Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 HOẶC https://www.facebook.com/garmentspace/ https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh

1. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
SO SÁNH VÀ CHỌN LỌC CÁC QUY TRÌNH PCR
PHÁT HIỆN VI KHUẨN
CORYNEBACTERIUM DIPTHERIAE
GÂY BỆNH BẠCH HẦU
Ngành học: Công Nghệ Sinh Học
Giảng viên hƣớng dẫn: THS.PHAN VĂN THÀNH
BS.HỒ NGUYỄN LỘC THÙY
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐỖ KHÁNH NHƢ
MSSV: 1311100546 Lớp: 13DSH03
TP. Hồ Chí Minh, 2017
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
SO SÁNH VÀ CHỌN LỌC CÁC QUY TRÌNH PCR PHÁT
HIỆN VI KHUẨN
CORYNEBACTERIUM DIPTHERIAE
GÂY BỆNH BẠCH HẦU
Ngành học: Công Nghệ Sinh Học
Giảng viên hƣớng dẫn: THS.PHAN VĂN THÀNH
BS.HỒ NGUYỄN LỘC THÙY
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐỖ KHÁNH NHƢ
MSSV: 1311100546 Lớp: 13DSH03
TP. Hồ Chí Minh, 2017

3. i
LỜI CAM ĐOAN
Khóa luận tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dƣới sự
hƣớng dẫn khoa học của THS. Phan Văn Thành và Bác sĩ Hồ Nguyễn Lộc
Thùy (Chuyên viên nghiên cứu phòng Vi khuẩn hô hấp, khoa Vi sinh miễn
dịch, viện Pasteur TP Hồ Chí Minh)
Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chƣa từng
đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về
khóa luận tốt nghiệp của mình.
TP.HCM, ngày 26 tháng 07 năm 2017
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Đỗ Khánh Nhƣ

4. ii
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, ngƣời đã nuôi nấng
dạy dỗ con trong 22 năm qua, cảm ơn anh chị trong gia đình đã định hƣớng và
ủng hộ con đƣờng học tập của em.
Em xin cảm ơn Thạc sĩ Võ Thị Trang Đài, Thạc sĩ Phạm Thị Hoan đã
tận tâm chỉ dạy và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình thực hiện
khóa luận.
Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến Thạc sĩ
Phan Văn Thành và Bác sĩ Hồ Nguyễn Lộc Thùy ngƣời luôn nhiệt tình giúp
đỡ em, luôn định hƣớng và cung cấp những kiến thức bổ ích cho chúng em,
ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn em thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp này.
Đồng thời, xin cảm ơn đến chị Nguyễn Hoàng Vân Anh, anh Nguyễn
Gia Kỳ, bạn Phạm Trần Diệu Huyền, Trƣơng Khánh Duy, Lê Thị Thùy
Trang, Hồ Thị Thu Trang đã hổ trợ mình thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp,
cảm ơn tất cả các bạn trên phòng thí nghiệm đã giúp đỡ mình trong suốt quá
trình làm thí nghiệm.
Em xin chân thành cảm ơn !
TP.HCM, ngày 26 tháng 07 năm 2017
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Đỗ Khánh Nhƣ

5. iii
MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG .........................................................................................vii
Phần I: MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
Phần II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................. 3
2.1 Sơ lược về bệnh Bạch hầu .................................................................................... 3
2.1.1 Tác nhân gây bệnh ......................................................................................... 3
2.1.2 Cơ chế gây bệnh ............................................................................................. 4
2.1.3Tình hình bệnh bạch hầu trên thế giới ............................................................ 5
2.1.5 Biện pháp phòng bệnh ............................................................................... 8
2.2 Corynebacterium Diphtheriae............................................................................ 10
2.2.1Hình thái và cấu trúc..................................................................................... 10
2.2.2Tính chất nuôi cấy ......................................................................................... 11
2.2.3Đặc điểm sinh hóa......................................................................................... 12
Phần III: PHƢƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ...................................... 16
3.1 Vật liệu nghiên cứu............................................................................................. 16
3.1.1Dụng cụ cần thiết .......................................................................................... 16
3.1.3 Đối tượng nghiên cứu................................................................................... 18
3.2 Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 19
3.2.3 Khảo sát nồng độ của mồi trong phản ứng Real time PCR ......................... 21
3.2.4 Khảo sát nồng độ của mẫu dò trong phản ứng Realtime PCR .................... 22
3.2.5 Khảo sát độ nhạy ( ngưỡng phát hiện dưới) của phản ứng Realtime PCR . 22
3.2.6 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng PCR và Realtime PCR ................... 23
PHẦN IV: KẾT QUẢ .................................................................................................. 24
4.1 Khảo sát độ nhạy (ngưỡng phát hiện dưới) của phản ứng PCR:...................... 24
4.2 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng PCR: ........................................................ 25
4.3 Khảo sát nồng độ mồi trong phản ứng Realtime PCR ....................................... 26
4.4 Khảo sát nồng độ mẫu dò quy trình Realtime PCR............................................ 27
4.5 Khảo sát độ đặc hiệu quy trình Realtime PCR................................................... 27

6. iv
4.6 Khảo sát độ nhạy quy trình Realtime PCR......................................................... 28
PHẦN V: KẾT LUẬN................................................................................................ 31
Phần VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 32
PHẦN VII: PHỤ LỤC ................................................................................................. 34

7. v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AE Elution buffer
AL Lysis buffer
AW1 Wash buffer 1
AW2 Wash buffer 2
DNA Deoxyribose Nucleic Acid
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EtBr Ethidium Bromide
PCR Polymerase Chain Reaction
RT-PCR Real Time - Polymerase Chain Reaction
TBE Tris-Borate EDTA
µL Microlitter
µM Micromole

8. vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Theodor Albrecht Edwin Klebs1883 (bên phải), Friedrich Loeffler1884
(bên trái)................................................................................................................... 11
Hình 2.1: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1940-1980 .......14
Hình 2.2: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1980-2010 .......15
Hình 2.3: Tình hình bệnh Bạch hầu trên thế giới.....................................................15
Hình 2.4: Tình hình bệnh bạch hầu ở Việt Nam từ năm 2005-2015........................16
Hình 2.5: Mô phỏng vi khuẩn Gram dƣơngC.diphtheriae khi dùng kĩ thuật nhuộm
Xanh methylene. (Nguồn: public health image library-PHLI) .................................18
Hình 2.6: Hình dạng vi khuẩn khi dùng kĩ thuật nhuộm Albert (Nguồn: public
health image library-PHLI).......................................................................................18
Hình 2.7: Hình dạng khuẩn lạc trên môi trƣờng BA (bên phải), hình dạng khuẩn lạc
trên môi trƣờng HA (bên trái). (Nguồn: public health image library-PHLI)...........19
Hình 2.8: Thử nghiệm Elek......................................................................................21
Hình 4.1: Kết quả điện di độ nhạy của mồi trong phản ứng PCR xử dụng cặp mồi
DT1, DT2 ..................................................................................................................32
Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR, quy trình sử dụng cặp mồi Tox1, Tox2
không bổ sung MgCl2................................................................................................................................................32
Hình 4.3: Kết quả điện di độ nhạy của mồi trong phản ứng PCR xử dụng cặp mồi
Tox1, Tox2 có bổ sung MgCl2...........................................................................................................................33
Hình 4.4, 4.5, 4.6: Kết quả điện di trên gel, thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu cuả mồi
DT1, DT2 ..................................................................................................................33
Hình 4.8: Kết quả khảo sát nồng độ mồi trong Realtime PCR ................................34
Hình 4.9: Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò trong Realtime PCR ..........................35
Hình 4.10: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu. trong Realtime PCR...............................35
Hình 4.11: Kết quả khảo sát độ nhạy trong Realtime PCR......................................36
Hình 4.12: Kết quả chạy Realtime-PCR trên mẫu. trong Realtime PCR ................36

9. vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn bạch hầu và giả bạch hầu...................19
Bảng 2.2: Khả năng tan huyết của các biotype ......................................................20
Bảng 3.1: Các cặp mồi và đầu dò đƣợc dùng để thực hiện phản ứng PCR ...........25
Bảng 3.2: Các cặp mồi và đầu dò đƣợc dùng để thực hiện phản ứng Realtime PCR
.................................................................................................................................26
Bảng 3.3: Các chủng vi khuẩn trong thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu ..................26
Bảng 3.4: Thành phần phản ứng cho cặp mồi DT1, DT2 ......................................28
Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cho cặp mồi Tox1, Tox2....................................28
Bảng 3.6: Chu trình nhiệt cho cặp mồi DT1, DT2.................................................29
Bảng 3.7: Chu trình nhiệt cho cặp mồi Tox1, Tox2...............................................29
Bảng 3.8: Chu trính nhiệt của phản ứng Realtime PCR.........................................30
Bảng 3.9: Thành phẩn phản ứng của phản ứng Realtime PCR..............................30
Bảng 4.1: Kết quả chạy trên 39 mẫu .....................................................................37

10. 1
CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU
Bệnh bạch hầu do khuẩn C. Diphtheriae gây ra. Biểu hiện lâm sàng thông
thƣờng nhất là nhiễm trùng khu trú ở niêm mạc hô hấp, với đặc điểm là màng giả
xuất hiện ở nơi nhiễm trùng. Một số vi trùng có thể tạo ra độc tố, do đó nếu nhiễm
độc tố, bệnh có thể diễn tiến nặng với nhiều biến chứng nhƣ viêm cơ tim, viêm dây
thần kinh, viêm thận... trong đó biến chứng tim gây tử vong rất cao. Trong thế chiến
thứ II ở Na Uy, chỉ trong vòng 2 năm sau khi Đức xâm lƣợc số trƣờng hợp nhiễm
bệnh tăng lên đến 50000 ca [3]. Ở Việt Nam, thời kỳ chƣa thực hiện tiêm vắc xin
bạch hầu trong Chƣơng trình tiêm chủng mở rộng (TCMR) thì bệnh bạch hầu
thƣờng xảy ra và gây dịch ở hầu hết các tỉnh, đặc biệt là ở các thành phố có mật độ
dân cƣ cao. Do thực hiện tốt việc tiêm vắc xin bạch hầu nên tỷ lệ mắc bạch hầu ở
Việt Nam đã giảm dần từ 3,95/100.000 dân năm 1985 xuống 0,14/100.000 dân năm
2000. Nhƣng đến năm 2015 ở tỉnh Quảng Nam dịch lại xuất hiện, phát hiện 2 ca
dƣơng tính với vi khuẩn C.diphtheriae. Năm 2016 trong vụ dịch Bình Phƣớc phát
hiện 5 ca trong đó có 1 ca tiếp xúc dƣơng tính với khuẩn [15].
Phƣơng pháp nuôi cấy đang là “ Tiêu chuẩn vàng” trong phòng thí nghiệm
tuy nhiên phƣơng pháp này tốn nhiều thời gian do không phải lúc nào các sinh vật
sống cũng còn trong mẫu bệnh phẩm sau quá trình vận chuyển và bảo quản mẫu.
Để phân biệt các chủng bạch hầu sinh độc tố và không sinh độc tố bằng các phƣơng
pháp nuôi cấy truyền thống là rất khó, vì C.diphtheriae và C.ulcerans giống nhau
đến 95% axit amin và nucleotic . Thử nghiệm Elek cũng là một trong những
phƣơng pháp phát hiện đƣợc độc tố bạch hầu. Nhƣng vì tình hình bệnh ngày càng ít
đi và các sinh hóa phẩm dùng cho thử nghiệm này chỉ sử dụng riêng biệt mà lại
không tận dụng đƣợc nhiều nên thử nghiệm này hiện nay ít đƣợc dùng đến hơn [13].
Sự phát triển của sinh học phân tử - phƣơng pháp PCR giúp ích rất nhiều trong việc
nghiên cứu, chữa trị cũng nhƣ kiểm soát bệnh bạch hầu. Ƣu điểm của phƣơng pháp
PCR là có thể phát hiện chính xác chủng bạch hầu sinh độc tố chỉ trong thời gian
ngắn, độ đặc hiệu cao. Để đáp ứng nhanh nhu cầu phát hiện, chẩn đoán và chữa trị,
Real time – PCR ra đời rút ngắn hơn nữa thời gian xét nghiệm bệnh do chỉ thực

11. 2
hiện một phản ứng cho ra kết quả chính xác vi khuẩn gây bệnh và loại bỏ đƣợc
bƣớc điện di sản phẩm của PCR chuẩn. Realtime-PCR sử dụng mẫu dò giúp đọc
đƣợc kết quả chính xác ngay sau khi phản ứng kết thúc. Trên cơ sở đó, đề tài “ So
sánh và chọn lọc các quy trình PCR phát hiện vi khuẩn C.diphtheriae gây bệnh bạch
hầu ” đƣợc thực hiện nhằm khảo sát chọn lọc ra phƣơng pháp PCR phù hợp với
điều kiện nghiên cứu của phòng xét nghiệm Vi khuẩn hô hấp, khoa Vi sinh miễn
dịch, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh.

12. 3
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về bệnh Bạch hầu
Hình 1.1: Theodor Albrecht Edwin Klebs1883 (bên phải), Friedrich Loeffler1884 (bên trái)
2.1.1 Tác nhân gây bệnh
Tác nhân gây bệnh C. diphtheriae, đƣợc Klebs tìm thấy và Loeffler phân
lập. C. diphtheriae là trực khuẩn bắt màu Gram dƣơng, không có vỏ, không có
lông và không có nha bào, đƣờng kính từ 0.3 -0.8µm, dài từ 1-8µm, có những
hạt nhiễm sắc khi nhuộm bằng phƣơng pháp đặt biệt nhƣ Albert hoặc Neisser.Vi
khuẩn dễ dàng mọc trên huyết thanh đông, mọc thành những khuẩn lạc sau 12-
18 giờ, vƣợt nhanh sự phát triển của các loại vi khuẩn kèm theo. Dựa trên hình
thái học của cụm vi trùng trên thạch tellurite, dựa vào phản ứng lên men và khả
năng tán huyết, vi khuẩn Bạch hầu đƣợc chia làm 4 biotype: mitis, intermedius,
gravis và belfanti [1].

13. 4
Sức đề kháng của vi khuẩn ở ngoài cơ thể rất lớn. Trên các đồ vật, trực
khuẩn bạch hầu sống vài ngày, trong những điều kiện thuận lợi (đƣợc chất nhày
trong họng bảo vệ) vi khuẩn sống đƣợc vài tuần. Trên đồ vải vi khuẩn sống đƣợc
40-50 ngày,trên cát sống đƣợc đến 100 ngày, trên các đồ chơi bằng gỗ chúng
sống đƣợc 3 tháng, trên quản bút mà học sinh ngậm vào miệng đã phát hiện thấy
trực khuẩn bạch hầu sau 15 ngày [1].
Tác nhân gây bệnh bạch hầu rất nhạy cảm với bất kì yếu tố hóa lý nào, ánh
sáng mặt trời giết chúng sau vài giờ, ánh sáng khuếch tán giết trong vài ngày. Ở
nhiệt độ 60o
C chúng chết sau 10 phút, dƣới tác dụng của dung dịch clorua thủy
ngân 1% hoặc phenol 5% chúng chết sau 1 phút [1].
2.1.2 Cơ chế gây bệnh
Ngƣời là nguồn bệnh duy nhất của vi khuẩn Bạch hầu. Bệnh lây lan chủ yếu
qua tiếp xúc thân mật giữa bệnh nhân hoặc ngƣời mang vi trùng qua các chất
tiết đƣờng hô hấp hoặc qua các chất dịch ở sang thƣơng ngoài da có chứa vi
trùng gây bệnh, và trong rất ít trƣờng hợp bệnh có thể lây qua đồ chơi của trẻ
em [4].
Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn phụ thuộc khả năng xâm nhập vào hệ thống
đƣờng hô hấp trên hoặc qua da và khả năng sinh ngoại độc tố bạch hầu. Trong
đó khả năng sinh ngoại độc tố đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh
[4].
Tại họng, độc tố vi khuẩn giải phóng gây phản ứng viêm nhiễm dẫn đến hình
thành các giả mạc. Các giả mạc bao gồm khối sợi huyết, bạch cầu, hồng cầu,
các tế bào biểu mô bị hoại tử ở đƣờng hô hấp và vi khuẩn. Giả mạc có thể ở tại
chỗ (amidan, họng, mũi) hoặc lan rộng xuống thanh, khí phế quản gây tắc
nghẽn khí đạo, phù nề mô mềm. Màng giả gây bít tắc chính là nguyên nhân
thƣờng gây tử vong nhất ở ngƣời lớn và trẻ em. Hiện tƣợng mang vi trùng ở
vùng cổ họng là nguồn truyền lây nhiễm quan trọng để duy trì và lan truyền
bệnh trong cộng đồng [5].

14. 5
Độc tố ức chế quá trình tổng hợp protein của tế bào chủ, gây ảnh hƣởng lên
tất cả toàn tế bào cơ thể nhƣng tác động chủ yếu trên cơ tim, trên thần kinh và
trên thận. Liều độc tố nhỏ hơn 0.1mg/kg có thể gây chết với các động vật nhạy
cảm [5].
2.1.3Tình hình bệnh bạch hầu trên thế giới
Theo một số tác giả Mỹ (Youmans và cộng sự 1975) bệnh thƣờng xảy ra ở
phía nam Hoa Kỳ, tại đây số đông ngƣời dân sống trong điều kiện thiếu vệ sinh
và cơ sở vật chất. Môi trƣờng sống không đủ vệ sinh tạo điều kiện thuận lợi cho
các bệnh về hô hấp phát triển, ngƣời dân đa phần không đƣợc dùng vắc xin.
Bệnh cũng thƣờng xảy ra ở nơi có khí hậu ẩm ƣớt dễ dàng cho sự phát triển
bạch hầu da [3].
Thời kỳ tiền vắc xin, bạch hầu là một căn bệnh giết ngƣời hàng đầu trên
thế giới. Trong những năm 1940-1950, việc áp dụng phổ cập tiêm chủng cho trẻ
em ở trẻ sơ sinh đã đƣợc loại bỏ hầu hết các bệnh bạch hầu ở đa số các nƣớc
công nghiệp hóa. Ở các nƣớc đang phát triển, mức tiêm chủng cao của trẻ sơ
sinh với ba liều vắc xin bệnh đậu mùa - bạch hầu (DTP) đã đạt đƣợc sau khi
thực hiện Chƣơng trình Mở rộng Chƣơng trình Tiêm chủng Tổ chức Y tế Thế
giới (WHO) vào những năm 1970 [12].
Tại Belarus, Estonia, Latvia, Lithuania, Nga và Ukraine, tỷ lệ mắc bệnh
bạch hầu ở ngƣời nhỏ hơn 15 tuổi dao động từ 64% đến 82%. Ngƣời lớn 40-49
tuổi có tỷ lệ mắc bệnh và tử vong rất cao, ở một số quốc gia, nhóm tuổi này
chiếm gần một nửa số ngƣời chết. Trẻ em và thanh thiếu niên ở độ tuổi đi học
cũng có tỷ lệ mắc bệnh cao, đặc biệt là ở Liên bang Nga. Tuy nhiên, những
nhóm tuổi này có tỉ lệ tử vong thấp, số bệnh nhân tử vong xảy ra chủ yếu ở trẻ
em không đƣợc tiêm vắc xin đầy đủ. Tại Moldova, các nƣớc thuộc khu vực
Caucasus (Armenia, Azerbaijan và Georgia), Trung Á (Kyrgyzstan, Tajikistan,
Turkmenistan và Uzbekistan) và Kazakhstan, tỷ lệ ngƣời lớn bị bệnh dao động
từ 38% đến 59% [12].

15. 6
Năm 1990, dịch bệnh bạch hầu đã tái hiện ở Liên Bang Nga, phần lớn là ở
ngƣời lớn. Trong giai đoạn 1991-1993, đại dịch lan rộng nhanh chóng, vào cuối
năm 1994, do sự bất cập trong các biện pháp y tế cộng đồng, tất cả các Quốc
gia Mới độc lập (NIS) và các quốc gia Baltic của Liên bang Cộng hòa Xã hội
Chủ nghĩa Liên Xô (Liên Xô cũ) đều xảy ra dịch. Dịch bệnh đạt đỉnh điểm vào
năm 1994-1995, với tỷ lệ hàng năm là 17 ca / 100.000 dân và tỷ lệ mắc bệnh
cao nhất là 73 ca / 100.000 dân ở Tajikistan năm 1995. Từ năm 1990 đến năm
1998, 1157.000 trƣờng hợp và 5000 trƣờng hợp tử vong đƣợc công bố ở các
quốc gia thuộc Liên Xô cũ, chiếm 180% số ca tử vong do bệnh bạch hầu ở
ngƣời. Ba phần tƣ các trƣờng hợp đƣợc công bố từ Liên bang Nga. Đây là vụ
dịch bệnh bạch hầu lớn nhất kể từ những năm 1950, bắt đầu thời kỳ tiêm chủng
bạch hầu mở rộng [12].
Từ năm 1980 đến năm 2011 ở Mỹ đã xảy ra 55 ca. Năm 1990 dịch xảy ra ở
Liên xô cũ gây tổn thất nghiêm trọng về ngƣời. Năm 1994 bệnh xảy ra ở 15
quốc gia độc lập từ Liên Xô có 157.000 ca mắc và hơn 5,000 ca tử vong,
nguyên nhân dẫn đến hậu quả này là do điều kiện sống của ngƣời dân không
đƣợc bảo đảm, vắc xin chƣa đƣợc phổ cập rộng rãi [12].
Hình 2.1: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1940-1980
Diphtheria - United States
1940-1980

16. 7
Hình 2.2: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1980-2010
(http://www.cdc.gov/vaccines/pubs/pinkbook/dip.html)
.
Hình 2.3: Tình hình bệnh Bạch hầu trên thế giới.

17. 8
2.1.4 Tình hình bệnh bạch hầu ở Việt Nam
Trƣớc khi có chƣơng trình tiêm chủng, bệnh bạch hầu là bệnh của trẻ em,
thỉnh thoảng gây dịch lẻ tẻ, do thực hiện tốt việc tiêm vắc xin bạch hầu nên tỷ lệ
mắc bạch hầu ở Việt Nam đã giảm dần từ 3,95/100.000 dân năm 1985 xuống
0,14/100.000 dân năm 2000 [15].
Đến năm 2015 bạch hầu lại xuất hiện ở Quảng Nam trong đó phát hiện hai
ca dƣơng tính với khuẩn C.diphtheriae. Năm 2016 dịch xảy ra ở Bình Phƣớc 5
ca đƣợc xác định, 1 ca tiếp xúc dƣơng tính với khuẩn C.diphtheriae.
Hình 2.4: Tình hình bệnh bạch hầu ở Việt Nam từ năm 2005-2015
2.1.5 Biện pháp phòng bệnh
Đối với ngƣời nhiễm bệnh:
Bệnh xảy ra chủ yếu của trẻ nhỏ. Lứa tuổi càng tăng sự nhạy cảm với
bệnh càng giảm. Bệnh có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi nếu thiếu miễn dịch bạch
hầu [3]. Nguy hiểm nhất là bệnh đe dọa các trẻ em nhỏ tuổi (từ 1 đến - 4
tuổi). Nhất thiết phải cách ly ở bệnh viện, ở cách li riêng biệt, khi xác định
chuẩn đoán bằng xét nghiệm, nhân viên phải đeo khẩu trang, trang bị bảo hộ
an toàn. Nếu điều trị sớm và đúng cách thì tỉ lệ tử vong rất thấp. Phải dùng
0
10
20
30
40
Số ca BH
Số ca
chết

18. 9
huyết thanh chống bạch hầu ngay từ ngày đầu tiên của bệnh (trƣớc ngày thứ
6).
Những ngƣời mang vi khuẩn không sinh độc tố có thể trở lại tập thể
và sinh hoạt nhƣ bình thƣờng. Bắt buộc phải khử trùng trong thời kì phát
bệnh và thời kì khỏi bệnh, năng rửa cổ họng cho ngƣời bệnh. Trƣớc đây,
ngƣời ta dùng nhiều loại thuốc (huyết thanh khô giải độc tố, trypallavis,
sulfamide) nhƣng không mang lại kết quả tốt, trẻ em vẫn mang vi khuẩn
hàng tháng. Hiện nay ngƣời ta dùng penicillin hoặc tyrotricin cho kết quả tốt
hơn. Chất tyrotrixin không tan trong nƣớc, cho nên thƣờng dùng với nƣớc,
trong glycerine hoặc trộn tyrotrixin bột với natri bitmutbazic [6]. Phải khử
trùng buồng và đồ vật bằng cloramin 0.5% trong 1 giờ, khử trùng bát đũa
bằng cloramin 1% và đồ vải bằng cloramin 5% trong một giờ rƣỡi.( Ramon,
1944).
Đối với ngƣời tiếp xúc với ca bị nhiễm bệnh:
Tất cả những ngƣời tiếp xúc với ngƣời bệnh đều phải xét nghiệm 2
lần cách nhau 2 ngày, lấy bệnh phẩm trƣớc khi dùng thuốc súc miệng. Nếu
xét nghiệm có kết quả dƣơng tính (có trực khuẩn bạch hầu sinh độc tố) thì
phải theo dõi ít nhất là 7 ngày kể từ khi đƣa ngƣời vào bệnh viện [6].
Tiêm ngừa phòng bệnh
Phải tiêm chủng đúng độ tuổi quy định và tiêm mũi nhắc lại cho trẻ
em. Ngày nay ngƣời ta tiêm giải độc tố bạch hầu hoặc vắc xin phối hợp bạch
hầu – ho gà hoặc vắc xin phối hợp bạch hầu – uốn ván – thƣơng hàn, hay là
vắc xin phối hợp bạch hầu – uốn ván – ho gà. Trong chƣơng trình tiêm chủng
mở rộng, chúng ta sử dụng vắc xin tam liên DPT có kết quả rất tốt, đến năm
2000 tỷ lệ mắc chỉ còn 0.14/100000 dân.

19. 10
2.2 Corynebacterium Diphtheriae
Phân loại khoa học
Giới (regnum) Bacteria
Ngành (phylum) Actinobacteria
Bộ (ordo) Actinomycetales
Họ (familia) Corynebacteriaceae
Chi (genus) Corynebacterium
Loài (species) C. diphtheriae
2.2.1Hình thái và cấu trúc
C.diphtheriae là trực khuẩn Gram dƣơng, đƣờng kính từ 0.3 -0.8µm, dài từ
1-8µm, mảnh , cong hoặc hình chùy, không di động, không sinh bào tử, không
có vỏ, không có nha bào.
Hình 2.5: Mô phỏng vi khuẩn Gram dƣơng C.diphtheriae khi dùng kĩ thuật nhuộm
Xanh methylene. (Nguồn: public health image library-PHLI)
Nhuộm Gram C.diphtheriae có hình trực khuẩn bắt màu Gram dƣơng, hình
hơi cong, có một đầu nhỏ xếp thành hình chữ V, T, Y hay nhƣ hình hàng rào.
Khi nhuộm Albert vi khuẩn có hình dài, thân bắt màu xanh nhạt, có 2-3 hạt màu
đỏ tím, 2 đầu to hơn bắt màu xanh đậm.

20. 11
Hình 2.6: Hình dạng vi khuẩn khi dùng kĩ thuật nhuộm Albert
(Nguồn: public health image library-PHLI)
2.2.2Tính chất nuôi cấy
Trực khuẩn Bạch hầu ƣa các môi trƣờng có máu, huyết thanh đông và
pepton, thích hợp với pH trung tính hoặc hơi kiềm, nhiệt độ môi trƣờng là 370
C vì
vậy các môi trƣờng nuôi cấy và phân lập phải có đủ các điều kiện trên. Trên môi
trƣờng thạch máu thƣờng, khuẩn lạc mọc sau sau 24h, nhỏ, màu trắng, có thể quan
sát đƣợc tan huyết. Môi trƣờng chọn lọc cho C.diphtheriae là môi trƣờng thạch
máu có tellurite ở 35-370
C/24-48 giờ. Khuẩn lạc nhỏ li ti, bắt màu xám đen.
C.diphtheriae mọc sau 12-18 giờ trên môi trƣờng huyết thanh đông Loffle, ở điều
kiện 370
C (một số vi khuẩn khác mọc chậm hơn). Khuẩn lạc nhỏ, trơn, hơi đục,
đƣờng kính 1-2 mm, dễ tan trong nƣớc muối đẳng trƣơng
Hình 2.7: Hình dạng khuẩn lạc trên môi trƣờng BA (bên phải), hình dạng khuẩn lạc
trên môi trƣờng HA (bên trái). (Nguồn: public health image library-PHLI)

21. 12
2.2.3Đặc điểm sinh hóa
Cần phân biệt bạch hầu với giả bạch hầu, dựa vào sự lên men hai loại
đƣờng glucose và sacarose, khả năng làm tan hồng cầu cừu [5].
Bảng 2.1: Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn bạch hầu và giả bạch hầu
Chủng vi khuẩn Glucose Sacarose Tan hồng cầu cừu
C.diptheriae
C.hoffmanni
C.cutis
+
+
-
-
+
-
+hoặc-
-
-
Bảng 2.2: Khả năng tan huyết của các biotype
C.diphtheriae Tan máu tế bào
hồng cầu bò
Tan máu tế bào
hồng cầu thỏ
Tính chất lên men
đƣờng
Gravis
Intermedius
Mitis
-
-
+
+
-
+
+
-
-
2.2.4 Độc tố vi khuẩn
C.diphtheriae chủ yếu sinh ngoại độc tố, gồm có 2 phần: A là độc tố,
B là phần gắn vào các thụ cảm trên tế bào. Sau khi B bám vào tế bào, quá
trình phân giải protein xẩy ra giúp cho phần A xâm nhập vào tế bào, tại đó
ức chế quá trình tổng hợp chuỗi acid amin của protein.
Độc tố bạch hầu ức chế sự tổng hợp protein ở tất cả các tế bào có
nhân điển hình bằng việc gắn ADP vào yếu tố kéo dài 2 (EF-2) làm cho các
ribosom sẽ dịch xuống bộ ba tiếp theo để đọc mã trên RNA thông tin.
Độc tố này đƣợc mã hóa bởi phage ly giải, phage này tích hợp vào
trong DNA của vi khuẩn. Độc tố là một protein [6].
Các chủng vi khuẩn đều sinh độc tố (ngoại độc tố), có trọng lƣợng
phân tử 62kDa. Việc sản sinh độc tố phụ thuộc vào sự có mặt của thực khuẩn
thể gây ly giải mang gen mã hóa độc tố (tox +). Nó tác động lên tế bào vật
chủ giải phóng gen độc tố và sản sinh độc tố. Sự sản sinh độc tố tăng khi cơ
thể vật chủ thiếu yếu tố sắt.

22. 13
Chủng vi khuẩn không có thể thực khuẩn sẽ không sản sinh độc tố do
vậy không có khả năng gây bệnh. Chúng có thể trở thành chủng có độc tố khi
bị nhiễm trùng với thể thực khuẩn có độc tố ly giải.
Xác định độc tố vi khuẩn bằng cách tiêm truyền chuột lang, làm phản
ứng trung hòa hoặc làm phản ứng Elek [5]. Thử nghiệm này dựa trên sự
khuếch tán kép của độc tố bạch hầu và kháng độc tố trong môi trƣờng thạch.
Giấy lọc vô trùng ngâm tẩm chất kháng độc tố bạch hầu đƣợc đặc trong môi
trƣờng nuôi cấy. Cấy các chủng nghi bạch hầu theo đƣờng thẳng vuông góc
90 ° với dải kháng độc. Toxigenic C.diphtheriae đƣợc phát hiện bởi vì độc tố
tiết ra từ khu vực tăng trƣởng, phản ứng với chất chống độc để tạo thành các
dòng precipitin
Hình 2.8: Thử nghiệm Elek
Vi khuẩn nhạy cảm với penicillin nhƣng độc tố gây ra các triệu chứng
lâm sàng không bị bất hoặt bởi kháng sinh. Điều trị và phòng bệnh đều phụ
thuộc vào việc trung hòa độc tố. Nếu trên lâm sàng có triệu chứng của bạch
hầu, cần dùng kháng độc tố. Bạch hầu là bệnh cấp tính, đòi hỏi xử lý sớm và
nhanh kể trƣớc khi có xét nghiệm [6].

23. 14
2.3 Phương pháp PCR và Realtime PCR trong nghiên cứu phát hiện
bệnh bạch hầu
Phát hiện bệnh bạch hầu phụ thuộc vào việc nuôi cấy C.diphtheriae
và thực hiện thử nghiệm Elek để xác định độc tính là chủ yếu. Tuy nhiên, do
quá trình bảo quản và vận chuyển số lƣợng vi khuẩn còn sống không phải lúc
nào cũng có trong mẫu bệnh phẩm hoặc thƣờng nằm dƣới mức giới hạn phát
hiện. Do đó các xét nghiệm PCR tiêu chuẩn phát hiện ra gen độc tố bạch hầu
đang là phƣơng pháp phổ biến nhất trong việc chẩn đoán phân tử bệnh bạch
hầu [8]. PCR chuẩn phát hiện đƣợc C.diphtheriae dù tỉ lệ còn sống của vi
khuẩn trong bệnh phẩm sau quá trình vận chuyển là rất ít. Các nghiên cứu
trƣớc đó không đánh giá độ nhạy của PCR, một thời gian sau đó họ mới bắt
đầu đánh giá độ nhạy của phƣơng pháp này sau khi vận chuyển và lƣu trữ
các mẫu lâm sàng trong silica gel một thời gian dài (7-14 tháng). Ở Indonesia
một nghiên cứu cho thấy rằng khi bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm
trong túi silica gel, 11 trong số 17 bệnh nhân đƣợc chẩn đoán lâm sàng đã
đƣợc chẩn đoán bằng bạch hầu cổ họng dƣơng tính với C.diphtheriae sau khi
chúng đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 2 tuần [10]. Tỉ lệ tử vong do
nhiễm trùng gây ra chủ yếu là do độc tố bạch hầu, vì vậy ngƣời dùng cặp mồi
DT1 Fw 5’- CGGGGATGGTGCTTCGCG-3’, DT2 Rev 5’-
CGCGATTGGAAGCGGGGT-3’ trong phản ứng PCR để phát hiện gen độc
tố. Nhƣng độc tố bạch hầu ở C.ulcerans và C.diphtheriae giống nhau đến
95% ở nucleotide và acid amin nên PCR chuẩn phải lặp lại đến 2 lần để phân
biệt đƣợc 2 chủng vi khuẩn này [14].
So sánh giới hạn phát hiện giữa Realtime PCR và các xét nghiệm
PCR thƣờng, các thử nghiệm Realtime PCR phát hiện đƣợc các nồng độ
DNA thấp hơn so với các xét nghiệm PCR tiêu chuẩn. Với sự xuất hiện của
công nghệ khuếch đại gen dò huỳnh quang mới, phƣơng pháp này đã có thể
cải thiện đáng kể hơn phƣơng pháp PCR chuẩn. Mƣời lăm DNA chiết xuất từ
các mẫu bệnh phẩm đƣợc thu thập từ năm 1997 đến năm 1998, đƣợc lƣu trữ

24. 15
ở -70 ° C kể từ thời điểm thu thập ban đầu (24 đến 36 tháng), đƣợc xác định
là dƣơng tính theo PCR chuẩn (bốn là dƣơng tính yếu) Một hoặc cả hai tiểu
đơn vị tox khi đƣợc kiểm tra tại thời điểm thu mẫu. Hai năm sau, trong
nghiên cứu này, PCR chuẩn đƣợc lặp lại trên 15 chiết xuất này, và gen độc tố
đƣợc phát hiện chỉ trong hai mẫu. Khi phân tích bằng Realtime PCR, 13
trong số 15 mẫu dƣơng tính đối với một hoặc cả hai tiểu đơn vị của gen độc
tố [8].
Trong phƣơng pháp pha loãng Realtime PCR phát hiện thấy gen độc
tố chỉ với 2 CFU nhạy hơn rất nhiều so với 1.500 CFU đƣợc phát hiện bởi
PCR chuẩn. Bằng cách này, Realtime PCR có độ nhạy cảm gấp 10 lần so với
các kết quả PCR truyền thống đƣợc báo cáo trong nghiên cứu của Nakao và
Popovic [8]. Real time PCR cho phép xác định độc tính trong mẫu bệnh
phẩm khi PCR tiêu chuẩn tỏ ra không thích hợp. Realtime PCR có độ nhạy
cao hơn, cụ thể, nhanh chóng và làm giảm nhu cầu sử dụng PCR. Các nghiên
cứu trƣơc chỉ ra rằng, mặc dù nhiều mẫu lâm sàng chỉ chứa một lƣợng nhỏ
DNA nhƣng Realtime PCR có thể phát hiện đƣợc độc tố khi có tới hai đến ba
bản sao của gen mục tiêu. Tuy nhiên, một lợi thế lớn của phƣơng pháp này là
loại bỏ đƣợc bƣớc điện di, chụp hình kết quả điện di và dễ dàng đọc đƣợc kết
quả sau khi phản ứng kết thúc. Realtime PCR là sự cải tiến đáng kể so với
các xét nghiệm PCR chuẩn hiện có để phát hiện độc tố. Do đó có thể cung
cấp những kiên thức dịch tễ học quan trọng để phát hiện nhanh chóng các
trƣờng hợp nhiễm bệnh trong nƣớc và nhập cƣ cũng nhƣ kiểm soát đƣợc tình
hình cấp bách của bệnh bạch hầu trên toàn thế giới [8].

25. 16
CHƢƠNG 3: PHƢƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.1 Vật liệu nghiên cứu
3.1.1Dụng cụ cần thiết
- Kính hiển vi điện tử
- Máy ly tâm
- Máy PCR
- Máy điện di
- Tủ chụp UV sản phẩm điện di
- Máy RT-PCR
- Tủ âm 80o
C, âm 20o
C
- Tủ mát
- Tủ an toàn sinh học
- Bình ủ CO2, tủ ấm 37o
C
- Pipet vi lƣợng các loại
- Đĩa petri đƣờng kính 90mm
3.1.2 Môi trường, sinh hóa phẩm
- Bộ nhuộm Gram
- Thuốc nhuộm Albert’A
Toludine blue 0.15gr
Malachite green 0.20gr
Glacial acetic acid 1ml
Alcohol (95% ethanol) 2ml

26. 17
- Thuốc nhuộm Albert’B
Iodine 2gr
Potassium iodide (KI) 3gr
Môi trƣờng phân lập:
Môi trƣờng Tellurite
Canh thang não tim-BHI 200ml
Máu cừu đã loại bỏ tơ huyết 20ml
Dung dịch Kali tellurite 4% 1.5ml
- QIAamp DNA mini Kit
- H2O
- TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1nM)
- Tris-Borate-EDTA buffer, BioReagent
- Ethidium Bromide
- Gel loading buffer bromophenol
- Ladder 100bp
- Nƣớc cất pha tiêm
- Mutanolysin từ S.globisporus ATCC
- Lyzosyme
- QIAGEN proteinase K (10mL)
Bảng 3.1: Các cặp mồi và đầu dò đƣợc dùng để thực hiện phản ứng PCR [7][11]
Tên Trình tự nucleotide (từ 5’-3’) Kích thƣớc sản
phẩm
Mồi DT1 CGGGGATGGTGCTTCGCG 910bp
Mồi DT2 CGCGATTGGAAGCGGGGT
Mồi Tox1 ATCCACTTTTAGTGCGAGAACCTTCGTA 248bp
Mồi Tox2 GAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAA

27. 18
Bảng 3.2: Các cặp mồi và đầu dò đƣợc dùng để thực hiện phản ứng Realtime PCR
[9]
Tên Trình tự nucleotide (từ 5’-3’) Kích thƣớc sản phẩm
Mồi ToxA-R CTTGCTCCATCAACGGTTCA
117bp
Mồi ToxA-F GGCGTGGTCAAAGTGACGTA
Đầu dò ToxA-Prb FAM-CCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACT-
TAMRA
3.1.3 Đối tượng nghiên cứu
- Chủng chứng dƣơng C.diphtheriae phân lập tại Việt Nam
- Chủng vi khuẩn xác định độ đặc hiệu.
- Mẫu: 40 mẫu ngoáy họng từ các ca có triệu chứng lâm sàng bạch hầu, mẫu ngoáy
họng các ca tiếp xúc gần với ca nhiễm bệnh từ đợt dịch Bình Phƣớc năm 2016
Bảng 3.3: Các chủng vi khuẩn trong thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu.
Số TT Tên chủng Nguồn
1 Haemophilus influenzae ATCC 49247
2 Staphylococcus aureus ATCC 25923
3 Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
4 Neisseria meningitidis ATCC 35561
5 Neisseria gonorrhoeae ATCC 31426
6 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
7 Escherichia coli ATCC 25922
8 Bacillus Subtilis ATCC 11774
9 Haemophilus paraphrophilus ATCC 49917
10 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228
11 Bacillus paralicheniformis ATCC12759
12 Enterobacter cloacae Viện Pasteur TP.HCM
13 Neisseria lactamica ATCC 49142
14 Neisseria meningitidis Viện Pasteur TP.HCM

28. 19
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Tách DNA từ mẫu
Sơ đồ tách chiếc DNA theo bộ QIAamp DNA Mini Kit của hãng
QIAGEN của Đức
Các bƣớc tách chiếc thực hiện theo hƣớng dẫn của WHO
3.2.2 Khảo sát độ nhạy (ngưỡng phát hiện dưới) phản ứng PCR
Cấy khuẩn C.diphtheriae trên đĩa môi trƣờng BA sau 24h lấy khuẩn
lạc tăng sinh trong 2mL BHI broth, sau đó hút 1ml dịch tăng sinh ly tâm
10000 vòng /5 phút thu cặn, tiến hành tách DNA theo quy trình ở mục 3.2.1.
1ml dịch tăng sinh còn lại tiến hành pha loãng từ nồng độ 10-1
-10-8
CFU/mL.
Chọn hai nồng độ là 10-6
và 10-7
hút 100µL dung dịch cấy trải trên đĩa môi
trƣờng BA mỗi nồng độ lặp lại trên 2 đĩa, 24h sau đếm số khuẩn lạc thu đƣợc
trên mỗi đĩa.
Dựa vào nồng độ mồi đƣợc đƣa ra trên các bài báo khoa học trƣớc đây
để tìm ra ngƣỡng phát hiện của phản ứng PCR mới thiết lập, quy trình đƣợc
kiểm tra trên một dải nồng độ chứng dƣơng vi khuẩn C.diphtheriae nồng độ
từ 10-1
-10-8
CFU/mL thực hiện lặp lại 2 lần cho mỗi nghiệm thức với 2 cặp
mồi DT1, DT2 và Tox1, Tox2.
Ly tâm 14000
rpm/3p. Bỏ
dịch nổi, ly
tâm 14000
rpm/1p
Dung
dịch
DNA
Ly tâm
8000
rpm/60s
Ly tâm
8000
rpm/60s
Dung
giải.thêm
200µl buffer
AE, ủ 5p,25
độ C
Rửa.thêm
500µl
buffer
AW2
Rửa.thêm
500µl
buffer
AW1
Ly tâm
8000
rpm/60s
100µ buffer Lysis+
20µl protein K +
200µL buffer AL +
260µl Ethanol 99%

29. 20
Bảng 3.4: Thành phần phản ứng cho cặp mồi DT1, DT2
Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích hút
Master Mix 2X 1X 12.5µL
Mồi DT1 10µM 0.4µM 1µL
Mồi DT2 10µM 0.4µM 1µL
DNA khuôn mẫu 2µL
Nƣớc Hút vô cho đủ 25µL
Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cho cặp mồi Tox1, Tox2
Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích hút
Master Mix 2X 1X 12.5µL
Mồi Tox1 10µM 0.8µM 2µL
Mồi Tox2 10µM 0.8µM 2µL
MgCl2 1µL
DNA khuôn mẫu 2µL
Nƣớc Thêm cho đủ 25µL
Kĩ thuật PCR khuếch đại các phân đoạn gene của C.diphtheriae đƣợc thực hiện
theo trình trình sau:
- Lau tủ an toàn sinh học bằng cồn 70%, bật UV trong 30 phút
- Chuẩn bị các dụng cụ, hóa chất cần thiết và tiến hành pha trộn hỗn hợp phản
ứng theo thành phần định sẵn theo bảng trên, ngoại trừ DNA.
- Chia đều các hỗn hợp phản ứng cho các tube .
- Chuyển sang các tube phản ứng sang phòng mix DNA và thêm DNA của
từng chủng vào các tube đã đƣợc chú thích trƣớc.
- Spin down các tube.
- Đặt các tube phản ứng vào máy PCR đã cài đặt chu trình nhiệt thích hợp và
tiến hành phản ứng khuếch đại gene

30. 21
Bảng 3.6: Chu trình nhiệt cho cặp mồi DT1, DT2
Chu trình nhiệt
1X 940
C trong 2 phút
30X 940
C trong 20 giây
620
C trong 30 giây
720
C trong 30 giây
2X 720
C trong 5 phút
100
C đến ∞
Bảng 3.7: Chu trình nhiệt cho cặp mồi Tox1, Tox2
Chu trình nhiệt
1X 950
C trong 2 phút
35X 950
C trong 30 giây
550
C trong 30 giây
720
C trong 1 phút
2X 720
C trong 10 phút
100
C đến ∞
3.2.3 Khảo sát nồng độ của mồi trong phản ứng Real time PCR
Mục đích là để tìm ra nồng độ thích hợp của cặp mồi ToxA-R, ToxA-F nhằm
tiết kiệm đƣợc sinh phẩm mà vẫn cho ra đƣợc kết quả tốt nhất. Nghiệm thức đƣợc
thực hiện trên 1 dải nồng độ mồi: 0.8µM, 0.6µM, 0.4µM, 0.2µM, 0.1µM, lặp lại 3
lần cho mỗi nồng độ mồi.
Theo nghiên cứu của Elizabeth A. Mothershed và cộng sự, nghiên cứu năm
2002 báo cáo rằng những tín hiệu huỳnh quang có giá trị Ct dƣới 35 thì cho kết quả
dƣơng tính

31. 22
Bảng 3.8: Chu trính nhiệt của phản ứng Realtime PCR
Sau khi kết thúc giai đoạn 600
C trong 1 phút, tiến hành đọc kết quả.
Bảng 3.9: Thành phần phản ứng của phản ứng Realtime PCR
Thành phần phản
ứng
Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích hút
Master Mix 2X 1X 12.5µL
Mồi ToxA-R 10µM 1.2µM 3µL
Mồi ToxA-F 10µM 1.2µM 3µL
Rox 0.2µl/100µL super mix
Probe 1.25µM 0.1µM 2µL
DNA khuôn mẫu 2µL
Nƣớc Thêm cho đủ 25µL
3.2.4 Khảo sát nồng độ của mẫu dò trong phản ứng Realtime PCR
Sử dụng nồng độ mồi đã chọn ở thí nghiệm 3.2.4, khảo sát qua các nồng độ
mẫu dò 0.2 µM, 0.1µM, 0.05µM, lặp lại 2 lần cho mỗi nồng độ.
3.2.5 Khảo sát độ nhạy ( ngưỡng phát hiện dưới) của phản ứng Realtime PCR
Tiến hành cấy vi khuẩn C.diphtheriae trên mồi trƣờng BA sau đó thực hiên
tách chiết và cấy đếm tƣơng tự ở mục 3.2.2
Chu trình nhiệt
1X 500
C trong 2 phút
1X 950
C trong 10 phút
45X 950
C trong 15 giây
600
C trong 1 phút

32. 23
Sau khi tìm ra đƣợc nồng độ mồi thích hợp tiến hành thực hiện thí nghiệm
khảo sát độ nhạy của mồi trên dải nồng độ DNA là 10-1
- 10 -7
, thí nghiệm đƣợc thực
hiện với nồng độ mồi 1.2µM
3.2.6 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng PCR và Realtime PCR
Độ đặc hiệu của quy trình PCR mới đƣợc thiết lập sẽ đƣợc kiểm tra bằng các
chủng vi khuẩn đƣợc liệt kê ở bảng 3.3 với nồng độ mồi 1.2 µM và nồng độ mẫu
dò là 0.1µM
Tiến hành áp dụng quy trình PCR, Realtime PCR chạy trên 40 mẫu ngoáy
họng có các triệu chứng lâm sàn và các mẫu ngoáy họng tiếp xúc với ca nhiễm
bệnh:
Quy trình PCR (mồi DT1, DT2): nồng độ mồi 0.4µM. Tiến hành điện di sản
phẩm PCR trong 35 phút, điện thế 100V
Quy trình PCR (mồi Tox1, Tox2): nồng độ mồi 0.8µM, bổ sung 1µL MgCl2.
Tiến hành điện đi sản phẩm PCR trong 30 phút, điện thế 100V
Quy trình Realtime PCR (mồi ToxA-R, ToxA-F): nồng độ mồi 1.2µM, nồng
độ mẫu dò 0.1µM

33. 24
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ
4.1 Khảo sát độ nhạy (ngưỡng phát hiện dưới) của phản ứng PCR:
.
Hình 4.1: Kết quả điện di độ nhạy của mồi trong phản ứng PCR
sử dụng cặp mồi DT1, DT2.
Theo hình 4.1: Trong thí nghiệm này sử dụng cặp mồi DT1, DT2 để
khảo sát độ nhạy của phản ứng trên dải nồng độ DNA từ 10-1
-10-9
. Nồng độ
0.4µM mồi phát hiện gen độc tố trong khoảng nồng độ DNA từ 10-4
, nghiã là
với 2180CFU quy trình PCR có thể phát hiện đƣợc vi khuẩn C.diphtheriae.
Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR, quy trình sử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 không bổ
sung MgCl2
Theo hình 4.2: Thí nghiệm sử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 có bổ sung thêm
MgCl2 để khảo sát độ nhạy phản ứng trên dải nồng độ DNA từ 10-1
-10-7
, Ở nồng
độ 0.8µM, mồi bắt đƣợc gen độc tố gây bệnh ở ngƣỡng 10-4
. Nghĩa là với
2180CFU thì quy tình PCR có thể phát hiện vi khuẩn gây bệnh. Kết quả trên gel
điện di cho thấy trong thành phần phản ứng có bổ sung MgCl2 (hình 4.3) cho kết
quả rõ hơn, hình chụp sáng màu hơn so với khi không bổ sung MgCl2 (hình 4.2)
Lad 10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-9
_
Lad + 10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
-

34. 25
Hình 4.3:Kết quả điện di độ nhạy của mồi trong phản ứng PCR xử dụng cặp mồi Tox1,
Tox2 có bổ sung MgCl2
4.2 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng PCR:
Hình 4.4 Hình 4.5 Hình 4.6
Hình 4.4, 4.5, 4.6: Kết quả điện di trên gel, thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu cuả mồi DT1,
DT2 trong phản ứng PCR. Lad= thang đo kích thƣớc phân tử; (+) = đối chứng dƣơng; 1=
Haemophilus influenza, 2= Staphylococcus aureus; 3= Streptococcus pneumonia; 4= Neisseria
meningitides; 5= Neisseria gonorrhoeae;6= Pseudomonas aeruginosa; 7= Escherichia coli; 8=
Bacillus Subtilis; 9= Haemophilus paraphrophilus; 10= Staphylococcus epidermidis; 11=
Bacillusparalicheniformis; 12= Enterobacter cloacae; 13= Neisseria lactamica; 14= Neisseria
meningitidis
Theo hình 4.4, 4.5, 4.6: Thí nghiệm sử dụng cặp mồi DT1, DT2 và các
chủng vi khuẩn khác để khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng. Kết quả cho thấy cặp
mồi chỉ gắn đặc hiệu với gen độc tố vi khuẩn C.diphtheriae.
Lad + 1 2 3 4 5 6 Lad + 7 8 9 10 11 12 Lad + 13 14
Lad + 10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
-

35. 26
Hình 4.7: Kết quả điện di trên gel, thí nghiệm khảo sát độ đặc hiệu của mồi Tox1, Tox2. Lad=
thang đo kích thƣớc phân tử; (+) = đối chứng dƣơng; 1= Haemophilus influenza, 2=
Staphylococcus aureus; 3= Streptococcus pneumonia; 4= Neisseria meningitides; 5= Neisseria
gonorrhoeae;6= Pseudomonas aeruginosa; 7= Escherichia coli; 8= Bacillus Subtilis; 9=
Haemophilus paraphrophilus; 10= Staphylococcus epidermidis; 11= Bacillusparalicheniformis; 12=
Enterobacter cloacae; 13= Neisseria lactamica; 14= Neisseria meningitides; (-)= đối chứng âm.
Theo hình 4.7: Thí nghiệm sử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 có bổ sung MgCl2
và các chủng vi khuẩn để khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng. Kết quả cho thấy cặp
mồi chỉ gắn đặc hiệu với gen độc tố vi khuẩn C.diphtheriae mà không phát hiện
thêm bất kì một chủng vi khuẩn nào khác.
4.3 Khảo sát nồng độ mồi trong phản ứng Realtime PCR
Hình 4.7: Kết quả khảo sát nồng độ mồi
Với các nồng độ mồi khác nhau đƣợc khảo sát, 6 nồng độ mồi sau 3 lần lăp
lại đều cho tín hiệu vƣợt qua tín hiệu nền, kết quả rõ ràng nên chọ nồng độ.
Lad + 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 _
14 -

36. 27
4.4 Khảo sát nồng độ mẫu dò quy trình Realtime PCR
Với ba lần lặp lại ở 3 nồng độ mẫu dò, cả 3 nồng độ đều cho tín hiệu vƣợt
lên cao khỏi tín hiệu nền, nên chọn nồng độ thấp nhất 0.1µM để sử dụng trong phản
ứng Realtime PCR
Hình 4.8: Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò
4.5 Khảo sát độ đặc hiệu quy trình Realtime PCR
Cặp mồi- mẫu dò dùng để kiểm tra độ đặc hiệu cho đối chứng dƣơng
C.diphtheriae vƣợt lên cao khỏi tín hiệu nền, trong khi không phát tín hiệu huỳnh
quang với các ống chứa DNA của các chủng vi khuẩn đối chiếu.
Kết quả này khẳng định độ tin cậy của cặp mồi và mẫu dò này trong phản
ứng Realtime PCR chuẩn đoán C.diphtheriae.
Hình 4.9: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu. (1) đƣờng biểu diễn đối chứng dƣơng.
(2) đƣờng nền, (3) đƣờng biểu diễn những vi khuẩn khác
1
2
3

37. 28
4.6 Khảo sát độ nhạy quy trình Realtime PCR
Thí nghiệm khảo sát độ nhạy trên dãy nồng độ DNA vi khuẩn từ 10-1
-10-9
,
kết quả cho thấy cặp mồi- mẫu dò phát hiện đƣợc vi khuẩn ở ngƣỡng nồng độ 10-5
,
đồng nghĩa chỉ với 124 CFU thì quy trình Realtime PCR phát hiện đƣợc vi khuẩn
C.diphtheriae.
Hình 4.10: Kết quả khảo sát độ nhạy
Hình 4.11: Kết quả chạy Realtime-PCR trên mẫu. (1) đƣờng biểu diễn chứng
dƣơng. (2) mẫu 16-389CD. (3) mẫu 16-393CD.(4) mẫu 16-386CD.(5) đƣờng nền
3
1
2
4
5

38. 29
Bảng 4.1:Kết quả chạy trên 40 mẫu
Tên chủng Nuôi cấy
(+)
PCR1
(mồi DT)(+)
PCR2
( mồi Tox)(+)
Realtime-PCR
(+)
1 16-373CD
2 16-377CD
3 16-378CD X X X X
4 16-379CD
5 16-380CD
6 16-381CD
7 16-382CD
8 16-383CD
9 16-384CD
10 16-385CD
11 16-386CD X X X X
12 16-387CD
13 16-388CD
14 16-389CD X X X X
15 16-390CD
16 16-391CD
17 16-392CD
18 16-393CD X X
19 16-394CD
20 16-395CD
21 16-396CD
22 16-397CD
23 16-398CD X
24 16-399CD
25 16-400CD
26 16-401CD
27 16-402CD
28 16-403CD
29 16-404CD
30 16-405CD
31 16-406CD
32 16-407CD
33 16-408CD
34 16-409CD
35 16-410CD
36 16-411CD
37 16-412CD
38 16-417CD
39 16-418CD X X
40 16-419CD X X

39. 30
Qua bảng thống kê số liệu kết quả 2 quy trình PCR và Realtime PCR ta thấy
đƣợc quy trình PCR1 phát hiện đƣợc 3 mẫu dƣơng tính/ 5 mẫu nuôi cấy dƣơng tính
hiệu xuất quy trình này đạt khoảng 60%. Quy trình PCR2 phát hiện 5 mẫu dƣơng
tính trong đó 2 mẫu 16-393 CD và 16-418CD phát hiện dƣơng tính trong khi kết
quả nuôi cấy âm tính, hiệu xuất quy trình này đạt khoảng 60%. Quy trình Realtime
PCR phát hiện đƣợc 6 mẫu dƣơng tính trong đó có 2 mẫu là 16-393CD và 16-
418CD phát hiện dƣơng tính trong khi kết quả nuôi cấy là âm tính, hiệu suất quy
trình này đạt khoảng 80%.

40. 31
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN
Bài nghiên cứu so sánh ba phƣơng pháp PCR1, PCR2 và Realtime PCR :
PCR1 sử dụng cặp mồi DT1, DT2; PCR2 sử dụng cặp mồi Tox1, Tox 2 và Real
time PCR sử dụng mồi ToxA-R, ToxA-F. Trong phƣơng pháp PCR2 ở thí
nghiệm khảo sát độ nhạy ta thấy đƣợc cặp mồi Tox1, Tox2 cho kết quả rõ ràng
và chính xác hơn khi bổ sung MgCl2. Quy trình PCR1, PCR2 đƣợc thiết lập để
có độ đặc hiệu tối ƣu và độ nhạy phát hiện gen độc tố ở nồng độ DNA 10-4
nghĩa là với 2180CFU quy trình phát hiện đƣợc vi khuẩn gây bệnh. Quy trình
Real time PCR đƣợc khảo sát cho độ đặc hiệu cao ở nồng độ mồi 0.4µM, nồng
độ mẫu dò 0.1µM quy trình phát hiện gen độc tố ở nồng độ DNA 10-5
. Nghĩa là
chỉ với 124CFU thì quy trình phát hiện đƣợc vi khuẩn gây bệnh.
Realtime PCR có độ nhạy cao, cho kết quả cụ thể và nhanh chóng và làm
giảm nhu cầu sử dụng PCR. Mặc dù nhiều mẫu lâm sàng chỉ chứa một lƣợng nhỏ
DNA, Realtime PCR có thể phát hiện ra độc tố khi có tới hai đến ba bản sao của
gen mục tiêu. Tuy nhiên, một lợi thế lớn của phƣơng pháp này là có thể loại cung
cấp thông tin khi phản ứng vừa kết thúc, điều này rất quan trọng trong trƣờng hợp
xảy ra sự cố. Realtime PCR cung cấp sự cải tiến đáng kể so với các xét nghiệm
PCR chuẩn hiện có để phát hiện độc tố, do đó có thể rất hữu ích trong việc nghiên
cứu, dự đoán và phòng chóng dịch bệnh.
Tuy nhiên bài nghiên cứu chƣa thực hiện khảo sát nồng độ mồi cho hai quy
trình PCR1, PCR2. Cần phải thực hiện thêm thí nghiệm này để hoàn thiện hơn 2
quy trình này. Trong thí nghiệm pha loãng nồng độ, chỉ thực hiện pha loãng bậc 10
nên tiến hành thêm pha loãng bậc 2 để nâng cao độ chính xác cho quy trình.

41. 32
CHƢƠNG 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
[1]Dịch tể học các bệnh truyền nhiễm phổ biến, NXB y học, 2012, trang 209-214
[2]Dịch tể học các bệnh truyền nhiễm phổ biến, NXB y học, 2012, trang212-214
[3]PGS. TS. Lê Văn Phùng. Vi Khuẩn Y Học. Vụ Khoa học và Đào tạo, 2009, trang 126
[4]PGS.TS Lê Văn Phủng. Vi sinh Y học. Vụ khoa học và đào tạo. 2009, trang 130
[5] Xét nghiệm và chuẩn đoán vi khuẩn, NXB y học, 2012, trang105-107
[6]Vi sinh vật gây nhiễm trùng cơ quan (Sách đào tạo Bác sĩ chuyên khoa I dịch tễ học
thực địa), NXB Y học, 2012, trang 12
Tài liệu nƣớc ngoài:
[7] DANIEL HAUSER, MICHEL R. POPOFF, MARTINE KIREDJIAN,
PATRICE BOQUET AND FRANOIS BIMET. Polymerase Chain Reaction Assay
for Diagnosis of Potentially Toxinogenic Corynebacterium diphtheriae Strains:
Correlation with ADP-Ribosylation Activity Assay., Journal of Clinical
Microbiology OCt. 1993, p. 2720-2723
[8] Espy, M. J., et al. "Real-time PCR in clinical microbiology: applications for
routine laboratory testing." Clinical microbiology reviews 19.1 (2006): 165-256.
[9] Hiroshi Nakao, Tanja Popovic . Development of a Direct PCR Assay for
Detection of the Diphtheria Toxin Gene. Journal of Clinical Microbiology. , July
1997, p. 1651–1655. 0095-1137/97/$04.0010
[10]Kobaidze, Ketevan, et al. "Direct polymerase chain reaction for detection of
toxigenic Corynebacterium diphtheriae strains from the Republic of Georgia after
prolonged storage." Journal of Infectious Diseases 181.Supplement_1 (2000):
S152-S155.
[11] Mancini, Fabiola, et al. "Identification and molecular discrimination of toxigenic and
nontoxigenic diphtheria Corynebacterium strains by combined real-time polymerase chain
reaction assays." Diagnostic microbiology and infectious disease 73.2 (2012): 111-120.

42. 33
[12] Young, T. Kue. Population health: concepts and methods. Oxford University Press,
USA, 2005
[13]Sing A, Berger A, Schneider-Brachert W, Holzmann T, Reischl U. Rapid
Detection and Molecular Differentiation of Toxigenic Corynebacterium diphtheriae
and Corynebacterium ulcerans Strains by LightCycler PCR . Journal of Clinical
Microbiology. 2011;49(7):2485-2489. doi:10.1128/JCM.00452-11
[14]Sing A, Hogardt M, Bierschenk S, Heesemann J. Detection of Differences in
the Nucleotide and Amino Acid Sequences of Diphtheria Toxin
from Corynebacterium diphtheriae and Corynebacterium ulcerans Causing
Extrapharyngeal Infections. Journal of Clinical Microbiology. 2003;41(10):4848-
4851. doi:10.1128/JCM.41.10.4848-4851.2003.
Tài liệu từ internet
[15] http://vncdc.gov.vn/vi/danh-muc-benh-truyen-nhiem/1084/benh-bach-hau

43. 34
CHƢƠNG 7: PHỤ LỤC
Kết quả chạy điện di mẫu của phƣơng pháp PCR dùng cặp mồi DT1, DT2
- 382 383 384 385 386 387 + lad 388 389 390 391 392 393 + -
__ -
Lad 373 377 378 379 380 381 + _
- 394 395 396 397 398 399 + lad + 400 401 402 403 404 405 -
Lad 406 407 408 409 410 411 412 + -

44. 35
Kết quả chạy điện di mẫu của phƣơng pháp PCR dùng cặp mồi Tox1, Tox2
lad + 388 389 390 391 392 393 394 395 396 397 398 399
-
- 418 419 + lad

45. 36
Kết quả chạy Realtime PCR trên mẫu:
Hình chạy mẫu 16-373CD, 16-377CD, 16-378CD, 16-379CD, 16-380CD, 16-
381CD
Hình chạy mẫu 16-382CD, 16-383CD, 16-384CD, 16-385CD, 16-386CD, 16-
387CD, 16-388CD, 16-389CD, 16-390CD, 16-391CD, 5616-392CD, 16-393CD,
16-394CD
Lad + 412 417 418 419 -
378
Chứng
dương
Chứng
dương
389
386
393

46. 37
Hình chạy mẫu 16-394CD, 16-395CD, 16-396CD, 16-397CD, 16-398CD, 16-
399CD, 16-400CD, 16-401CD, 16-402CD, 16-403CD, 16-404CD
Hình chạy mẫu 16-405CD, 16-406CD, 16-407CD, 16-408CD, 16-409CD,
16-410CD, 16-418CD, 16-419CD
Chứng
dương
Chứng
dương
418
419