Dokumen ini membahas tentang vektor dalam rekayasa genetika, dengan fokus pada plasmid, bakteriofag, dan kosmid sebagai alat untuk mentransfer DNA ke dalam sel inang. Ditekankan pentingnya skrining untuk menemukan klon yang mengandung gen tertentu, serta teknik hibridisasi untuk mendeteksi produk gen. Selain itu, dijelaskan juga metode pemindahan DNA, teknik plasmid, dan terapi genetik yang bertujuan untuk memperbaiki gen yang bermasalah.

1. Vektor
Vektor adalah molekul DNA yang berfungsi sebagai wahana atau kendaraan yang akan
membawa suatu fragmen DNA masuk ke dalam sel inang dan memungkinkan terjadinya
replikasi dan ekspresi DNA asing tersebut. Vektor yang dapat digunakan pada sel inang
prokariot, khususnya E.coli, adalah plasmid, bakteriofag, kosmid.
1. Plasmid
Secara umum plasmid dapat didefinisikan sebagaimolekul DNA sirkuler untai ganda di luar
kromosom yang dapat melakukan replikasi sendiri.
Agar dapat digunakan sebagai vektor kloning, plasmid harus memenuhi syarat-syarat
berikut ini:
 Mempunyai ukuran relative kecil bila dibandingkan dengan pori dinding sel sebingga
dapat dengan mudah melintasinya
 Mempunyai sekurang-kurangnya dua gen marker yang dapat menandai msuk tidaknya
plasmid ke dalam sel inang.
 Mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya didalam salah satu
marker yang dapat digunakan sebagaitempat penyisipan fragmen DNA.
 Mempunyai titik awalreplikasi (ori) sehingga dapat melakukan replikasi di dalam sel
inang.
2. Virus λ Bakteriofag
Bakteriofag adalah virus yang sel inangnya berupa bakteri. Dengan daur hidupnya yang
bersifat litik atau lisogenik bakteriofag dapat digunakan sebagai vektor kloning pada sel
inang bakteri. Ada beberapa macam bakteriofag yang biasa digunakan sebagai vector
kloning, diantaranya adalah bakteriofag λ dan M13.
3. Cosmid
Kosmid merupakan vektor yang dikonstruksi dengan menggunakan kos dari DNA lamdha
dengan plasmid. Kemampuannya untuk membawa fragmen DNA sepanjang 32 hingga 47 kb
menjadikan kosmid lebih menguntungkan daripada fag λ dan plasmid.

2. DNA dapat masuk kedalam sel bakteri melalui 3 cara:
a.Konjugasi
b.Transformasi,dan
c.Transduksi
a. Konjugasi
Perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) kedalam sel bakteri lainnya (sel resipien)
melalui kontak fisik antara kedua sel
b. Transformasi
pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan disekelilingnya.
c. Transduksi
cara pemindahan DNA dari satu sel kedalam sel lainnya melalui perantaraan fage.

3. Prosedur Skrining
Proses untuk mengidentifikasi suatu klon yang membawa gen tertentu yang diinginkan di antara sejumlah
besar klon lainnya di dalam perpustakaan gen dinamakan skrining. Pada dasarnya skrining dilakukan
dengan teknik hibridisasi menggunakan suatu molekul pelacak DNA (DNA probe). Beberapa
pengetahuan mengenai gen yang akan dicari, atau produknya, diperlukan dalam pembuatan molekul
pelacak bagi gen tersebut. Di dalam proses skrining, molekul pelacak akan menempel pada sekuens
DNA yang komplementer dengannya sehingga klon yang diinginkan dapat dikenali.
Apabila diperoleh protein yang merupakan produk gen tertentu dalam jumlah yang memungkinkan untuk
penentuan sekuens asam aminonya, maka dari informasi sekuens asam amino ini dapat disusun
beberapa kemungkinan sekuens DNA yang menyandinya. Selanjutnya, informasi sekuens DNA yang
disusun dapat digunakan untuk membuat molekul pelacak.
Hibridisasi koloni dan plak
Seleksi transforman dengan vektor rekombinan yang dikonstruksi menggunakan vektor λ dilakukan
dengan melihat terbentuknya plak pada medium kultur sel inang. Sementara itu, seleksi transforman
dengan vektor rekombinan yang dikonstruksi menggunakan plasmid dilakukan dengan melihat
pertumbuhan koloni pada medium seleksi . Namun, prosedur skrining bagi kedua sistem kloning tersebut
pada dasarnya sama saja.
Langkah pertama adalah mentransfer DNA di dalam plak atau koloni ke suatumembran nilon atau
nitroselulosa. Untuk plak, DNA λ dapat langsung diperoleh dan ditransfer ke membran karena plak
merupakan area tempat keberadaan bakteri inang yang mengalami lisis. Akan tetapi, jika yang ditransfer
ke membran adalah koloni-koloni bakteri, maka perlu dilakukan lisis sel bakteri untuk mendapatkan DNA.
Sebelumnya, dibuat replika bagi koloni-koloni yang ditransfer tersebut di dalam medium kultur yang baru.
Lisis sel bakteri biasanya dilakukan dengan merendam membran nilon di dalam sodium dodesil sulfat
(SDS) dan protease. Selanjutnya, DNA yang keluar dari sel didenaturasi menggunakan alkali sehingga
diperoleh DNA untai tunggal, yang kemudian difiksasi ke membran dengan pengeringan atau iradiasi UV.
Membran dicelupkan ke dalam larutan pelacak DNA dan diinkubasi agar terjadi hibridisasi antara

4. pelacak, yang juga berupa untai tunggal, dan beberapa DNA untai tunggal yang komplementer
dengannya. Pelacak DNA biasanya diberi label radioaktif.
Setelah hibridisasi, membran dicuci untuk menghilangkan sisa-sisa pelacak yang tidak terhibridisasi.
Beberapa DNA di dalam membran yang mengalami hibridisasi divisualisasikan menggunakan
autoradiografi dengan sinar X. Dengan membandingkan posisi DNA yang terhibridisasi oleh pelacak
dengan posisi koloni pada kultur replika akan diketahui koloni-koloni yang membawa DNA rekombinan
dengan fragmen sisipan yang diinginkan.
Skrining ekspresi
Pada dasarnya skrining ekspresi sama dengan skrining perpustakaan gen melalui hibridisasi koloni/plak.
Hanya saja pada skrining ekspresi, bukannya DNA yang dideteksi pada membran, melainkan protein
yang merupakan produk suatu gen yang diinginkan. Sebagai pelacak digunakan antibodi, sedangkan
untuk mengetahui terjadinya hibridisasi digunakan antibodi lain atau bahan kimia yang dapat
mengenalinya. Dengan cara seperti ini dapat ditentukan koloni/plak yang mengekspresikan protein yang
dikehendaki.
Penghambatan dan pelepasan translasi oleh hibrid
Klon-klon cDNA dapat digunakan untuk menghibridisasi mRNA yang diisolasi. Setelah dilakukan
hibridisasi, populasi mRNA langsung ditranslasi menjadi protein. Translasi tidak akan terjadi pada
segmen mRNA yang terhibridisasi oleh cDNA, atau dengan perkataan lain, translasi telah dihambat oleh
hibrid (hybrid-arrest translation). Dengan mendeteksi produk-produk protein yang tidak terbentuk dapat
diketahui cDNA yang menghambat translasi suatu protein. Artinya, cDNA ini dapat dipastikan membawa
sekuens yang menyandi protein yang tidak ditranslasi tersebut.
Cara kebalikannya juga dapat dilakukan. Hibrid-hibrid antara cDNA dan mRNA dimurnikan.
Kemudian, mRNA dilepaskan dari hibrid dengan pemanasan atau menggunakan agen denaturasi.
Setelah itu, mRNA ditranslasi (hybrid-release translation) untuk menghasilkan produk protein
tertentu. Dengan mengetahui protein yang terbentuk dapat diketahui klon cDNA yang membawa
sekuens penyandi protein tersebut.

5. Southern blotting dan Northern blotting
Kedua prosedur skrining ini digunakan untuk mendeteksi keberadaan sekuens tertentu tetapi tidak
dilakukan langsung pada klon-klon rekombinannya. Skrining didasarkan atas hasil hibridisasi antara
molekul asam nukleat dan pelacaknya pada gel agarosa. Istilah Southern blotting berasal dari nama
penemunya, sedangkan Northern blotting diekstrapolasi dari nama tersebut. Jika Southern blotting
ditujukan untuk DNA, Northern blotting digunakan untuk hibridisasi RNA.
Tahap pertama untuk kedua prosedur tersebut adalah migrasi molekul asam nukleat pada gel agarosa.
Khusus untuk Southern blotting, dilakukan denaturasi DNA (biasanya menggunakan alkali) sehingga
akan diperoleh DNA untai tunggal. Pita-pita untai tunggal, baik DNA maupun RNA, kemudian
dipindahkan ke membran nilon atau nitroselulosa seperti halnya pada hibridisasi koloni.
Begitu asam nukleat dipindahkan ke membran, tahap-tahap selanjutnya pada kedua prosedur skrining
tersebut sama, yaitu fiksasi asam nukleat pada membran, hibridisasi dengan pelacak, pencucian sisa
pelacak, dan deteksi fragmen yang mengalami hibridisasi menggunakan autoradiografi. Di antara tahap-
tahap tersebut kondisi hibridisasi merupakan faktor yang paling memerlukan perhatian. Jika antara
pelacak dan sekuens target terdapat homologi yang sangat tinggi (mendekati atau sama dengan 100%),
maka dapat diberlakukan kondisi hibridisasi yang ketat, yaitu dengan suhu hibridisasi tinggi dan
konsentrasi garam rendah pada bufer hibridisasi. Sebaliknya, jika sekuens pelacak tidak terlalu homolog
dengan sekuens target, maka ketetatan kondisi hibridisasi harus diturunkan sampai pada tingkatan yang
memungkinkan terbentuknya hibrid-hibrid yang kurang sempurna. Namun, jika keketatannya diturunkan
terlalu banyak, fragmen pelacak mungkin akan berikatan dengan sekuens-sekuens lain yang tidak
spesifik.
Southern blotting terhadap fragmen-fragmen DNA genomik yang diklon dapat dilakukan menggunakan
pelacak berupa cDNA untuk mencari bagian-bagian klon genomik yang sesuai dengan fragmen cDNA
pelacak. Jika fragmen DNA genomik yang membawa suatu gen tertentu dapat dideteksi, maka akan
diketahui ukuran fragmen yang membawa gen tersebut. Blot-blot dengan sampel DNA atau RNA dari
organisme yang berbeda (zoo blots) dapat menunjukkan betapa konservatifnya suatu gen di antara
spesies yang satu dan lainnya.

6. I nf or m asi Online
 .
Home Genetika Rekayasa Genetika
Rekayasa Genetika
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
REKAYASA GENETIKA
1. Pengertian Rekayasa Genetika
Rekayasa genetika adalah suatu teknik bioteknologi yangdigunakan untuk mentransfer gen dari suatu organisme ke organisme
lain untuk mendapatkan produk baru dengan cara membuat DNA Rekombinan.
DNA Rekombinan adalah DNA yang urutannya telah direkombinasikan agar memiliki sifat- sifat atau fungsi yang kita
inginkan sehingga organisme penerimanya mengekspresikan sifat atau melakukan fungsi yang kita inginkan. Misalnya, kita membuat
DNA rekombinan yang memiliki fungsi membuat insulin. DNA ini kemudian kita masukan ke dalam bakteri dengan harapan bakteri
tersebut dapat menghasilkan insulin. DNA rekombinan dilakukan melalui penyisipan gen dengan plasmid sebagai vektornya/ “kendaraan
pemindah”.
Adapun teknik pembuatan DNA rekombinan adalah sebagai berikut:
§ Teknik mengisolasi DNA;
§ Teknik memotong DNA dengan menggunakan enzim retriksi endonuklease;
§ Teknik menggabung/ menyambung DNA dengan menggunakan enzim ligase;
§ Teknik memasukkan DNA kedalam sel hidup (vektor)
§ Vektor berkembang dengan sisipan DNA yang direkayasa.
Dua komponen utama yang terlibat di dalam rekayasa genetika, yaitu plasmid dan enzim.
1) Plasmid
Plasmid adalah molekul DNA berantai rangkap dan berbentuk cincin. Plasmid ditemukan didalam sel bakteri dan
dapat berbiak secara bebas, lepas dari kromosom induk. Dalam rekayasa genetika, plasmid berperan sebagai vektor
(kendaraan) yang digunakan untuk mentransfer dan memperbanyak gen asing.
Keuntungan penggunaan plasmid adalah dapat di pindahkan dari satu sel ke sel yang lain, misalnya melalui cara
transformasi. Ketika satu gen “asing” (biasanya diekstrak dari satu kromosom sel eukariotik) telah disisipkan ke dalam satu
plasmid, ia akan bertindak seperti kendaraaan yang mengangkut gen ke dalam sel bakteri. Plasmid yang membaw a gen
tersebut siap di absorpsi dan di replikasikan oleh bakteri sehingga setiap anakan sel yang dihasilkan akan mew arisi gen-
gen baru. Selanjutnya, setiap bakteri didalam kultur gen- gen akan menginstruksi, misalnya “hasilkan hormon insulin
manusia”.
Adapun beberapa cara pemindahan DNA diantaranya adalah:
§ Konjugasi: pemindahan DNA dalam sel bakteri melalui kontak fisik antar kedua sel.
§ Transformasi: pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan sekitarnya.
§ Transduksi: pemindahan DNA daribsatu sel ke sel lainnya melaui perantara
2) Enzim
Dalam rekayasa genetika dikenal dua macam bahan kimia yang berperan penting. Kedua macam bahan kimia
tersebut adalah enzim pemutus (retriksi endonuklease) dan enzim perekat (ligase).
Enzim retriksi endonuklease merupakan enzim khusus dari bakteri yang berguna sebagai alat pertahanan tubuh. Misalnya
untuk melawan DNA asing yang menyusup masuk, seperti yang berasal dari virus. Dalam dunia rekayasa genetika, enzim tersebut
bertindak sebagai gunting biologi yang berfungsi untuk memotong/ menggunting rantai DNA pada tempat- tempat khusus. Enzim
retriksi endonuklease memiliki dua keutamaan. Pertama, memiliki fungsi kerja spesifik. Dalam hal ini enzim mampu mengenal dan
memotong urutan nukleotida tertentu pada DNA. Kedua, mampu menghasilkan potongan- potongan runcingketika memotong rantai
ganda DNA. Fragmen- fragmen yang dihasilkannya adalah berupa ujung runcing (ujung lengket) yang terdiri atas untaian tunggal. Setiap

7. ujung dari fragmen memiliki bagian yang menjorok dengan urutan basa yang dapat dikenali dan dipasangi oleh basa yang terletak di
ujung untaian lainnya. Misalnya, ujung untaian tunggal dengan urutan basa AATT pada satu ujung dan TTAA pada ujung yang lain.
Kedua fragmen tersebut dapat disambungkan sehingga membentuk satu untaian nukleotida lagi. Dalam hal ini, enzim ligase berfungsi
untuk merekatkan dan mempersatukan fragmen- fragmen/ potongan- potongan DNA.
2. Teknik- teknik Rekayasa Genetika
a) Teknik Plasmid Rekayasa Genetika
Melalui teknk plasmid dalam rekayasa genetika, para ahli dibidang bioteknologi dapat mengembangkan tanaman
transgenik yang resisten terhadap hama dan penyakit, adaptif kekeringan dan kondisi tanah yang tidak subur, hew an
transgenik dan lain- lain.
Gambar. Rekayasa genetika dengan plasmid bakteri

8. b) Teknik Hibridoma
Teknik hibridoma adalah penggabungan dua sel dari organisme yang sama ataupun dari sel organisme yang
berbeda sehingga menghasilkan sel tunggal berupa sel hibrid (hibridoma) yang memiliki kombinasi sifat dari kedua sel
tersebut.
Contoh teknik hibridoma adalah pembuatan antibodi monoklonal. Antibodi monoklonal adalah antibodi yang
diperoleh dari suatu sumber tunggal atau sel klon yang hanya mengenal satu jenis antigen.
Pembentukan antibodi monoklonal dilakukan dengan menggunakan kelinci atau tikus. Langkah pertama adalah
menginjeksikan antigen ke tubuh kelinci atau tikus percobaan, kemudian limpanya dipisahkan. Selanjutnya dilakukan
peleburan sel- sel limpa dengan sel- sel mieloma (sel- sel kanker). Sekitar 1% dari sel limpa adalah sel plasma yang
menghasilkan antibodi. Sedangkan 10% sel hibridoma akhir terdiri dari sel yang menghasilkan antibodi. Setiap sel
hibridoma hanya menghasilkan 1 antibodi.
Disini teknik seleksi dikembangkan untuk mengidentifikasi sel hibridoma, kemudian dilakukan pengembangan atau
pengklonan berikutnya. Klon yang diperoleh dari hibridoma berupa antibodi monoklonal. Antibodi monoklonal dapat disimpan beku,
kemudian dapat diinjeksikan ke dalam tubuh hewan atau dibiakkan dalam suatu kultur untuk menghasilkan antibodi dalam jumlah besar.
Gambar. Tehnik pembuatan antibodi monoklonal oleh Kohler dan Milstein
Kegunaan antibodi monoklonal:
ü Para ilmuwan berharap dapat menggunakan antibodi monoklonal dalam pemgobatan kanker.
ü Untuk mendeteksi kandungan hormon korionik gonadotropin (HCG) dalam urine wanita hamil.
ü Untuk mengikat racun dan menonaktifkannya, contohnya racun tetanus dan kelebihan obat digoxin dapat dinonaktifkan oleh antibodi ini.
ü Mencegah penolakan jaringan terhadap sel hasil transplantasi jaringan lain.
a) Teknik Terapi Genetik

9. Terapi gen diartikan sebagai upaya memperbaiki atau mengganti gen- gen yang menyebabkan suatu penyakit. Terapi ini
dilakukan dengan mengganti gen- gen yang tidak dapat bekerja dengan salinan gen yang normal ke dalam sel. Pada pertengahan tahun
1990, terapi genetik untuk mengobati penyakit menurun dan kanker kulit ganas.
Para ahli berusaha melaw an gen- gen perusak dalam inti sel itu dengan berbagai cara, upaya yang dirintis
tersebut dikenal dengan terapi genetik. Sayangnya penemuan itu tidak segera dapat diterapkan. Dalam rekayasa genetika
ada kode etik yang melarang keras percobaan ini pada manusia. Rekayasa ini dikhaw atirkan disalahgunakan untuk
mengubah gen pembaw a sifat manusia, misalnya untuk membuat manusia super.
Namun para ahli tidak selamanya bersikap kaku sebab berbagai penyakit fatal memang susah disembuhkan
kecuali dengan terapi genetik. Maka munculah pendapat tentang perlu adanya dispensasi. Dispensasi itu dikeluarkan oleh
Komite Rekayasa Genetik Nasional Institut of Healt (NIH) di Amerika Serikat yang mengizinkan penerapan terapi genetik
untuk dua jenis penyakit yaitu penyakit menurun yang sangat jarang seperti Adenosine Deaminase Deficiency (ADD) dan
sejenis kanker kulit yang ganas.
ADD adalah kelainan yang menyebabkan penderitanya tidak memiliki daya tahan tubuh sama sekali. Kontak
dengan kuman apapun akan menyebabkan kematian. Rusaknya kekebalan pada ADD terjadi akibat sel- sel darah tidak
mampu memproduksi enzim Adenosine Deaminase (AD) yang diperlukan untuk membangun daya tahan tubuh.
b) Teknik Kloning
Kloning berasal dari kata Yunani kuno, clone yang berarti ranting atau cangkokan. Dalam bahasa
Inggris,clone (klona) digunakan untuk menyebut sekelompok makhluk hidup yang dilahirkan tanpa proses seksual. Istilah
clone (klona) pertama diusulkan oleh Herbert Webber pada tahun 1903. Kloning dapat dilakukan dengan transfer gen,
transfer embrio dan transfer inti. Organisme hasil kloning akan memiliki salinan genetika yang sama persis dengan makhluk
hidup yang lain.
1. Transfer Gen
Kloning ini dilakukan dengan menyisipkan potongan gen yang dikehendaki dari suatu spesies lain sehingga
spesies ke spesies lain sehingga spesies yang di klon tadi akan memiliki sifat tambahan sesuai dengan gen yang telah di
sisipkan ke dalam sel tubuhnya.
2. Transfer Embrio
Transfer embrio ini dilakukan dengan jalan mengambil ovum kemudian membuahinya dengan sperma, setelah
terjadi zigot yang akan berkembang menjadi embrio, embrio- embrio ini di transfer atau ditanam dalam rahim individu betina
sampai lahir menjadi individu dew asa.
3. Transfer Inti
Prinsip dari transfer inti yaitu dengan memasukkan inti sel (nukleus) dari satu spesies ke dalam sel spesies lain
yang sebelumnya inti selnya telah dibuang atau dikosongkan.
Pada tahun 1952, Robert Brigs dan Thomas J. King (AS) mencoba teknik kloning pada katak. Sepuluh tahun
kemudian (1962), John B. Gurdon juga mencoba teknik kloning pada katak, namun prcobaannya menghasilkan banyak
katak yang abnormal atau cacat. Gurdon kemudian menyempurnakan percobaannya sehingga menghasilkan banyak katak
yang tumbuh normal dan berkembang menjadi dew asa.
Pada tahun 1986, Steen Wikkadsen (Inggris) mengklona sapi dengan tujuan komersial dengan metode transfer
inti. Ia bekerja sama dengan Lembaga Grenada Genetics.
Pada tahun 1996, Ian Wilmut mengklona domba. Ia menggunakan sel kelenjar susu domba finn dorsetsebagai
donor inti dan sel telur domba blackface sebagai resipien. Sel telur domba blackface dihilangkan intinya dengan cara
mengisap nukleusnya keluar dari sel menggunakan pipet mikro. Kemudian, sel kelenjar susu dombafinn dorset difusikan
dengan sel telur blackface yang tanpa nukleus. Hasil fusi ini kemudian berkembang menjadi embrio dalam tabung
percobaan dan kemudian dipindahkan ke rahim domba blackface. Kemudian embrio berkembang dan lahir dengan ciri- ciri
sama dengan finn dorset. Domba hasil kloning ini diberi nama Dolly. Dolly disuntik mati pada tanggal 14 februari 2003
karena menderita penyakit yang sulit disembuhkan.
Perlu diperhatikan bahw a Wilmut melakukan 277 percobaan kloning dan dari sekian banyak percobaan, hanya 29
yang berhasil menjadi embrio domba yang dapat ditransplantasikan ke rahim domba, dan hanya satu yang menjadi domba
normal. Dengan demikian, tingkatkeberhasilan kloning domba masih sangat rendah (Purves et al. 2004).

10. Gambar. Teknik cloning yang dilakukan untuk menghasilkan domba Dolly