Kloning Gen

7,864 views

Published on

PPT ini merupakan salah satu materi kuliah BIOTEKNOLOGI yang ditulis oleh Trianik Widyaningrum, M.Si. (dosen Pendidikan Biologi Universitas Ahmad Dahlan Yogyakarta).

Butuh lebih banyak materi biologi..???
http://belajar-di-rumah.blogspot.com/

Published in: Education
0 Comments
18 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total views
7,864
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
3
Actions
Shares
0
Downloads
0
Comments
0
Likes
18
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Kloning Gen

  1. 1. Kloning Gen
  2. 2. Kloning - definisi Dari Bahasa Yunani - klon, ranting Kumpulan turunan suatu individu yang dihasilkan tanpa melalui perkawinan; kumpulan replika sebagian atau seluruh makromolekul (contoh, DNA atau antibodi) Suatu individu yang tumbuh dari satu sel somatik induknya serta memiliki identitas genetik yang sama dengan induknya Klon: Koleksi molekul atau sel yang semua identitasnya sama dengan molekul atau sel penurunnya
  3. 3. Kloning DNAMetoda untuk memurnikan atau mengidentifikasi danmemperbanyak suatu potongan DNA tertentu (klon)yang dikehendaki dari campuran potongan-potonganDNA yang kompleks.
  4. 4. Kloning Gen Ketika keseluruhan DNA dari suatu organisme diekstraksi, akan diperoleh seluruh gen yang dimiliki organisme tersebut Pada kloning gen, hanya gen (DNA) tertentu yang diisolasi, dimurnikan, dan diperbanyak (diklon)
  5. 5. Tujuan mengklon Gen Menentukan urutan basa nukleotida penyusun gen tersebut Menganalisis atau mengidentifikasi urutan basa nukleotida pengendali gen tersebut Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang disandi gen tersebut Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada kecacatan gen yang mengakibatkan penyakit bawaan Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu, misalnya memproduksi insulin, ketahanan terhadap hama, dll.
  6. 6. Sumber DNA untuk diklon DNA kromosom cDNA (complementary DNA) yang disintesis menggunakan mRNA sebagai cetakan (template) DNA yang dihasilkan dari perbanyakan menggunakan PCR
  7. 7. Mensintesis cDNA
  8. 8. Perbanyakan DNA dengan PCR(Polymerase Chain Reaction)
  9. 9. Bahan / Alat untuk Mengklon Enzim endonuklease restriksi Enzim ligase Vektors Inang (Host) Metoda untuk memasukkan DNA ke dalam sel inang
  10. 10. Memotong DNA Menggunakan enzim endonuklease restriksi  Ujung “lengket” (sticky ends)  Ujung “tumpul” (blunt ends) Penamaan enzim  EcoRI  E = genus (Escherichia)  co = species (coli)  R = strain  I = # of enzyme
  11. 11. Ujung “lengket” dan “tumpul”(Blunt & Sticky ends)
  12. 12. Penyambungan (pasting) DNA  Pembentukan ikatan- H pada ujung-ujung yang komplemen (sticky ends)  Ligase membentuk ikatan fosfodiester untuk merekatkan benang-benang DNA
  13. 13. Vektor untuk MengklonDiperlukan suatu wahana (vehicle)untuk memasukkan suatu potonganDNA ke dalam sel agar DNAtersebut dapat disimpan dandiperbanyak di dalam sel tersebut
  14. 14. PlasmidDNA bukan kromosom (extrachromosomal DNA) yang secara alami dimiliki suatu jasad Bentuknya benang ganda (double strands DNA, dsDNA) sirkularPlasmid buatan (Artificial plasmids) dapat dibuat dengan menambahkan potongan-potongan DNA lain
  15. 15. Vektor untuk MengklonPlasmid dapat dimodifikasi untuk mampumembawa potongan DNA lain ke dalam selbila memiliki:  Replikator (origin of replication)  Penanda (Marker) yang mudah diseleksi (misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik)  Situs untuk mengklon (potongan DNA yang memiliki urutan basa nukleotida yang menjadi sasaran enzim restriksi tetapi tidak terletak di dalam daerah replikator atau penanda
  16. 16. Plasmid yang Dimiliki olehEscherichia coli Berasal dari plasmid alami E. coli Potongan DNA tambahan Potongan DNA tambahan
  17. 17. Plasmid Khimera (Chimeric Plasmids)Khimera berasal dari mitologi Yunani, makhluk dengan tubuh gabungan dari bagian-bagian makhluk binatang lain Setelah pemotongan plasmid menggunakan suatu enzim restriksi, potongan DNA asing yang memiliki ujung pemotongan yang sama dapat disisipkan Setelah ujung-ujung plasmid dan potongan DNA asing disambung, akan dihasilkan "plasmid rekombinan" Plasmid rekombinan dapat bereplikasi dalam sel inang yang sesuai
  18. 18. Kloning TerorientasiBila diinginkan untuk menginsersikan potongan DNA asing dengan orientasi tertentu Dilakukan dengan memotong DNA vektor maupun DNA sumber gen yang dikehendaki menggunakan dua enzim restriksi yang berbeda
  19. 19. Vektor untuk Mengklon1 Vektor berupa plasmid2 Vektor berupa bakteriofaga3 Cosmid4 BACs (Bacterial Artificial Chromosome) & YAC (Yeast Artificial Chromosome)
  20. 20. Vektor berupa Plasmid• Memiliki origin of replication dari inang yang dituju, sehingga memungkinkan replikasi secara independen terhadap genom inang.• Memiliki penanda selektif: Memudahkan seleksi sel pembawa plasmid tersisipi DNA asing ketahanan terhadap antibiotik ganda penapisan biru-putih• Memiliki banyak situs pengkloningan (multiple cloning sites, MCS)• Mudah diisolasi dari sel inang.
  21. 21. Multiple Cloning Site (MCS)
  22. 22. Vektor berupa Plasmid
  23. 23. Vektor berupa Plasmid Keunggulan:  Kecil, mudah pengerjaannya  Strategi seleksi mudah  Berguna untuk mengklon potongan DNA ukuran kecil (< 10kbp) Kelemahan:  Kurang bermanfaat untuk mengklon potongan DNA ukuran besar (> 10kbp)
  24. 24. Bakteriofaga (λ phage)
  25. 25. Vektor berupa bakteriofaga (λ vectors)  Lengan kiri:  Protein penyusun kepala & ekor  Lengan kanan:  Sintesis DNA  Pengendalian  Lisis inang  Daerah yang dihilangkan:  integrasi & eksisi  Pengendalian
  26. 26. Vektor berupa bakteriofaga (λ vectors)
  27. 27. Vektor berupa Bakteriofaga Keunggulan:  Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA ukuran besar (10 - 23 kbp)  Seleksi berdasar ukuran Kelemahan:  Lebih sulit pengerjaannya
  28. 28. Vektor CosmidGabungan sifat vektor plasmid dan sifat bergunadari situs λ cos (dihilangkan pada vektor λ) Keunggulan:  Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA berukuran sangat besar (32 - 47 kbp)  Seleksi berdasar ukuran  Pengerjaan seperti plasmid Kelemahan:  Tidak terlalu mudah untuk mengerjakan plasmid dengan ukuran sangat besar (~ 50 kbp)
  29. 29. Vektor Cosmid
  30. 30. λ ZAP
  31. 31. Vektor BAC  Replikasi dimediasi oriS dan oriE  parA and parB mengendalikan agar hanya terdapat satu vektor dalam sel  Menggunakan penanda ketahanan terhadap KhloramfenikolR
  32. 32. Vecktor YAC large inserts ARS URA3 HIS3 telomere centromere markers telomere replication origin Dapat disisipi gen asing 200 - 2000 kbp dan dimasukkan ke dalam yeast
  33. 33. BACs dan YACsBACs : Bacterial Artificial ChromosomesYACs : Yeast Artificial Chromosomes Keunggulan:  Dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA dengan ukuran sangat besar (100 - 2,000 kbp)  Penting digunakan dalam proyek penetapan urutan basa nukleotida total genom Kelemahan:  Tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan ukuran sangat besar
  34. 34. Shuttle Vector Vektor yang dapat digunakan untuk dua macam inang (memiliki origin of replication dari masing-masing inang)
  35. 35. Memilih Vektor Ukuran DNA yang disisipkan Ukuran vektor Situs enzim restriksi yang tersedia Jumlah salinan (copy number) Efisiensi kloning Kemampuan untuk menapis DNA sisipan Rencana penelitian selanjutnya
  36. 36. Cara Mengklon DNA (1) Isolasi vektor kloning (plasmid bacterial) & DNA sumber gen Pemotongan DNA sumber gen & vektor kloning menggunakan enzim restriksi yang sama Penyisipan potongan DNA sumber gen ke dalam vektor kloning yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi yang sama; potongan disambung dengan bantuan enzim DNA ligase
  37. 37. Cara Mengklon DNA (2) Vektor kloning yang telah tersisipi potongan DNA dimasukkan ke dalam sel inang (transformasi sel inang) Penapisan sel pengklon (dan gen yang dimasukkan) Identifikasi sel pengklon pembawa gen yang dikehendaki
  38. 38. Transformasi Sel InangMemasukkan plasmid (yang merupakanvektor yang telah disisipi gen) ke dalamsel inang
  39. 39. Transformasi (1) PRA-INKUBASI Sel E. coli calon penerima plasmid dipaparkan kepada ion positif kalsium klorida (CaCl2). Perlakuan ini memberikan cekaman kepada bakteri yang mengakibatkan membran sel dan dinding sel bakteri tersebut menjadi permeabel terhadap plasmid donor. Proses ini mengakibatkan E. coli menjadi “kompeten" untuk menerima plasmid .
  40. 40. Transformasi (2) INKUBASI  Plasmid ditambahkan ke dalam suspensi sel E. coli kompeten.  Suspensi sel E. coli kompeten lainnya yang tidak ditambah plasmid digunakan sebagai kontrol.
  41. 41. Transformasi (3) KEJUTAN PANAS (HEAT SHOCK) Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun kontrol) dipaparkan sejenak (90 detik) kepada suhu 42 oC. Langkah ini memaksimumkan masuknya plasmid menembus membran dan dinding sel.
  42. 42. Transformasi (4) PENYEMBUHAN (RECOVERY) Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun kontrol) ditumbuhkan dalam medium kaya nutrisi untuk memberi kesempatan penyembuhan setelah mengalami cekaman dan kejutan. Masa penyembuhan biasanya berlangsung satu waktu generasi (untuk E. coli berkisar antara 30 hingga 45 menit)
  43. 43. Transformasi (5) PENAPISAN (SCREENING) Sel kompeten yang telah mengalami penyembuhan ditapis pada medium padat yang mengandung senyawa penapis berdasarkan penanda yang dibawa oleh plasmid.
  44. 44. Koloni E. coli yang membawaplasmid dengan penanda gen pendarfluor (pGLO)
  45. 45. E. coli yang Membawa Plasmid pGlo
  46. 46. Penanda selektifMemudahkan seleksi sel pembawa plasmid tersisipi DNA asing ketahanan terhadap antibiotik ganda penapisan biru-putih
  47. 47. Penapisan Klon Medium pertumbuhan diberi antibiotik yang sesuai dengan sifat ketahanan yang digunakan sebagai penanda, misalnya Kanamisin Bakteri di paruh cawan petri sebelah kanan memiliki plasmid dengan penanda ketahanan terhadap Kanamisin(Kanr), yang di sebelah kiri tidak memilikinya
  48. 48. Penapisan warna koloni Biru/Putih lacZ lacZ insert Enzim berfungsi Enzim tidak berfungsiX-gal produk X-gal produk
  49. 49. Penapisan Koloni Bakteripembawa Plasmid Rekombinan
  50. 50. Hibridisasi Koloni Dapat dilakukan jika memiliki DNA pelacak  Bagian dari gen yang dikehendaki  Bagian dari gen yang mirip dari jasad lain  Oligonukleotida sintetik
  51. 51. End Terima kasih………

×