Тема 4 Безперервне культивування

1. Загальна технологія фармацевтичних та
біотехнологічних виробництв
Спеціальність 133 “Галузеве машинобудування ”
спеціалізації «Обладнання фармацевтичних і
біотехнологічних виробництв»
Tема 4. Безперервне культивування
НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ
ТЕХНОЛОГІЙ

2. Безперервна культура характеризується стаціонарними умовами
– видалення клітин урівноважується їх збільшенням за рахунок
поділу. Широке розповсюдження набули системи:
Хемостат - сталість хімічних характеристик та складу середовища, у
якому знаходяться мікроорганізми. Це процес, при якому у культуру з
постійною швидкістю безперервно подається свіже поживне
середовище, а об’єм культури підтримується на постійному рівні
шляхом безперервного видалення частини культуральної рідини.
Базується на ствердженні – абсолютна концентрація клітин не залежить
від поживних речовин, які знаходяться у середовищі і лише від
субстрату, якій лімітує ріст. Середовище складають так, щоб усі поживні
компоненти були у надлишку у порівнянні з компонентами, які необхідні
для синтезу клітини у необхідній концентрації. Цей єдиний компонент,
якого не стає лімітує ріст та контролює величину мікробної популяції у
сталому стані. Одної з найбільш важливих особливостей хемостату є те,
що мікроорганізми можуть рости у фізіологічно постійних умовах, коли
усі параметри культури залишаються постійними (об’єм культури,
концентрації розчиненого кисню, поживних речовин, клітинної біомаси,
pH, та інші).

3. Режим хемостата дозволяє за допомогою фіксованої швидкості
розбавлення підтримувати постійну швидкість поділу і густину клітин у
популяції. Якщо концентрація клітин у біореакторі низька, клітини можуть
рости зі швидкістю більшою, ніж швидкість розбавлення, оскільки ріст не
лімітується концентрацією лімітуючого компонента середовища.
Лімітуючий компонент - це речовина, яка потрібна для росту та присутня у
середовищі в лімітуючій концентрації (усі інші поживні речовини
знаходяться або в достатку, або в надлишку). Однак, якщо концентрація
клітин стає високою, кількість клітин, що видаляється із реактору не може
бути заміщена рістом оскільки додавання лімітуючого фактора не
достатньо. Це явище характеризується як “стабільний стан" чи
«рівноважний стан» (steady state), коли швидкість росту клітин
дорівнюється швидкості їх видалення з ферментера. При "рівноважному
стані" питома швидкість росту мікроорганізмів (μ) дорівнюється швидкості
розбавлення (D). Швидкість розбавлення визначається як швидкість потоку
середовища відносно об’єму культури в біоректорі:
D = Швидкість потоку середовища / Об’єм культури = F/V
Кожний мікроорганізм росте на певному субстраті зі своєю максимальній
швидкістю (μmax) (швидкість росту якщо не має лімітуючого фактору). Якщо
швидкість розбавлення вище ніж μmax, культура буде вимиватися із
реактора.

4. Турбідостат – це теж метод безперервного культивування. На
відміну від хемостату, де швидкують розбавлення контролює
швидкість росту мікроорганізмів, в турбідостаті щільність
мікробної біомаси визначає швидкість подачі поживного
середовища.
Щільність популяції у ферментері є постійною величиною. Як
тільки щільність, що контролюється нефелометрично, досягає
певного рівня, в культиватор починає поступати свіже живильне
середовище. Цей метод дозволяє підтримувати культуру у
стійкому становищі. Цей метод застосується в лабораторній
практиці, але не в промисловості - із-зі технічної складності.
Ріст в хемостаті та ріст в турбідостаті схожі між собою. В хемстаті
швидкість розбавлення D = const, яка визначає рівень біомаси, в
турбідостаті концентрація біомаси X = const, в результаті
встановлюється відповідальна величина D. Але при стабільному
стані культури швидкість розбавлення дорівнюється питомій
швидкості росту, а кожній величині швидкості росту відповідає
певна концентрація лімітуючої речовини, тобто кінцевий результат
буде однаковий в апаратах обох типів.

5. Цільові продукти утворюються в експонентній (первинні метаболіти -
ферменти, амінокислоти, вітаміни) і стаціонарній (вторинні метаболіти -
антибіотики) фазах. Різні режими культивування застосуються для
максимальної продукції того або іншого цільового продукту. Періодично
ферментер спорожняють, роблять виділення й очищення продукту.
Безперервний процес культивування мікроорганізмів має істотні
переваги перед періодичним. Безперервна ферментація здійснюється в
умовах сталого режиму, коли мікробна популяція і її продукти найбільш
однорідні. Застосування безперервних процесів ферментації створює
умови для ефективного регулювання й керування процесами біосинтезу.
Системи безперервної ферментації можуть бути організовані за
принципом повного витиснення або повного змішання.
Перший приклад - процес ферментації здійснюється в довгій трубі, у
якій з одного кінця безупинно надходять живильні компоненти й інокулят,
а з іншого з тією ж швидкістю випливає культуральна рідина. Дана
система проточної ферментації є гетерогенною.
Схема біореактора

6. При безперервній ферментації у ферментах повного змішання (гомогенний
спосіб) у всій масі ферментаційного апарата створюються однакові умови.
Застосування таких систем ферментації дозволяє ефективно управляти
окремими стадіями, а також всім біотехнологічним процесом і стабілізувати
продуцент у необхідному фізіологічному стані. Керування подібними
установками здійснюється двома способами: хемостат та турбідістат.
Хемостат (хімічні умови постійні) - це біореактор, у який постійно
подається свіже середовище, в той час як культуральна рідина постійно
виводиться з ферментера з тією ж швидкістю. Швидкість росту
мікроорганзмів у біореакторі контролюється швидкістю подавання
середовища.
A Б
Схема біореакторів для безперервного культивування мікроорганізмів
A, хемостат; Б, турбидостат. 1, середовище; 2, мішалка; 3, культуральна
рідина; 4, насос; 5,фотоелемент; 6, джерело світла.

7. Існують і інші способи регулювання безперервних процесів,
наприклад рН-стат. Є прямий зв’язок між швидкістю змінення рН
середовища та швидкістю росту культури. Змінення рН
викликається використання мікробними клітинами кислих або
лужних компонентів середовища. Так, при використанні
сірчанокислого амонію як джерела азоту, спостерігається
підкислення середовища. Змінення рН культуральної рідини
викликає її розбавлення свіжим середовищем.
• Загальна продуктивність апарату – це кількість продукту на
за одиницю часу
Px/V = X · V [kg/ · hour]
• Питома продуктивність апарату – це кількість продукту на
одиницю об’єму за одиницю часу
Qx = Px/V = X · D [kg/m3 · hour]

8. ПРОМИСЛОВЕ КУЛЬТИВУВАННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ РОЗРІЗНЯЮТЬ:
• Поверхневе - вирощування промислової культури на середовищі,
яке містить тверді частки субстрату:
- твердофазне – мікроорганізми ростуть на поверхні щільного
середовища.
- рідке – ростуть на поверхні рідкого поживного середовища
Глибинне – розподіляються у всьому об’ємі, а компоненти поживного
середовища надходять в результаті аерації та перемішування.
• Періодичне – мікроорганізми вирощують у стерильних умовах без
додавання свіжого культурального середовища.
• Безперервне – свіже культуральне середовище надходить у
ферментер безперервно, паралельно відводиться така сама
кількість клітинної суспензії.
• Періодичне з додаванням субстрату – до культури періодично
додають поживні речовини, а культуральне середовище не
видаляють до кінця культивування.

9. Стерильне та нестерильне культивування.
Ідеальний варіант біотехнологічного виробництва - це 100%
домінування виробничої культури. Реально вдається забезпечити
переважний ріст та життєздатність штаму-продуценту. Особливо це
має значення на початку ферментації. У подальшому з’являється
стороння мікрофлора і треба створити умови култивування, які б
пригнічували ріст сторонньої мікрофлори. Це так звана нестерильна
ферментація, яка насправді не існує, тому що створюються такі
умови, які забезпечують домінування виробничого штаму над
сторонньою мікрофлорою. Приклад - культивування у безперервних
умовах кормових дріжджів, отримання оцтової кислоти при низьких
рН, отримання кормового вітаміну В12 та анаеробне бродіння
органічних речовин з використанням термофільних мікроорганізмів в
температурних умовах 50-55оС. Також можна збільшити частку
посівного матеріалу до 20-25%.

10. Аеробне та анаеробне культивування.
Під час аеробного культивування мікроорганізми потребують кисню
у середовищі. Це досягається шляхом забезпечення необхідної
концентрації розчиненого кисню у рідкому середовищі, шляхом
надходження кисню по трубах (барботерах) з малими отворами по
всій довжині. При цьому кисень надходить у середовище у вигляді
дрібних пухирців, які розчиняються під дією мішалки. Інколи
використовують анаеробне культивування, наприклад для
отримання вітаміну В12.