2. Тема 8. ПРОМИСЛОВЕ ОТРИМАННЯ БАР
1. Загальні відомості про стадії
виробництво БАР
2
3. В загальному вигляді виробництво
любої біологічно-активної речовини
(БАР), в тому числі і антибіотика включає
в себе ряд стандартних стадій
(процедур), які мають забезпечувати
отримання цільового продукту заданої
якості. Ці процедури регламентуються
законодавчими актами як національного,
так і міжнародного рівня.
3
4. Відносно якості виробництва готових
лікарських засобів (ГЛЗ) - це GMP – Good
Manufacturing Practice – Практика
гарного виробництва. В Україна на
підставі цього міжнародного документа
розроблено та використовується
галузевий нормативний документ (ГНД)
“Продукція медичної та мікробіологічної
промисловості. Зміст, порядок
розробки, узгодження та
затвердження” (ГСТУ 64 01-98).
4
5. Основним документом, що регулює процес
виробництва БАР є регламент. Регламент -
нормативний документ, що встановлює вимоги
до технологічних процесів, технологічного
обладнання і приміщень, пов’язаних з якісним
виготовленням продукції при дотриманні умов
охорони праці та навколишнього середовища.
5
6. Регламент має певну структуру і включає в
себе багато розділів.
Складовую частиною регламенту є
технологічна схема виробництва (ТС), яка
показує в якому порядку мають бути проведені
стадії та операції технологічного процесу, в
результаті яких має бути отримана продукція
заданої якості.
В загальному вигляді ТС має такий вигляд.
6
8. В цілому схема пошуку та організація
промислового виробництва антибіотика
іллюструється даною схемою.
8
Виділення штаму-продуценту з
природного середовища
Підвищення антибіотичної
продуктивності штаму
Природня
мінливість
Індукований
мутагенез
Гено-інженерні
маніпуляції
Високопродуктивний штам-
продуцент
9. 9
Зберігання продуцента в
умовах, що забезпечують
сталість його властивостей
Підвищення антибіотичної
продуктивності штаму
Приготування
поживного
середовища
Отримання посівного
матераілу
Виробничий біосинтез
(ферментація)
Попереднє оброблення
культуральної рідини та
виділення антибіотика
11. Першим етапом на шляху до
промислового випуску антибіотика є
створення лабораторного регламенту,
завдання якого – розроблення
оптимального методу виробництва
антибіотичної речовини та напрацювання
певної кількості антибіотика для
проведення І етапу клінічних досліджень
на ефективність лікувальної та токсичної
дії на лабораторних тваринах.
11
12. При цьому проводиться уточнення
технологічних параметрів процесу отримання
антибіотика в лабораторних умовах.
Позитивні результати І клінічних
випробувань дозволяють перейти до до ІІ
етапу клінічних випробувань, коли отримані
дослідні партії антибіотика на підставі
лабораторного або дослідно-промислового
регламенту використо-вують для проведення
досліджень в умовах лікарні. Позитивні
результати таких випробувань дають підставу
для розроблення інструкції по використанню
препарату антибіотика та затвердження
нормативно-технічної документаціїї (НТД) на
виробництво даного препарату антибіотика.
12
13. І. Етап підготовки та вирощування посівного
матеріалу (інокуляту)
Підготовка посівного матеріалу – це
багатоступеневе вирощування культури
продуцента при поступовому збільшенні обсягу
його біомаси. Від кількості та якості посівного
матеріалу залежить успіх ферментації.
Кількість етапів підготовки посівного
матеріалу залежить від:
1) таксономічної приналежності продуцента, від
його питомої швидкості росту.
2) об’єму поживного ферментаційного середовища.
13
14. Інокуляція може бути: одноступенева,
двоступенева, трьохступенева. Вона залежить
від робочого об’єму виробничого ферментера та
кількості інокуляту.
Вимоги до посівного матеріалу:
• 1. Чистота – відсутність контамінуючої
мікрофлори (визначається мікроскопіюванням)
• 2. Заданий титр клітин продуцента- кількість
клітин продуцента в 1 мл поживного середовища.
• 3. Висока фізіологічна активність культури;
• 4. Кількість інокуляту складає 5 -10 % від об’єму
поживного середовища у ферментері.
14
15. Етап ІІ. Виробничий біосинтез (ферментація)
відбувається при технологічних параметрах, що
відображають фізіолого-біохімічні особливості
біологічного агенту.
рН середовища - Більшість бактеріальних
продуцентів утворюють антибіотики при
нейтральному значенні рН (рН 7,0), крім
молочнокислих стрептококів продуцентів нізину,
їх оптимальне значення рН 5,5 – 6,0.
Для культивування актиноміцетів оптимальне
значення рН 6,7 – 7,8.
Для культивування мікроміцетів оптимальне
значення рН 4,5 – 5,0.
15
16. Температура – Т, °С
Для більшості бактеріальних продуцентів
оптимальною є температура 30 – 37о
С.
Виключення – продуцент граміцидину, який
культивують при 40о
С.
Актиноміцетні продуценти антибіотиків
культивують при 26–30о
С..
Мікроміцетні продуценти антибіотиків
культивують при температурі 25 – 28о
С.
16
17. Аерація – суттєвий фактор при
культивуванні продуцентів антибіотичних
речовин, зважаючи на те, що більшість
продуцентів – аероби. Ступінь аерації – один
з засобів зміни окисно-відновних умов
середовища (ступінь аерації – це
співвідношення об’єму повітря до об’єму
середовища за 1хв). Більшість антибіотиків
утворюються при значенні ступеню аерації
близькому до одиниці.
17
18. В біосинтезі антибіотиків дуже важливим є
негативне явище піноутворення. Причини
утворення піни: наявність у поживному
середовищі досить великої кількості ПАР
(білків; високий ступінь аерації).
Утворення піни може стати причиною
контамінації культуральної рідини. Крім того,
цей фактор визначає коефіцієнт заповнення
ферментера: чим піноутворення
інтенсивніше, тим коефіцієнт заповнення
нижчий. З піноутво-ренням борються
механічним та хімічним шляхом - добавлють
до ПС природні (соняшникова олія, тваринні
жири) та штучні (ніоген, пропінол) поверхнево-
активні речовини.
18
19. Контроль процесу ферментації:
1 . Мікробіологічний – відсутність сторонньої
мікрофлори, титр клітин продуценту,
фізіологічний стан клітин.
2. Біохімічний – визначення динаміки
споживання основних джерел вуглецю,
азоту, накопичення цільового препарату.
3. Технологічний – визначення параметрів
середовища – рН, температура, розчинний
кисень.
19
20. Етап ІІІ. Попереднє оброблення
культуральної рідини, виділення і
очищення антибіотиків
В залежності від місця накопичення
антибіотика підбирають методику його
виділення. Так, якщо антибіотик знаходиться
в культуральній рідині, його виділяють
методами екстракції, використовуючи з цією
метою розчинники, що не змішуються з
водою, осаджують у вигляді нерозчинної
сполуки або сорбують іонообмінними
смолами.
20
21. З клітин мікроорганізмів антибіотики
виділяють екстрагуванням органічними
розчинниками. При цьому досить часто
клітини продуцентів-бактерій необхідно
руйнувати, тоді як мікроміцети мають більшу
проникність клітин, і антибіотик може бути
екстраговано з неушкоджених клітин.
Методи руйнації клітин поділяють на:
а) механічні – балістичні, екструзійні
(продавлювання з піском);
б) фізичні – термошок, осмотичний шок, дія
ультразвуку, процес заморожування-танення,
просте висушування клітин;
21
22. в) хімічні – дія кислот, лугів, ПАР;
г) ензиматичні – дія літичних ферментів
(дріжджолітин);
д) біологічні – дія антибіотиків, дія фагів;
е) дія речовин, що призводять до інгібування
біосинтезу клітинної оболонки.
Відділення нативного розчину, що містить
антибіотик, від біомаси та зважених частинок
здійснюють методами фільтрації і
центрифугування.
22
23. Заходи, що використовуються для
покращення фільтрації:
- кислотна коагуляція;
- теплова коагуляція;
- введення у рідину електролітів;
- використання наповнювачів, покращувачів
фільтрації.
23
24. Очищення антибіотиків
Використовуються, як правило, методи
хімічного очищення.
Мета хімічної очистки – видалення
антибіотика з нативної рідини, його
концентрування і звільнення від супутніх
домішок для отримання високоочищеного
препарату. Очищення антибіотиків – це дуже
важливий етап, оскільки кількість домішок
сягає в культуральній рідині іноді до 99%.
Основні методи очищення – це екстракція,
осадження, сорбція на іонообмінних
матеріалах.
24
25. Очищення може здійснюватись багаторазо-
вим переведенням антибіотика з одного
розчинника в інший з використанням
попереднього осадження –
перекристалізації. Кристалізація –
принцип полягає у різкому зменшенні
розчинності в результаті зміни температури
розчину, як правило, пониження (виняток –
еритроміцин, підвищення) чи завдяки
переводу антибіотика в іншу хімічну форму,
менш розчинну.
25
26. Іонообмінна сорбція – водні розчини
антибіотика, який за своєю хімічною
природою є кислотою, лугом, амфотерною
сполукою, пропускають крізь колонки з
відповідними іонообмінними смолами.
Антибіотики сорбуються на смолах, а розчин
з домішками, які мають заряд, протилежний
заряду антибіотика, проходить крізь колонку. .
Потім за допомогою специфічних елюентів
(розчини, які порушують зв'язок антибіотика зі
смолою) здійснюють процес десорбції.
26
27. Метод осадження – базується на
зв’язуванні антибіотика з органічними або
неорганічними речовинами з метою
отримання нерозчинного осаду, який, як
правило, за допомогою центрифугування
відділяють і висушують. Осадження –
найбільш розповсюджений метод у
виробництві тетрациклінових антибіотиків.
27
28. Екстракція – цей метод базується на різній
розчинності різних хімічних форм антибіотика
у воді та органічних розчинниках, що не
змішуються з водою. Наприклад,
переведення пеніциліну із солевої форми у
кислотну та навпаки, що досягається зміною
рН розчину, забезпечує перехід з одного
розчинника в інший при їх контакті.
28
29. Концентрування очищених розчинів
антибіотика – це видалення надлишкової
вологи з розчинів антибіотиків.
Відбувається за допомогою вакуум-
випарювання через лабільність останнього
або при використання сучасних мембранних
методів розділення – мікро- та
ультрафільтрації через селективні пористі
мембарни. При цьому досягається подвійний
ефект – концентрування розчинів
антибіотика та очищення його від
низькомолекулярних домішок.
29
30. Сушіння антибіотиків
Метод видалення залишкової вологи з
концентрованих розчинів- вміст сухих
речовин – від 30-40% до 90- 95 %. Сушіння
антибіотиків, зважаючи на термолабільність,
може відбуватись за допомогою:
- ліофільної сушарки;
- розпилювальної сушарки;
- у вакуум-сушильних шафах.
30
31. Отримання готової лікарської форми
форми антибіотиків
Одним із завершальних етапів
виробництва антибіотиків є отримання
готових до використання лікарських форм.
Антибіотики можуть бути представлені
ін’єкційними, пероральними, ректальними та
вагінальними лікарськими формами. Для
прийому внутрь антибіотики випускають у
вигляді таблеток, капсул, гранул або
порошків для приготування суспензій,
сиропів, а також у вигляді готовий водних
суспензій. Більшість антибіотиків випускають
у вигляді таблеток та капсул.
31
32. Антибіотики характеризуються низкою
особливостей, які визначають технологічні і
практичні аспекти лікарських препаратів з
ними:
• недостатня стабільність при зберіганні;
• взаємодія між собою і з багатьма
допоміжними речовинами;
• погана розчинність деяких антибіотиків у
воді;
• недостатня стабільність водних розчинів
антибіотиків;
• термолабільність.
32
33. Лікарські форми, що містять антибіотики,
повинні відповідати наступним вимогам:
• приготування лікарських форм з
антибіотиками повинно здійснюватися в
асептичних умовах.
• забезпечувати стабільність антибіотика
як у процесі технології, так і при зберіганні.
• забезпечувати необхідну концентрацію
антибіотика в макроорганізмі при його
мінімальному дозуванні.
33
34. Важливим етапом технологічного
процесу отримання антибіотиків є
контроль готових препаратів
Готові препарати антибіотиків підлягають
біологічному та фармакологічному контролю.
Біологічний контроль: з’ясування
стерильності (або обнасіненості
мікроорганізмами) готового препарату. Для
цього використовують два методи:
1) Інактивація антибіотика і висів його на
відповідне поживне середовище.
34
35. 2) Метод мембранної фільтрації.
Цей метод використовують для контролю
стерильності антибіотиків, для яких невідомі
інактиватори їхньої антибіотичної активності.
Розчин антибіотика пропускають крізь
мембранні фільтри з діаметром пор 0,75 мкм.
Потім здійснюється висів на поживні
середовища змивів з цих фільтрів.
35
36. Фармакологічний контроль
До антибіотиків, що використовуються в
лікарській практиці висувають суворі вимоги.
Перед введенням в практику нового
лікарського препарату визначають:
пірогенність, гостру і хронічну токсичність
(вплив на кров, центральну нервову систему,
дихання), встановлюють дозу, що спричинює
загибель 50% піддослідних тварин LD50 і
абсолютно смертельну дозу LD100.
36
