Luận Văn Xây Dựng Phương Pháp Định Lượng Majonoside R2 Trong Chế Phẩm Chứa Sâm Ngọc Linh

HÀ NỘI 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN CHÍNH KHOA
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
MAJONOSIDE R2 TRONGCHẾ PHẨM CHỨA
SÂM NGỌC LINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ
Tham khảo thêm tài liệu tại Luanvanpanda.com
Dịch Vụ Hỗ Trợ Viết Thuê Tiểu Luận,Báo Cáo
Khoá Luận, Luận Văn
ZALO/TELEGRAM HỖ TRỢ 0932.091.562
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN CHÍNH KHOA
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
MAJONOSIDE R2 TRONGCHẾ PHẨM CHỨA
SÂM NGỌC LINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210
Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh

LỜI CẢM ƠN
Để có thể hoàn thành đề tài Luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh, sự hướng dẫn
nhiệt tình của quý thầy cô, sự động viên ủng hộ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp
trong suốt thời gian học tập nghiên cứu luôn là nguồn đồng lực lớn lao và quý báu nhất
đối với tôi.
Đầu tiên, tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất đến
PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, là người trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến toàn thể quý thầy cô trường Đại học
Dược Hà Nội và đặc biệt là quý thầy cô Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, đã tận tình
truyền đạt những kiến thức quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin gởi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo và các anh chị cán bộ Viện Công nghệ
Dược phẩm Quốc gia – Trường Đại học Dược Hà Nội và Trung tâm giám định ma túy
– Viện Khoa học hình sự – Bộ Công an đã không ngừng hỗ trợ về thiết bị và tạo mọi
điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, các bạn và các anh chị đồng nghiệp
đã động viên, hỗ trợ cho tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng trong suốt quá trình thực hiện đề tài, song có thể còn
có những mặt hạn chế, thiếu sót. Tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp và sự chỉ
dẫn của các thầy cô giáo và các anh chị đồng nghiệp.
Hà Nội, ngày 01 tháng 04 năm 2019
Nguyễn Chính Khoa

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................... 3
1.1. Tổng quan về sâm Ngọc Linh................................................................... 3
1.1.1. Đặc điểm của sâm Ngọc Linh ............................................................. 3
1.1.2. Thành phần hóa học ........................................................................... 4
1.1.2.1. Thành phần hóa học của phần dưới mặt đất ................................... 4
1.1.2.2. Thành phần hóa học của phần trên mặt đất .................................... 5
1.1.3. Tác dụng của sâm Ngọc Linh.............................................................. 5
1.2. Tổng quan về Majonoside R2................................................................... 8
1.2.1. Công thức cấu tạo và tính chất............................................................ 8
1.2.2. Tác dụng của Majonoside R2.............................................................. 8
1.2.3. Phương pháp định tính và định lượng Majonoside R2.......................... 9
1.2.3.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng ...................................................... 9
1.2.3.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao .......................................10
1.2.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ...............................................11
1.2.4. Một số chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh lưu hành trên thị trường ..........12
1.3. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng khối phổ .....................................13
1.3.1. Phương pháp sắc ký lỏng...................................................................13
1.3.2. Detector khối phổ cho sắc ký lỏng .....................................................13
1.3.2.1. Nguyên tắc..................................................................................13
1.3.2.2. Các nguồn ion hóa trong sắc ký lỏng khối phổ..............................14
1.3.2.3. Bộ phận phân tích khối lượng ......................................................14
1.3.3. Ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ trong phân tích..............15
1.3.3.1. Ứng dụng trong định tính.............................................................15
1.3.3.2. Ứng dụng trong định lượng..........................................................15

CHƯƠNG 2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................16
2.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu....................................................16
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .....................................................................16
2.1.2. Phương tiện và thiết bị nghiên cứu...................................................17
2.1.3. Hóa chất và dung môi.....................................................................17
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................18
2.2.1. Thu thập mẫu .................................................................................18
2.2.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký...............................................................18
2.2.3. Lựa chọn phương pháp xử lý mẫu ...................................................18
2.2.4. Thẩm định phương pháp .................................................................19
2.2.5. Áp dụng trên một số chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh ........................19
2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu...............................................................19
CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU..................................................... 21
3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký....................................................21
3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn. ..............................................................21
3.1.2. Khảo sát điều kiện khối phổ ............................................................21
3.1.3. Khảo sát cột sắc ký.........................................................................23
3.1.4. Khảo sát thành phần và tỷ lệ pha động.............................................26
3.1.5. Khảo sát thể tích tiêm .....................................................................30
3.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu.................................................................31
3.2.1. Khảo sát dung môi chiết..................................................................32
3.2.2. Khảo sát thời gian chiết...................................................................33
3.2.3. Khảo sát số lần chiết .......................................................................34
3.3. Quy trình phân tích...............................................................................35
3.3.1. Điều kiện sắc ký.............................................................................35
3.3.2. Chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu thử......................................................36
3.3.3. Định tính Majonoside R2................................................................37
3.3.4. Định lượng Majonoside R2.............................................................37
3.4. Thẩm định phương pháp .......................................................................38

3.4.1. Độ phù hợp của hệ thống.................................................................38
3.4.2. Độ đặc hiệu ....................................................................................38
3.4.3. Độ tuyến tính..................................................................................41
3.4.4. Độ chụm ........................................................................................42
3.4.5. Độ đúng.........................................................................................44
3.4.6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) .................47
3.5. Áp dụng phương pháp trên một số mẫu chứa sâm Ngọc Linh .................48
3.5.1. Định tính........................................................................................49
3.5.2. Định lượng.....................................................................................51
CHƯƠNG 4.BÀN LUẬN............................................................................ 52
4.1. Lựa chọn phương pháp phân tích...........................................................52
4.2. Lựa chọn phương pháp xử lý mẫu .........................................................53
4.3. Thẩm định phương pháp .......................................................................54
4.4. Áp dụng phương pháp vào nền mẫu thực tế............................................55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................................... 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu và
chữ viết tắt
Diễn giải tiếng Anh
Dịch nghĩa tiếng
Việt
AOAC
Association of Official
Agricultural Chemists
Hiệp hội các nhà hoá
phân tíchchính thống
APCI
Atmospheric pressure chemical
ionization
Ion hóa hóa học ở áp suất
khí quyển
APPI
Atmospheric pressure
photoionization
Ion hóa quang học ở áp
suất khí quyển
ESI Electrospray ionization Ion hóa phun điện tử
HPLC
High performance liquid
chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng
cao
IUPAC
International Union of Pure and
Applied Chemistry
Liên minh Quốc tế về
Hóa học thuần túy và
Hóa học ứng dụng
LC-MS
Liquid chromatography–mass
spectrometry
Sắc ký lỏng khối phổ
LC-MS/MS
Liquid chromatography–mass
spectrometry/ mass
spectrometry
Sắc ký lỏng khối phổ hai
lần
Rf Retention factor Hệ số lưu giữ
RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối
TNF-α tumor necrosis factor α Yếu tố hoại tử khối u α
TOF Time of flight Thời gian bay
UV-VIS Ultraviolet–visible Tử ngoại- khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Một số chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh ........................................12
Bảng 2.1 Chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh dạng rắn.....................................16
Bảng 2.2 Chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh dạng dầu ....................................16
Bảng 2.3 Danh mục dung môi và hóa chất .................................................17
Bảng 3.1 Các thông số tối ưu của buồng ion hóa ........................................22
Bảng 3.2 Điều kiện phân mảnh của Majonoside R2....................................23
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát dung môi chiết (n =3) .......................................32
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát thời gian chiết (n=3) .........................................33
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát số lần chiết.......................................................35
Bảng 3.6 Chương trình dung môi...............................................................36
Bảng 3.7 Điều kiện khối phổ .....................................................................36
Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ phù hợp hệ thống.........................................38
Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ tuyến tính ....................................................41
Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ chụm mẫu dạng rắn......................................43
Bảng 3.11 Kết quả khảo sát độ chụm mẫu dạng dầu .....................................44
Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ thu hồi mẫu dạng rắn....................................45
Bảng 3.13 Kết quả khảo sát độ thu hồi mẫu dạng dầu...................................46
Bảng 3.14 Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện .............................................47
Bảng 3.15 Kết quả định lượng Majonoside R2 trên một số mẫu....................51

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1 Sâm Ngọc Linh................................................................................. 3
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Majonoside R2............................................... 8
Hình 1.3 Nguyên lý hoạt động của sắc ký lỏng khối phổ ................................ 13
Hình 1.4 Phạm vi áp dụng của các cơ chế ion hóa.......................................... 14
Hình 3.1 Phổ khối lượng của Majonoside R2 chế độ ion hóa dương................ 21
Hình 3.2 Phổ khối lượng của Majonoside R2 chế độ ion hóa âm..................... 22
Hình 3.3 Kết quả khảo sát ion convà năng lượng phân mảnh.......................... 23
Hình 3.4 Kết quả khảo sát cộtInertsustain NH2 ............................................. 25
Hình 3.5 Kết quả khảo sát cột Inertsustain AQ C18........................................ 26
Hình 3.6 Kết quả khảo sát pha động methanol : nước chứa 0,1% acid formic . 27
Hình 3.7 Kết quả khảo sát pha động acetonitril : nước chứa 0,1% acid formic . 28
Hình 3.8 Kết quả khảo sát tỷ lệ pha động....................................................... 30
Hình 3.9 Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu.................................................. 31
Hình 3.10 Kết quả khảo sát dung môi chiết .................................................... 33
Hình 3.11 Kết quả khảo sát thời gian chiết..................................................... 34
Hình 3.12 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu....................................................... 40
Hình 3.13 Kết quả định tính mẫu R1.............................................................. 40
Hình 3.14 Kết quả định tính mẫu N1.............................................................. 41
Hình 3.15 Đường chuẩn Majonoside R2........................................................ 42
Hình 3.16 Kết quả xác định LOD của phương pháp (nồng độ 0,2ng/ml). 48
Hình 3.17 Sắc ký đồ mẫu R2 và N5............................................................... 49
Hình 3.18 Kết quả định tính mẫu R2 và N5.................................................... 50

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là nước có nguồn tài nguyên thực vật đa dạng, cùng với đó là
nguồn dược liệu làm thuốc rất phong phú. Từ hàng ngàn năm trước, các loại
dược liệu đã được sử dụng để phòng, chữa bệnh và có vai trò rất quan trọng
trong việc bảo vệ sức khỏe con người. Sử dụng các loại dược phẩm có nguồn
gốc tự nhiên (đông dược) đang là xu hướng phát triển chủ yếu không chỉ ở Việt
Nam mà còn rất nhiều nước châu Á. Các thành phần tự nhiên trong dược liệu
thân thiện với sức khỏe con người, ít độc hại và ít gây tác dụng không mong
muốn hơn so với thuốc tân dược.
Sâm Ngọc Linh có tên khoa học là Panax Vietnamensis, là một loài cây
thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae). Được tìm thấy lần đầu tiên vào năm 1973 tại
núi Ngọc Linh, huyện Đắc Tô, tỉnh Kon Tum [4]. Sâm Ngọc Linh là loại sâm
đặc biệt quý hiếm, chỉ có tại Việt Nam. Trước đây, người dân sử dụng sâm Ngọc
Linh theo các bài thuốc cổ truyền để chữa rất nhiều bệnh. Sau khi được tìm thấy
và xác nhận danh tính, sâm Ngọc Linh được nghiên cữu kỹ hơn, các nhà khoa
học đã phát hiện ra 52 loại saponin trong củ sâm, có những chất chưa từng được
phát hiện trong các loại sâm khác [18], [19], [20]. Các nghiên cứu về tác dụng
của sâm Ngọc Linh cũng được tiến hành và cho thấy nhiều kết quả khả quan.
Chính vì vậy, hiện nay trên thị trường có rất nhiều các sản phẩm từ sâm Ngọc
Linh như sâm tươi, cao sâm và các chế phẩm khác.
Majonoside R2 là saponin chiếm tỷ lệ cao nhất trong sâm Ngọc Linh [1],
[5], đây cũng là hoạt chất đặc trưng chỉ có ở sâm Ngọc Linh mà không có ở bất
kỳ loại sâm nào đã được phát hiện trước đó. Do đó, việc định tính và định lượng
Majonoside R2 có ý nghĩa rất quan trọng trong việc kiểm soát chất lượng sâm
Ngọc Linh cũng như các chế phẩm liên quan. Trong Dược điển Việt Nam V đã
có chuyên luận về định lượng Majonoside R2 trong dược liệu sâm Ngọc Linh
theo phương pháp HPLC [3]. Ngoài ra, có nhiều nghiên cứu định lượng
Majonoside R2 trong sâm Ngọc Linh [1], [5], [28]. Tuy nhiên, đối với các chế

2
phẩm trên thị trường ngoài thành phần Sâm Ngọc Linh thì còn có nhiều dược
liệu khác nên các phương pháp này rất khó có thể tách và định lượng được
Majonoside R2, mà yêu cầu một phương pháp đặc hiệu hơn.
Để góp phần vào công tác kiểm tra chất lượng các chế phẩm chứa Sâm
Ngọc Linh chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Xây dựng phương pháp định
lượng Majonoside R2 trong chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh bằng phương pháp
sắc ký lỏng khối phổ hai lần” với các mục tiêu sau:
Xây dựng được phương pháp định tính, định lượng Majonoside R2 trong
các chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ.
Áp dụng phương pháp để định tính, định lượng Majonoside R2 trong một
số chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh lưu hành trên thị trường.

3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về sâm Ngọc Linh
1.1.1. Đặc điểm của sâm Ngọc Linh
 Tên khoa học
Sâm Ngọc Linh có tên khoa học là Panax Vietnamensis Ha & Grushv.1985
thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae), bộ Hoa tán (Apiales), lớp Mộc lan
(Magnoliopsida), ngành Mộc lan (Magnoliophyta) [4].
 Đặc điểm thực vật
Hình 1.1 Sâm Ngọc Linh
Cây thảo sống nhiều năm, cao 0,3-110 cm. Thân rễ tạo thành các đốt, nằm
ngang, có thể phân nhánh, đường kính từ 1-2cm. Phần mang lá từ 1-5 thân, tùy
theo số đầu nhánh của thân rễ. Lá kép chân vịt, mọc vòng, ở ngọn, mỗi lá kép
gồm 3-5 lá chét, lá chét hình bầu dục thuôn, nhọn hai đầu, 6-14 x 2,5-4cm, mép
khía răng cưa. Cụm hoa tán đơn hay tán kép (thêm 1-2 tán phụ), mọc ở ngọn,
chiều dài cuống cụm hoa dài hơn cuống lá, nên thường cao vượt tán lá. Hoa có
cuống ngắn, màu trắng xanh, 5 đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị. Bầu 2 ô (nếu thấy 1 ô
là do ô còn lại bị chèn ép khó phân biệt), vòi nhụy chẻ 2 ở đầu. Quả mọng, hình
cầu, đường kính 0,5-0,6cm, khi chín có màu đỏ và thường có chấm đen ở đỉnh.

4
Hạt thường 1 hoặc 2, hạt nhỏ gần tròn hoặc giống hình thận, vỏ hạt không nhẵn
[2].
 Đặc điểm sinh thái
Mùa hoa vào tháng 4-5, quả tháng 6-9. Gieo giống tự nhiên bằng hạt. Phần
thân rễ bị gãy còn lại có thể tái sinh. Cây thường lụi hàng năm vào mùa đông,
đến đầu mùa xuân năm sau từ thân rễ sẽ mọc lên chồi thân mới. Cây đặc điểm
ưa ẩm và ưa bóng, mọc rải rác dưới tán rừng kín thường xanh ẩm, nhất là dọc
theo hành lang ven suối, ở độ cao từ 1900-2300m [2].
 Phân bố
Trong nước: Quảng Nam (Trà My), Kon Tum (Đăk Tô)[2].
Thế giới: Trung Quốc.
1.1.2. Thành phần hóa học
1.1.2.1. Thành phần hóa học của phần dưới mặt đất
 Hợp chất saponin
Hợp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của cây Sâm
Ngọc Linh cũng như của các loài sâm khác trên thế giới. Từ phần dưới mặt đất
của sâm Ngọc Linh hoang dại đã phân lập và xác định được cấu trúc 52 hợp chất
saponin, trong đó có 26 saponin đã biết và 26 saponin có cấu trúc mới
[2],[18],[19],[20]. Tổng hàm lượng saponin trong các bộ phận thân rễ, rễ và rễ
con lần lượt là 19,52%; 15,59% và 13,93%, cao hơn nhiều so với các loại sâm
khác [13].
Các saponin trong sâm Ngọc Linh được chia làm 4 nhóm chính [2]:
 Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol gồm 20 chất, các
chất có hàm lượng lớn là G-Rb1 (2,0%)và G-Rd (0,87%), 2 chất này cũng có
trong các loại sâm khác như Nhân sâm [26].
 Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatrol gồm 17 chất, trong
đó G-Rg1 chiếm tỷ lệ cao nhất (1,37%), chất này cũng có trong thành phần của
Nhân sâm.

5
 Các saponin có cấu trúc ocotillol gồm 11 chất, trong đó có
Majonoside R2 có hàm lượng cao nhất (5,29%) và là hoạt chất hoàn toàn mới,
chưa có ở bất kỳ loài sâm nào khác.
 Các saponin dẫn chất của acid oleanolic gồm 2 chất.
 Hợp chất polyacetylen
Có 7 hợp chất đã được phân lập, 5 hợp chất đã được xác định cấu trúc với
panaxynol và heptadeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol là 2 polyacetylen chủ
yếu. Hai hợp chất mới là 10-acetoxyheptadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol và
heptadeca-1,8(E),10(E)-trien-4,6-diyn-3,10-diol[3,6,7,11,12,33-35] [2].
 Hợp chất Sterol
β – Sitosterol và daucosterin (β–Sitosteryl–3 – o - β – D – glucopyranosid)
[2].
 Hợp chất Glucid
Đường tự do: 6,19%
Đường toàn phần: 26,77% [2].
 Các thành phần khác:
Thành phần acid béo trong rễ củ sâm Ngọc Linh chiếm 0,55%, gồm 17 loại
acid béo khác nhau. Trong rễ củ cũng chứa 18 loại acid amin thiết yếu và 20
nguyên tố đa lượng và vi lượng [2].
1.1.2.2. Thành phần hóa học của phần trên mặt đất
Lá sâm và thân giả chứa ít saponin hơn các bộ phận dưới mặt đất, cả về số
lượng lẫn hàm lượng. Các saponin phân lập được từ lá sâm gồm 19 saponin,
trong đó có 11 chất đã biết và 8 chất mới [2].
1.1.3. Tác dụng của sâm Ngọc Linh
 Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương:
Sâm Ngọc Linh liều thấp có tác dụng kích thích thần kinh, làm tăng hoạt
động và trí nhớ, nhưng liều cao lại ức chế thần kinh [2].

6
 Tác dụng chống trầm cảm:
Sâm Ngọc Linh có tác dụng chống trầm cảm ở liều uống một lần 200mg/kg
hoặc liều 50 – 100 mg/kg dùng luôn 7 ngày ở chuột nhắt trắng, Majonoside R2
tiêm trong màng bụng có tác dụng chống trầm cảm ở cả 3 liều: 3,1; 6,2 và 12,5
mg/kg [2].
 Tác dụng tăng sinh lực:
Sâm Ngọc Linh có tác dụng tăng sinh lực trong thí nghiệm chuột bơi, làm
tăng sinh lực chống lại sự mệt mỏi, giúp phục hồi sức lực [2].
 Tác dụng sinh thích ứng:
Trong stress vật lý, cho chuột nhắt trắng uống sâm Ngọc Linh liều
100mg/kg có tác dụng làm tăng khả năng chịu đựng đối với nước nóng (37–
42oC) và lạnh (-5oC) làm kéo dài thời gian sống thêm của chuột thí nghiệm.
Trong stress cô lập, chuột nhắt trắng được nuôi riêng từng con trong 4 tuần, thời
gian ngủ khi tiêm natri barbital giảm đi 30%. Sâm Ngọc linh liều uống 50 – 100
mg/kg hoặc hoạt chất Majonoside R2 tiêm trong màng bụng liều 3,1; 12,5
mg/kg làm thời gian ngủ trở lại gần bình thường [2].
 Tác dụng chống oxy hóa:
Trên thí nghiệm in vitro dùng dịch nổi của dịch não, gan và phân đoạn vi
thể gan của mô não chuột và phân đoạn vi thể gan của chuột nhắt trắng, saponin
sâm Ngọc Linh ở nông độ 0,05 – 0,5 mg/kg có tác dụng chống oxy hóa, ức chế
sự hình thành malondialdehyde là sản phẩm của quá trình oxy hóa lipid màng
sinh học [2], [23], [34].
 Tác dụng kích thích miễn dịch:
Bột chiết sâm Ngọc Linh liều uống 500mg/kg và Majonoside R2 tiêm trong
màng bụng có tác dụng làm tăng chỉ số thực bào trong thí nghiệm in vitro và in
vivo ở chuột nhắt trắng [2]. Dùng liều Escherichia coli gây chết chuột nhắt
trắng. nếu kết hợp dùng sâm và Majonoside R2 với liều trên sẽ làm tăng tỷ lệ số
chuột sống sót. Có lẽ do thuốc làm tăng tác dụng thực bào với E. coli [2].

7
 Tác dụng phục hồi máu:
Trong thí nghiệm làm giảm hồng cầu và bạch cầu ở động vật thí nghiệm,
sâm Ngọc Linh có tác dụng làm phục hồi số lượng hồng cầu và bạch cầu đã bị
giảm [2].
 Tác dụng khác:
Sâm Ngọc Linh còn có tác dụng tăng cường nội tiết tố sinh dục, điều hòa
hoạt động của tim, chống tăng cholesterol máu, chống viêm, chống đông máu và
ức chế sự phát triển của Streptococcus gây bệnh viêm họng ở người [2], [10],
[14], [15].
Theo Trần Lê Quân và cộng sự, dịch chiết methanol của sâm Ngọc Linh có
tác dụng bảo vệ gan do tác động lên D-galactosamine/yếu tố hoại tử (TNF-α)
[29], [30].

8
1.2. Tổng quan về Majonoside R2
1.2.1. Công thức cấu tạo và tính chất
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Majonoside R2
 Danh pháp IUPAC: (2S,3R,4S,5R)-2-[(2R,3R,4S,5S,6R)-2-[[(5R,6R,8S,
9R,10R,12S,13S,14S,17S)-3,12-dihydroxy-17-[(2S,5S)-5-(2-hydroxypropan-2-
yl)-2-methyloxolan-2-yl]-4,4,8,10,14-pentamethyl-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17
-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-6-yl]oxy]-4,5-dihydroxy-6-
(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane-3,4,5-triol
 Công thức phân tử: C41H70O14
 Khối lượng phân tử: 786,997 đvC
 Độ tan: Majonoside R2 tan được trong methanol, nước, butanol, ethanol.
1.2.2. Tác dụng của Majonoside R2
 Tác dụng chống ung thư
Majonoside R2 thể hiện tác dụng chống ung thư trên chuột bị ung thư gan
sử dụng N-nitrosodiethylamine làm chất gây ung thư [11].
Trong nghiên cứu của Takao Konoshima và cộng sự, Majonoside R2 cho
thấy tác dụng ức chế đối với kháng nguyên Epstein-Barr do khối u sinh ra và 12-
O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (chất được sử dụng để sàng lọc hoạt chất
chống ung thư). Thử nghiệm được tiến hành trên chuột bị gây ung thư da bởi
7,12-dimethylbenz[a]anthracene [12]. Kết quả này cũng được Kazuo Yamazaki
đưa ra trong nghiên cứu của mình vào năm 2000 [33].

9
 Tác dụng chống oxy hóa
Majonoside R2 có tác dụng điều chỉnh nồng độ nito oxyd và glutathion
trong máu, đồng thời làm tăng nồng độ gama – aminobutyric acid từ đó bảo vệ
lớp màng lipid ở não trước tác động của các chất oxy hóa [8], [22].
Một nghiên cứu khác của Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự cũng cho
thấy Majonoside R2 có tác dụng chống oxy hóa tương tự vitamin E [21].
 Tác dụng bảo vệ gan
Majonoside R2 có tác dụng bảo vệ gan khỏi quá trình apoptosis thông qua
ức chế sản xuất yếu tố hoại tử khối u alpha (TNF-α) bằng các đại thực bào hoạt
hóa và ức chế trực tiếp tác dụng apoptosis gây ra bởi TNF-α [29].
 Tác dụng khác
Một số nghiên cứu chỉ ra rằng Majonoside R2 có tác dụng chống trầm cảm
[23], chống viêm [27] và giảm phản ứng khó chịu gây ra bởi opioid [24].
1.2.3. Phương pháp định tính và định lượng Majonoside R2
1.2.3.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Tác giả Hoàng Hải Anh và cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc ký lớp
mỏng để định tính 6 saponin chính của sâm Ngọc Linh trong đó có Majonoside
R2. Dịch chiết methanol của rễ củ sâm được phân tích trên bản mỏng silicagel
GF254 được hoạt hóa. Hệ dung môi khai triển là hỗn hợp cloroform-methanol-
nước với tỷ lệ lần lượt là 65-35-10. Bản mỏng sau khi khai triển được phun
thuốc thử hiện màu là dung dịch acid sulfuric 20% trong ethanol 50% và sấy ở
105oC đến khi hiện màu. Mẫu thử được phân tích cùng mẫu chuẩn, kết quả sắc
ký đồ của dịch chiết sâm Ngọc Linh xuất hiện vết Majonoside R2 với Rf = 0,48
[1].
Lian-Wen Qi và cộng sự của mình cũng định tính và định lượng một số
saponin trong sâm Ngọc Linh như Ginsenoside Rh5, Vina-ginsenoside R25 và
đưa đến kết luận phương pháp sắc ký lớp mỏng rất hữu dụng cho việc định

10
lượng saponin trong sâm. Tuy nhiên, nhược điểm chính của phương pháp là độ
chính xác thấp và độ lặp lại kém [25].
1.2.3.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Shu Zhu và cộng sự công bố nghiên cứu năm 2004, tiến hành định lương
Majonoside R2 cùng nhiều saponin khác bằng phương pháp HPLC. Sử dụng cột
C18 (5µm; 250 x4,6mm) với pha động là dung dịch đệm phosphat 10mM pH
5,8 (A), acetonitril (B) và nước (C). Chương trình gradient dài 85 phút. Detector
quang phổ tử ngoại ở bước sóng 196nm. Mẫu bột rễ củ sâm được chiết với cồn
70o. Dung dịch chuẩn được pha với nồng độ 1mg/ml. Kết quả hàm lượng
Majonoside R2 trong sâm Ngọc Linh là 5,78% ±0,054% tính theo dược liệu khô
kiệt. Phương pháp có độ thu hồi 97,5% và giới hạn phát hiện là 3µg/ml [28].
Năm 2011, Hoàng Hải Anh và cộng sự tiến hành định lượng Majonoside
R2 bằng phương pháp HPLC. Bột dược liệu sau khi được chiết với methanol sẽ
được làm sạch bằng cột diaion HP-20 (2,5 x30cm) và rửa giải lần lượt bằng
nước, methanol và cloroform. Dịch methanol được tiêm vào hệ thống HPLC để
phân tích. Tác giả sử dụng cột Supelcosil C18 (150 x 4,6mm; 5,0µm). Pha động
là acetonitril và nước tỷ lệ 24 : 76. Detector mảng diod ở bước sóng 203 nm.
Đường chuẩn được xây dựng từ 0,8mg/ml đến 3,2mg/ml. Kết quả hàm lượng
Majonoside R2 trong rễ củ sâm Ngọc Linh là 5,97% [1]. Phương pháp tương tự
cũng được đề cập đến trong nghiên cứu của Nguyễn Đức Hạnh và cộng sự, tuy
nhiên khoảng tuyến tính được xây dựng từ 1,88mg/ml – 7,06mg/ml, hàm lượng
Majonoside R2 trong rễ củ sâm là 5,31% [17].
Dược điển Việt Nam V có chuyên luận về định lượng saponin trong sâm
Ngọc Linh. Theo đó, bột dược liệu sau khi được nghiền nhỏ và đồng nhất được
chiết với methanol 70% ở 30oC trong 40 phút. Dịch chiết được phân tích cùng
với dung dịch chuẩn Majonoside R2 với nồng độ 0,5mg/ml bằng hệ thống
HPLC. Cột được sử dụng là cột nhồi pha tĩnh C18 (5µm) với kích thước 15cm x
4,6mm. Hệ dung môi gồm acetonitril (A) và nước (B) với chế độ gradient: 0-11

11
phút: 21% A; 11-25 phút: 21-32% A; 25-35 phút: 32-40% A; 35-40 phút: 40-
95% A; 460-60 phút: 95% A; 60-61 phút: 95-21% A; 61-71 phút: 21% A.
Detector quang phổ tử ngoại ở bước sóng 196 nm. Hàm lượng Majonoside R2
không được thấp hơn 0,4% tính theo dược liệu khô kiệt [3].
Các phương pháp định lượng bằng HPLC nêu trên đều có độ chính xác cao
và dễ thực hiện do sự phổ biến của thiết bị HPLC. Tuy nhiên, một số điểm
chung khác là thời gian phân tích dài (85 phút trong phương pháp của Shu Zhu,
71 phút trong chuyên luận Dược Điển Việt Nam V), nồng độ chất cần phân tích
lớn cỡ mg/ml và qui trình xử lý mẫu rất phức tạp, qua nhiều giai đoạn nên có thể
ảnh hưởng tới độ chính xác của kết quả định lượng.
1.2.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ
Các nghiên cứu hiện tại chủ yếu sử dụng khối phổ như một công cụ để định
tính Majonoside R2 và các saponin khác như nghiên cứu của Hong-Ping Wang
và cộng sự năm 2015 [32], Juan Luu và cộng sự năm 2017 [16].
Một bài báo được công bố năm 2015 của tác giả Võ Hoàng Tùng và cộng
sự đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để định lượng Majonoside R2.
Mẫu dược liệu được nghiền nhỏ và đồng nhất, sau đó chiết bằng methanol 80%
trong 5 giờ. Quá trình sắc ký được tiến hành trên thiết bị Shimadzu, với cột tách
C18 (4µm; 150 x 4,6mm). Pha động gồm Acetonitril chứa 0,1% acid formic (A)
và nước (B). Gradient như sau: 0-2 phút: 0-5%A; 2-7 phút: 5-50%A; 7-15 phút:
50-80%A; 15-17 phút: 80-5%A; 17-20 phút; 5%A. Thiết bị sử dụng detector
khối phổ 3 tứ cực với chế độ ion hóa phun điện tử (ESI) và dải quét từ 50-2000
dalton. Kết quả hàm lượng Majonoside R2 trong sâm Ngọc Linh 5 năm tuổi là
8,088±0,05% [31].
Một ưu điểm dễ nhận thấy nhất của phương pháp sắc ký lỏng khối phổ là
thời gian phân tích nhanh. Tuy nhiên, phương pháp của tác giả chỉ dừng lại ở
nền mẫu dược liệu và detector khối phổ với chế độ quét toàn dải dễ bị ảnh
hưởng bởi nền mẫu.

12
Từ tổng quan tài liệu chưa có nghiên cứu nào tiến hành trên các chế phẩm
làm từ sâm Ngọc Linh.
1.2.4. Một số chế phẩm chứa sâmNgọc Linh lưu hành trên thị trường
Bảng 1.1 Một số chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh
STT Tên sản phẩm Nguồn gốc
1 Sâm Ngọc Linh gói bột Công ty CPDP Boston Việt Nam
2
TPBVSK chiết xuất sinh khối
sâm Ngọc Linh (Lọ)
Công ty cổ phần đầu tư sâm Ngọc
Linh Việt Nam
3
TPBVSK chiết xuất sinh khối
sâm Ngọc Linh (Vỉ)
Công ty cổ phần đầu tư sâm Ngọc
Linh Việt Nam
4 Trà sâm Ngọc Linh hòa tan
Công ty cổ phần sâm Ngọc Linh Tu
Mơ Rông Kon Tum
5 TPCN Anti-U100 Công ty CP Thọ Xuân Đường
6 Viên ngậm sâm Việt Nam
Viện dược liệu - Trung tâm sâm và
dược liệu TP. Hồ Chí Minh
7 Sâm Ngọc Linh viên nang mềm Công ty CPDP Boston Việt Nam
8
Sâm Ngọc Linh Đông Trùng Hạ
Thảo
Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sản
xuất TPCN Học viện Quân Y
9 Tỏi đen sâm Ngọc Linh
10 Tỏi đen cô đơn sâm Ngọc Linh Công ty CPSPQT Canada Việt Nam
11 Kem Skginseng

13
1.3. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng khối phổ
1.3.1. Phương pháp sắc ký lỏng
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và
pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên cột
tách dưới dạng dung dịch. Cơ chế của quá trình sắc ký lỏng là hấp phụ, phân bố,
trao đổi ion hay loại trừ theo kích cỡ.
1.3.2. Detector khối phổ cho sắc ký lỏng
1.3.2.1. Nguyên tắc
Khối phổ là kỹ thuật phân tích đo phổ về khối lượng của các phân tử tích
điện khi chúng di chuyển trong điện trường. Mẫu được ion hóa trở thành các
phân tử tíchđiện khác nhau và được phân tách dựa vào sự sai khác về giá trị m/z.
Hệ thống khối phổ thường gồm ba phần chính là nguồn ion, bộ phân tích
khối lượng và detector thu nhận tín hiệu.
Hình 1.3 Nguyên lý hoạt động của sắc ký lỏng khối phổ
Trong sắc ký lỏng khối phổ, dòng mẫu sau khi ra khỏi cột được chuyển
sang dạng hơi qua kim phun nhờ khí N2, dưới tác dụng của điện trường, các
phân tử chuyển sang dạng ion âm hoặc dương và được đưa vào bộ phận phân
tách khối.

14
1.3.2.2. Các nguồn ion hóa trong sắc ký lỏng khối phổ
Một số nguồn ion cho sắc ký lỏng khối phổ hiện nay là ion hóa phun điện
tử (ESI), ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (APCI), ion hóa quang học tại áp
suất khí quyển (APPI) và bắn phá nguyên tử nhanh (FAB). ESI hiện là phương
pháp được lựa chọn phổ biến cho các nghiên cứu do khả năng ion hóa mềm tạo
và chủ yếu tạo ra các ion phân tử. Nguồn ion APCI và APPI cũng ít tạo ra ion
phân mảnh và được sử dụng thay cho ESI trong phân tích các chất kém phân cực
và có độ ổn định cao như chất béo. Phạm vi áp dụng của của các nguồn ion được
tóm tắt trong hình [7].
Hình 1.4 Phạm vi áp dụng của các cơ chế ion hóa
1.3.2.3. Bộ phận phân tích khối lượng
 Bẫy ion (Ion trap): Dựa vào sự kết hợp của điện trường và từ trường để
phân tách các ion có số khối khác nhau. Các bẫy ion có thể kết hợp với nhau tạo
ra khối phổ nhiều lần.
 Bộ phân tích từ (Magnetic sector): gồm thiết bị hội tụ đơn và hội tụ kép.
Thiết bị hội tụ kép có thể cho độ phân giải rất cao.

15
 Thời gian bay (TOF): Dựa trên thời gian bay khác nhau của các ion có số
khối khác nhau trong từ trường để phân tách các ion. Có 2 kiểu TOF là Linear-
TOF và Reflection-TOF, trong đó, Reflection-TOF có độ phân giải cao.
 Tứ cực (Quadrupole): là hệ thống gồm 4 điện cực, trong đó cứ 2 điện cực
đối nhau được tích điện giống nhau gồm một điện tích một chiều và một điện
tích xoay chiều. Sự thay đổi điện tích ở các tứ cực sẽ loại bỏ các ion khác và chỉ
để lại ion cần phân tích với số khối nhất định di chuyển qua tứ cực. Hiện nay có
hai loại tứ cực là: đơn tứ cực (single quadrupole) và ba tứ cực (triple
quadrupole). Hệ thống ba tứ cực có thể tạo ra phổ khối lượng hai lần. Ngoài ra,
tứ cực còn có thể ghép nối với một bẫy ion hoặc bộ phân tích thời gian bay để
tạo ra phổ khối hai lần.
1.3.3. Ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ trong phân tích
1.3.3.1. Ứng dụng trong định tính
Một số ứng dụng của phổ khối trong định tính hợp chất hữu cơ như:
 Định danh một chất bằng cách so phổ khối của chất đó với phổ khối của
chất chuẩn hoặc so với phổ trong ngân hàng phổ chuẩn.
 Xác định công thức nguyên của hợp chất hữu cơ từ giá trị m/z của ion
phân tử (phổi khối lượng độ phân giải cao).
 Xác định công thức cấu tạo của hợp chất nhờ việc bắn phá ion mẹ và phân
tích các ion con thu được.
1.3.3.2. Ứng dụng trong định lượng
Ứng dụng của sắc ký lỏng khối phổ trong phân tích định lượng tương tự
như các phương pháp sắc ký lỏng khác. Có thể dùng một số phương pháp như:
So sánh, đường chuẩn, phương pháp thêm.

16
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
 Chất chuẩn: Majonoside R2 (Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí
Minh; số kiểm soát: Majo.Ref.012012; Hàm lượng: 98.86%)
 Chế phẩm:
Bảng 2.1 Chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh dạng rắn
STT Tên mẫu Số lô Nguồn gốc
R1 Sâm Ngọc Linh gói bột 020517
Công ty CPDP Boston Việt
Nam
R2 Bột sâm Ngọc Linh Công ty Sao Thái Dương
R3
TPBVSK chiết xuất sinh
khối sâm Ngọc Linh (Lọ)
050917
Công ty cổ phần đầu tư sâm
Ngọc Linh Việt Nam
R4
TPBVSK chiết xuất sinh
khối sâm Ngọc Linh (Vỉ)
011216
Công ty cổ phần đầu tư sâm
Ngọc Linh Việt Nam
R5 Trà sâm Ngọc Linh hòa tan 010517
Công ty cổ phần sâm Ngọc
Linh Tu Mơ Rông Kon Tum
R6 TPCN Anti-U100 181016
Công ty CP Thọ Xuân
Đường
R7 Viên ngậm sâm Việt Nam 0010418
Viện dược liệu - Trung tâm
sâm và dược liệu TP. Hồ Chí
Minh
Bảng 2.2 Chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh dạng dầu
STT Tên mẫu Số lô Nguồn gốc
N1
Sâm Ngọc Linh viên nang
mềm
020517
Công ty CPDP Boston Việt
Nam

17
N2
Sâm Ngọc Linh Đông
Trùng Hạ Thảo
091118
Trung tâm nghiên cứu ứng
dụng sản xuất TPCN Học
viện Quân Y
N3 Tỏi đen sâm Ngọc Linh 010117
viện Quân Y
N4
Tỏi đen cô đơn sâm Ngọc
Linh
0118
Công ty CPSPQT Canada
Việt Nam
N5 Kem Skginseng 010618
viện Quân Y
2.1.2. Phương tiện và thiết bị nghiên cứu
 Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ hai lần EVOQ QUBE của Bruker – Mỹ
 Cột phân tích: Inertsustain AQ C18 (2.1mm x 100mm; 3.0µm) và
Inertsustain NH2 (2.1mm x 100mm; 3.0µm) của GL Sciences – Nhật
 Cân phân tích Shimadzu AWU220D (độ chính xác 0,01mg) – Nhật
 Bể lắc siêu âm Elma S60H – Đức
 Nồi cáchthủy Memmert – Đức
 Bộ lọc hút chân không Duran – Đức
 Máy cất nước hai lần OPTI-4D – Ấn Độ
 Dụng cụ: các loại pipet, bìnhđịnh mức, màng lọc mẫu, …….
2.1.3. Hóa chất và dung môi
Bảng 2.3 Danh mục dung môi và hóa chất
TT Tên hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn
1 Ethanol Merck – Đức Dùng cho HPLC
2 Methanol Merck – Đức Dùng cho HPLC

18
4 Acetonitril Merck – Đức Dùng cho LC-MS
5 Nước cất Máy cất nước 2 lần DĐVN V
6 Acid formic Merck – Đức Dùng cho HPLC
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thu thập mẫu
 Thu thập mẫu là các chế phẩm có chứa thành phần sâm Ngọc Linh trên thị
trường.
 Cách thức thu thập: nhà thuốc/cửa hàng bán chế phẩm bảo vệ sức khỏe,
mua trực tuyến và một số mẫu gửi kiểm nghiệm.
 Dạng bào chế: Dạng rắn và dạng dầu.
2.2.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký
 Khảo sát thông số detector khối phổ: Khảo sát điều kiện phân mảnh của
Majonoside R2 gồm: nguồn ion hóa, ion mẹ (ion phân tử), ion con và
năng lượng bắn phá dựa vào tính năng Optimize của thiết bị.
 Khảo sát cột phân tích: Inertsustain AQ C18 (2,1mm x 100mm; 3,0µm);
Inertsustain NH2 (2,1mm x 100mm; 3,0µm)
 Khảo sát thành phần pha động: Dung dịch acid formic 0.1% trong nước
và methanol hoặc acetonitril.
 Khảo sát tỷ lệ pha động: đẳng dòng và gradient
 Khảo sát thể tích tiêm mẫu: tiêm mẫu 2µl, 10µl và 20µl.
Lựa chọn điều kiện sắc ký cho pic Majonoside R2 gọn, thời gian lưu
không quá sớm.
2.2.3. Lựa chọn phương pháp xử lý mẫu
 Khảo sát dung môi chiết: khảo sát các dung môi chiết là methanol,
ethanol, nước hoặc hỗn hợp nước – ethanol, nước – methanol với các tỷ lệ
khác nhau để lựa chọn được dung môi chiết phù hợp nhất. Trên cùng một

19
nền mẫu tiến hành chiết theo quy trình chiết trên với các loại dung môi tỷ
lệ khác nhau, mỗi loại tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình.
 Khảo sát thời gian chiết: 10 phút, 20 phút, 30 phút, 40 phút.
 Khảo sát số lần chiết: 1 lần, 2 lần, 3 lần.
Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu cho giá trị hàm lượng Majonoside R2 cao
nhất.
2.2.4. Thẩm định phương pháp
Xử lý mẫu theo qui trình đã lựa chọn, chạy sắc ký các dung dịch thu được
theo điều kiện đã khảo sát, thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của phụ lục
K AOAC 2013 [6] với các chỉ tiêu:
 Độ đặc hiệu
 Độ phù hợp hệ thống
 Độ tuyến tính
 Độ chụm
 Độ đúng
 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
2.2.5. Áp dụng trên một số chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh
Thu thập một số chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh trên thị trường.
Tiến hành phân tích thành phần Majonoside R2 trong các chế phẩm theo
quy trình đã xây dựng.
2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu
Một số đặc trưng thống kê: các đặc trưng thống kê được tính dựa vào các
hàm số trong Microsoft Excel.
Giá trị trung bình (X): hàm AVERAGE
Độ lệch chuẩn (SD): hàm STDEV.
Độ lệch chuẩn tương đối (RSD):
SD100
x
(%)

20
Tương quan hồi quy tuyến tính: Phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện
mối quan hệ giữa diện tíchpic sắc ký và nồng độ chất cần phân tíchcó dạng:
y = a. x + b
Trong đó: y Diện tíchpic
x nồng độ chất cần phân tích
a hệ số góc (tính toán bằng hàm SLOPE)
b hệ số chắn (tính toán bằng hàm INTERCEPT)
r hệ số tương quan (tính toán bằng hàm CORREL).

21
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký
3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 10mg Majonoside
R2 vào bình định mức 10ml, thêm 7ml methanol, siêu âm trong 5 phút, định
mức bằng methanol, lắc đều.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn 10µg/ml: Hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn gốc vào
bình định mức 100ml, định mức bằng methanol.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn. Hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn 10µg/ml vào
bình định mức 100ml, định mức bằng methanol.
3.1.2. Khảo sát điều kiện khối phổ
Để phân tích một hoạt chất bằng LC-MS/MS cần phải xác định được ion
mẹ (ion phân tử), ion con cũng như mức năng lượng phân mảnh. Với kỹ thuật
ion hóa ESI, các ion phân tử thường được tạo thành bằng cách thêm 1 proton
[M+H]+ (chế độ ion hóa dương) hoặc mất proton [M-H]- (chế độ ion hóa âm).
Dùng dung dịch chuẩn nồng độ 10µg/ml tiêm vào hệ thống khối phổ để xác
định ion phân tử và chế độ ion hóa. Kết quả được trình bày trong hình 3.1 và 3.2
Hình 3.1 Phổ khối lượng của Majonoside R2 chế độ ion hóa dương

22
Hình 3.2 Phổ khối lượng của Majonoside R2 chế độ ion hóa âm
Nhận xét: Trong phổ khối lượng chế độ ion hóa dương xuất hiện ion phân
tử của Majonoside R2 với m/z là 787,5 còn trong phổ khối lượng chế độ ion hóa
âm không xuất hiện ion phân tử. Vậy chọn chế độ ion hóa dương và ion phân tử
với m/z là 787,5 để tiến hành khảo sát tiếp theo.
Các thông số của buồng ion hóa được cài đặt theo bảng sau:
Bảng 3.1 Các thông số tối ưu của buồng ion hóa
Thông số Giá trị
Điện áp đầu phun + 3500 V
Khí chắn 20 psi
Nhiệt độ nón 350 C
Khí ion hóa 1 40 psi
Nhiệt độ ion hóa 250 C
CID gas Ar 1.5 mTorr
Dùng dung dịch chuẩn nồng độ 10µg/ml tiêm vào hệ thống khối phổ để xác
định ion con và năng lượng phân mảnh bằng chế độ tối ưu hóa tự động của máy,
kết quả thu được như sau:

23
Hình 3.3 Kết quả khảo sát ion con và năng lượng phân mảnh
Bảng 3.2 Điều kiện phân mảnh của Majonoside R2
Ion mẹ (m/z) Ion con (m/z) Năng lượng (eV) Tỷ lệ tương đối (%)
787,5
143,1 (định lượng) 16 100
457,4 (định tính) 14 70
Nhận xét: Kết quả khảo sát thu được một ion mẹ và 2 ion con, phù hợp với
yêu cầu của phương pháp LC-MS/MS theo quy định của châu Âu với số điểm
nhận dạng là 4 (ion mẹ = 1 điểm, 2 ion con mỗi ion = 1,5 điểm) [9].
3.1.3. Khảo sát cột sắc ký
Cột sắc ký có vai trò phân tách các chất và các thành phần khác nhau trong
mẫu. Việc lựa chọn cột phân tích phụ thuộc vào bản chất của chất cần phân tích
cũng như thành phần của pha tĩnh. Phân tử Majonoside R2 gồm hai thành phần,
phần sapogenin có cấu trúc kém phân cực nên có thể sử dụng cột có pha tĩnh
C18 để tiến hành phân tích. Mặt khác, phần đường phân cực hơn nên có thể
phân tích bằng cột có pha tĩnh NH2 (loại pha tĩnh thường dùng để phân tích các
hợp chất đường).

24
Tiến hành khảo sát trên 2 cột: Inertsustain AQ C18 (100 x 2,1 mm; 3,0µm)
và Inertsustain NH2 (100 x 2,1 mm; 3,0µm). Sử dụng cùng pha động là hỗn hợp
acetonitril (A) và nước chứa 0,1% acid formic (B) với các tỷ lệ A : B lần lượt là
60 :40; 40:60; 30:70; 20:80 và chế độ gradient như sau: 0 phút: 15%A; 0-6 phút:
15-40%A; 6-7 phút: 40-15%A, 7-10 phút: 15%A. Kết quả được thể hiện trong
hình 3.4 và 3.5.
a)
b)
c)
d)

25
e)
Hình 3.4 Kết quả khảo sát cột Inertsustain NH2
. a) Tỷ lệ A:B = 60:40; b) Tỷ lệ A: B = 40:60; c) Tỷ lệ A: B = 30:70; d) Tỷ lệ A:
B = 20:80; e) Chế độ gradient
a)
b)
c)

26
d)
e)
Hình 3.5 Kết quả khảo sát cột Inertsustain AQ C18
a) Tỷ lệ A:B = 60:40; b) Tỷ lệ A: B = 40:60; c) Tỷ lệ A: B = 30:70; d) Tỷ lệ A:
Nhận xét: Cột sắc ký Inertsustain NH2 cho pic không cân xứng và chân
pic rộng hơn nhiều so với cột Inertsustain AQ C18 ở cả chế độ đẳng dòng và
gradient. Vì vậy, chọn cột Inertsustain AQ C18 để tiến hành khảo sát tiếp theo.
3.1.4. Khảo sát thành phần và tỷ lệ pha động
Pha động là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả tách sắc ký, nó có
thể ảnh hưởng tới độ chọn lọc, thời gian lưu giữ, hiệu lực của cột tách, độ phân
giải, độ rộng của pic sắc ký…

27
 Khảo sát loại dung môi cho pha động:
Tiến hành phân tích sử dụng cột Inertsustain C18 với thành phần pha động
như sau: Hỗn hợp dung môi acetonitril (A) - nước chứa 0,1% acid formic (B)
với các tỷ lệ A: B là 60: 40; 40: 60; 30 : 70 và hỗn hợp methanol (A) – nước
chứa 0,1% acid formic (B)với các tỷ lệ A: B là 80: 20; 60 : 40; 40 : 60. Kết quả
được thể hiện trong hình 3.6 và 3.7.
a)
b)
c)
Hình 3.6 Kết quả khảo sát pha độngmethanol : nước chứa 0,1% acid formic
a) Tỷ lệ A:B = 80:20; b) Tỷ lệ A: B = 60:40; c) Tỷ lệ A: B = 40:60

28
a)
b)
c)
Hình 3.7 Kết quả khảo sát pha động acetonitril : nước chứa 0,1% acid formic
a) Tỷ lệ A:B = 60:40; b) Tỷ lệ A: B = 40:60; c) Tỷ lệ A: B = 30:70
Nhận xét: Hỗn hợp dung môi methanol và nước cho pic có thời gian lưu
chậm hơn và chân pic rộng hơn so với hỗn hợp acetonitril và nước ở cùng tỷ lệ
(60: 40 và 40:60). Mặt khác, hỗn hợp methanol – nước làm áp suất trước cột
tăng nhiều, có khả năng ảnh hưởng đến cột. Vì vậy, chọn dung môi acetonitril để
khảo sát tỷ lệ pha động.
 Khảo sát tỷ lệ pha động:

29
Tiến hành phân tích sử dụng pha động là hỗn hợp acetonitril (A) - nước
chứa 0,1% acid formic (B) với chế độ đẳng dòng ở các tỷ lệ 60 : 40; 40 : 60; 30 :
70; 20 : 80 và chế độ gradient như sau: 0-6 phút: 15-40%A; 6-7 phút: 40-15%A,
7-10 phút: 15%A. Kết quả được thể hiện trong hình sau:
a)
b)
c)
d)

30
e)
Hình 3.8 Kết quả khảo sát tỷ lệ pha động.
a) Tỷ lệ A:B = 60:40; b) Tỷ lệ A: B = 40:60; c) Tỷ lệ A: B = 30:70; d) Tỷ lệ A:
Nhận xét: Với hỗn hợp dung môi acetonitril - nước (0,1% acid formic) các
tỷ lệ 60:40; 40:60; 30:70 cho pic cân xứng, chân pic nhỏ nhưng thời gian lưu
ngắn, có thể bị ảnh hưởng bởi các chất khác trong nền mẫu. Chế độ đẳng dòng
tỷ lệ 20:80 cho pic cân xứng nhưng chân pic dãn rộng. Chế độ gradient cho pic
cân xứng, chân pic nhỏ, thời gian lưu không quá ngắn. Vì vậy chọn chế độ
gradient để tiến hành khảo sát tiếp theo.
3.1.5. Khảo sát thể tích tiêm
Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn với các điều kiện chọn lựa được ở phần
trước, thể tích tiêm lần lượt là 2µl, 10µl và 20µl. Kết quả thu được như sau:
a)
b)

31
c)
Hình 3.9 Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu
a) 2µl; b) 10µl; c) 20µl.
Nhận xét: Thể tích tiêm mẫu 10µl cho pic bị giãn rộng chân, thể tích tiêm
mẫu 20µl cho pic bị giãn rộng chân và chẻ pic. Vì vậy, chọn thể tích tiêm là 2µl
để có pic cân xứng, chân pic hẹp.
3.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Yếu tố khảo sát: dung môi chiết, thời gian chiết, số lần chiết
Đối tượng khảo sát:
Mẫu dạng rắn: TPBVSK Sâm Ngọc Linh dạng gói (R1)
Mẫu dạng dầu: TPBVSK Sâm Ngọc Linh nang mềm (N1)
Thông số đánh giá: hàm lượng Majonoside R2 trong mẫu.

32
3.2.1. Khảo sát dung môi chiết
Do Majonoside R2 tan được trong các dung môi nước, methanol, ethanol
nên sử dụng các dung môi này để chiết, khảo sát loại dung môi và tỷ lệ dung
môi thích hợp. Mỗi loại dung môi tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình. Các
thông số khác cố định: phương pháp chiết siêu âm, thời gian chiết 20 phút, số
lần chiết 01 lần. Hàm lượng Majonoside R2 (µg/g) trong mẫu được trình bày
trong bảng sau:
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát dung môi chiết (n =3)
Dung môi chiết
Hàm lượng MR2 trong
nền mẫu rắn (TB ±SD)
(µg/g)
nền mẫu dầu (TB±SD)
(µg/g)
Methanol 2,82±0,11 4,67±0,05
Ethanol 2,79±0,11 4,17±0,15
Nước 3,13±0,06 2,15±0,08
MeOH: Nước = 3 : 7 2,66±0,08 2,70±0,08
MeOH: Nước = 7 : 3 2,60±0,05 3,52±0,09
EtOH: Nước = 3 : 7 2,67±0,06 2,66±0,07
EtOH: Nước = 7 : 3 2,68±0,08 3,42±0,11

33
Hình 3.10 Kết quả khảo sát dung môi chiết (n=3)
Nhận xét: Kết quả cho thấy, với mẫu dạng rắn R1, khi sử dụng dung môi là
nước, hàm lượng Majonoside R2 thu được cao hơn hẳn so với các dung môi
khác. Vì vậy chọn nước làm dung môi chiết cho nền mẫu dạng rắn, vừa đảm bảo
hiệu suất chiết mà không độc hại với môi trường.
Với mẫu dạng dầu N1, dung môi cho hàm lượng Majonoside R2 cao nhất
là methanol, vì vậy chọn methanol làm dung môi chiết cho nền mẫu dạng dầu.
3.2.2. Khảo sát thời gian chiết
Tiến hành chiết mẫu theo quy trình dự kiến, cố định các thông số: phương
pháp chiết siêu âm, dung môi chiết là nước với mẫu dạng rắn và methanol với
mẫu dạng dầu, số lần chiết 01 lần. Khảo sát thời gian chiết 10 phút, 20 phút, 30
phút, 40 phút. Mỗi thời gian tiến hành lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình. Hàm
lượng Majonoside R2 trong mẫu được trình bày trong bảng sau:
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát thời gian chiết (n=3)
Thời gian
nền mẫu rắn (TB ±SD)
(µg/g)
nền mẫu dầu (TB±SD)
(µg/g)

34
10 phút 2,81±0,11 3,25±0,06
20 phút 3,12±0,03 4,21±0,09
30 phút 3,17±0,06 4,71±0,02
40 phút 3,11±0,05 4,77±0,09
Hình 3.11 Kết quả khảo sát thời gian chiết (n=3)
Nhận xét: Kết quả cho thấy, với mẫu dạng rắn, khi thời gian chiết tăng từ
10 phút lên 20 phút thì hàm lượng hoạt chất tăng lên (từ 2,81µg/g đến 3,12µg/g),
còn khi thời gian chiết tăng lên 30 và 40 phút hàm lượng thay đổi không đáng
kể. Vì vậy chọn thời gian chiết với mẫu dạng rắn là 20 phút.
Với mẫu dạng dầu, khi tăng thời gian chiết từ 10 phút lên 30 phút thì hàm
lượng hoạt chất tăng lên rõ rệt (từ 3,25µg/g đến 4,71µg/g), thời gian chiết 30
phút và 40 phút cho kết quả tương đương nhau. Vì vậy chọn thời gian chiết với
mẫu dạng dầu là 30 phút.
3.2.3. Khảo sát số lần chiết
Tiến hành chiết mẫu theo quy trình dự kiến, cố định các thông số: phương
pháp chiết siêu âm, dung môi chiết là nước với mẫu dạng rắn và methanol với

35
mẫu dạng dầu, thời gian chiết 20 phút với mẫu rắn và 30 phút với mẫu dạng dầu.
Khảo sát số lần chiết 1 lần, 2 lần, 3 lần. Mỗi thời gian tiến hành lặp lại 3 lần, lấy
kết quả trung bình. Kết quả thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát số lần chiết
Số lần chiết
Hàm lượng MR2 trong nền
mẫu rắn (TB±SD)
(µg/g)
Hàm lượng MR2 trong nền
mẫu dầu (TB±SD)
(µg/g)
1 3,09±0,05 4,72±0,05
2 3,15±0,10 4,70±0,02
3 3,20±0,10 4,74±0,05
Nhận xét: Hàm lượng Majonoside R2 thay đổi không đáng kể khi tăng số
lần chiết từ 1 lần đến 3 lần. Vì vậy, lựa chọn chiết 1 lần để tiết kiệm thời gian
mà vẫn đạt hiệu quả chiết.
3.3. Quy trình phân tích
Qua khảo sát quy trình phân tích và điều kiện sắc ký, quy trình định lượng
Majonoside R2 trong chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh dạng rắn và dầu được lựa
chọn như sau:
3.3.1. Điều kiện sắc ký
 Cột: Inertsustain AQ C18 (100 mm x 2,1 mm; 3,0m)
 Nhiệt độ buồng cột: 40oC
 Thể tíchtiêm mẫu: 2 µl
 Tốc độ dòng: 0,3 ml/ phút
 Thời gian phân tích:10 phút
 Pha động: Pha động A: Dung dịch acid formic 0,1% trong nước
Pha động B: Acetonitril
 Chương trình dung môi như sau:

36
Bảng 3.6 Chương trình dung môi
Thời gian (phút) Tỷ lệ Acetonitril (%)
Tỷ lệ nước chứa 0,1%
acid formic (%)
0 15 85
6 40 60
7 15 85
10 15 85
 Các điều kiện khối phổ:
Bảng 3.7 Điều kiện khối phổ
Thông số Giá trị
Điện áp đầu phun + 3500 V
Khí chắn 20 psi
Nhiệt độ nón 350 C
Nhiệt độ ion hóa 250 C
CID gas Ar 1.5 mTorr
Chế độ quét MRM
787,5 → 143,1 (16eV) (Định lượng)
787,5 → 457,4 (14eV) (Định tính)
3.3.2. Chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu thử
 Chuẩn bị đường chuẩn:
Cân và pha chuẩn Majonoside R2 trong methanol hoặc nước để được dãy
dung dịch có nồng độ từ 5ppb đến 200ppb, lọc qua màng lọc 0,22µm.
 Chuẩn bị dung dịch thử:
+ Mẫu thử dạng rắn: Cân chính xác khoảng 0,50 - 1,00 g mẫu thử vào
bình định mức 50 ml, thêm 40 ml nước, siêu âm 20 phút, định mức bằng nước

37
đến vạch, lắc đều. Pha loãng mẫu thử trong methanol để được nồng độ nằm
trong đường chuẩn, lọc qua màng lọc 0,22µm.
+ Mẫu thử dạng dầu: Cân chính xác khoảng 0,50 - 1,00 g mẫu thử vào
bình định mức 50ml, thêm 40ml methanol, siêu âm 30 phút, định mức bằng
methanol đến vạch, lắc đều. Pha loãng mẫu thử trong methanol để được nồng độ
nằm trong đường chuẩn, lọc qua màng lọc 0,22µm.
3.3.3. Định tính Majonoside R2
Định tính Majonoside R2 trong mẫu thử dựa vào so sánh thời gian lưu và
phổ khối lượng (tỷ lệ giữa ion định tính và ion định lượng) của pic trong sắc ký
đồ dung dịch thử với pic trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn.
3.3.4. Định lượng Majonoside R2
Từ các dung dịch trong đường chuẩn, xây dựng đường phụ thuốc tuyến tính
giữa nồng độ và diện tích pic có dạng:
y = a. x + b
Trong đó:
a Hệ số góc của đường tuyến tính
b Hệ số chắn của đường tuyến tính
x Nồng độ dung dịch chuẩn (ng/ml)
y Diện tíchpic Majonoside R2 (Cps.s)
Hàm lượng hoạt chất trong chế phẩm được tính theo công thức:
HL =
St − b
×
50
×
1 (µg/g)
Trong đó:
a mt 1000
St Diện tích pic Majonoside R2 trong mẫu thử (Cps.s)
mt Khối lượng cân mẫu thử (g)
1/1000 Hệ số quy đổitừ ng sang µg

38
3.4. Thẩm định phương pháp
3.4.1. Độ phù hợp của hệ thống
Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn Majonoside R2 có nồng độ chính xác khoảng
100 ng/ml theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn, ghi lại sắc ký đồ và diện tích pic.
Kết quả được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ phù hợp hệ thống
STT
Thời gian lưu
(phút)
Diện tích pic
(Cps.s)
Tỷ lệ ion
457,4/143,1 (%)
1 4,964 222026 67,7
2 4,974 220691 67,4
3 4,980 222420 66,7
4 4,980 219411 67,0
5 4,945 218693 67,2
6 4,991 218094 67,1
Trung bình 4,972 220223 67,1
Độ lệch chuẩn (%) 0,3 0,8 0,3
Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic và tỷ
lệ mảnh ion đều thấp (< 1%). Như vậy, hệ thống đáp ứng được yêu cầu theo phụ
lục K AOAC (2013) (RSD ≤ 15% với nồng độ < 1µg/g).
3.4.2. Độ đặc hiệu
Độ đặc hiệu được đánh giá qua phân tích các mẫu chuẩn và mẫu thử và
mẫu thử thêm chuẩn.
 Dung dịch mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn Majonoside R2 có nồng độ
100ng/ml
 Dung dịch mẫu thử: chuẩn bị theo quy trình đề xuất
 Dung dịch mẫu thử thêm chuẩn:

39
+ Mẫu dạng rắn: Cân chính xác 0,4825g mẫu thử, thêm 0,2ml dung
dịch chuẩn gốc 10µg/ml vào và tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đề xuất.
+ Mẫu dạng dầu: Cân chính xác 0,4214g mẫu thử, thêm 0,2ml dung
dịch chuẩn gốc 10µg/ml vào và tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đề xuất.
Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu thử R1, dung dịch
mẫu thử N1, dung dịch mẫu R1, N1 thêm chuẩn. Kết quả được thể hiện ở hình
3.12, 3.13, 3.14, kết quả định tính thể hiện đầy đủ ở phụ lục 2.
a)
b)
c)
d)

40
e)
Hình 3.12 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu
a) Mẫu chuẩn; b) Mẫu thử dạng rắn; c) Mẫu thử dạng dầu; d) Mẫu thử dạng rắn
thêm chuẩn; e) Mẫu thử dạng dầu thêm chuẩn
Hình 3.13 Kết quả định tính mẫu R1

41
Hình 3.14 Kết quả định tính mẫu N1
Nhận xét: Trên sắc ký đồ mẫu chuẩn xuất hiện pic Majonoside R2 ở thời
gian lưu khoảng 5 phút. Trên sắc ký đồ mẫu thử dạng rắn và dầu đều xuất hiện
pic Majonoside R2 với thời gian lưu tương ứng và phổ khối trùng với sắc ký đồ
mẫu chuẩn (Tỷ lệ ion 457,4/143,1 nằm trong giới hạn cho phép 69,09±20% so
với mẫu chuẩn (Châu Âu 2002/657) [9]. Vì vậy, phương pháp có độ đặc hiệu
với nền mẫu dạng rắn và dầu.
3.4.3. Độ tuyến tính
Tiến hành pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc nồng độ 10µg/ml, tiến hành
pha loãng để được dãy dung dịch chuẩn có nồng độ từ 5ng/ml đến 200ng/ml.
Tiến hành sắc ký các dung dịch trong đường chuẩn, ghi lại sắc ký đồ và
diện tíchpic. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ tuyến tính
Chuẩn C1 C2 C3 C4 C5 C6
Nồng độ (ng/ml) 5,05 25,23 50,47 100,94 151,40 201,87
Diện tíchpic (Cps.s) 6738 52680 105174 222040 327944 451640

42
Phương trình đường
chuẩn
y = 2244,4x – 5738,8
Hệ số tương quan r = 0,9997
Độ thu hồi (%) 110,08 103,17 97,92 100,54 98,20 100,95
Hình 3.15 Đường chuẩn Majonoside R2
Nhận xét: Kết quả khảo sát tính tuyến tính cho thấy trong khoảng nồng độ
từ 5,05ng/ml đến 201,87ng/ml có sự tương quan chặt chẽ giữa nồng độ và diện
tích pic (hệ số tương quan r > 0,995). Độ thu hồi của các dung dịch chuẩn khi
tính toán lại theo đường chuẩn đều nằm trong giới hạn cho phép của AOAC (75-
120% với nồng độ ≤1µg/ml) [6].
3.4.4. Độ chụm
 Độ lặp lại
Độ lặp lại của phương pháp được tính trên kết quả phân tích các mẫu độc
lập trong cùng một điều kiện phân tích. Tiến hành định lượng 6 lần song song
trên mẫu thử R1, mẫu thử N1 theo quy trình chiết mẫu và phân tích đã lựa chọn.
Tính hàm lượng Majonoside R2 trong mẫu thử, độ lệch chuẩn tương đối của 6
kết quả.

43
 Độ tái lặp
Tiến hành định lượng 6 lần lặp lại song song đối với mẫu thử R1 và N1
theo quy trình phân tích đã chọn nhưng tiến hành vào 2 ngày khác nhau. Tính
trung bình và độ lệch chuẩn tương đối của 12 giá trị hàm lượng. Kết quả thể
hiện trong bảng sau:
Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ chụm mẫu dạng rắn
Ngày STT
Khối lượng
cân (g)
Diện tích pic
(Cps.s)
Hàm
lượng
(µg/g)
Trung
bình
(µg/g)
RSD
(%)
1
1 0,4821 63042 3,18
3,14 2,72
2 0,5585 74737 3,21
3 0,6727 84454 2,99
4 0,9426 126449 3,12
5 0,9105 121988 3,13
6 0,9938 137826 3,22
2
1 0,5521 64178 3,22
3,17 2,65
2 0,6682 74118 3,05
3 0,7021 79559 3,10
4 0,8441 99896 3,21
5 0,9627 117051 3,28
6 1,1564 136856 3,17
Tổng hợp (n=12) 3,16 2,60

44
Bảng 3.11 Kết quả khảo sát độ chụm mẫu dạng dầu
Ngày STT
Khối lượng
cân (g)
Diện tích pic
(Cps.s)
Hàm
lượng
(µg/g)
Trung
bình
(µg/g)
RSD
(%)
1
1 0,3107 54259 4,59
4,70 2,26
2 0,4155 76070 4,72
3 0,5242 94847 4,63
4 0,4658 86389 4,76
5 0,7058 136011 4,87
6 0,7946 145504 4,62
2
1 0,3224 52858 4,59
4,67 2,95
2 0,4439 76143 4,70
3 0,5207 86930 4,55
4 0,5117 86378 4,60
5 0,6054 110585 4,93
6 0,8222 143170 4,66
Tổng hợp 4,69 2,52
Nhận xét: Theo AOAC, với mức hàm lượng 1µg/g đến 10µg/g, độ lệch
chuẩn tương đối của kết quả (RSD %) phải đạt < 8% [6]. Kết quả phân tích cho
thấy độ lặp lại của Majonoside R2 đối với cả hai nền mẫu đều đạt yêu cầu.
Ở cả 2 mẫu thẩm định chỉ tiêu độ tái lặp, kết quả cho thấy phương pháp
khảo sát có độ tái lặp nằm trong giới hạn cho phép (RSD <8%).
Vậy có thể kết luận độ chụm của phương pháp đạt yêu cầu của AOAC.
3.4.5. Độ đúng
Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn vào nền mẫu thử và
xác định lượng hoạt chất thu hồi. Thực hiện ở ba mức nồng độ khác nhau, mỗi

45
mức nồng độ tiến hành 7 lần, tương ứng 21 mẫu thử riêng biệt. Kết quả thu được
như sau:
Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ thu hồi mẫu dạng rắn
Phương trình đường chuẩn: y = 2244,4x – 5738,8
Lượng mẫu
thử (g)
Lượng thêm
(µg)
Diện tích
pic (Cps.s)
Lượng tìm
lại (µg)
Độ thu hồi
(%)
Mức 1
0,1805 0,50 43607 0,53 105,92
0,1714 0,50 43338 0,56 110,37
0,1823 0,50 44518 0,55 108,82
0,2026 0,50 46930 0,54 106,88
0,1944 0,50 45608 0,54 106,13
0,1800 0,50 43871 0,54 107,39
0,1858 0,50 43941 0,53 104,10
Mức 2
0,4825 2,02 148456 1,92 95,39
0,5214 2,02 156978 1,99 98,76
0,5269 2,02 160792 2,06 102,12
0,4228 2,02 138721 1,89 93,90
0,4377 2,02 142262 1,93 95,50
0,5489 2,02 162417 2,03 100,50
0,5548 2,02 162262 2,01 99,41
Mức 3
0,5561 4,04 257495 4,12 102,17
0,5888 4,04 265165 4,19 103,87
0,5944 4,04 264465 4,16 103,05
0,5526 4,04 248405 3,93 97,43
0,4377 4,04 235250 4,00 99,08
0,5680 4,04 256806 4,07 100,87
0,6254 4,04 270531 4,20 103,99
Mức 4
0,5582 6,05 349552 6,17 101,88
0,6002 6,05 358074 6,23 102,85

46
0,5744 6,05 350910 6,15 101,54
0,6248 6,05 363502 6,27 103,57
0,4928 6,05 339228 6,14 101,46
0,6526 6,05 367833 6,28 103,73
0,6242 6,05 360045 6,20 102,33
Bảng 3.13 Kết quả khảo sát độ thu hồi mẫu dạng dầu
Phương trình đường chuẩn: y = 2033,8x - 3781,4
Lượng mẫu
thử (g)
Lượng thêm
(µg)
Diện tích
pic (Cps.s)
Lượng tìm
lại (µg)
Độ thu hồi
(%)
Mức 1
0,1002 0,50 35912 0,51 100,11
0,1325 0,50 43142 0,53 105,26
0,1246 0,50 41888 0,54 106,51
0,1125 0,50 40011 0,55 108,63
0,1425 0,50 45844 0,55 109,12
0,1359 0,50 43731 0,53 104,97
0,1104 0,50 38369 0,52 102,59
Mức 2
0,4214 2,02 161231 2,08 102,92
0,4351 2,02 161465 2,02 100,01
0,4604 2,02 162696 1,93 95,62
0,4552 2,02 162299 1,94 96,35
0,4221 2,02 160635 2,06 102,03
0,4355 2,02 164311 2,09 103,39
0,4115 2,02 158855 2,06 102,33
Mức 3
0,4251 4,04 242811 4,07 100,72
0,3858 4,04 239132 4,16 103,05
0,4451 4,04 245797 4,04 100,21
0,3895 4,04 240798 4,18 103,64
0,4559 4,04 244381 3,96 98,09

47
0,4327 4,04 244395 4,07 100,80
0,4452 4,04 241982 3,95 97,88
Mức 4
0,4214 6,05 318060 5,93 97,99
0,3721 6,05 316869 6,13 101,33
0,4525 6,05 337856 6,27 103,62
0,4238 6,05 324015 6,07 100,22
0,4655 6,05 324489 5,88 97,18
0,4600 6,05 339327 6,27 103,63
0,4321 6,05 338571 6,39 105,49
Nhận xét: Trên nền mẫu R1, độ thu hồi ở cả 4 mức nồng độ trong khoảng
93,90% - 110,37%. Trên nền mẫu N1, độ thu hồi ở cả 3 mức nồng độ trong
khoảng 95,62% - 109,12%. Độ thu hồi của Majonoside R2 trên cả 2 nền mẫu
đều nằm trong giới hạn cho phép theo AOAC (từ 80-115% với nồng độ
>10µg/g) [6].
3.4.6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của
phương pháp bằng cách phân tích các chất ở nồng độ thấp và xác định giá trị tỷ
số tín hiệu/nhiễu (S/N). LOD được xác định tại nồng độ có S/N khoảng bằng 3
và LOQ được xác định ở nồng độ bằng 3,3 lần giá trị nồng độ LOD.
Tiến hành pha loãng mẫu thử ở cả 2 nền mẫu với hàm lượng xác định bằng
methanol đến nồng độ lần lượt là 1ng/ml; 0,5 ng/ml và 0,2ng/ml. Sắc ký các
dung dịch trên, ghi lại sắc ký đồ và giá trị S/N. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.14 Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện
Nồng độ Giá trị S/N trên nền mẫu rắn Giá trị S/N trên nền mẫu dầu
1,0 ng/ml 10 8
0,5 ng/ml 6 5
0,2 ng/ml 3 3

48
a)
b)
Hình 3.16 Kết quả xác định LOD của phương pháp (nồng độ 0,2ng/ml).
a) Mẫu dạng rắn; b) Mẫu dạng dầu
Nhận xét: Trên cả 2 nền mẫu, phương pháp có giới hạn phát hiện của
Majonoside R2 là 0,2ng/ml. Giới hạn định lượng xác định bằng 3,3 lần giới hạn
phát hiện có giá trị là 0,66ng/ml.
Kết quả thẩm định phương pháp cho thấy phương pháp có đầy đủ độ đặc
hiệu, độ tuyến tính, độ chụm và độ đúng đáp ứng yêu cầu của AOAC. Phương
pháp có giới hạn phát hiện thấp 0,2 ng/ml do vậy có thể định tính và định lượng
đối với các mẫu có hàm lượng thấp. Kết quả thẩm định đáp ứng các yêu cầu của
AOAC do vậy có thể áp dụng đối với phân tích mẫu thực.
3.5. Áp dụng phương pháp trên một số mẫu chứa sâm Ngọc Linh
Các mẫu TPCN chứa sâm Ngọc Linh được chuẩn bị mẫu như quy trình đề
xuất mỗi mẫu chuẩn bị 3 lần song song. Tiến hành sắc ký theo điều kiện sắc ký
đã chọn, ghi lại sắc ký đồ và diện tích pic Majonoside R2. Kết quả định tính,

49
định lượng được minh họa trong hình 3.17, 3.18 (đầy đủ trong phụ lục 2) và
bảng 3.13.
3.5.1. Định tính
Sắc ký đồ các dung dịch mẫu thử từ R1-R7, N1-N4 đều có pic tại thời gian
lưu tương ứng với thời gian lưu của pic Majonoside R2 trong sắc ký đồ dung
dịch chuẩn. Phổ khối lượng tại vị trí pic đều có 2 ion con 457,4 và 143,1 với tỷ
lệ đáp ứng 457,4/143,1 nằm trong khoảng 70±20%. Do vậy có thể kết luận các
mẫu thử R1-R7, N1-N4 thể hiện phép thử định tính của Majonoside R2.
Sắc ký đồ mẫu thử N5 không xuất hiện pic có thời gian lưu trùng với thời
gian lưu của pic Majonoside R2 trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Vì vậy,
mẫu N5 không thể hiện phép thử định tính Majonoside R2.
a)
b)
Hình 3.17 Sắc ký đồ mẫu R2 (a) và N5 (b)

50
a)
b)
Hình 3.18 Kết quả định tính mẫu R2 (a) và N5 (b)

51
3.5.2. Định lượng
Dựa vào khối lượng cân mẫu thử, phương trình đường chuẩn, tính toán hàm
lượng Majonoside R2 trong các mẫu thử thể hiện định tính ở mục 3.5.1. Kết quả
thu được như sau:
Bảng 3.15 Kết quả định lượng Majonoside R2 trên một số mẫu
Mẫu Mô tả Hàm lượng (µg/g±SD) (n=3)
R1 Bột màu nâu đựng trong túi giấy 3,13±0,09
R2 Bột màu nâu 124,04±1,54
R3 Viên nén hình tròn màu nâu 233,78±4,66
R5 Cốm màu nâu đựng trong túi giấy 102,40±3,01
R6
Viên nang cứng, vỏ màu tím, ruột
bên trong màu vàng cam
1138,98±30,26
N1
Viên nang mềm vỏ màu nâu, ruột
bên trong màu nâu
4,70±0,11
N2
1,30±0,04
N3
1,10±0,04
N4
Viên nang mềm màu vàng nâu, ruột
bên trong màu nâu nhạt
0,98±0,02
Nhận xét: Hàm lượng Majonoside R2 trong các mẫu chứa sâm Ngọc Linh
rất đa dạng, có thể do nguồn gốc (sâm củ hoặc sâm sinh khối), số năm tuổi.

52
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
4.1. Lựa chọn phương pháp phân tích.
Phương pháp LC-MS/MS hiện nay được sử dụng phổ biến trên thế giới do
có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, phương
pháp này cũng được đưa vào phân tích nhiều chất trong các nền mẫu khác nhau
như thực phẩm, thực phẩm chức năng, dịch sinh học, nước thải,....
Các phương pháp phân tích Majonoside R2 đã được nghiên cứu trước đây
chủ yếu tập trung vào HPLC với detector UV-VIS và nền mẫu dược liệu với đặc
điểm là hàm lượng Majonoside R2 rất cao, có thể lên đến 8% [31]. Trong nền
mẫu thực phẩm chức năng, ngoài dược liệu sâm Ngọc Linh, chế phẩm còn được
phối hợp thêm nhiều loại dược liệu như Tỏi đen, Đông trùng hạ thảo cùng các
loại dược chất và tá dược, khác điều này gây khó khăn trong việc phân tách. Một
đặc điểm của Majonoside R2 và các saponin khác trong sâm Ngọc Linh là cấu
trúc không có nhóm mang màu nên hấp thụ ánh sáng UV ở bước sóng rất thấp,
do đó dễ bị ảnh hưởng bởi nền mẫu khi phát hiện bằng detector UV [1], [3],
[28]. Sâm Ngọc Linh là dược liệu quý, rất đắt tiền nên khi bào chế dạng chế
phẩm tỷ lệ sâm Ngọc Linh rất nhỏ do đó hàm lượng Majonoside R2 trong nền
mẫu này thấp hơn rất nhiều so với trong dược liệu, dẫn đến độ nhạy của detector
UV-VIS không đủ để phát hiện. Phương pháp khối phổ hai lần có thể giải quyết
được cả hai vấn đề này do có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
Detector khối phổ với chế độ quét toàn dải đã được tác giả Võ Hoàng Tùng
sử dụng để phân tích Majonoside R2, tuy nhiên phương pháp này vẫn có hạn chế
do không loại trừ được ảnh hưởng của nền mẫu [31]. Trong phương pháp khối
phổ hai lần, chất phân tích được xác định gồm 1 ion phân tử, 2 ion con và năng
lượng phân mảnh, tương ứng với số điểm nhận dạng (IP) bằng 4. Điều này phù
hợp với yêu cầu của châu Âu với phương pháp sắc ký lỏng khối phổ.
Trong các phương pháp phân tích bằng HPLC đã được nghiên cứu, cột
phân tách chủ yếu được sử dụng là cột với pha tĩnh là C18 với kích thước hạt

53
5µm, dẫn đến thời gian phân tích rất dài, có thể lên đến 85 phút [28]. Để khắc
phục điều này, cột nhồi pha tĩnh C18 với kích thước hạt nhỏ hơn đã được sử
dụng, giúp làm giảm thời gian phân tích đi rất nhiều mà vẫn đảm bảo được khả
năng phân tách. Một loại cột khác cũng được khảo sát đó là cột nhồi pha tĩnh
aminopropyl (Inertsustain NH2), một loại pha tĩnh thường dùng để phân tách các
hợp chất đường. Tuy nhiên, pic Majonoside R2 khi phân tích bằng cột
Inertsustain NH2, bị giãn rộng chân và không cân xứng. Điều này có thể lý giải
bởi Majonoside R2 có phần sapogenin không phân cực, làm giảm tính thân nước
của phần đường.
Về khảo sát thành phần pha động, hai dung môi được sử dụng là acetonitril
và methanol. Tuy nhiên methanol cho pic ra muộn hơn nhiều so với acetonitril
(ở cùng tỷ lệ) và chân pic cũng bị giãn rộng hơn. Việc sử dụng pha động là
acetonitril và nước theo chế độ gradient cũng giúp pic đẹp hơn, thời gian lưu
không quá muộn và đảm bảo được khả năng phân tách Majonoside R2 ra khỏi
nền mẫu.
4.2. Lựa chọn phương pháp xử lý mẫu
Các loại dung môi chiết khác nhau được sử dụng dựa trên độ tan của
Majonoside R2 trong các dung môi này. Kết quả cho thấy với nền mẫu dạng rắn,
dung môi chiết cho hàm lượng cao nhất là nước, điều này có thể giải thích do
nguồn gốc sâm Ngọc Linh cho vào chế phẩm đều là cao chiết bằng nước, làm
nước thấm dễ hơn vào trong nền mẫu. Trái ngược với nền mẫu dạng rắn, nền
mẫu dạng dầu được chiết tốt nhất với dung môi methanol, mẫu thử dạng dầu
được chiết bằng nước cho hàm lượng Majonoside R2 thấp nhất, là do bản chất tá
dược thân dầu không thấm nước nên làm giảm khả năng chiết.
Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra, thời gian chiết có ảnh hưởng lớn đến hàm
lượng hoạt chất chiết được. Đặc trưng của phương pháp chiết siêu âm là thời
gian chiết ngắn do làm tăng mức độ phân tán và khả năng thấm của dung môi.
Đối với mẫu dạng rắn, thời gian chiết mẫu tối ưu là 20 phút. Tuy nhiên với mẫu

54
dạng dầu, thời gian chiết tối ưu là 30 phút do khả năng thẩm thấu dung môi của
tá dược dạng dầu kém hơn so với nền mẫu rắn. Khi tăng thời gian chiết, hàm
lượng hoạt chất thu được không chênh lệch đáng kể, tuy nhiên, thời gian chiết
quá dài có thể làm tăng nhiệt độ của bể siêu âm dẫn đến làm hỏng chất cần phân
tích.
Kết quả khảo sát số lần chiết mẫu trên nền mẫu dạng rắn cho thấy hàm
lượng Majonoside R2 khi chiết 1 lần và chiết 2, 3 lần không khác nhau đáng kể,
điều này có nghĩa là việc chiết 1 lần đã lấy được hết hoạt chất ra khỏi nền mẫu.
Hơn thế nữa việc chiết 1 lần có ưu điểm tiết kiệm thời gian, dung môi chiết.
Trong một số nghiên cứu của Hoàng Hải Anh và Nguyễn Đức Hạnh, mẫu
thử sau khi chiết với dung môi được làm sạch bằng cột Diaion HP-20 [1], [17]
trước khi tiêm vào hệ thống. Điều này không cần thiết khi sử dụng phương pháp
LC-MS/MS do tính đặc hiệu rất cao. Vì vậy, mẫu thử sau khi siêu âm được lọc
qua màng lọc 0,22µm và tiêm trực tiếp vào hệ thống.
4.3. Thẩm định phương pháp
Phương pháp phân tích trong nghiên cứu này đã được thẩm định các chỉ
tiêu độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chụm và xác định được giới
hạn phát hiện, giới hạn định lượng. Kết quả cho thấy với cả 2 nền mẫu rắn và
lỏng, phương pháp đều có độ đặc hiệu cao, phù hợp theo quy định của Châu Âu
với 4 điểm định danh.
Khoảng tuyến tính được xây dựng với nồng độ từ 5ng/ml đến 200ng/ml,
kết quả cho thấy có sự tương quan chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ hoạt
chất với hệ số tương quan tuyến tính r > 0,995. Nồng độ tuyến tính của phương
pháp LC-MS/MS thấp hơn rất nhiều so với các phương pháp HPLC trước đây
(0,8mg/ml đến 3,2mg/ml) [1], điều này cho phép định lượng hoạt chất với nồng
độ rất thấp, cỡ µg/g, rất phù hợp với các chế phẩm trên thị trường với hàm lượng
dao động từ 0,25µg/g đến 1050,24µg/g. Mặt khác nồng độ chuẩn thấp cũng giúp

55
giảm lượng chuẩn sử dụng, tiết kiệm chi phí phân tích do chất chuẩn
Majonoside R2 rất đắt tiền.
Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,2ng/ml tương ứng với 10ng/g mẫu
thực cũng thấp hơn nhiều so với trong phương pháp của Shu-Zhu và cộng sự
(3µg/g) [28].
Độ chụm của phương pháp trên cả hai nền mẫu đều đáp ứng yêu cầu của
AOAC. Độ đúng được đánh giá qua độ thu hồi bằng phương pháp thêm chuẩn
vào nền mẫu thực, trên cả hai nền mẫu, độ thu hồi của phương pháp đều đáp ứng
yêu cầu của AOAC.
4.4. Áp dụng phương pháp vào nền mẫu thực tế
Trên thị trường hiện nay, số lượng sản phẩm chứa sâm Ngọc Linh khá lớn,
tuy nhiên, các chế phẩm hiện có khác nhau rất nhiều về nguồn gốc cũng như
hàm lượng sâm Ngọc Linh, điều này gây khó khăn trong công tác quản lý chất
lượng. Phương pháp định lượng Majonoside R2 được nghiên cứu với mục đích
đưa ra một phương pháp để đánh giá chất lượng các chế phẩm chứa sâm Ngọc
Linh.
Để kiểm tra khả năng áp dụng của phương pháp, nghiên cứu tiến hành thu
thập trên thị trường 12 mẫu sản phẩm chứa sâm Ngọc Linh dạng rắn (viên nén,
bột, cốm) và dạng dầu (viên nang mềm, kem). Kết quả cho thấy, trong 12 chế
phẩm có 1 chế phẩm không thể hiện phép thử định tính của Majonoside R2, các
chế phẩm còn lại đều có Majonoside R2 với hàm lượng rất khác nhau, từ
0,25µg/g đến 1150,24µg/g. Hàm lượng Majonoside R2 trong các chế phẩm trên
đều thấp, tuy nhiên có thể nhận thấy sự khác biệt hàm lượng do nguồn gốc của
sâm Ngọc Linh. Các mẫu chứa sâm Ngọc Linh sinh khối N2, N3, N4 đều có
hàm lượng hoạt chất thấp hơn nhiều so với mẫu có nguồn gốc từ rễ củ sâm Ngọc
Linh. Kết quả này tương đồng với kết quả nghiên cứu của Hoàng Hải Anh về
saponin trong sâm Ngọc Linh nuôi cấy mô [1]. Kết quả phân tích mẫu thực cũng

56
cho thấy phương pháp được nghiên cứu hoàn toàn có khả năng áp dụng để định
lượng Majonoside R2 trong các chế phẩm có trên thị trường.

57
Kết luận
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Qua nghiên cứu thực nghiệm chúng tôi thu được các kết quả sau:
1. Đã xây dựng được phương pháp định tính, định Majonoside R2 trong chế
phẩm dạng rắn và dầu chứa sâm Ngọc Linh bằng phương pháp LC-MS/MS với
ưu điểm xử lý mẫu đơn giản, thời gian phân tích ngắn và độ nhạy cao.
Quy trình cụ thể:
Mẫu thử được đồng nhất hóa, sau đó mẫu dạng rắn được chiết siêu âm bằng
nước trong 20 phút, mẫu dạng dầu được chiết siêu âm bằng methanol trong 30
phút.
Điều kiện sắc ký: Cột Inertsustain AQ C18 (100 mm x 2,1 mm; 3,0m),
nhiệt độ buồng cột: 40oC. Pha động gồm hai thành phần acetonitril (A) và nước
(chứa 0,1% acid formic) (B), tốc độ dòng 0,3ml/phút với chương trình dung môi
như sau: 0 phút: 15% A; 0-6 phút: 15% -40% A; 6-7 phút: 40% - 15% A; 7-10
phút: 15%A. Chất phân tích được phát hiện bằng detector khối phổ với chế độ
ion hóa dương (ESI +), số khối lựa chọn 787,5 → 143,1 (định lượng)/457,4
(định tính).
Đã thẩm định phương pháp trên nền mẫu dạng rắn và dầu. Kết quả cho thấy
phương pháp có tính đặc hiệu cao, có mối tương quan tuyến tính giữa đáp ứng
và nồng độ Majonoside R2 trong khoảng nồng độ 5ng/ml đến 200ng/ml. Độ
chụm và độ đúng của phương pháp đều đáp ứng được yêu cầu của AOAC. Giới
hạn phát hiện của phương pháp rất thấp (0,2ng/ml) chứng tỏ phương pháp có độ
nhạy rất cao.
2. Đã áp dụng phương pháp đối với một số chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh
(7 mẫu dạng rắn và 5 mẫu dạng dầu). Quy trình xử lý mẫu đơn giản, có thể áp
dụng với nhiều sản phẩm với thành phần khác nhau. Kết quả cho thấy có 1 mẫu
không thể hiện phép thử định tính với Majonoside R2, các mẫu còn lại hàm
lượng Majonoside R2 rất khác nhau (từ 0,25µg/g đến 1050,24µg/g) do nguồn

58
gốc nguyên liệu ban đầu khác nhau (rễ củ sâm Ngọc Linh, sâm Ngọc Linh sinh
khối).
Kiến nghị
 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để đánh giá hàm lượng Majonoside
R2 trong các chế phẩm chứa sâm Ngọc Linh có thành phần tương tự nền mẫu đã
khảo sát.
 Phát triển, đánh giá phương pháp định lượng Majonoside R2 trong chế
phẩm chứa sâm Ngọc Linh dạng lỏng.

Tiếng Việt
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Hoàng Hải Anh, Nguyễn Minh Cang, Nguyễn Minh Đức (2011), “Phân tích
thành phần các saponin chính trong sâm Việt Nam nuôi cấy mô bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”, Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh,
15, trang 579-584.
2. Đỗ Huy Bích và cộng sự (2006), “Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt
Nam”, NXB khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, trang 704-710.
3. Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V, NXB Y học, Hà Nội, trang 1313-
1314.
4. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà
Nội, trang 808-810.
5. Trần Bảo Trâm, Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Thị Thanh Mai, Trương Thị
Chiên, Phạm Thế Hải, Phạm Hương Sơn (2017), “Đánh giá sinh trưởng và
thành phần hoạt chất của Sâm việt nam (Panax vietnamensis) trồng ở Quảng
Nam”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 33,
trang 227-232.
Tiếng Anh
6. AOAC International (2013), AOAC official methods of analysis, Appendix
K: Guidelines for Dietary Supplements and Botanicals.
7. Bin Z., Jun F. X., Leepika T., Habtom W. R.(2012), “LC-MS-based
metabolomics”, Molecular BioSystems, 8, pp. 470-481.
8. Duong T. H. Q., Nguyen V. T. P., Nguyen T. T. H., Nguyen M. D.(2016),
“Effects of ocotillol-type saponins majonoside-R1 and vina-ginsenoside-R2
on abrogating depression and neuronal oxidative stress in socially isolated
depression mouse model”, International Journal of Applied Research in
Natural Products, 9, pp. 27-32.

9. European Commission (2002). Commission Decision 2002/657/EC
implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of
analytical methods and the interpretation of results. Off. J. Eur. Communitie,
pp. 8–36.
10. Jeong J. J., Le T.H.V, Lee S. Y., Eun S. H., Nguyen M. D., Park J. H., Kim
D. H. (2015), “Anti-inflammatory effects of vina-ginsenoside R2 and
majonoside R2 isolated from Panax vietnamensis and their metabolites in
lipopolysaccharide-stimulated macrophages”, International
Immunopharmacology, 28, pp. 700–706.
11. Konoshima T., Takasaki M., Ichiishib E., Murakamib T., Tokudab H.,
Nishinob H., Duc N. M., Kasaid R., Yamasaki K. (1999), “Cancer
chemopreventive activity of majonoside-R2 from Vietnamese ginseng,
Panax vietnamensis”, Cancer Letters, 147, pp. 11-16.
12. Konoshima T., Takasaki M., Tokuda H., Nishino H., Duc N. M., Kasai
R., Yamasaki K. (1998), “Anti-tumor-promoting activity of majonoside-R2
from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv. (I)”, Biol
Pharm Bull., 21, pp. 834-838
13. Le T. H. V., Lee G. J., Vu H. K. L., Kwon S. W., Nguyen N. K., Park J. H.,
and Nguyen M. D.(2015), “Ginseng Saponins in Different Parts of Panax
vietnamensis”, Chem. Pharm. Bull., 63, pp. 950–954.
14. Le T. H. V, Lee S. Y., Lee G. J., Nguyen N. K., Park J. H., Nguyen M.
D.(2015), “Effects of steaming on saponin compositions and
antiproliferative activity of Vietnamese ginseng”, Journal of Ginseng
Research, 39, pp. 274-278
15. Lee S. Y., Jeong J. J., Le T. H. V., Eun S. H., Nguyen M. D., Park J. H. and
Kim D. H. (2016), “Ocotillol, a Majonoside R2 Metabolite, Ameliorates
2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic Acid-Induced Colitis in Mice by Restoring the

Balance of Th17/Treg Cells”, Journal of Agricultural and Food Chemistry,
63, pp. 7024-7031.
16. Liu J., Xu Y., Yang J., Wang W., Zhang J., Zhang R., Meng Q.(2017),
“Discovery, semisynthesis, biological activities, and metabolism of ocotillol-
type saponins”, Journal of Ginseng Research, 41, pp. 373-378.
17. Nguyen D. H, Nguyen M. C., Nguyen M. D. (2010), “HPLC quantitative
determination of Majonoside R2 in Vietnamese ginseng”, Journal of
medicinal materials, 15, pp 219-222.
18. Nguyen M. D., Kasai R., Ohtani K., Ito A., Nguyen T. N., Yamasaki
K., Tanaka O. (1994), “Saponins from Vietnamese Ginseng, Panax
vietnamensis HA et GRUSHV. Collected in Central Vietnam. II”, Chem.
Pharm. Bull., 42, pp. 115-122.
19. Nguyen M. D., Kasai R., Ohtani K., Ito A., Nguyen T. N., Yamasaki
K., Tanaka O. (1994), “Saponins from Vietnamese Ginseng, Panax
vietnamensis HA et GRUSHV. Collected in Central Vietnam. III”, Chem.
Pharm. Bull., 42, pp. 634-640.
20. Nguyen M. D., Nguyen T. N., Kasai R., Ito A., Yamasaki K., Tanaka
O.(1993), “Saponins from Vietnamese Ginseng, Panax vietnamensis HA et
GRUSHV. Collected in Central Vietnam. I”, Chem. Pharm. Bull., 41, pp.
2010-2014.
21. Nguyen T. T. H, Matsumoto K., Kasai R., Yamasaki K., Watanabe H.
(1998). “In Vitro Antioxidant Activity of Vietnamese Ginseng Saponin and
Its Components.”, Biol. Pharm. Bull., 21, pp. 978-81.
22. Nguyen T. T. H., Murakami Y., Tohda M., Watanabe H., and Matsumoto K.
(2005), “Social Isolation Stress-Induced Oxidative Damage in Mouse Brain
and Its Modulation by Majonoside-R2, a Vietnamese Ginseng Saponin”,
Biol. Pharm. Bull,. 28, pp. 1389—1393

23. Nguyen T. T. H., Matsumoto K., Yamasaki K., Nguyen M. D., Nguyen T.
N. and Watanabe H.(1996), “Effects of Majonoside-R2 on Pentobarbital
Sleep and Gastric Lesion in Psychologically Stressed Mice”, Pharmacology
Biochemistry and Behavior, 53, , pp. 957-963,
24. Nguyen T. T. H., Matsumoto K., Yamasaki K., Nguyen M. D., Nguyen T.
N. and Watanabe H.(1997), “Majonoside-R2, a Major Constituent of
Vietnamese Ginseng, Attenuates Opioid-induced Antinociception”,
Pharmacology Biochemistry and Behavior, 57, pp. 285–291.
25. Qi L. W., Wanga C. Z. and Yuan C. S. (2011), “Isolation and analysis of
ginseng: advances and challenges”, Natural Product Reports, 28, pp. 467-
495
26. Shin B. K., Kwon S. W., Park J. H. (2015), “Chemical diversity of ginseng
saponins from Panax ginseng”, Journal of Ginseng Research, 39, pp. 287-
298
27. Shoji S. (2001), “Chemistry and Cancer Preventing Activities of Ginseng
Saponins and Some Related Triterpenoid Compounds”, J Korean Med Sci,
16, pp. 28-37.
28. Shu Z., Kun Z., Shaoqing C., Meselhy R. M. and Katsuko K. (2004),
“Simultaneous Determination of Triterpene Saponins in Ginseng Drugs by
High-Performance Liquid Chromatography”, Chem. Pharm. Bull., 52, pp.
995—998.
29. Tran Q. L., Adnyana I. K., Tezuka Y., Harimaya Y., Saiki I., Kurashige
Y., Tran Q. K., Kadota S. (2002), “Hepatoprotective effect of majonoside
R2, the major saponin from Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis)”,
Planta Medica, 68, pp. 402-406
30. Tran Q. L., Adnyana I. K., Tezuka Y., Nagaoka T., Tran Q. K. and Kadota
S. (2001), “Triterpene Saponins from Vietnamese Ginseng (Panax

vietnamensis) and Their Hepatocytoprotective Activity”, J. Nat. Prod. , 64,
pp. 456-461
31. Vo H. T., Amal K. G., Vu N. T., Jeong Y. H. (2015), “Quantitative
estimation of ginsenosides in different ages of Panax Vietnamensis and their
antiproliferation effects in hela cells”, African Journal of Traditional,
Complementary and Alternative Medicines, 12, pp. 79-83
32. Wang H. P., Zhang Y. B., Yang X. W., Zhao D. Q., Wang Y. P. (2016),
“Rapid characterization of ginsenosides in the roots and rhizomes of Panax
ginseng by UPLC-DAD-QTOF-MS/MS and simultaneous determination of
19 ginsenosides by HPLC-ESI-MS”, Journal of Ginseng Research, 40, pp.
382-394
33. Yamasaki K. (2000), “Bioactive Saponins In Vietnamese Ginseng, Panax
Vietnamensis”, Pharmaceutical Biology, 38, pp. 16-24
34. Yobimoto K., Matsumoto K., Nguyen T. T. H., Kasai R., Yamasaki K. and
Watanabe H. (2000), “Suppressive Effects of Vietnamese Ginseng Saponin
and Its Major Component Majonoside-R2 on Psychological Stress-Induced
Enhancement of Lipid Peroxidation in the Mouse Brain”, Pharmacology
Biochemistry and Behavior, Vol. 66, pp. 661–665.

PHỤ LỤC
1. Quy trình phân tích Majonoside R2
1.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
1.1.1. Thiết bị và dụng cụ
 Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ hai lần EVOQ QUBE của Bruker – Mỹ
 Cộtphân tích: Inertsustain AQ C18 (2.1mm x 100mm; 3.0µm) – Nhật
 Cân phân tích Shimadzu AWU220D (độ chính xác 0,01mg) – Nhật
 Bể lắc siêu âm Elma S60H – Đức
 Nồi cáchthủy Memmert – Đức
 Bộ lọc hút chân không Duran – Đức
 Máy cất nước hai lần OPTI-4D – Ấn Độ
 Dụng cụ: các loại pipet, bìnhđịnh mức, màng lọc mẫu, …….
1.1.2. Dung môi và hóa chất
TT Tên hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn
1 Ethanol Merck – Đức Dùng cho HPLC
2 Methanol Merck – Đức Dùng cho HPLC
4 Acetonitril Merck – Đức Dùng cho LC-MS
5 Nước cất Máy cất nước 2 lần DĐVN V
6 Acid formic Merck – Đức Dùng cho HPLC
1.2. Điều kiện sắc ký
 Cột: Inertsustain AQ C18 (100 mm x 2,1 mm; 3,0m)
 Nhiệt độ buồng cột:40oC
 Thể tíchtiêm mẫu: 2 µl
 Tốc độ dòng: 0,3 ml/ phút
 Thời gian phân tích:10 phút
 Pha động: Pha động A: Dung dịch acid formic 0,1% trong nước

Luận Văn Xây Dựng Phương Pháp Định Lượng Majonoside R2 Trong Chế Phẩm Chứa Sâm Ngọc Linh

Luận Văn Xây Dựng Phương Pháp Định Lượng Majonoside R2 Trong Chế Phẩm Chứa Sâm Ngọc Linh

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Luận Văn Xây Dựng Phương Pháp Định Lượng Majonoside R2 Trong Chế Phẩm Chứa Sâm Ngọc Linh

Similar to Luận Văn Xây Dựng Phương Pháp Định Lượng Majonoside R2 Trong Chế Phẩm Chứa Sâm Ngọc Linh (20)

More from Dịch Vụ Viết Thuê Luận Văn Zalo : 0932.091.562

More from Dịch Vụ Viết Thuê Luận Văn Zalo : 0932.091.562 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Luận Văn Xây Dựng Phương Pháp Định Lượng Majonoside R2 Trong Chế Phẩm Chứa Sâm Ngọc Linh