kloning DNA

1. Kloning DNA
Ermia Hidayanti
Hestu Anggrah Eny
Kiki Riana Yulita Sari
Gusti Arisandi

3. Proses aseksual untuk
menghasilkan individu-
individu dari jenis yang sama
(populasi) yang identik secara
genetik.
Kloning DNA adalah teknik untuk memproduksi fragmen
DNA yang identik

4. Sejarah Kloning
1997
1952
1903
Willmut dan Champbell, telah sukses melakukan
cloning domba dewasa yang menghasilkan seekor
anak domba yang diberi nama Dolly.
Bricks dan Young melakukan peyelidikan tentang cloning
terhadap katak dengan cara memasukkan nucleus yang
sedang mengalami proses perpisahan ke dalam sel
normal.
Muncul suatu istilah untukl sekelompok makhluk hidup yang
dilahirkan tanpa proses seksual dari induk (Herbert Webber)
Jump
Growth
Start

5. 1. Membuat
salinan gen
tertentu
2. Menghasilkan
produk
protein
Why Cloning ??? Tumbuhan
resisten
terhadap
hama
Produksi
hormon
insulin
jumlah besar
A vector is required to
carry the DNA fragment of
interest into the host cell.

6. Komponen Kloning
Digunakan sebagai
diperbanyak
gen yang akan
Berfungsi untuk menyimpan
gen atau fragmen DNA yang
sudah di klon
DNA
Sisipan Sel
Inang
DNA
Vektor
Berfungsi sebagai wadah DNA
sisipan
Enzim
Ligase
Digunakan untuk menyambung DNA
Enzim
RestriksiDigunakan untuk memotong DNA
Plasmid
Merupakan DNA rantai ganda yang berbentuk
sirkular dan terdapat bebas di dalam sel.

7. Komponen Kloning
DNA Sisipan
Merupakan fragmen DNA (gen) yang akan di kloning
DNA sisipan bisa diperoleh dengan dua cara, yaitu :
1. Produk PCR.
2. Fragmen DNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi
DNA vektor
Vektor merupakan suatu mulekul DNA sirkular yang bertindak sebagai wadah untuk
membawa DNA sisipan masuk ke dalam sel inang dan bertanggung jawab atas
replikasinya.
Syarat suatu vektor adalah :
(1)Dapat dipotong dengan enzim restriksi
(2)Mampu memasuki sel inang,
(3)Bereplikasi sendiri (memiliki ori),
(4)Menghasilkan jumlah copy yang banyak dan
(5)Mempunyai ukuran yang relatif kecil (< 10 kb)

8. Komponen Kloning
Plasmid
Merupakan DNA rantai ganda yang berbentuk sirkular dan
terdapat bebas di dalam sel.
Plasmid dapat bereplikasi sendiri di dalam sel inang karena
mempunyai suatu urutan DNA spesifik yang disebut ori
(origin of replication/ titik awal replikasi).
Plasmid memilki ciri-ciri antara lain :
a. Berbentuk lingkaran tertutup dan untaiannya ganda (double stranded)
b. Dapat melakukan replikasi sendiri di luar kromosom inti
c. Terdapat di luar kromosom
d. Secara genetik dapat ditransfer secara stabil

9. Komponen Kloning
Enzim Restriksi
Enzim restriksi merupakan suatu endonuklease yang mengenal urutan spesifik pada molekul DNA dan
memotong pada urutan yang spesifik tersebut.
Enzim Restriksi yang sering digunakan pada proses rekombinan DNA
Enzyme Source Recognition Sequence Cut
EcoRI Escherichia coli 5’GAATTC 5’--G AATTC--3’
3’CTTAAG 3’--CTTAA G--5’
EcoRII Escherichia coli 5’CCWGG 5’-- CCWGG--3’
3’GGWCC 3’--GGWCC --5’
BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5’GGATCC 5’--G GATCC--3’
3’CCTAGG 3’--CCTAG G--5’
HindIII Haemophilus influenzae 5’AAGCTT 5’--A AGCTT--3’
3’TTCGAA 3’--TTCGA A--5’
TaqI Thermus aquaticus 5’TCGA 5’--T CGA--3’
3’AGCT 3’--AGC T--5’

10. Komponen Kloning
Enzim Ligase
Enzim yang mengkatalisis reaksi pembentukan kembali ikatan fospodiester antara potongan
fragmen DNA atau RNA berujung kohesif yang saling berkomplemen hasil pemotongan dengan
enzim restriksi.
Enzim ligase yang sering digunakan adalah DNA ligase dari
ligase bakteri termofilik dan termostable DNA ligase.
E. Coli, DNA ligase dari Fage T4,
Sel Inang
Organisme yang menampung virus, dll umumnya dengan
menyediakan makanan dan tempat berlindung.

11. Bacterium
Bacterial
chromosome
Plasmid
2
1
3
4
Gene inserted into
plasmid
Cell containing gene
of interest
Recombinant
DNA (plasmid)
Gene of
interest
Plasmid put into
bacterial cell
DNA of
chromosome
(“foreign” DNA)
Recombinant
bacterium
Host cell grown in culture to
form a clone of cells containing
the “cloned” gene of interest
Gene of
interest
Protein expressed from
gene of interest
Protein harvestedCopies of gene
Basic research
and various
applications
Basic
research
on protein
Basic
research
on gene
Gene for pest
resistance inserted
into plants
Gene used to alter
bacteria for cleaning
up toxic waste
Protein dissolves
blood clots in heart
attack therapy
Human growth
hormone treats
stunted growth
1. Isolasi plasmid bakteri
2. Penyisipan DNA ke plasmid
3. Pengembalian plasmid ke
bakteri
4. Pencampuran DNA dengan sel-
sel bakteri
5. Penyebaran bakteri pada
cawan petri yang mengandung
ampisilin dan x-gal.
Wondering how
cloning happened ???

12. Common Restriction Enzymes
Fig. 13.8
Bakteri yang sering
digunakan

13. Restriction Enzymes
Fig. 13.6
Restriction enzyme
cuts sugar-phosphate
backbones.
Restriction site
DNA
5
5
5
5
5
5
3
3
3
3
3
3
1
Sticky
end
GAATTC
CTTAAG

14. Figure 20.3-2
One possible combination
DNA fragment added
from another molecule
cut by same enzyme.
Base pairing occurs.
Restriction enzyme
cuts sugar-phosphate
backbones.
Restriction site
DNA
5
5
5
5
5
5
5
5
55
5
5
55
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
2
1
Sticky
end
GAATTC
CTTAAG
G
G
G
G
AATT CAATT C
C TTAA C TTAA

15. Figure 20.3-3
Recombinant DNA molecule
One possible combination
DNA ligase
seals strands
DNA fragment added
from another molecule
cut by same enzyme.
Base pairing occurs.
Restriction enzyme
cuts sugar-phosphate
backbones.
Restriction site
DNA
5
5
5
5
5
5
5
5
55
5
5
55
5
5
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
2
3
1
Sticky
end
GAATTC
CTTAAG
G
G
G
G
AATT CAATT C
C TTAA C TTAA

18. 1. Pengklonan Tumbuhan : Kultur Sel Tunggal
2. Pengklonan Hewan : Transplantasi Nukleus
3. Pengklonan Reproduktif Mamalia
4. Sel Punca (Stem Cell)
Aplikasi Kloning

19. Pengklonan Tumbuhan : Kultur Sel
Tunggal
– Pengklonan organisme (organismal cloning) adalah pengklonan
yang menghasilkan satu atau lebih organisme yang secara genetis
identik dengan induk yang mendonorkan sel tunggal.
– Sel totipoten adalah sel yang dapat menghasilkan organisme
baru yang lengkap.
– Kloning tanaman digunakan secara luas di bidang pertanian.

22. Pengklonan Hewan:
Transplantasi Nukleus
 Dalam transplantasi nuklues, nukleus sel telur yang
belum maupun sudah terfertilisasi diganti dengan
nukleus yang telah terdiferensiasi.
 Percobaan dengan embrio katak menunjukkan bahwa
nukleus yang ditransplantasikan sering mengalami
perkembangan normal.
 Namun, semakin tua inti donor, semakin rendah
persentasenya berkembang.

24. 3. Pengklonan Reproduktif
Mamalia
– Pada tahun 1997 peneliti Skotlandia berhasil mengklon
domba yang disebut dolly, anak domba ini diklon dari
domba dewasa melalui transplantasi nukleus sel yang
telah terdiferensiasi.
– Namun pada tahun 2003 domba ini mati karena artritis
yang dideritanya, ini menunjukkan bahwa sel-sel dolly
tidak sesehat domba normal.

26.  Sejak 1997 peneliti mengklon banyak mamalia seperti
mencit, kucing, sapi, kuda, babi dan anjing.
 CC (Carbon Copy) adalah kucing pertama yang
dikloning; namun, CC agak berbeda dari induknya.
 Hewan yang dikloning tidak selalu terlihat atau
berperilaku persis sama.
3. Pengklonan Reproduktif Mamalia

28.  Adalah sel yang relatif belum terspesialisasi dan dapat
mereproduksi diri secara tak terbatas dan dalam kondisi
yang sesuai berdiferensiasi menjadi sel-sel terspesialisasi
dari satu tipe sel atau lebih.
 Sel punca diisolasi dari embrio awal disebut tahap
blastula (ekuivalen blastula pada manusia) dan dapat
berdeferensiasi ke semua tipe sel.
 Tubuh dewasa juga mempunyai sel punca, yang
berperan untuk menggantikan sel-sel terspesialisasi
yang tidak bereproduksi apabila dibutuhkan.
4. Sel Punca (Stem Cell)