nấm sẽ phân nhánh và đâm xuyên qua bề mặt vỏ trứng. Chỗ phình ra ở đầu sợi
nấm sẽ tạo ra những đĩa áp tiếp xúc với bề mặt trứng. Móc xâm nhập được tạo nên
bên dưới sợi áp sẽ đâm xuyên và mọc bên trong vỏ trứng. Trứng bị xâm nhiễm sẽ
phình ra và biến dạng. Sau đó, lớp màng vitelline chia thành ba vùng, xuất hiện một
lượng lớn không bào và lớp lipid hầu như biến mất (Esser và cộng sự, 1993). Khi
sợi nấm đã xâm nhập vào trứng, nó nhanh chóng tiêu diệt các ấu trùng bên trong
trước khi tiến ra khỏi vỏ trứng rỗng để sản sinh bào tử đỉnh và mọc về phía các
trứng liền kề. Ở con cái trưởng thành giai đoạn bị nhiễm nấm là khi sợi nấm tiến
vào lỗ sinh dục hoặc hậu môn (Jatala và cộng sự, 1979).

12
CHƢƠNG 2:
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 4 – tháng 8 năm 2015
Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ Vi sinh – Trung tâm công nghệ sinh
học thành phố Hồ Chí Minh.
2.2 Thiết bị, hóa chất, vật liệu nghiên cứu
2.2.1 Dụng cụ, thiết bị
Nồi hấp khử trùng
Que cấy điểm
Dao cấy
Đĩa Petri
Ống ngiệm
Đèn cồn
Dụng cụ đục lỗ thạch 5mm
Micropipette
2.2.2 Vật liệu, đối tượng nghiên cứu
Vật liệu: Khối trứng và tuyến trùng cái Meloidogyne spp. được thu nhận từ rễ
cây.
Đối tượng: 38 chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở
Vũng Tàu do Phòng Công nghệ Vi sinh của Trung Tâm Công nghệ sinh học cung
cấp.
Bảng 2.1 Các chủng nấm P. lilacinum được phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở
Vũng Tàu
STT TÊN NGUỒN GỐC
1 PB 1.1
Đất rừng Bình Châu - Phước Bửu
ở Vũng Tàu
2 PB 1.3
3 PB 1.7
4 PB 1.10

13
5 PB 2.9
6 PB 2.10
7 PB 3.1
8 PB 3.3
9 PB 3.4
10 KL 1.2
Đất canh tác ở
Vũng Tàu
11 KL 1.3
12 KL 1.4
13 KL 3.1
14 KL 4.1
15 KL 5.1
16 KL 5.2
17 KL 5.3
18 KL 6.1
19 KL 6.2
20 KL 8.2
21 HT 1.1
22 HT 1.2
23 HT 1.3
24 HT 2.1
25 HT 2.2
26 HT 2.3
27 HT 3.1
28 HT 3.2
29 HT 3.3
30 HT 4.1
31 HT 4.2
32 HT 4.3
33 HT 5.1
34 HT 5.2
35 HT 6.1
36 HT 6.3
37 HT 7.2
38 HT 7.3

14
2.2.3 Hóa chất
Các môi trường sử dụng
Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)
PDA 39 g
Nước cất 1000 ml
pH = 6,1 – 6,5
Hấp khử trùng ở 121o
C, 15 phút.
Môi trường cảm ứng enzyme protease
KH2PO4 1,5 g
K2HPO4.3H2O 1,4 g
CaCl2.2H2O 0,4 g
MgSO4.7H2O 0,41 g
NaCl 0,2 g
Agar 16 g
Casein 1%
pH = 6,1 – 6,5
C, 15 phút.
Cách pha dung dịch casein 1%: Đun sôi cách thủy 1g casein trong dung dịch
đệm sorensen đến tan hoàn toàn rồi sau đó định mức bằng sorensen cho đủ 100 ml.
Chuẩn bị dung dịch đệm casein 1%: Dung dịch Na2HPO4 1/15 M: Hoà tan
5,96 g Na2HPO4 trong nước cất thành 250 ml. Dung dịch KH2PO4 1/15 M: Hòa tan
0,9072 g KH2PO4 trong nước cất thành 100 ml. Dung dịch đệm sorensen 1/15 M:
Trộn 177 ml dung dịch Na2HPO4 1/15M và 23 ml dung dịch KH2PO4, đo và chỉnh
lại pH = 7,6.
Môi trường cảm ứng enzyme chitinase
KH2PO4 1,5 g
K2HPO4.3H2O 1,4 g
CaCl2.2H2O 0,4 g
MgSO4.7H2O 0,41 g

15
NaCl 0,2 g
NaNO3 15 g
Chitin huyền phù 1%
Agar 16 g
pH = 6,1 - 6,5
C, 15 phút.
Cách chuẩn bị chitin huyền phù 1%: 1g bột vỏ tôm được cho dần vào 20 ml
HCl đậm đặc, để ở 4o
C và khuấy đều qua đêm. Thêm vào hỗn hợp 200 ml ethanol
lạnh (-20o
C) khuấy đều thật nhanh và ủ qua đêm. Ly tâm hỗn hợp ở 5000 vòng/
phút, trong 20 phút, thu lấy kết tủa và rửa bằng nước cất cho đến khi pH trung tính.
Thêm nước cất vào tủa cho đến thể tích 100 ml (Dai và cộng sự, 2011).
Môi trường Water Agar (WA)
Agar 16 g
pH = 6,1 - 6,5
C, 15 phút.
Môi trường Water Agar (WA) mềm
Agar 14 g
pH = 6,1 - 6,5
C, 15 phút.
Các thuốc thử sử dụng
Thuốc thử Trichloroacetic acid (TCA) 10%
TCA 10 g
Thuốc thử lugol
Iod tinh thể 1 g
KI 2 g

16
Cách pha: Hòa tan KI trong cối với 5 - 10 ml nước cất. Thêm Iod tinh thể vào
và nghiền cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Cho dung dịch nghiền vào cốc đong và
thêm nước cất đến 300 ml. Bảo quản trong lọ màu và chỉ trong vòng 30 ngày trước
khi sử dụng (Nguyễn Đức Lượng, 2003).
Thuốc nhuộm
Thuốc nhuộm lactophenol cotton blue (LPCB)
Phenol tinh thể 20 g
Cotton blue (Aniline blue) 0,05 g
Glycerol 40 ml
Acid lactic 20 ml
Nước cất 20 ml
Cách pha: Hòa tan phenol tinh thể, glycerol và acid lactic với nước cất trong
cốc thủy tinh đem đun cách thủy, sau đó cho thuốc nhuộm cotton blue rồi trộn đều.
Bảo quản trong lọ thủy tinh tối màu (TCVN).
2.3 Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào protease và chitinase
của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu.
- So sánh khả năng xâm nhập con cái và khối trứng Meloidogyne spp. của các
chủng nấm P. lilacinum này.
2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp định tính hệ enzyme ngoại bào protease, chitinase của nấm
P. lilacinum
Nguyên tắc
Đối với enzyme protease: Khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung
casein 1%, nấm sẽ tiết ra enzyme protease phân giải casein thành các amino acid.
Các dạng amino acid được tạo thành sẽ không phản ứng với thuốc thử TCA 10%,
chỉ có casein mới tạo tủa trắng đục với TCA 10%.
Đối với enzyme chitinase: Khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung
chitin, nấm sẽ tiết ra enzyme chitinase phân giải chitin thành các dạng có cấu trúc

17
mạch ngắn hơn và N-acetyl- D- glucosamine. Các dạng này không cho phản ứng
màu với thuốc thử Lugol, do đó sau khi nhỏ thuốc thử Lugol, độ lớn của phần môi
trường trong suốt phản ánh khả năng sinh tổng hợp chitinase của nấm sợi. Phương
pháp này chỉ định tính enzyme, chỉ đánh giá sơ bộ khả năng tổng hợp chitinase chứ
chưa xác định chính xác hoạt độ chitinase (Lê Thị Huệ, 2010).
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 38 chủng nấm khảo sát.
Thực hiện trên đĩa Petri chứa môi trường có chứa cơ chất cảm ứng enzyme cần
khảo sát và lặp lại 3 lần cho mỗi chủng nấm ứng với mỗi mốc thời gian khảo sát
(24, 48, 72 giờ).
Thực hiện
Cấy nấm từ ống giống vào môi trường thạch PDA trong đĩa Petri bằng phương
pháp cấy điểm rồi đem ủ trong 7 ngày. Sau đó, cấy chuyển nấm từ môi trường PDA
qua môi trường thạch WA trong đĩa Petri đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 ngày để sợi
nấm phát triển. Tiếp theo, đổ môi trường đã hấp khử trùng có chứa cơ chất cảm ứng
phù hợp với enzyme cần khảo sát vào đĩa Petri (9 ml môi trường / đĩa) và để nguội.
Sử dụng dụng cụ khoan thạch 5 mm để đục các tản thạch có chứa tơ nấm trên môi
trường WA, rồi dùng dao cấy chuyển các tản thạch này vào môi trường có chứa cơ
chất cảm ứng bằng phương pháp cấy úp ngược đĩa thạch để tránh hiện tượng phát tán
bào tử ra xung quanh môi trường. Đem ủ ở nhiệt độ phòng, rồi nhỏ thuốc thử phù hợp
với từng loại enzyme cần khảo sát (TCA 10% đối với enzyme protease và lugol đối
với enzyme chitinase) sau 24, 48, 72 giờ để xác định vòng phân giải cơ chất.
Chỉ tiêu theo dõi
Đo đường kính khuẩn lạc (d, mm) và đường kính vòng phân giải cơ chất (D,
mm) sau các khoảng thời gian 24, 48, 72 giờ sau khi cấy.
Xác định khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng nấm dựa vào hiệu D -
d (mm).

18
Đối với enzyme protease:
D - d ≥ 9: mạnh
7≤ D - d < 9: khá
5 ≤ D - d < 7: trung bình
D - d < 5: yếu
Đối với enzyme chitinase:
D - d ≥ 5: mạnh
4 ≤ D - d < 5: khá
3 ≤ D - d < 4: trung bình
D - d < 3: yếu
2.3.2 Phương pháp khảo sát khả năng xâm nhập trứng và con cái tuyến trùng
Meloidogyne spp. của nấm P. lilacinum
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với nghiệm thức là số chủng
nấm P. lilacinum có khả năng tiết enzyme ngoại bào mạnh ở hai vùng và được lặp
lại 3 lần cho mỗi nghiệm thức. Mỗi lần lặp lại tiến hành trên 3 - 4 con cái hay khối
trứng đặt trong đĩa Petri chứa môi trường WA mềm.
Thực hiện
Theo phương pháp cải tiến của Stirling và West (1991), thu nhận trứng và con
cái từ các nốt sần của rễ tiêu. Rửa qua trứng và con cái vài lần bằng nước cất đã
được hấp khử trùng để loại bỏ chất bẩn, rồi đặt chúng lên khăn giấy vô trùng. Sử
dụng dụng cụ khoan lỗ thạch đục các tản thạch có chứa sinh khối nấm đã được nuôi
cấy sau 7 ngày trên môi trường PDA sao cho các tản nấm được đục nằm trên cùng
một vòng tròn để nấm trên các miếng thạch được tương đồng với nhau. Rồi, dùng
dao cấy chuyển các tản nấm lên môi trường WA mềm chứa trong đĩa Petri đã chuẩn
bị trước đó. Đồng thời, đặt các khối trứng hoặc con cái xung quanh tản nấm này.
Đem để ở nhiệt độ phòng và tiến hành quan sát để kiểm tra khả năng ký sinh
(Stirling và cộng sự, 1991).

19
Chỉ tiêu theo dõi
Tính số con cái hay khối trứng bị nấm ký sinh sau mỗi 24 giờ. Thí nghiệm này
sẽ kết thúc khi có một chủng nấm ký sinh hoàn toàn số con cái hay khối trứng trong
một thí nghiệm. Dùng thuốc nhuộm LPCB để quan sát sự xâm nhập của sợi nấm
vào trứng và con cái.
Xác định khả năng ký sinh tuyến trùng của các chủng nấm theo công thức: Tỷ
lệ con cái hay khối trứng được ký sinh trên tổng số con cái hay khối trứng có trong
một đĩa. Theo đó,
Tỷ lệ ký sinh trên 75%: ký sinh mạnh
Tỷ lệ ký sinh từ 50 - 75%: ký sinh khá
Tỷ lệ ký sinh từ 25 - 50%: ký sinh trung bình
Tỷ lệ ký sinh nhỏ hơn 25%: ký sinh yếu
2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu
Tính hiệu D-d và tỷ lệ ký sinh tuyến trùng bằng chương trình Excel 2007. Sau
đó xử lý số liệu bằng phần mềm xử lý thống kê SAS 9.0. Phân loại số liệu theo
LSD0,05.

20
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào của các chủng nấm P. lilacinum
3.1.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào protease
Để đánh giá sơ bộ khả năng tiết enzyme protease của các chủng nấm được
phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu, ta sử dụng phương pháp 2.3.1. Kết
quả thu được thể hiện ở bảng 3.1 và bảng 3.2
Bảng 3.1 Vòng phân giải casein của các chủng nấm phân lập được từ đất rừng ở
Vũng Tàu ở các khoảng thời gian khác nhau
Chủng
Vòng phân giải casein theo thời gian (D-d (mm))
24h 48h 72h
TB
(chủng)
PB 1.1 6,203i-l
9,347abc
7,070f-j
7,540C
PB 1.3 8,770a-e
8,130c-g
8,443b-f
8,448AB
PB 1.7 6,820g-k
6,243h-k
5,800j-m
6,288D
PB 1.10 8,790a-e
8,847a-d
6,143j-l
7,927BC
PB 2.9 4,720lmn
4,957l-n
7,013f-j
5,564D
PB 2.10 7,125f-j
9,907ab
10,003a
9,012A
PB 3.1 7,247e-j
8,28c-g
7,787d-h
7,771BC
PB 3.3 4,130n
5,393k-n
7,753d-i
5,759D
PB 3.4 4,517mn
5,980j-m
7,790d-h
6,096D
TB (thời gian) 6,481B
7,454A
7,534A
CV(%)=13,261 F*A = 15,73 F*B = 10,31 F**AB = 5,37
Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi
kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α
= 0,05); ** khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01).

21
Dựa vào bảng kết quả 3.1, có thể thấy các chủng nấm phân lập ở đất rừng
Vũng Tàu đều có khả năng tiết enzyme protease. Xét theo thời gian, thấy không có
sự khác biệt về khả năng tiết enzyme ngoại bào ở 48 giờ và 72 giờ. Ở thời gian đầu
nuôi cấy, các chủng nấm này phân hủy cơ chất yếu nên vòng phân giải chỉ đạt 6,481
mm do đây là giai đoạn thích nghi khi nấm mới vừa được cấy vào môi trường có
chứa cơ chất cảm ứng nên lượng enzyme được tiết ra để phân giải casein còn ít. Xét
riêng theo từng chủng, có thể thấy PB 2.10 có khả năng tiết enzyme protease mạnh
nhất, tiếp theo là chủng PB 1.3 và yếu nhất là chủng PB 2.9. Và chủng PB 2.10
cũng là chủng có khả năng phân giải cao nhất sau 48 và 72 giờ. Ngoài ra ở 48 giờ
chủng PB 1.1 và PB 1.10 cũng tiết enzyme mạnh. Nhìn chung, chủng PB 3.3 phân
hủy cơ chất yếu nhất ở 24 giờ.
Hình 3.1 Vòng phân giải casein của chủng PB 2.10 trong các khoảng thời gian 24 giờ
(A); 48 giờ (B) và 72 giờ (C).
Hình 3.2 Vòng phân giải casein của chủng PB 1.1 (A), PB 1.10 (B), PB 3.1 (C) ở 48 giờ
A B C
A B C

22
Bảng 3.2 Vòng phân giải casein của các chủng nấm phân lập được từ đất canh tác ở
Vũng Tàu ở các khoảng thời gian khác nhau
Chủng
Vòng phân giải casein theo thời gian (D-d (mm))
24h 48h 72h TB (chủng)
KL 1.2 6,940q-e
7,917i-w
8,173h-t
7,697D-H
KL 1.3 5,017g-k
5,397d-k
6,680t-f
5,698LM
KL 1.4 6,910r-e
6,637t-f
9,410b-j
7,652E-H
KL 3.1 6,643t-f
6,753t-e
8,930c-m
7,442F-I
KL 4.1 6,883r-e
5,8933a-j
8,213g-t
6,997H-K
KL 5.1 8,000h-v
7,247n-b
8,770d-n
8,006C-G
KL 5.2 7,413m-b
8,167h-t
3,780k
6,453JKL
KL 5.3 7,480m-a
9,523b-i
11,233a
9,412A
KL 6.1 6,953q-e
9,343b-k
6,227x-h
7,508E-H
KL 6.2 9,950a-f
8,093h-u
10,150a-e
9,398A
KL 8.2 6,730t-f
5,130f-k
7,830j-x
6,563I-L
HT 1.1 7,993h-v
9,347b-k
7,350m-b
8,230B-F
HT 1.2 8,030h-v
8,777d-m
4,760h-k
7,189G-J
HT 1.3 7,687l-y
10,290a-d
7,333m-b
8,437B-E
HT 2.1 5,370e-k
6,066z-i
6,790s-e
6,076KLM
HT 2.2 6,197y-h
7,013p-d
7,530l-z
6,913H-K
HT 2.3 8,373f-s
7,223n-b
10,363a-d
8,653ABC
HT 3.1 7,507a-z
9,600b-h
6,967q-e
8,024C-G
HT 3.2 6,943q-e
4,370jk
4,500ijk
5,271M

23
HT 3.3 8,553e-q
10,370a-d
6,950q-e
8,624A-D
HT 4.1 6,680t-f
7,413m-b
10,467abc
8,187C-F
HT 4.2 6,443v-g
7,807j-y
8,633e-o
7,628E-H
HT 4.3 7,077o-c
6,990p-d
6,520u-g
6,862H-K
HT 5.1 6,713t-f
4,547ijk
5,860b-j
5,707LM
HT 5.2 7,767k-y
9,147b-l
10,557ab
9,157AB
HT 6.1 5,553c-j
7,163n-c
9,533b-i
7,417F-I
HT 6.3 6,927r-e
8,593e-p
7,570l-z
7,697D-H
HT 7.2 6,447v-g
6,470v-g
8,480f-r
7,132G-J
HT 7.3 6,343w-h
7,180n-b
9,820a-g
7,781C-H
TB (thời gian) 7,087C
7,533B
7,910A
CV(%)= 13,372 F*A=10,16 F*B=14,63 F**AB=5,69
Theo bảng kết quả 3.2, có thể thấy các chủng nấm phân lập được từ đất canh
tác cũng đều có khả năng tiết enzyme protease. Xét theo thời gian, thấy các chủng
tiết enzyme tốt nhất ở 72 giờ do giai đoạn từ 24 và 48 giờ nấm cần thích nghi với
môi trường. Xét riêng theo từng chủng thì KL 5.3 và KL 6.2 có khả năng tiết
enzyme mạnh nhất và yếu nhất là chủng HT 3.2. Chủng KL 5.3 và KL 6.2 cũng
phân giải casein mạnh ở thời gian 72 giờ, bên cạnh đó còn có thêm các chủng HT
2.3, HT 4.1 và HT 5.2. Ở 24 giờ, chủng KL 6.2 có khả năng phân giải cơ chất
mạnh. Còn chủng HT 1.3 và HT 3.3 có vòng phân giải lớn nhất ở 48 giờ. Nhìn
chung, thì chủng KL 5.2 phân hủy cơ chất yếu nhất ở 72 giờ.

24
Hình 3.3 Vòng phân giải casein của chủng KL 5.3 (A) và KL 6.2 (B) và KL 5.2 (C) ở 72
giờ.
Biểu đồ 3.1 Vòng phân giải casein trung bình của các chủng nấm
P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu theo thời gian.
Theo biểu đồ 3.1, nhìn chung, có thể thấy ở các mốc thời gian khảo sát, vòng
phân giải casein trung bình của các chủng phân lập từ đất canh tác lớn hơn so với
đất rừng nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê. Nguyên nhân là
do khả năng tiết enzyme ngoại bào protease giữa các chủng trong cùng một vùng
không đồng đều. Cụ thể, ở thời gian 24 giờ có 3,45% các chủng phân lập từ đất
canh tác có khả năng tiết enzyme mạnh, 37,93% có khả năng tiết enzyme khá và
không có chủng nào tiết enzyme yếu. Trong khi đó, hầu hết các chủng phân lập từ
đất rừng có khả năng phân hủy cơ chất ở mức độ khá (bảng 3.3). Sự khác biệt này
có thể là do các chủng nấm phân lập từ đất canh tác đã quen với môi trường có chứa
các hợp chất có bản chất protein. Ở mốc thời gian 48 giờ, số chủng nấm phân hủy
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
24h 48h 72h
Đất rừng
Đất canh tác
A B C

25
cơ chất ở mức độ mạnh, khá, trung bình tương đương nhau ở cả hai vùng. Tuy
nhiên, tỷ lệ phần trăm số chủng tiết enzyme ở mức độ yếu ở đất canh tác ít hơn so
với đất rừng. Ở 72 giờ, hầu hết các chủng phân lập ở đất rừng có khả năng tiết
enzyme khá và không có chủng nào tiết enzyme yếu. Trong khi đó, khả năng tiết
enzyme ngoại bào của các chủng ở đất canh tác yếu hơn so với thời gian 48 giờ. Sự
khác biệt này có thể là do các chủng nấm phân lập từ đất canh tác đã quen với môi
trường có chứa cơ chất bản chất là protein nên khi phát triển qua một thời gian nấm
đã điều tiết lượng enzyme vừa đủ để phân giải cơ chất, còn các chủng phân lập từ
đất rừng đã qua giai đoạn thích nghi nên phân hủy cơ chất mạnh hơn.
Bảng 3.3 Mức độ tiết enzyme protease của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất
rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau
Thời gian Vùng lấy mẫu Số chủng
Tỷ lệ (%) chủng nấm tiết enzyme
Yếu Trung bình Khá Mạnh
24 giờ
Đất rừng 9 33,33 22,22 44,45 0
Đất canh tác 29 0 58,62 37,93 3,45
48 giờ
Đất rừng 9 11,11 33,33 33.33 22,23
Đất canh tác 29 3,45 27,59 41,38 27,58
72 giờ
Đất rừng 9 0 22,22 66,67 11,11
Đất canh tác 29 10,34 24,14 37,93 27,59
Hình 3.4 Vòng phân giải casein của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất
canh tác sau 24 giờ (A), 48 giờ (B), 72 giờ (C).
A A
PB 3.1 KL 1.2 B KL 5.1
B PB 1.7 C PB 3.4 C KL 5.2

26
3.1.2 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào chitinase của các chủng nấm P.
lilacinum
Để đánh giá sơ bộ khả năng tiết enzyme ngoại bào chitinase của các chủng
nấm được phân lập từ đất rừng và đất canh tác ta sử dụng phương pháp 2.3.1. Kết
quả thu được tương ứng với bảng 3.3 và 3.4
Bảng 3.4 Vòng phân giải chitin của các chủng nấm phân lập từ đất rừng ở Vũng
Tàu theo các khoảng thời gian khác nhau
Chủng
Vòng phân giải chitin theo thời gian (D-d (mm))
PB 1.1 2,470def
4,620c
2,700de
3,263C
PB 1.3 1,953fgh
4,617c
1,193ij
2,588D
PB 1.7 1,560ghi
3,060d
1,260hij
1,960F
PB 1.10 2,170efg
4,263c
0,943ijk
2,460DE
PB 2.9 2,683def
5,680b
3,110d
3,824B
PB 2.10 2,037efg
4,503c
0,750jk
2,430DE
PB 3.1 2,023efg
4,057c
0,273k
2,118DE
PB 3.3 2,530def
6,550a
4,473c
4,518A
PB 3.4 2,490def
4,320c
0,983ijk
2,598D
4,630A
1,743C
CV(%)= 15,848 F*A=31,12 F*B=314,94 F**AB= 6,31
Dựa vào bảng kết quả 3.4, có thể nhận thấy rõ ràng các chủng nấm thu được từ
đất rừng ở Vũng Tàu có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase, và phân giải
chitin mạnh ở thời gian 48 giờ và giảm dần khi thời gian nuôi cấy tăng lên. Nhìn

27
chung, chủng PB 3.3 có khả năng tiết enzyme mạnh nhất và thấp nhất là chủng PB
1.7. Và chủng PB 3.3 cũng phân giải cơ chất mạnh nhất ở 48 giờ, tiếp theo là chủng
PB 2.9 và thấp nhất là chủng PB 3.1 ở 72 giờ.
Hình 3.5 Vòng phân giải chitin của chủng PB 3.3 sau 24 giờ (A), 48 giờ (B), 72 giờ (C).
Bảng 3.5 Vòng phân giải chitin của các chủng nấm phân lập từ đất canh tác ở Vũng
Tàu theo các khoảng thời gian khác nhau
Chủng
Vòng phân giải chitin theo thời gian (D-d (mm))
KL 1.2 5,537y-h
5,293i-n
1,770g-l
3,200J-N
KL 1.3 2,447y-h
5,360h-n
0,883lmn
2,897K-O
KL 1.4 1,680h-l
3,813p-u
1,037k-n
2,177P
KL 3.1 3,593q-v
6,097e-k
1,307j-m
3,666G-J
KL 4.1 2,557x-h
4,597m-q
3,230s-a
3,461H-K
KL 5.1 2,327z-y
3,457s-y
2,137c-j
2,64NOP
KL 5.2 2,527y-h
4,817l-p
0,270n
2,538OP
KL 5.3 3,877p-t
6,907cde
4,153o-s
4,979BC
KL 6.1 1,953e-k
5,443g-n
0,640mn
2,679M-P
KL 6.2 2,60w-h
6,357d-h
1,363i-m
3,440H-L
KL 8.2 2,677v-h
5,017l-o
1,977e-k
3,223J-M
HT 1.1 3,333s-z
8,213ab
2,253a-j
4,600BCD
HT 1.2 2,950t-e
6,883cde
2,683v-h
4,172D-G
HT 1.3 3,003t-d
4,710l-p
1,800f-l
3,171J-N
HT 2.1 3,627q-v
6,170e-j
2,753v-g
4,183D-G
A B C

28
HT 2.2 2,843u-e
6,977cde
5,710f-l
5,177B
HT 2.3 3,890p-t
5,330i-n
3,557r-x
4,259DEF
HT 3.1 3,370s-y
7,183cd
1,783f-l
4,112D-G
HT 3.2 3,237s-a
5,023l-o
1,087k-n
3,116J-O
HT 3.3 2,693v-g
5,577f-m
1,070k-n
3,113J-O
HT 4.1 3,113t-b
6,577c-f
1,750g-l
3,813F-I
HT 4.2 3,173s-b
6,413c-g
2,693v-g
4,093D-G
HT 4.3 3,263s-a
6,303d-i
2,180b-j
3,916E-H
HT 5.1 6,300d-i
6,937cde
9,150a
7,462A
HT 5.2 2,107c-j
5,480g-n
1,027k-n
2,871L-O
HT 6.1 3,927p-t
5,110k-o
2,037d-k
3,691F-J
HT 6.3 3,027t-d
7,377bc
2,787v-f
4,397CDE
HT 7.2 2,323z-i
4,520n-r
5,207j-n
4,017E-H
HT 7.3 2,263a-j
5,040l-o
2,447y-h
3,250I-M
5,758A
2,439C
CV(%)= 16,784 F*A=24,07 F*B=697,4 F**AB=8,03
Tương tự các chủng phân lập từ đất rừng, các chủng nấm từ đất canh tác ở
Vũng Tàu đều có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase. Ban đầu, các chủng
nấm này tiết enzyme trung bình 3,007, mạnh nhất ở thời gian 48 giờ và yếu dần khi
thời gian nuôi cấy tăng dần (bảng 3.5).
Ở bảng 3.5, khi xét theo trung bình, chủng HT 5.1 tiết enzyme chitinase mạnh
nhất (7,462 mm), tiếp theo là HT 2.2 (5,177 mm) và thấp nhất là chủng KL 1.4
(2,177 mm). Xét theo thời gian khảo sát, chủng có đường kính vòng phân giải cơ
chất lớn nhất là HT 5.1 ở thời gian 72 giờ, tiếp theo là HT 1.1 ở 48 giờ và thấp nhất
là KL 5.2 ở 72 giờ.

29
Hình 3.6 Vòng phân giải chitin của chủng HT 5.1 sau 24 giờ (A), 48 giờ (B), 72 giờ (C).
Biểu đồ 3.2 Vòng phân giải chitin trung bình của các chủng nấm
P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu theo thời gian.
Dựa theo biểu đồ 3.2, nhìn chung, vòng phân giải chitin trung bình của các
chủng nấm phân lập ở đất canh tác lớn hơn so với các chủng ở đất rừng. Tuy nhiên,
sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê là do khả năng tiết enzyme của
các chủng trong từng vùng không đồng đều.
Sau 24 giờ nuôi cấy, tất cả các chủng phân lập ở đất rừng chỉ tiết enzyme ở
mức độ yếu (bảng 3.6). Còn các chủng ở đất canh tác tiết enzyme mạnh đạt 6,89%,
trung bình là 44,83% còn lại là ở mức độ yếu. Ở 48 giờ, không có chủng nấm nào
tiết enzyme yếu. Hầu hết các chủng phân lập từ đất canh tác tiết enzyme mạnh,
trong khi các chủng ở đất rừng có mức độ tiết enzyme khá. Sau 72 giờ, hầu hết các
0
1
2
3
4
5
6
7
8
24h 48h 72h
Đất rừng
Đất canh tác
A B C

30
chủng điều phân giải cơ chất ở mức độ yếu. Trong đó, không có chủng nào ở đất
rừng tiết enzyme mạnh, còn tỷ lệ các chủng mạnh ở đất canh tác chiếm 10,34%.
Bảng 3.6 Mức độ tiết enzyme chitinase của các chủng P. lilacinum phân lập từ đất
rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu ở các mốc thời gian khác nhau
Thời gian Vùng lấy mẫu Số chủng
Tỷ lệ (%) chủng nấm tiết enzyme
24 giờ
Đất rừng 9 100 0 0 0
Đất canh tác 29 48,28 44,83 0 6,89
48 giờ
Đất rừng 9 0 11,11 66,67 22,22
Đất canh tác 29 0 6,9 13.79 79,31
72 giờ
Đất rừng 9 77,78 11,11 11,11 0
Đất canh tác 29 79,31 6,9 3,45 10,34
Tuyển chọn các chủng P. lilacinum có khả năng tiết enzyme ngoại bào mạnh
Qua kết quả thu được từ các bảng trên, có thể thấy được các chủng nấm phân
lập từ đất rừng hay đất canh tác đều có khả năng tiết enzyme protease và chitinase.
Tuy nhiên khả năng tiết enzyme protease mạnh hơn so với chitinase.
Tiêu chí chọn chủng là phải có khả năng tiết enzyme protease hoặc chitinase
mạnh nhất hay tiết hai loại enzyme này đều mạnh. Theo đó, các chủng nấm phân
lập từ đất rừng được tuyển chọn: PB 1.1, PB 1.3, PB 1.10, PB 2.10 và PB 3.3.
Trong đó, chủng tiết enzyme chitinase mạnh nhất là PB 3.3 và chủng tiết enzyme
protease mạnh nhất là PB 2.10. Các chủng nấm được phân lập từ đất canh tác được
tuyển chọn: KL 5.3, KL 6.2, HT 3.3 và HT 5.1. Trong đó, chủng HT 5.1 có khả
năng tiết enzyme chitinase mạnh nhất, chủng KL 5.3 và KL 6.2 tiết enzyme
protease mạnh nhất.
3.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh khối trứng và con cái tuyến trùng
Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum
Chúng tôi chọn các chủng nấm PB 1.1, PB 1.3, PB 1.10, PB 2.10, PB 3.3, KL
5.3, KL 6.2, HT 3.3 và HT 5.1 có khả năng tiết enzyme ngoại bào protease và

31
chitinase mạnh để khảo sát khả năng ký sinh con cái và khối trứng tuyến trùng
Meloidogyne spp.
3.2.1 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh trên trứng tuyến trùng Meloidogyne
spp. của các chủng nấm P. lilacinum

32
Bảng 3.7 Tỷ lệ ký sinh trên khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng và
đất canh tác ở Vũng Tàu
Chủng
Tỷ lệ ký sinh (%) trên trứng
Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 Ngày 8 Ngày 9 Ngày 10 Ngày 11 Ngày 12 Ngày 13 Ngày 14
PB 1.1 2,67c
3,67c
6c
7,67b
9,33c
11bc
12,67d
16d
23,67d
32b
39c
44,33ab
48,67ab
50,33ab
PB 1.3 17,67ab
27,67ab
33,33ab
39,67a
45,33ab
51a
56ab
61ab
66,67ab
74a
78,33a
80,33a
82a
82,33a
PB 1.10 9bc
13,33abc
17abc
20ab
23,33abc
27abc
30,67a-d
34,33a-d
40,67a-d
49ab
52,67abc
54ab
55ab
56,67ab
PB 2.10 11,67abc
15,33abc
20abc
24ab
29abc
34ab
38,67abc
44,67abc
58,33abc
73,67a
76,67a
78,33a
79,33a
80,33a
PB 3.3 4,67bc
7bc
9,33bc
12,33b
16,33bc
19bc
22,67bcd
26,67bcd
33bcd
36,67ab
39,33bc
42ab
44,33ab
46ab
KL 5.3 3,33c
4,33c
6c
7,67b
10c
12,33c
13,33d
14,67d
17,33d
19,67b
23c
24,67b
25,67b
27b
KL 6.2 2c
4c
5,33c
7,33b
8,67c
10c
12,67d
15d
23,67d
28b
32,33c
34,33b
36b
37,67b
HT 3.3 2,67c
4c
7c
9,33b
11,33c
13,33bc
17cd
19cd
27cd
33b
35c
37,33b
39b
41b
HT 5.1 23,33a
29a
33,33a
38,33a
44a
50a
54a
60a
67,67a
72a
76ab
79,33a
82a
83,67a
F 3,38* 3,08* 2,75* 2,9* 2,95* 3,26* 3,2* 3,44* 3,33* 3,39* 3,36* 3,24* 3,09* 3,06*
CV(%) 42,97 43,09 40,48 36,3 34,15 31,77 30,11 27,89 24,3 22,94 21,12 20,43 20,28 19,57
Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt
thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α = 0,05); ** khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01).

33
Theo số liệu của bảng 3.7, có thể thấy nấm ký sinh trên trứng diễn ra trong
vòng 14 ngày. Và nấm xâm nhiễm trên 50% các khối trứng trong 1 đĩa sau ngày thứ
5, điều này phù hợp với nghiên cứu của Jatala và cộng sự (1979). Trong 5 ngày đầu
tiên, hầu hết các chủng nấm phân lập được đều có khả năng ký sinh yếu, do ở giai
đoạn này sợi nấm chỉ mới bắt đầu tiếp xúc với bề mặt khối trứng chứ chưa đâm
xuyên vào chúng. Ngày thứ 6, hầu hết các chủng nấm đều ký sinh khối trứng tuyến
trùng ở mức dưới trung bình, chỉ có chủng PB 1.3 và HT 5.1 đạt mức trung bình. Ở
ngày thứ 7 và thứ 8 kết quả cũng tương tự như vậy. Vào ngày thứ 9, ngoài hai
chủng PB 1.3 và HT 5.1 còn có thêm chủng PB 2.10 có mức độ xâm nhiễm tuyến
trùng trong khoảng 50 - 75%. Kết quả tương tự cho đến ngày thứ 11, nhưng có thêm
chủng PB 1.10 ký sinh ở mức khá. Ở ba ngày cuối, các chủng PB 1.3, PB 2.10, HT
5.1 có khả năng ký sinh mạnh, còn chủng PB 3.3, KL 5.3, KL 6.2 và HT 3.3 ở mức
trung bình và ở mức độ khá là chủng PB 1.10. Có thể thấy rằng, việc ký sinh lên
khối trứng của các chủng phụ thuộc vào khả năng tiết enzyme ngoại bào protease
hoặc chitinase mạnh, trong đó chủng PB 2.10 có khả năng tiết protease mạnh và tỷ
lệ ký sinh đạt 80,33% ở ngày thứ 14. Còn tỷ lệ ký sinh khối trứng tuyến trùng của
chủng HT 5.1 đạt 83,67% (ở ngày 14) tiết enzyme chitinase mạnh nhất.
Hình 3.7 Quá trình khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. bị nấm P. lilacinum ký
sinh. (A) hình dạng khối trứng ban đầu, (B) nấm tiếp xúc khối trứng, (C) khối trứng bị kí
sinh.
A
A
A
C
B

34
Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ ký sinh khối trứng trung bình của các chủng nấm P. lilacinum
phân lập ở đất rừng và đất canh tác ở các khoảng thời gian khác nhau.
Nhìn chung các chủng nấm phân lập từ đất rừng có khả năng ký sinh khối
trứng cao hơn so với đất canh tác ở tất cả các khoảng thời gian khảo sát, nhưng sự
khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê do khả năng ký sinh khối trứng của
các chủng không đồng đều trong cùng một vùng.
Tỷ lệ ký sinh khối trứng tuyến trùng của các chủng nấm ở ngày đầu hầu hết
dưới 25% (bảng 3.8). Ngày thứ 2, 3, 4, 5, dưới 40% chủng có khả năng ký sinh khối
trứng ở mức độ trung bình, còn lại là yếu. Từ ngày 6 đến ngày 10, khả năng ký sinh
khối trứng của các chủng phân lập từ hai vùng tương đương nhau ở mức độ khá,
khả năng ký sinh ở mức độ yếu và trung bình của các chủng từ đất rừng là tương
đương nhau. Khả năng ký sinh khối trứng của các chủng nấm ở ngày thứ
11,12,13,14 có sự khác biệt nhau rõ rệt. Cụ thể, có 40% các chủng nấm ở đất rừng
có mức độ ký sinh mạnh (trong khi, chỉ 25 % chủng từ đất canh tác).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
N
g
à
y
1
N
g
à
y
2
N
g
à
y
3
N
g
à
y
4
N
g
à
y
5
N
g
à
y
6
N
g
à
y
7
N
g
à
y
8
N
g
à
y
9
N
g
à
y
1
0
N
g
à
y
1
1
N
g
à
y
1
2
N
g
à
y
1
3
N
g
à
y
1
4
Đất rừng
đất canh tác

35
Bảng 3.8 Mức độ ký sinh khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng
P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu ở các mốc thời gian
khác nhau
Thời gian Vùng lấy mẫu
Số
chủng
Tỷ lệ (%) chủng nấm ký sinh
Ngày 1
Đất rừng 5 100 0 0 0
đất canh tác 4 100 0 0 0
Ngày 2
Đất rừng 5 80 20 0 0
Ngày 3
Đất rừng 5 80 20 0 0
Ngày 4
Đất rừng 5 80 20 0 0
Ngày 5
Đất rừng 5 60 40 0 0
Ngày 6
Đất rừng 5 40 40 20 0
Ngày 7
Đất rừng 5 40 40 20 0
Ngày 8
Đất rừng 5 20 60 20 0
Ngày 9
Đất rừng 5 20 40 40 0
Ngày 10
Đất rừng 5 0 60 40 0
Ngày 11
Đất rừng 5 0 40 20 40
Ngày 12
Đất rừng 5 0 40 20 40
Ngày 13
Đất rừng 5 0 40 20 40
Ngày 14
Đất rừng 5 0 20 40 40

36
3.2.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh trên tuyến trùng cái Meloidogyne spp.
Bảng 3.9 Tỷ lệ ký sinh trên con cái Meloidogyne spp. của các chủng nấm
P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu
Chủng
Tỷ lệ ký sinh (%) trên con cái
Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4
PB 1.1 49,33ab
72,67d
84,67abc
87,67ab
PB 1.3 51,33ab
76,67a-d
88abc
91,33ab
PB 1.10 50,67ab
81,33abc
88,33abc
91ab
PB 2.10 54,33a
83a
90,67a
93,33a
PB 3.3 37,67c
74,33cd
81,33c
85,33b
KL 5.3 43,33bc
75,67bcd
82bc
86,33ab
KL 6.2 53a
82,33ab
87,67abc
92ab
HT 3.3 46abc
82ab
89,67ab
92,67ab
HT 5.1 52,33ab
82ab
88,33abc
91ab
F 2,99* 2,77* 1,57* 1,31*
CV(%) 11,09 5,29 5,27 4,85
Dựa vào bảng 3.9, có thể thấy các chủng nấm phân lập từ đất rừng và đất canh
tác đều có khả năng ký sinh mạnh trên con cái. Sau 1 ngày, các chủng PB 1.3, PB
1.10, PB 2.10, KL 6.2, HT 5.1 đều có khả năng tiếp xúc và kí sinh trên 50% số con
cái thử nghiệm. Từ ngày thứ 2 trở đi, tất cả các chủng nấm thử nghiệm đều có khả
năng xâm nhiễm ở mức độ mạnh tuyến trùng cái, ngoại trừ chủng PB 1.1 và
PB 3.3 ở ngày thứ 2.

37
Hình 3.8 Quá trình tuyến trùng cái Meloidogyne spp. bị nấm P. lilacinum ký sinh. (A)
hình dạng con cái ban đầu, (B) nấm bắt đầu ký sinh, (C) con cái bị kí sinh.
Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ ký sinh con cái Meloidogyne spp. trung bình của các chủng nấm
P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở các khoảng thời gian khác nhau.
Nhìn chung, tỷ lệ ký sinh tuyến trùng của các chủng nấm phân lập từ đất canh
tác và đất rừng ở các mốc thời gian khác nhau không khác biệt về mặt thống kê
(biểu đồ 3.4) do khả năng ký sinh không đồng đều giữa các chủng ở các vùng. Từ
đó có thể thấy việc ký sinh tuyến trùng của các chủng nấm không phụ thuộc vào
nguồn gốc phân lập. Điều này cũng được chứng minh ở bảng 3.10. Mức độ ký sinh
con cái tuyến trùng của các chủng nấm từ đất rừng và đất canh tác đạt khá, trung
bình và tương đương nhau ở ngày thứ 1. Ở ngày thử nghiệm thứ 2, 100% các chủng
từ đất canh tác ký sinh mạnh tuyến trùng cái, còn đối với các chủng từ đất rừng thì
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4
Đất rừng
đất canh tác
A B C

38
chỉ có 60% trên tổng số ký sinh đạt mức độ mạnh. Tuy nhiên, sau đó, tất cả các
chủng nấm khảo sát đều có khả năng xâm nhiễm mạnh tuyến trùng cái. Như vậy, có
thể thấy rằng khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. cái mạnh hay yếu
không phụ thuộc vào nguồn gốc của chủng phân lập mà phụ thuộc vào hệ enzyme
ngoại bào được tiết ra bởi chúng. Các chủng có khả năng tiết enzyme ngoại bào
(protease hay chitinase) mạnh thì ký sinh tuyến trùng mạnh.
Bảng 3.10 Mức độ ký sinh con cái tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng
P. lilacinum phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở Vũng Tàu ở các mốc thời gian
khác nhau
Thời
gian
Vùng lấy
mẫu
Số
chủng
Tỷ lệ (%) chủng nấm ký sinh
Ngày 1
Đất rừng 5 0 40 60 0
Đất canh tác 4 0 50 50 0
Ngày 2
Đất rừng 5 0 0 40 60
Ngày 3
Đất rừng 5 0 0 0 100
Ngày 4
Đất rừng 5 0 0 0 100

39
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1 Kết luận
Tất cả các chủng nấm P. lilacinum khảo sát đều có khả năng tiết enzyme ngoại
bào protease và chitinase. Trong đó, khả năng tiết enzyme protease của các chủng
nấm mạnh hơn so với tiết enzyme chitinase. Và đường kính vòng phân giải casein
lớn nhất sau 72 giờ, trong khi đường kính vòng phân giải chitin đạt cực đại sau 48
giờ. Không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê về khả năng tiết enzyme
ngoại bào của các chủng nấm phân lập từ đất rừng và đất canh tác. Xét riêng theo
vùng đất rừng, chủng PB 2.10 và PB 3.3 tiết enzyme protease và chitinase mạnh
nhất; còn đối với đất canh tác thì các chủng KL 5.3, KL 6.2 và HT 5.1 tối ưu nhất.
Khả năng ký sinh con cái Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum
nhanh và mạnh hơn so với ký sinh khối trứng. Và việc ký sinh tuyến trùng mạnh
hay yếu cũng không phụ thuộc vào nguồn gốc mẫu phân lập mà phụ thuộc vào khả
năng tiết enzyme ngoại bào, chủng có khả năng tiết enzyme ngoại bào phân hủy cơ
chất mạnh là chủng có thể ký sinh tuyến trùng mạnh.
4.2 Đề nghị
Việc đánh giá các chủng nấm P. lilacinum dựa vào định tính hệ enzyme ngoại
bào thường ít chính xác nên tiến hành định lượng enzyme ngoại bào protease và
chitinase để việc chọn chủng được đầy đủ và chính xác hơn.
Cần tiến hành thử nghiệm ký sinh tuyến trùng cái và trứng trên sần rễ để có
thể đánh giá chính xác hơn bởi vì thực tế tuyến trùng sống và ký sinh bên trong rễ
cây.

40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
Lê Thị Huệ (2010). Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của
một số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus. Trichoderma và ứng dụng. Luận
văn thạc sĩ. Chuyên ngành vi sinh vật. Trường đại học sư phạm thành phố Hồ Chí
Minh.
Nguyễn Đức Lượng, 2003. Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2. Nxb ĐHQG
Tp.Hồ Chí Minh.
Trần Thị Nhã Uyên (2010). Nghiên cứu và thu nhận enzyme protease từ các
chủng nấm sợi ở rừng ngập mặn Cần Giờ. Luận văn thạc sĩ. Chuyên ngành vi sinh
vật. Trường đại học sư phạm thành phố Hồ Chí Minh.
Tài liệu tiếng Anh
Agrios, G. (2005). Plant Pathology. 5th
ed., Academic Press, America.
Anderson, T.H., Domsch, K.H. and Gams, W. (1995). Compendium of Soil
Fungi. Lubrecht & Cramer Ltd, New York.
Baldwin, J.G. and Hedwig, H. (1975). “Body Wall Fine Structure of the
Anterior Region of Meloidogyne incognita and Heterodera glycines Males”. Journal
of Nematology, 7 (2), 175 – 193.
Bird, A. F. (1958). “The adult female cuticle and egg sac of the genus
Meloidogyne Goeldi, 1887”. Nematologica, 3 (3), 205 - 212.
Bird, A.F. and McClure, M.A. (1976). “The tylenchid (Nematoda) egg shell:
structure, composition and permeability”. Parasitology, 72 (1), 19 - 28.
Bonants, P.J., Fitters, P.F., Thijs, H., Belder, D.E., Waalwijk, C. and Henfling,
J.W. (1995). “A basic serine protease from Paecilomyces lilacinus with biological
activity against Meloidogyne hapla eggs”. Microbiology, 141 (4), 775 - 784.
De-hui Dai, Wei-lian Hu, Guang-rong Huang and Wei Li (2011). “Purification
and characterization of a novel extracellular chitinase from thermophilic Bacillus
sp. Hu1”. African Journal of Biotechnology, 10 (13), 2476 - 2485.

41
Huang, X., Zhao, N. and Zang, K. (2004). “Extracellular enzymes serving as
virulence factors in nematophagous fungi involved in infection of the host”.
Research in Microbiology, 155, 811-816.
Inglis, P.W. and Tigano, M.S. (2006). “Identification and taxonomy of some
entomopathogenic Paecilomyces spp. (Ascomycota) isolates using rDNA-ITS
Sequences”. Genetics and Molecular Biology, 29 (1), 132-136.
Jatala, P., R. Kaltenbach, and Bocangel, M. (1979). “Biological control of
Meloidogyne incognita acrita and Globoderra pallid on potatoes”. Journal of
Nematology, 11, 303.
Jolles, P. & Muzzarelli, R.A.A. (1999). Chitin and Chitinases. Springer,
America.
Khan, A., Williams, K.L. and Helena, K.M.N. (2004). “Effects of
Paecilomyces lilacinus protease and chitinase on the eggshell structures and
hatching of Meloidogyne javanica juveniles”. Biol Control, 31 (3), 346-352.
Luangsa, A.J., Jos, H., Tineke-van, D., Seung-Beom, H., Andrew, M.B.,
Jones, N.L.H. and Robert A. S. (2011). “Purpureocillium, a new genus for the
medically important Paecilomyces lilacinus”. FEMS Microbiology Letters, 321 (2),
141-149.
Morgan, J.G., White, J.F. and Rodriguez, K.R. (1984). “Phytonematode
pathology: ultra structural studies II. Parasitism of Meloidogyne arenaria eggs and
larvae by Paecilomyces lilacinus”. Nematropica, 14 (1), 57-71.
Morton, C.O., Tim, H.M., Kerry, R. and Penny, R.H. (2003). “PCR-based
DNA fingerprinting indicates host-related genetic variation in the nematophagous
fungus Pochonia chlamydosporia”. Mycological Research, 107 (2), 198-205.
Nevalainen, H., Khan, A. and Williams, K. (2003). “Testing the
nematophagous biological control strain Paecilomyces lilacinus 251 for the
Paecilotoxin Production”. FEMS microbiology letter, 227 (1), 107-111.
Perry, R.N. (2002). “Hatching”. In: Lee, D.L. (ed), The biology of nematodes,
Taylor & Francis, London, 147 - 170.

42
Samson, R.A. (1974). “Paecilomyces and some allied hyphomycetes”. Studies
in Mycology (Baarn: Centralbureau voor Schimmelcultures), 6, 1-119.
Sasser, J.N. and Carter C.C. (1985). “An Advanced Treatise on Meloidogyne”.
North Carolina State University, 1, 19-24.
Segers, R. (1996). “The role of the proteinase VCP1 produced by the
nematophagous Verticillium chlamydosporium in the infection process of nematode
eggs”. Mycological Research, 100, 421-428.
Stirling, G.R. and West, L.M. (1991). “Fungal parasites of root-knot nematode
eggs from tropical and sub-tropical regions of Australia”. Australasian Plant
Pathology, 20 (4), 149-154.
Sung, G.H., Hywel-Jones, N.L., Sung, J.M., Luangsa-ard, J.J., Sherstha, B.
and Spatafora, J.W. (2007). “Phylogenetic classification of Cordyceps and the
clavicipitaceous fungi”. Studies in Mycology, 57 (1), 5-59.
Thom, C. (1910). “Cultural studies of species of Penicillium”. USDA Bureau
of Animal Industry Bulletin, 118, 1-109.
Watson, B.D. (1965). “The fine structure of the body-wall and the growth of
the cuticle in the adult nematode Ascaris lumbricoides”. Journal of Cell Science,
106 (1), 83-91.
Wharton, D. (1980). “Nematode eggshells”. Parasitology, 81, 447-463.
Tài liệu từ Internet
Nguyễn Văn Bá, Cao Ngọc Diệp và Nguyễn Văn Thành (2005). Giáo trình
môn nấm học (online), 10/07/2015,
http://thuvien.yersin.edu.vn/doc/giao-trinh-mon-nam-hoc-phan-1-pgs-ts-nguyen-
van-ba-bien-soan-dh-can-tho-293739.htm
Esser, R.P.and El-Gholl, E.. Paecilomyces lilacinus, a fungus that parasitizes
nematode eggs, 7/2015,
https://www.freshfromflorida.com/content/download/10991/142237/nem203.pdf
Mitkowski, N.A. and Abawi, G.S. (2003). Root-knot nematodes, 5 July 2015,
http://www.apsnet.org/edcenter/intropp/lessons/Nematodes/Pages/RootknotNemato
de.aspx

1
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC A: KHẢ NĂNG TIẾT ENZYME NGOẠI BÀO CỦA CÁC CHỦNG NẤM
P. lilacinum
Phụ lục A.1: Khả năng tiết enzyme ngoại bào protease
Khả năng tiết enzyme protease của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng
Bảng số liệu thô đường kính vòng phân giải cơ chất casein
Đƣờng kính vòng phân giải casein ( D - d (mm))
STT Chủng
24 giờ 48 giờ 72giờ
LL1 LL2 LL3 LL1 LL2 LL3 LL1 LL2 LL3
A1 PB 1.1 6,47 6,1 6,04 9,68 8,1 10,26 7,53 6,22 7,46
A2 PB 1.3 9,19 8,17 8,95 7,3 8,18 8,91 9,26 8,57 7,5
A3 PB 1.7 7,94 6,7 5,82 7,27 5,46 6 6 5,22 6,18
A4 PB 1.10 9,64 8,27 8,46 6,74 10,14 9,66 5,94 5,44 7,05
A5 PB 2.9 3,32 3,76 7,09 4,72 5,44 4,71 7,56 6,42 7,06
A6 PB 2.10 8,23 7,075 6,07 8,94 10,63 10,15 11,53 9,7 8,78
A7 PB 3.1 7 6,8 7,94 8,58 8,78 7,48 7,89 7,47 8
A8 PB 3.3 2,84 4,72 4,83 5,18 5,68 5,32 7,47 7,94 7,85
A9 PB 3.4 3,41 6,28 3,86 6,5 5,96 5,48 8,28 7,24 6,6
Kết quả xử lý thống kê số liệu đường kính vòng phân giải cơ chất casein theo thời gian
A: Tên chủng. Tương ứng với STT chủng trên bảng số liệu thô.
B: Thời gian đo. Tương ứng: B1: 24 giờ, B2: 48 giờ, B3: 72 giờ
AB: Tên chủng theo thời gian
Class Level Information
Class Levels Values
A 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9
B 3 1 2 3
Number of Observations Read 81
Number of Observations Used 81
R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean
0.811437 13.26107 0.948961 7.155988
Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F

2
A 8 113.3572877 14.1696610 15.73 <.0001
B 2 18.5628451 9.2814225 10.31 0.0002
A*B 16 77.3413716 4.8338357 5.37 <.0001
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 54
Error Mean Square 0.900526
Critical Value of t 2.00488
Least Significant Difference 0.8969
Means with the same letter are not significantly different.
t Grouping Mean N A
A 9.0117 9 6
A
B A 8.4478 9 2
B
B C 7.9267 9 4
B C
B C 7.7711 9 7
C
C 7.5400 9 1
D 6.2878 9 3
D
D 6.0956 9 9
D
D 5.7589 9 8
D
D 5.5644 9 5
Alpha 0.05
t Grouping Mean N B
A 7.5337 27 3

3
A
A 7.4537 27 2
B 6.4806 27 1
Alpha 0.05
t Grouping Mean N A
A 10.0033 3 A6B3
A
B A 9.9067 3 A6B2
B A
B A C 9.3467 3 A1B2
B A C
B D A C 8.8467 3 A4B2
B D A C
E B D A C 8.7900 3 A4B1
E B D A C
E B D A C 8.7700 3 A2B1
E B D C
E B D F C 8.4433 3 A2B3
E D F C
E G D F C 8.2800 3 A7B2
E G D F C
E G D F C 8.1300 3 A2B2
E G D F
E G D F H 7.7900 3 A9B3
E G D F H
E G D F H 7.7867 3 A7B3
E G D F H
E G D F H I 7.7533 3 A8B3
E G F H I

4
E G J F H I 7.2467 3 A7B1
G J F H I
G J F H I 7.1250 3 A6B1
G J F H I
G J F H I 7.0700 3 A1B3
G J F H I
G J F H I 7.0133 3 A5B3
G J H I
G J K H I 6.8200 3 A3B1
J K H I
L J K H I 6.2433 3 A3B2
L J K I
L J K I 6.2033 3 A1B1
L J K
L J K 6.1433 3 A4B3
L J K
L J K M 5.9800 3 A9B2
L J K M
L J K M 5.8000 3 A3B3
L K M
L N K M 5.3933 3 A8B2
L N M
L N M 4.9567 3 A5B2
L N M
L N M 4.7233 3 A5B1
N M
N M 4.5167 3 A9B1
N
N 4.1300 3 A8B1
Khả năng tiết enzyme protease của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất canh
tác
Bảng số liệu thô đường kính vòng phân giải cơ chất casein

5
Đƣờng kính vòng phân giải casein ( D - d (mm))
STT Chủng
24h 48h 72h
A1 KL 1.2 5,69 7,8 7,33 7,99 8,08 7,68 8,12 7,7 8,7
A2 KL 1.3 3,92 5,12 6,01 5,6 5,84 4,75 6,28 7,02 6,74
A3 KL 1.4 7,02 7,61 6,1 7,31 6,35 6,25 9,62 9,5 9,11
A4 KL 3.1 6,92 5,41 7,6 7,97 6,4 5,89 7,9 9,29 9,6
A5 KL 4.1 6,57 6,76 7,32 4,9 6,19 6,59 7,85 8,21 8,58
A6 KL 5.1 8,36 7,58 8,06 6,91 8,09 6,74 8,42 9,48 8,41
A7 KL 5.2 7,21 7,85 7,18 8,64 8,17 7,69 3,94 3,62 3,78
A8 KL 5.3 7,9 7,18 7,36 8,98 10,05 9,54 12,82 12,03 8,85
A9 KL 6.1 4,95 8,51 7,4 8,28 10,15 9,6 5,67 6,91 6,1
A10 KL 6.2 10,92 10,17 8,76 6,35 8,49 9,44 10,36 10,86 9,23
A11 KL 8.2 6,57 7,3 6,32 2,87 5,9 6,62 7,29 6,54 9,66
A12 HT 1.1 7,9 7,56 8,52 8,28 9,36 10,4 7,59 6,52 7,94
A13 HT 1.2 8,12 8,06 7,91 9,35 8,2 8,78 6,31 3,72 4,25
A14 HT 1.3 7,69 8,23 7,14 10,99 10,36 9,52 7,21 5,43 9,36
A15 HT 2.1 6,68 3,95 5,48 5,25 6,77 6,18 7,18 6,86 6,33
A16 HT 2.2 5,77 6,17 6,65 7,4 5,87 7,77 8,19 8,27 6,13
A17 HT 2.3 8,4 8,06 8,66 7,5 7,02 7,15 10,38 10,69 10,02
A18 HT 3.1 7,9 6,9 7,72 9,17 10,47 9,16 7,52 5,36 8,02
A19 HT 3.2 6,89 6,77 7,17 4,1 4,37 4,64 4,47 4,5 4,53
A20 HT 3.3 10,07 8,41 7,18 11,33 10,21 9,57 7,54 7,06 6,25
A21 HT 4.1 6,09 7,24 6,71 7,88 7,37 6,99 0,83 10,24 10,33
A22 HT 4.2 6,98 5,67 6,68 7,05 7,65 8,72 9,17 9,84 6,89
A23 HT 4.3 6,96 6,96 7,31 8,61 7,08 5,28 6,01 5,7 7,85
A24 HT 5.1 6,88 7,15 6,11 3,99 3,7 5,95 4,47 6,12 6,99
A25 HT 5.2 8,22 7,07 8,01 8,84 8,95 9,65 8,2 12,18 11,29
A26 HT 6.1 5,88 6,19 4,59 7,82 7,41 6,26 9,23 9,72 9,65
A27 HT 6.3 8,36 6,1 5,82 8,28 8,94 8,56 7,35 7,25 8,11
A28 HT 7.2 6,94 5,75 5,91 7,65 8,52 3,24 8,14 9,13 8,17
A29 HT 7.3 5,61 6,23 5,17 6,65 6,22 8,67 11,22 10,4 7,84
Kết quả xử lý thống kê số liệu đường kính vòng phân giải cơ chất casein theo thời gian

6
0.784170 13.37202 1.004238 7.510000
A 28 286.8814444 10.2457659 10.16 <.0001
B 2 29.5093540 14.7546770 14.63 <.0001
A*B 56 321.1693349 5.7351667 5.69 <.0001
Alpha 0.05
t Grouping Mean N A
A 9.4122 9 8
A
A 9.3978 9 10
A
B A 9.1567 9 25
B A
B A C 8.6533 9 17
B A C
B D A C 8.6244 9 20
B D C
B D E C 8.4367 9 14
B D E C
F B D E C 8.2300 9 12
F D E C
F D E C 8.1867 9 21
F D E C
F G D E C 8.0244 9 18
F G D E C
F G D E C 8.0056 9 6
F G D E C
F G D E C H 7.7811 9 29

7
F G D E H
F G D E H 7.6967 9 27
F G E H
F G E H 7.6767 9 1
F G E H
F G E H 7.6522 9 3
F G E H
F G E H 7.6278 9 22
F G E H
F G E H 7.5078 9 9
F G H
F G I H 7.4422 9 4
F G I H
F G I H 7.4167 9 26
G I H
G I J H 7.1889 9 13
G I J H
G I J H 7.1322 9 28
I J H
K I J H 6.9967 9 5
K I J H
K I J H 6.9133 9 16
K I J H
K I J H 6.8622 9 23
K I J
K L I J 6.5633 9 11
K L J
K L J 6.4533 9 7
K L
K L M 6.0756 9 15
L M
L M 5.7067 9 24
L M
L M 5.6978 9 2

8
M
M 5.2711 9 19
Alpha 0.05
t Grouping Mean N B
A 7.9097 87 3
B 7.5333 87 2
C 7.0870 87 1
Alpha 0.05
t Grouping Mean N AB
A 11.2333 3 A8B3
A
B A 10.5567 3 A25B3
B A
B A C 10.4667 3 A21B3
B A C
B D A C 10.3700 3 A20B2
B D A C
B D A C 10.3633 3 A17B3
B D A C
B D A C 10.2900 3 A14B2
B D A C
E B D A C 10.1500 3 A10B3
E B D A C
E B D A C F 9.9500 3 A10B1

9
E B D A C F
E B D A G C F 9.8200 3 A29B3
E B D G C F
E B D H G C F 9.6000 3 A18B2
E B D H G C F
E B D I H G C F 9.5333 3 A26B3
E B D I H G C F
E B D I H G C F 9.5233 3 A8B2
E B D I H G C F
E B J D I H G C F 9.4100 3 A3B3
E B J D I H G C F
E K B J D I H G C F 9.3467 3 A12B2
E K B J D I H G C F
E K B J D I H G C F 9.3433 3 A9B2
E K B J D I H G C F
L E K B J D I H G C F 9.1467 3 A25B2
L E K J D I H G C F
L E K M J D I H G C F 8.9300 3 A4B3
L E K M J D I H G F
L E K M J D I H G N F 8.7767 3 A13B2
L E K M J D I H G N F
L E K M J D I H G N F 8.7700 3 A6B3
L E K M J I H G N F
L E K M J O I H G N F 8.6333 3 A22B3
L E K M J O I H G N F
L E K M J O I H G N F P 8.5933 3 A27B2
L E K M J O I H G N F P
L E K M J O I H G N Q F P 8.5533 3 A20B1
L K M J O I H G N Q F P
L R K M J O I H G N Q F P 8.4800 3 A28B3
L R K M J O I H G N Q F P
L R K M J O I H G S N Q F P 8.3733 3 A17B1
L R K M J O I H G S N Q P
L R K M J O I H G S N Q T P 8.2133 3 A5B3

10
L R K M J O I H S N Q T P
L R K M J O I H S N Q T P 8.1733 3 A1B3
L R K M J O I H S N Q T P 8.1667 3 A7B2
L R K M J O I H U S N Q T P 8.0933 3 A10B2
L R K M J O I H U S N Q T P
L R K M J O I H V U S N Q T P 8.0300 3 A13B1
L R K M J O I H V U S N Q T P
L R K M J O I H V U S N Q T P
L R K M J O I V U S N Q T P
L R K M J O I W V U S N Q T P 7.9167 3 A1B2
L R K M J O W V U S N Q T P
L R K M J O X W V U S N Q T P 7.8300 3 A11B3
L R K M J O X W V U S N Q T P
L R K M J O X Y W V U S N Q T P 7.8067 3 A22B2
L R K M O X Y W V U S N Q T P
L R K M O X Y W V U S N Q T P 7.7667 3 A25B1
L R M O X Y W V U S N Q T P
L R M O X Y W V U S N Q T P 7.6867 3 A14B1
L R M O X Y W V U S N Q T P
L R M Z O X Y W V U S N Q T P 7.5700 3 A27B3
L R M Z O X Y W V U S N Q T P
L R M Z O X Y W V U S N Q T P 7.5300 3 A16B3
R M Z O X Y W V U S N Q T P
R A M Z O X Y W V U S N Q T P 7.5067 3 A18B1
R A M Z O X Y W V U S N Q T P
R A M Z O X Y W V U S N Q T P 7.4800 3 A8B1
R A M Z O X Y W V U S N Q T P
B R A M Z O X Y W V U S N Q T P 7.4133 3 A21B2
B R A M Z O X Y W V U S N Q T P

11
B R A Z O X Y W V U S N Q T P
B R A Z O X Y W V U S N Q T P 7.2467 3 A6B2
B R A C Z O X Y W V U S N Q T P 7.1633 3 A26B2
B R A C Z O X Y W V U S Q T P
B R A C Z O X Y W V U S Q T P 7.0767 3 A23B1
B R A C Z X Y W V U S Q T P
B R A C Z X Y W V U S D Q T P 7.0133 3 A16B2
B R A C Z X Y W V U S D Q T P
B R A C Z X Y W V U S D Q T P 6.9900 3 A23B2
B R A C Z X Y W V U S D Q T
B R A C Z E X Y W V U S D Q T 6.9667 3 A18B3
B R A C Z E X Y W V U S D Q T
B R A C Z E X Y W V U S D T
B R A C Z E X Y W V U S D T 6.9267 3 A27B1

12
B A C Z E X Y W V U S D T
B A C Z E X Y W V U S D T 6.7900 3 A15B3
B A C Z E X Y W V U D T
B A C Z E X Y W V U D T 6.7533 3 A4B2
B A C Z E X Y W V U D T
B F A C Z E X Y W V U D T 6.7300 3 A11B1
B F A C Z E X Y W V U D T
B F A C Z E X Y W V U D
B F A C Z E X Y W V U D G 6.5200 3 A23B3
B F A C Z E X Y W V D G
B F A C Z E X Y W V D G 6.4700 3 A28B2
B F A C Z E X Y W V D G 6.4467 3 A28B1
B F A C Z E X Y W V D G 6.4433 3 A22B1
B F A C Z E X Y W D G
B F A C Z E X Y W H D G 6.3433 3 A29B1
B F A C Z E X Y H D G
B F A C Z E X Y H D G 6.2267 3 A9B3
B F A C Z E Y H D G
B F A C Z E Y H D G 6.1967 3 A16B1
B F A C Z E H D G
B F A C Z E I H D G 6.0667 3 A15B2
B F A C E I H D G
B F A C E J I H D G 5.8933 3 A5B2

13
B F C E J I H D G
B F C E J I H D G 5.8600 3 A24B3
F C E J I H D G
F C E J I H D G 5.5533 3 A26B1
F E J I H D G
F K E J I H D G 5.3967 3 A2B2
F K E J I H G
F K E J I H G 5.3700 3 A15B1
F K J I H G
F K J I H G 5.1300 3 A11B2
K J I H G
K J I H G 5.0167 3 A2B1
K J I H
K J I H 4.7600 3 A13B3
K J I
K J I 4.5467 3 A24B2
K J I
K J I 4.5000 3 A19B3
K J
K J 4.3700 3 A19B2
K
K 3.7800 3 A7B3
Phụ lục A.2: Khả năng tiết enzyme ngoại bào chitinase
Khả năng tiết enzyme chitinase của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất rừng
Bảng số liệu thô đường kính vòng phân giải cơ chất chitin
STT Chủng
Đƣờng kính vòng phân giải chitin (D-d (mm))
24h 48h 72h
A1 PB 1.1 2,3 2,14 2,97 4,92 4,32 4,62 3,19 2,21 2,7
A2 PB 1.3 1,98 1,77 2,11 4,54 4,97 4,34 1,07 1,39 1,12
A3 PB 1.7 1,56 1,6 1,52 3,12 3 3,06 0,88 1,52 1,38
A4 PB 1.10 2,17 1,71 2,63 3,59 4,92 4,28 1,1 0,86 0,87
A5 PB 2.9 3,12 1,81 3,12 5,21 6,02 5,81 2,93 3 3,4

14
A6 PB 2.10 1,49 2,36 2,26 4,83 3,48 5,2 1,08 0,77 0,4
A7 PB 3.1 1,6 2,41 2,06 3,79 4,67 3,71 0,04 0,65 0,13
A8 PB 3.3 2,57 2,52 2,5 6,05 6,64 6,96 4,28 3,9 5,24
A9 PB 3.4 2,09 2,82 2,56 4,34 4,76 3,86 1,79 0,74 0,42
Kết quả xử lý thống kê số liệu đường kính vòng phân giải cơ chất chitin theo thời gian
Class Level Information
Class Levels Values
A 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9
B 3 1 2 3
Number of Observations Read 81
Number of Observations Used 81
0.947763 15.84820 0.453572 2.861975
A 8 51.2151506 6.4018938 31.12 <.0001
B 2 129.5815580 64.7907790 314.94 <.0001
A*B 16 20.7663086 1.2978943 6.31 <.0001
Alpha 0.05
t Grouping Mean N A
A 4.5178 9 8
B 3.8244 9 5
C 3.2633 9 1
D 2.5978 9 9

15
D
D 2.5878 9 2
D
E D 2.4589 9 4
E D
E D 2.4300 9 6
E
E F 2.1178 9 7
F
F 1.9600 9 3
Alpha 0.05
t Grouping Mean N B
A 4.6300 27 2
B 2.2130 27 1
C 1.7430 27 3
Alpha 0.05
t Grouping Mean N AB
A 6.5500 3 A8B2
B 5.6800 3 A5B2
C 4.6200 3 A1B2
C
C 4.6167 3 A2B2
C
C 4.5033 3 A6B2

16
C
C 4.4733 3 A8B3
C
C 4.3200 3 A9B2
C
C 4.2633 3 A4B2
C
C 4.0567 3 A7B2
D 3.1100 3 A5B3
D
D 3.0600 3 A3B2
D
E D 2.7000 3 A1B3
E D
E D F 2.6833 3 A5B1
E D F
E D F 2.5300 3 A8B1
E D F
E D F 2.4900 3 A9B1
E D F
E D F 2.4700 3 A1B1
E F
E G F 2.1700 3 A4B1
E G F
E G F 2.0367 3 A6B1
E G F
E G F 2.0233 3 A7B1
G F
H G F 1.9533 3 A2B1
H G
H G I 1.5600 3 A3B1
H I
H J I 1.2600 3 A3B3
J I

17
J I 1.1933 3 A2B3
J I
K J I 0.9833 3 A9B3
K J I
K J I 0.9433 3 A4B3
K J
K J 0.7500 3 A6B3
K
K 0.2733 3 A7B3
Khả năng tiết enzyme chitinase của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất canh
tác
Bảng số liệu thô đường kính vòng phân giải cơ chất chitin
Đƣờng kính vòng phân giải chitin (D-d (mm))
STT Chủng
24h 48h 72h
A1 KL 1.2 2,49 2,44 2,68 5,55 5,09 5,24 1,94 1,84 1,53
A2 KL 1.3 2,18 2,9 2,26 4,71 4,73 6,64 0,14 0,73 0,95
A3 KL 1.4 1,7 1,6 1,74 3,75 3,96 3,73 0,97 1,11 1,03
A4 KL 3.1 3,76 4,4 2,62 6,47 5,58 6,24 0,84 1,07 2,01
A5 KL 4.1 2,34 2,58 2,75 4,11 5,31 4,37 2,65 3,78 3,26
A6 KL 5.1 2,03 2,46 2,49 3,15 4,92 2,3 3,36 1,94 1,11
A7 KL 5.2 2,75 2,26 2,57 4,02 4,85 5,58 0,32 0,22 0,27
A8 KL 5.3 2,98 4,63 4,02 7,19 6,23 7,3 4,43 3,67 4,36
A9 KL 6.1 1,49 2,37 2 5,63 5,66 5,04 1,13 0,51 0,28
A10 KL 6.2 2,75 2,3 2,75 7,69 5,98 5,4 1,87 1,35 0,87
A11 KL 8.2 2,57 2,5 2,96 5,94 4,2 4,91 1 1,89 3,04
A12 HT 1.1 3,12 3,41 3,47 8,03 6,82 9,79 2,48 2,13 2,15
A13 HT 1.2 3,32 2,84 2,69 7,49 5,98 7,18 2,43 3,19 2,43
A14 HT 1.3 2,02 2,74 4,25 4,86 4,76 4,51 1,8 2,41 1,19
A15 HT 2.1 3,05 3,23 4,6 5,82 5,48 7,21 3,47 3,32 1,47
A16 HT 2.2 2,78 3,12 2,63 6,27 7,52 7,14 5,21 6,72 5,2
A17 HT 2.3 3,42 4,35 3,9 5,39 5,43 5,17 2,42 4,16 4,09
A18 HT 3.1 3,17 3,55 3,39 8,23 7,22 6,1 2,29 0,87 2,19
A19 HT 3.2 3,51 3,19 3,01 4,61 4,82 5,64 1,74 0,66 0,86
A20 HT 3.3 2,98 2,76 2,34 5,46 4,56 6,71 1,27 0,96 0,98
A21 HT 4.1 3,11 3,05 3,18 7,52 6,3 5,91 1,96 1,82 1,47

Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng của một số chủng nấm purpureocillium lilacium phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở vũng tàu

Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng của một số chủng nấm purpureocillium lilacium phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở vũng tàu

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng của một số chủng nấm purpureocillium lilacium phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở vũng tàu

Similar to Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng của một số chủng nấm purpureocillium lilacium phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở vũng tàu (20)

More from TÀI LIỆU NGÀNH MAY

More from TÀI LIỆU NGÀNH MAY (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào và ký sinh tuyến trùng của một số chủng nấm purpureocillium lilacium phân lập từ đất rừng và đất canh tác ở vũng tàu