Sediaan dahak difiksasi dan diwarnai untuk melihat morfologi dan sifat kuman. Pewarnaan Gram dan asam alkohol digunakan untuk membedakan jenis kuman, sementara pewarnaan asam tahan digunakan untuk mendeteksi Mycobacterium leprae. Kualitas sediaan dan hasil pewarnaan dievaluasi untuk diagnosis.

1. TIARA DINI HARLITA, S.S.T, M.Si.

2. •Jika dari kultur : dibuat suspensi kuman dengan cara 1 tetes
NaCl 0,85% + biakan kuman sedikit, kemudian sebarkan setipis
mungkin dengan diameter ± 1 cm, panjang ± 2 cm. Kemudian
biarkan kering di udara. Setelah itu difiksasi dengan api spirtus.
1
•Jika dari sediaan langsung seperti sputum, kita buat hapusan
pada object glass yang bersih dan bebas lemak dengan ukuran
2x3 cm, biarkan kering lalu difiksasi.
2
•Untuk pemeriksaan bahan yang cair (urine, pus, dsb), kita ambil
satu ose, kemudian letakkan pada object glass, lalu diratakan dan
dibiarkan kering di udara bebas,
3

3. • Fiksasi adalah suatu cara yang dilakukan untuk
merekatkan sampel pada object glass, sehingga tidak mudah
lepas pada saat pencucian ketika diwarnai.
Pengertian :
• Agar kuman segera mati sehingga mudah untuk diwarnai
dan tidak merusak struktur kuman.
• Agar substansi kuman dapat terlihat pada slide.
• Agar bahan warna dapat masuk dalam tubuh kuman
dengan sempurna.
• Mengawetkan sediaan.
Tujuan :

4. • Dengan api spirtus
• Sediaan yang sudah kering dilewatkan perlahan-lahan
pada nyala api kira-kira 3x berturut-turut.
• Dengan basa lemah : metanol, etil alkohol, alkohol absolut,
eter, formalin, aceton.
• Sediaan yang sudah kering digenangi dengan salah satu
bahan tersebut selama 3 menit.
• Dengan asam : asam chrimat 1%, asam pikrat, asam cuka.
• Sediaan yang sudah kering digenangi dengan salah satu
bahan tersebut selama 3 menit.
Metode :

5. • Melihat morfologi dan bentuk kuman
• Melihat susunan kuman
• Melihat sifat-sifat kuman terhadap pewarnaan (Misalnya
cat Gram, (+) = violet; (-) = merah)
• Mengarahkan pemeriksaan lebih lanjut dari kuman yang
kita temukan
• Membantu klasifikasi kuman
• Mendapatkan bentuk kuman yang khas
Tujuan

6. • Fisik : bahan pewarna diabsorbsi oleh kuman sehingga
terjadi ikatan antara zat warna dengan kuman
• Kimia : bahan warna yang diabsorbsi oleh kuman dan
bergabung dengan protoplasma kuman, dimana
protoplasma kuman banyak mengandung asam nukleat
yang bermuatan (-) dimana akan berikatan dengan bagian
zat warna yang bermuatan (+).
Teori proses pewarnaan :

7. •Menggunakan 1 macam zat warna
•Perbedaan warna sel-sel atau bagian sel tergantung dari besar
kecilnya kemampuan sel atau bagian sel menyerap warna yang
diberikan.
•Cat yang digunakan : Solutio fuchsin, carbol fuchsin, methilen
blue, carbol gentian violet, dsb.
Pewarnaan sederhana
•Teknik pewarnaan ini menyebabkan bagian sel terwarnai berbeda.
•Pewarnaan Gram : dikembangkan pertama kali oleh Hans
Christian Gram (1884). Dibagi menjadi 2, yaitu Gram positif dan
Gram negatif.
•Pewarnaan tahan asam : pewarnaan ini sering digunakan untuk
genus Mycobacterium dan Nocardia.
Pewarnaan diferensial

8. • Pewarnaan ini digunakan untuk melihat bagian-bagian
khusus dari sel bakteri.
• Pewarnaan negatif untuk kapsul. Banyak bakteri yang
mempunyai kapsul di bagian luar sel.
• Pewarnaan endospora : endospora tidak dapat diwarnai
dengan cara pewarnaan biasa, sebab zat warna tidak bisa
menembus spora.
Pewarnaan Khusus
• Pengecatan yang dilakukan dengan satu campuran cat
yang terdiri dari 2 atau 3 cat yang terlarut.
• Contoh : Wright, Giemsa, dll.
Pewarnaan majemuk

9.  Cat yang digunakan : Methylen blue/Safranin/Fuchsin
 Prosedur :
 Dibuat sediaan tipis dan rata pada object glass
 Keringkan sediaan di udara lalu difiksasi di atas lampu spirtus
sebanyak 3 kali.
 Teteskan zat warna/cat yang akan digunakan di atas sediaan
selama 1-2 menit
 Setelah itu, cat dibuang dan sediaan dicuci dengan air mengalir
secara perlahan sampai bersih.
 Kemudian dikeringkan sediaan di udara atau dengan tisu.
 Baca sediaan di bawah mikroskop menggunakan perbesaran
objektif 100x menggunakan minyak imersi.

10.  Bahan :
 Gram A
▪ 2 gr kristal violet + 20 ml alkohol 95% + 0,8 gr ammonium oksalat + 80 ml
aquadest
 Gram B
▪ 1 gr Iodium + 2 gr Kalium Iodida + 300 ml aquadest
 Gram C
▪ 50 ml aseton + 50 ml alkohol 95%
 Gram D
▪ 0,25 gr safranin O / fuchsin + 10 ml alkohol 95% + 90 ml aquadest

11.  Prosedur :
 Dibuat sediaan tipis dan rata pada object glass
 Keringkan sediaan di udara, lalu difiksasi di atas lampu spirtus
sebanyak 3 kali.
 Teteskan Gram A di atas sediaan selama 1-2 menit.
 Cuci sediaan dengan air mengalir secara perlahan melalui ibu jari.
 Teteskan Gram B, diamkan selama 30 detik.
 Cuci kembali dengan air mengalir secara perlahan melalui ibu jari.
 Teteskan Gram C hingga warna ungu larut/pucat.
 Teteskan Gram D dan diamkan selama 1 menit.
 Cuci dengan air mengalir secara perlahan melalui ibu jari.
 Keringkan sediaan di udara atau dengan tisu.
 Baca sediaan di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x
menggunakan minyak imersi.

12. Staphylococcus aureus
with Gram staining
(Gram positive) in the
light microscope
(x1000)
Gram positive
Clostridium perfringens
(x800)

13. Gram negative
Escherichia coli
(x500)
Gram negative
diplococci Neisseria
gonorrhoeae (x1000)

14. • Larutan Fuchsin 3% (100 mL) :
• Fuchsin 3 gram
• Etanol 96% 100 mL
• Larutan Phenol 5% :
• Phenol kristal 45 gram
• Aquadest add 900 mL
Carbon Fuchsin 0,3 gram (ZN A)
•HCl 37% 30 mL
•Etanol 96% 970 mL
Asam Alkohol 3% (ZN B)
•Methylene blue 3 gram
•Aquadest add 1000 mL
Methylene Blue 0,3% (ZN C)

15. 1. Tulis nomor identitas pasien pada bagian ujung kaca.
Bila menggunakan kaca frosted tulis dengan menggunakan
pensil 2B pada bagian yang buram.
Bila menggunakan kaca biasa, tulis dengan spidol permanen
pada stiker yang dilekatkan di baliknya.
2. Buat pola apusan berukuran 2 cm x 3 cm.
3. Pilih dan ambil bagian dari dahak yang purulen (A)
menggunakan ose atau lidi yang bersih.

16. 4. Sediaan apus yang baik :
Jangan terlalu tipis untuk menghindari apusan menjadi
kering sebelum diratakan. Untuk meratakan sediaan buat
spiral-spiral kecil sewaktu apusan setengah kering dengan
menggunakan lidi lancip sehingga didapatkan sebaran
leukosit lebih rata dan area baca lebih homogen.

17. Genangi seluruh permukaan
sediaan dengan Carbol Fuchsin.
Saring zat warna setiap kali akan
melakukan pewarnaan sediaan.
2
Letakkan sediaan dengan
bagian apusan menghadap ke
atas pada rak yang
ditempatkan di atas bak cuci
atau baskom, antara satu
sediaan dengan sediaan
lainnya masing-masing
berjarak kurang lebih 1 jari.
1

18. Dinginkan selama minimal 5
menit.
4
Panasi dari bawah dengan
menggunakan sulut api
setiap sediaan sampai keluar
uap, jangan sampai
mendidih.
3

19. Bilas sediaan dengan air
mengalir secara hati-hati dari
ujung kaca sediaan
5
Jangan ada percikan ke
sediaan lain.
X

20. Miringkan sediaan
menggunakan penjepit kayu
atau pinset untuk membuang
air.
6
Genangi dengan asam
alkohol sampai tidak tampak
warna merah Carbol fuchsin.
Jangan sampai ada percikan
ke sediaan lain.
7

21. Bilas sediaan dengan air
mengalir secara hati-hati dari
ujung kaca sediaan. Jangan
ada percikan ke sediaan lain.
8
Genangi permukaan sediaan
dengan Methylene blue selama
20-30 detik
9

22. Bilas sediaan dengan air
mengalir. Jangan ada
percikan ke sediaan lain.
10
Miringkan sediaan untuk
mengalirkan sisa Methylene
blue.
11

23. Keringkan sediaan pada rak
pengering. Jangan keringkan
dengan kertas tissue.
12
Contoh hasil pewarnaan
yang baik
13

24. Acid-fast staining Mycobacterium leprae (X100)

25. 1. Kualitas dahak
Kualitas dahak yang baik dinilai dengan melihat di bawah
mikroskop, yaitu terlihat lebih dari 25 leukosit per lapang
pandang pada pembesaran 100x (10x pembesaran lensa
objektif / 10x pembesaran lensa okuler)

26. 2. Ukuran sediaan apus
Ukuran sediaan apus yang baik adalah 2x3 cm, karena
dengan ukuran tersebut dapat dibaca minimal 100 lapang
pandang sepanjang garis tengah.

27. 3. Kerataan sediaan apus
Dahak tersebar merata, tidak terlihat daerah yang kosong
pada kaca objek.
4. Ketebalan sediaan apus
Diperiksa dengan memegang sediaan apus 4-5 cm di atas
surat kabar atau tulisan cetakan. Ketebalan sediaan apus
dianggap baik bila huruf-huruf tulisannya masih dapat
terbaca.

28. 5. Pewarnaan sediaan apus
BTA terlihat jelas berwarna merah terang dengan latar
belakang biru tanpa ada sisa-sisa zat warna Fuchsin.

29. 6. Kebersihan sediaan apus
Sediaan apus harus bebas dari sisa-sisa zat warna Fuchsin,
kotoran serta kristal yang dihasilkan dari pemanasan
berlebih saat pewarnaan.

30. • BTA (+) : tampak kuman berwarna merah, berbentuk
batang halus kadang- kadang bergranul disertai kuman-
kuman lain non BTA dan sel leukosit yang berwarna biru.
• BTA (-) : tidak ditemukan kuman batang berwarna merah,
hanya terlihat kuman-kuman non BTA dan sel leukosit
yang berwarna biru

31. Skala Internatiaonal Union Against To Lung Disease (IUATLD)