Dokumen tersebut membahas tentang kloning gen, yang merupakan proses untuk mengisolasi, memurnikan, dan memperbanyak gen tertentu dari suatu organisme. Metode yang digunakan meliputi pemotongan DNA menggunakan enzim restriksi, penyisipan gen ke dalam vektor seperti plasmid, dan transformasi ke dalam sel inang untuk mereplikasi DNA.
2. Kloning - definisi
Dari Bahasa Yunani - klon, ranting
Kumpulan turunan suatu individu yang dihasilkan
tanpa melalui perkawinan; kumpulan replika
sebagian atau seluruh makromolekul (contoh,
DNA atau antibodi)
Suatu individu yang tumbuh dari satu sel somatik
induknya serta memiliki identitas genetik yang
sama dengan induknya
Klon: Koleksi molekul atau sel yang semua
identitasnya sama dengan molekul atau sel
penurunnya
3. Kloning DNA
Metoda untuk memurnikan atau mengidentifikasi dan
memperbanyak suatu potongan DNA tertentu (klon)
yang dikehendaki dari campuran potongan-potongan
DNA yang kompleks.
4. Kloning Gen
Ketika keseluruhan
DNA dari suatu
organisme diekstraksi,
akan diperoleh seluruh
gen yang dimiliki
organisme tersebut
Pada kloning gen,
hanya gen (DNA)
tertentu yang diisolasi,
dimurnikan, dan
diperbanyak (diklon)
5. Tujuan mengklon Gen
Menentukan urutan basa nukleotida penyusun
gen tersebut
Menganalisis atau mengidentifikasi urutan basa
nukleotida pengendali gen tersebut
Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang
disandi gen tersebut
Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada
kecacatan gen yang mengakibatkan penyakit
bawaan
Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu,
misalnya memproduksi insulin, ketahanan
terhadap hama, dll.
6. Sumber DNA untuk diklon
DNA kromosom
cDNA (complementary DNA) yang disintesis
menggunakan mRNA sebagai cetakan
(template)
DNA yang dihasilkan dari perbanyakan
menggunakan PCR
9. Bahan / Alat untuk Mengklon
Enzim endonuklease restriksi
Enzim ligase
Vektors (Pembawa)
Inang (Host)
Metoda untuk memasukkan DNA ke dalam sel inang
10. Memotong DNA
Menggunakan enzim
endonuklease restriksi
Ujung “lengket” (sticky ends)
Ujung “tumpul” (blunt ends)
Penamaan enzim
EcoRI
E = genus (Escherichia)
co = species (coli)
R = strain
I = # of enzyme
12. Penyambungan (pasting) DNA
Pembentukan ikatan-
H pada ujung-ujung
yang komplemen
(sticky ends)
Ligase membentuk
ikatan fosfodiester
untuk merekatkan
benang-benang DNA
13.
14. Vektor untuk Mengklon
Diperlukan suatu wahana (vehicle)
untuk memasukkan suatu potongan
DNA ke dalam sel agar DNA
tersebut dapat disimpan dan
diperbanyak di dalam sel tersebut
15. Plasmid
DNA bukan kromosom (extrachromosomal DNA) yang
secara alami dimiliki suatu jasad
Bentuknya benang ganda (double strands DNA,
dsDNA) sirkular
Plasmid buatan (Artificial plasmids) dapat dibuat
dengan menambahkan potongan-potongan DNA lain
16. Vektor untuk Mengklon
Plasmid dapat dimodifikasi untuk mampu
membawa potongan DNA lain ke dalam sel
bila memiliki:
Replikator (origin of replication)
Penanda (Marker) yang mudah diseleksi
(misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik)
Situs untuk mengklon (potongan DNA yang
memiliki urutan basa nukleotida yang menjadi
sasaran enzim restriksi tetapi tidak terletak di
dalam daerah replikator atau penanda
17. Plasmid yang Dimiliki oleh
Escherichia coli
Berasal dari plasmid alami E. coli
Potongan DNA tambahan
Potongan DNA tambahan
18.
19. Plasmid Khimera (Chimeric Plasmids)
Khimera berasal dari mitologi Yunani, makhluk dengan
tubuh gabungan dari bagian-bagian makhluk
binatang lain
Setelah pemotongan plasmid menggunakan suatu
enzim restriksi, potongan DNA asing yang memiliki
ujung pemotongan yang sama dapat disisipkan
Setelah ujung-ujung plasmid dan potongan DNA
asing disambung, akan dihasilkan "plasmid
rekombinan"
Plasmid rekombinan dapat bereplikasi dalam sel
inang yang sesuai
20.
21. Kloning Terorientasi
Bila diinginkan untuk menginsersikan potongan
DNA asing dengan orientasi tertentu
Dilakukan dengan memotong DNA vektor
maupun DNA sumber gen yang dikehendaki
menggunakan dua enzim restriksi yang
berbeda
22.
23. Vektor untuk Mengklon
1 Vektor berupa plasmid
2 Vektor berupa bakteriofaga
3 Cosmid
4 BACs (Bacterial Artificial Chromosome)
& YAC (Yeast Artificial Chromosome)
24. Vektor berupa Plasmid
1. Memiliki origin of replication dari inang yang
dituju, sehingga memungkinkan replikasi secara
independen terhadap genom inang.
2. Memiliki penanda selektif: Memudahkan seleksi sel
pembawa plasmid tersisipi DNA asing
ketahanan terhadap antibiotik ganda
penapisan biru-putih
3. Memiliki banyak situs pengkloningan (multiple
cloning sites, MCS)
4. Mudah diisolasi dari sel inang.
27. Vektor berupa Plasmid
Keunggulan:
Kecil, mudah pengerjaannya
Strategi seleksi mudah
Berguna untuk mengklon potongan DNA ukuran
kecil (< 10kbp)
Kelemahan:
Kurang bermanfaat untuk mengklon potongan
DNA ukuran besar (> 10kbp)
31. Vektor berupa Bakteriofaga
Keunggulan:
Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA
ukuran besar (10 - 23 kbp)
Seleksi berdasar ukuran
Kelemahan:
Lebih sulit pengerjaannya
32. Vektor Cosmid
Gabungan sifat vektor plasmid dan sifat berguna
dari situs l cos (dihilangkan pada vektor l)
Keunggulan:
Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA
berukuran sangat besar (32 - 47 kbp)
Seleksi berdasar ukuran
Pengerjaan seperti plasmid
Kelemahan:
Tidak terlalu mudah untuk mengerjakan
plasmid dengan ukuran sangat besar (~ 50
kbp)
35. Vektor BAC
Replikasi dimediasi
oriS dan oriE
parA and parB
mengendalikan agar
hanya terdapat satu
vektor dalam sel
Menggunakan
penanda ketahanan
terhadap
KhloramfenikolR
36. Vecktor YAC
large
inserts
ARS URA3 HIS3
telomere centromere telomere
replication
origin
markers
Dapat disisipi gen asing 200 - 2000 kbp
dan dimasukkan ke dalam yeast
37. BACs dan YACs
BACs : Bacterial Artificial Chromosomes
YACs : Yeast Artificial Chromosomes
Keunggulan:
Dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA
dengan ukuran sangat besar (100 - 2,000 kbp)
Penting digunakan dalam proyek penetapan urutan basa
nukleotida total genom
Kelemahan:
Tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan
ukuran sangat besar
38. Shuttle Vector
Vektor yang dapat digunakan untuk dua macam inang
(memiliki origin of replication dari masing-masing inang)
39. Memilih Vektor
Ukuran DNA yang
disisipkan
Ukuran vektor
Situs enzim restriksi
yang tersedia
Jumlah salinan (copy
number)
Efisiensi kloning
Kemampuan untuk
menapis DNA sisipan
Rencana penelitian
selanjutnya
40. Cara Mengklon DNA (1)
Isolasi vektor kloning (plasmid
bacterial) & DNA sumber gen
Pemotongan DNA sumber gen
& vektor kloning
menggunakan enzim restriksi
yang sama
Penyisipan potongan DNA
sumber gen ke dalam vektor
kloning yang telah dipotong
menggunakan enzim restriksi
yang sama; potongan
disambung dengan bantuan
enzim DNA ligase
41. Cara Mengklon DNA (2)
Vektor kloning yang telah
tersisipi potongan DNA
dimasukkan ke dalam sel
inang (transformasi sel
inang)
Penapisan sel pengklon
(dan gen yang
dimasukkan)
Identifikasi sel pengklon
pembawa gen yang
dikehendaki
42. Transformasi Sel Inang
Memasukkan plasmid (yang merupakan
vektor yang telah disisipi gen) ke dalam
sel inang
43. Transformasi (1)
PRA-INKUBASI
Sel E. coli calon penerima plasmid dipaparkan
kepada ion positif kalsium klorida (CaCl2).
Perlakuan ini memberikan cekaman kepada
bakteri yang mengakibatkan membran sel dan
dinding sel bakteri tersebut menjadi permeabel
terhadap plasmid donor. Proses ini
mengakibatkan E. coli menjadi “kompeten"
untuk menerima plasmid .
44. Transformasi (2)
INKUBASI
Plasmid ditambahkan ke dalam suspensi sel E.
coli kompeten.
Suspensi sel E. coli kompeten lainnya yang tidak
ditambah plasmid digunakan sebagai kontrol.
45. Transformasi (3)
KEJUTAN PANAS (HEAT SHOCK)
Sel kompeten (baik yang diberi plasmid
maupun kontrol) dipaparkan sejenak (90 detik)
kepada suhu 42 oC. Langkah ini
memaksimumkan masuknya plasmid
menembus membran dan dinding sel.
46. Transformasi (4)
PENYEMBUHAN (RECOVERY)
Sel kompeten (baik yang diberi plasmid
maupun kontrol) ditumbuhkan dalam medium
kaya nutrisi untuk memberi kesempatan
penyembuhan setelah mengalami cekaman dan
kejutan. Masa penyembuhan biasanya
berlangsung satu waktu generasi (untuk E. coli
berkisar antara 30 hingga 45 menit)
47. Transformasi (5)
PENAPISAN (SCREENING)
Sel kompeten yang telah mengalami
penyembuhan ditapis pada medium padat yang
mengandung senyawa penapis berdasarkan
penanda yang dibawa oleh plasmid.
48. Koloni E. coli yang membawa
plasmid dengan penanda gen pendar
fluor (pGLO)
50. Penanda selektif
Memudahkan seleksi sel pembawa plasmid tersisipi
DNA asing
ketahanan terhadap antibiotik ganda
penapisan biru-putih
51. Penapisan Klon
Medium pertumbuhan
diberi antibiotik yang
sesuai dengan sifat
ketahanan yang digunakan
sebagai penanda, misalnya
Kanamisin
Bakteri di paruh cawan
petri sebelah kanan
memiliki plasmid dengan
penanda ketahanan
terhadap Kanamisin(Kanr),
yang di sebelah kiri tidak
memilikinya
52. Penapisan warna koloni Biru/Putih
lacZ insert
Enzim tidak berfungsi
X-gal produk
lacZ
Enzim berfungsi
X-gal produk
54. Hibridisasi Koloni
Dapat dilakukan
jika memiliki
DNA pelacak
Bagian dari gen
yang dikehendaki
Bagian dari gen
yang mirip dari
jasad lain
Oligonukleotida
sintetik
79. Domba Dolly
Kloning dengan transfer inti,dengan
memasukkan donor DNA dari hewan yang
karakternya diinginkan ke dalam sel telur
hewan yang inti DNA nya telah
dihilangkan.setelah terbentuk
embrioditanamkan ke rahim induk hewan
yang akan membesarkannya.contoh domba
Dolly(klon dari Skotlandia oleh IAN WILMOT)
Editor's Notes
* If any of these issues caused a schedule delay or need to be discussed further, include details in next slide.
Duplicate this slide as necessary if there is more than one issue.
This and related slides can be moved to the appendix or hidden if necessary.