Тема 5 Технологічні принципи біотехнологічних виробництв. Стерилізація та підготовка інокуляту

1. Загальна технологія фармацевтичних та
біотехнологічних виробництв
Спеціальність 133 “Галузеве машинобудування ”
спеціалізації «Обладнання фармацевтичних і
біотехнологічних виробництв»
Tема 5. Технологічні принципи біотехнологічних
виробництв. Стерилізація та підготовка інокуляту
Стабніков Віктор Петрович
НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ
ТЕХНОЛОГІЙ

2. Усі біотехнології основуються на використанні біологічного агенту
для отримання цільового продукту.
Біологічний агент найбільш важливий елемент. Незважаючи на те,
що діапазон біологічних агентів, що застосуються у біотехнологіях
на теперішній час значно розширився, традиційний агент –
мікробна клітина широко використовується у різних
біотехнологіях (Taблиця).
Мікробні штами – продуценти біологічно-активних речовин з
різними властивостями можуть бути ізольовані із природних
субстратів, а потім бути значно покращені за допомогою як
традиційних методів (селекція та скринінг) або сучасних методів
(клітинна та генна інженерія).

3. Деякі біологічні агенти, що використовуються для
отримання комерційних продуктів
Харчові продукти
Saccharomyces cerevisiae Хлібопекарні дріжджі, вино, спирт
Streptococcus thermophilus Йогурт
Gluconobacterium suboxidans Оцет
Penicillium roquefortii Сир Рокфор
Хімічні речовини
Clostridium acetobutylicum Ацетон та бутанол
Aspergillus niger Лимонна кислота
Амінокислоти та Аромати
Brevibacterium sp. L-глутамінова кислоа
Corynebacterium glutamicum L – лізин
Pycnoporus cinnabarinus Ванілін

4. Деякі біологічні агенти, що використовуються для
отримання комерційних продуктів
Фармацевтичні препарати
Penicillium chrysogenum Пеніцилін
Cephalosporium acremonium Цефалоспорин
Bacillus brevis Граміцидин S
Rhizopus nigricans Трансформація стероїдів
Hybridome Імуноглобулін
Hybridome Моноклональні атнтитела
Cell lines of mammals Інтерферон
Esherichia coli Інсулін, гормони росту,
інтерферон

5. Деякі біологічні агенти, що використовуються для отримання
комерційних продуктів
Інсектициди
Bacillus thuringiensis Ендотоксин білкової природи
Біопаливо
Clostridium butyricum Водень
Anaerobic consorcium Біогаз
Ферменти
Aspergilus oryzae Амілаза
Bacillus subtilis Протеаза
Trichoderma viride Пектіназа
Вітаміни
Propionibacterium Витамін - B12
Blakeslea trispora β-каротін
Ashbya gossypii Рібофлавін

6. Головними параметрами відбору продуцента для практичного
застосування є:
1. Їх безпечність для споживача; виробничого персоналу; довкілля.
2. Активність біосинтезу, що характеризується за слідуючими параметрами:
акумуляція іншого (нецільового) біологічно активного продукту;
фаза та швидкість біосинтезу продукту;
питома швидкість росту.
3. Відношення до різних джерел вуглецю:
ефективність утилізації;
здатність рости при високій концентрації субстрату.
4. Відношення до різних джерел азоту.
5. Вимога до додаткових факторів росту.
6. Чутливість до субстратів, які присутні у сировині.
7. Відношення до кисню.
8. Оптимум рН та чутливість до його змінювання.
9. Оптимальна температура.
10. Проникливість клітинної стінки.
11. Можливість застосування антибіотиків або хімічних речовин для
пригнічення сторонніх мікроорганізмів.
12. Стабільність на фагостійкість.

7. Взагалі, промисловий мікробний штам повинен:
- зберігати свої основні фізіолого-біохімічні властивості під час тривалої
ферментації;
- бути стійким до дії мутагенних факторів, фагів, мікробної інфекції;
- бути безпечним для людей та довкілля, не утворювати токсичні побічні
продукти та відходи;
- мати високу продуктивність та бути економічним.
В останній час змішані мікробні популяції стали більш часто
використовуватися у біотехнології. Мікробні асоціації на відміну від
монокультур мають вищу здатність споживати та переробляти складні
субстрати, вищу стійкість до несприятливих факторів навколишнього
середовища та токсичних субстратів, вищу продуктивність. Головна
область застосування змішаних мікробних культур – це технології довкілля,
біодеградації та утилізації комплексних субстратів.
Клітини рослин та тварин також використовують як нетрадиційні агенти у
біотехнологіях. Велику увагу приділяють в теперішній час трансгенним
клітинам мікроорганізмів, рослин та тварин, тобто клітинам, що містять ген
чужого організму, включений у хромосоми. Трансгенні організми отримують,
використовуючи методи генної інженерії.

8. Bacillus subtilis, продуцент
протеази
Pycnoporus cinnabarinus,
продуцент ваніліну
Penicillium chrysogenum,
продуцент пеніциліну
Bacillus thuringiensis, продуцент
інсектициду

9. Tехнологічні принципи біотехнологічних виробництв
Усі біотехнологічні виробництва можна поділити на дві великі групи:
метою першої групи – отримати максимальну кількість біомаси, метою
другою групи є отримання максимального виходу продуктів
життєдіяльності кліток (метаболітів).
Перша група включає живі клітини (наприклад, хлібопекарські дріжджі),
інактивована біомаса дріжджів як білковий корм для тварин, препарати
для захисту рослин від шкідників. Друга група – це органічні кислоти,
ферменти, амінокислоти, антибіотики, а сама біомаса мікроорганізмів є
відходом виробництва.
У загальному виді будь-який біотехнологічний процес включає три
основні стадії:
• предферментаційну (підготовка живильних середовищ; зберігання й
підготовка культури продуцента (інокулята); підготовка апаратів для
ферментації; підготовка повітря;
• ферментаційну (основна ферментація);
• постферментаційну (виділення та очищення кінцевого продукту;
отримання товарних форм препарату).

10. ЗНАЧЕННЯ АСЕПТИКИ В БІОТЕХНОЛОГІЧНИХ ПРОЦЕСАХ
Біотехнологічні процеси, як правило, проводять в асептичних умовах.
Асептика – це сукупність заходів, спрямованих на попередження
потрапляння у середовище сторонніх речовин. Використання асептики в
біотехнології забезпечує можливість застосування біологічного агенту
(продуценту біологічно активної речовини) і запобігти попадання
сторонніх інших мікроорганізмів. Асептика включає в себе: вологе
прибирання приміщення; обробку антисептичними речовинами;
ультрафіолетовим випромінюванням; використання стерильних
інстументів; подача стерильного повітря у ферментери та інші.
Існує механічний, фізичний та хімічний захист біооб'єктів.
Механічний захист – це видалення механічних домішок (наприклад, із
повітря, що подається на аерацію, за допогою фільтрів.
Фізичний захист – це обробка повітря або поверхонь апаратів
ультрафіолетовим випромінюванням, кип'ятіння, теплова стерилізація.
Хімічний захист – обробка антисептичними речовини (хлор, хлорамін,
хлорне вапно, озон, перекис водню, формалін).
Антисептики – це хімічні сполуки, які згубно діють на мікроорганізми, їх
дія зветься бактеріостатичною, коли затримується ріст та розмноження і
бактерицидною, коли викликає загибель бактерій.

11. Методи забезпечення стерильності ферментації
Підготовка стерильного повітря для ферменації
Для проведення стерильного процесу ферментації велике значення має
стерилізація повітря. Звичайно у повітрі міститься 0,8·103–104 на 1 м3
різних мікроорганізмів (бактерії, актиноміцети, дріджді, віруси). Повітря, що
подається на вирощування промислових продуцентів необхідно
стерилізувати. У промисловості використовується наступна технологічна
схема:
1 – фільтр; 2 – компресор; 3 – теплообмінник; 4 – вологоуловлювач; 5 –
ресивер; 6 – теплообмінник; 7 – головний фільтр.

12. Повітря на аерацією у посівні та виробничі ферментери подається
за допомогою компресора (2). Перед стиском повітря проходить
через спеціальний фільтр (1) очищення від механічних домішок.
Нагріте у процесі компресування повітря охолоджується в
теплообміннику (3) і після нього поступає у ресивер (4), далі
охолоджується у теплообміннику (5) для конденсації вологи,
підігрівається у кожухотрубному теплообміннику (6) і проходить
часткове очищення від мікроорганізмів на фільтрі грубого
бактеріального очищення (7). Повітря повністю очищується від
мікроорганізмів на фільтрі тонкого бактеріального очищення (на
схемі не показаний). Для тонкої бактеріальної очищення повітря
застосовують фільтри різних типів. Поширеними є фільтри з
тканиною Петрянова.
Повітря, що виходить з ферментера та посівних апаратів,
висушується від вологи на фільтрі і повинно містити допустиму
концентрацію мікроорганізмів.

13. Стерилізація поживних середовищ
Стерилізація поживних середовищ у промислових умовах здійснюється
двома методами: періодичним і безперервним.
Періодичний метод стерилізації застосовується у разі використання
невеликих об'ємів середовища й полягає в тому, що середовище
нагрівається до температури 120 – 130 °С безпосередньо у ферментерах
або в спеціальних ємностях-стерилізаторах, витримується при цій
температурі протягом 30 – 60 хвилин (залежно від об'єму середовища і
його складу), після чого охолоджується до 27 – 30 °С.
Безперервний метод стерилізації. Нестерильне середовище з збірника 1
подається відцентровим насосом 2 зі швидкістю від 15 до 20 м3/годину в
стерилізаційну колонку 3. Гострий пар з тиском 0.6 MPa та температурою
160°С постійно подається в колонку 3. Середовище в колонку подається
знизу. Пар подають по внутрішній трубі, що має щілиноподібні прорізи,
завдяки чому пар надходить у середовище, швидко її нагріваючи до
температури 130 °С. Далі середовище надходить у витримувач 4, де
витримується певний час при цієї температурі для забезпечення
стерильності середовища. Час витримки залежить від складу середовища
й триває 10 – 20 хвилин. Звідси стерильне середовище надходить у
теплообмінник – рекуператор 6, де теплова енергія застосується для
підігріву нового нестерильного середовища, охолоджується до 30 – 35 °С
(на виході) у теплообміннику-охолоджувачу 7, і надходить у ферментер 8.

14. Стерилізаційна установкa безперервної дії
1, збірник з середовищем; 2, насос; 3, стерилізаційна колонка; 4, витрумавач;
5, пробовідбірник; 6, теплообмінник-рекуператор; 7, теплообмінник-
охолоджувач; 8, ферментер.
.
Вода
Пар
Вода
Поживне
середовище

15. Безперервний метод стерилізації має ряд переваг: можливість
автоматичного регулювання процесу, швидке й рівномірне
нагрівання середовища, забезпечення більш повної стерильності
середовища.
Практично середовища з натуральних компонентів (меляса,
кукурудзяний екстракт, гідролізати, піногасник) стерилізуються при
підвищеній температурі, а розчини солей - шляхом холодної
фільтрації.
Для забезпечення стерильності обладнання найбільш ефективним
способом для малогабаритних апаратів є автоклавування, а для
великогабаритних апаратів та трубопроводів - обробка гострою
парою під тиском не менш 0,3 МПа.
Окремі блоки апаратів, у тому числі датчики вимірювальних
приладів і регуляторів, не витримують високотемпературну парову
стерилізацію і тоді можуть бути застосовані холодні способи
стерилізації. Найбільш прийнятні методи з використанням
розчинів різних антисептиків, наприклад, формаліну.

16. Принципова схема реалізації біотехнологічних процесів
у загальному виді може бути представлена блок-схемою, у якій зроблена
спроба охопити всі варіанти ферментаційних процесів (Схема).
1, реактор для приготування поживного середовища; 2, центробіжний
насос; 3, апарат для приготування твердого середовища; 4, стерилізаційна
колонка (середовище нагрівається до температури стерилізації); 5,
витримувач середовища при температурі стерилізації; 6, теплообмінник
для охолодження середовища; 7, мірник-збірник для поживного
середовища; 8, дозатор; 9, анаеробний ферментер; 10, аеробний
ферментер для глибинного культивування;11, біокаталітичний реактор;
12, ферментер для поверхневої твердо фазної ферментації; 13, ферментер
для поверхневої рідинної ферментації; 14, екстрактор; 15, сепаратор для
відділення біомаси; 16, система локальної автоматики; 17, плазмолізатор
біомаси; 18, дезінтегратор біомаси; 19, випарна установка; 20,
фракціонування дезінтегратів; 21, сушарка й інші апарати для
зневоднювання; 22, апаратури для розфасовки продукту; 23, іонообмінні
колони, апарати для хімічних і мембранних методів виділення,
центрифуги, фільтри, кристалізатори й ін. пристрої.
Умовні позначки: рН - розчин для корекції рН, П - компоненти й
середовища для підживлення, Пос - посівний матеріал, В - стиснене
повітря, ПАВ - піногасник, Ср - стерильне живильне середовище, БА –

17. Принципова схема реалізації біотехнологічних процесів (по У.Е. Вієстур і ін.,
1987).

18. Приготування поживного середовища
Поживне середовище – це субстрати, які складаються з компонентів
необхідних для росту та життєдіяльності мікроорганізмів. Основу
поживних середовищ для культивування мікроорганізмів складають
джерела органічного вуглецю. В біотехнології застосуються безліч
різних субстратів. Важливими субстратами є відновлювані субстрати –
продукти фотосинтезу.
Середовища для біотехнологічних процесів включають джерела
вуглецю та енергії, мінеральні елементи, та фактори росту. Часто
використовуються субстрати з непостійним складом: відходи різних
промислових виробництв, такі як меляса, сік цукрового тростина,
гідролізати відходів сільськогосподарських рослин та
деревооброблювальної промисловості, відходи харчової
промисловості (молочна сироватка, виноградні, яблуневі, томатні
вижимки), компоненти стічних вод (стічні води виробництва крохмалю)
та інші. Але для виробництва висококоштовних цінних біотехнологічних
продуктів використовується стандартні середовища з глюкозою або
цукрозою як джерело вуглецю.

19. Мінеральні елементи необхідні для росту біологічних агентів включають
макро- та мікроелементи. Макроелементи – це азот, фосфор, сірка, калій
та магній. Азот додається у формі сечовини, амонію або у вигляді солей
амонію. Але, деякі продуценти застосують нітрати або органічні форми
азоту. Мікроелементи (бор, молібден, кобальт, марганець, кальцій, мідь,
цинк, нікель, хлор, натрій, кремній, та інші) потребуються у дуже низькій
кількості. Ці елементи завжди присутні в природних субстратах та у воді,
тому немає потреби додавати їх у живильне середовище.
Деякі продуценти потребують для свого росту додавання у середовище
факторів росту (амінокислот чи вітамінів). Ці речовини можуть
додаватися у чистому виді. Одночасно вони присутні у таких субстратах
як кукурудзяний екстракт, сік картоплі, дріжджовий екстракт, відходи
виробництва молочних продуктів, які можуть також додаватися у
живильне середовище як фактори росту.
Попередники та синтетичні речовини, що стимулюють ріст
мікроорганізмів, широко застосуються у виробництві антибіотиків.
Синтетичні речовини, що можуть включатися у молекулу антибіотика,
наприклад фенілацетамід та феноксиоцтова кислота в виробництві
пеніциліну, посилюють його синтез.

20. Поверхнево-активні речовини застосуються у біотехнології як
антивспінювальні агенті. Це такі речовини як Твін 80 (полісорбат 80)
та олеїнова кислота.
Готування живильних середовищ здійснюється у спеціальних
реакторах, обладнаних мішалками. Залежно від розчинності й
сумісності компонентів середовищ можуть бути застосовані окремі
реактори. Важливим елементом підготовки поживних середовищ є їх
стерилізація для запобігання можливої контамінації культивування
промислового мікроорганізму. Це досягається шляхом попередньої
стерилізації усіх потоків, що надходять до стадії ферментації.
Як дозуюче встаткування при цьому застосовуються вагові й об'ємні
пристрої, використовувані в харчовій і хімічній промисловості.
Транспорт речовин здійснюється насосами, стрічковими й шнековими
транспортерами. Сипучі компоненти подають у ферментери за
допомогою вакуумних насосів. Часто застосовують принцип
попередніх сумішей, тобто солі попередньо розчиняють і потім
транспортують по трубопроводах, дозуючи їхню подачу по обсягу.

21. Підтримка й підготовка чистої культури
є дуже важливим моментом предферментаційної стадії, тому що
визначають ефективність усього біотехнологічного процесу. Штам-
продуцент цільового продукту – є основою кожної біотехнології. Тому
дуже важливо зберігати на протязі тривалого часу його корисні
властивості.
Кожне біотехнологічне виробництво обов’язково має відділення чистої
культури, де ведеться робота с промисловим продуцентом. Для
збереження корисних властивостей культура повинна періодично
пересіватися на свіже поживне середовище та зберігатися у холодильнику
при температурі 3-4°С.
Для тривалого зберігання застосують такі методи:
• зберігання під шаром стерильного мінерального (вазелінового) масла;
можливий строк зберігання – 6 – 12 місяців.
• зберігання в ампулах в 10 %-ному розчині гліцерину в запаяних
ампулах в атмосфері рідкого азоту при низьких температурах (- 196 ÷ -
165 °С); можливий строк зберігання до 5 років.
• зберігання в ліофільно-висушеному стані; можливий строк зберігання
5-6 років.
Існують і інші специфічні для окремих мікроорганізмів методи зберігання
виробничих штамів. Так, спороутворюючі бактерії можна роками
зберігати в стерильному ґрунті.

22. У відділенні чистої культури здійснюють зберігання виробничих штамів і
забезпечують їх реактивацію й наробіток інокулята в кількостях,
необхідних для початку процесу.
При вирощуванні посівних доз інокулята застосовують принцип
масштабування, тобто проводять послідовне нарощування біомаси
продуцента в колбах, а далі в серії послідовних ферментерів. Кожний
наступний етап даного процесу відрізняється по обсягу від попереднього
звичайно на порядок (в 10 разів). Отриманий інокулят по стерильній
посівній лінії направляється далі в основний ферментер, у якому
реалізується промислова ферментаця.
Розмір посівних апаратів для різних виробництв може змінюватися від 10
л до 50 м3.
Біотехнологічні процеси дуже різноманітні. Тому різні методи та
апарати використовуються для їх реалізації