Sitohistologi sangat menggantungkan diri pada penggunaan mikroskop dan teknik penyediaan contoh jaringan. Cara pembuatan sediaan histologis disebut mikroteknik. Pembuatan sediaan dari suatu jaringan dimulai dengan operasi, biopsi, atau autopsi. Jaringan yang diambil kemudian diproses dengan fiksatif yang akan menjaga agar sediaan tidak akan rusak (bergeser posisinya, membusuk, atau rusak). Fiksatif yang paling umum digunakan untuk jaringan hewan (termasuk manusia) adalah formalin (10% formaldehida yang dilarutkan dalam air). Larutan Bouin juga dapat digunakan sebagai fiksatif alternatif meskipun hasilnya tidak akan sebaik formalin karena akan meninggalkan bekas warna kuning dan artefak. Artefak adalah benda yang tidak terdapat pada jaringan asli, namun tampak pada hasil akhir sediaan. Artefak ini terbentuk karena kurang sempurnanya pembuatan sediaan. Sampel jaringan yang telah terfiksasi direndam dalam cairan etanol (alkohol) bertingkat untuk proses menghilangkan air dalam jaringan (dehidrasi). Selanjutnya sampel dipindahkan ke dalam toluena untuk menghilangkan alkohol (dealkoholisasi). Langkah terakhir yang dilakukan adalah memasukkan sampel jaringan ke dalam parafin panas yang menginfiltrasi jaringan. Selama proses yang berlangsung selama 12-16 jam ini, jaringan yang awalnya lembek akan menjadi keras sehingga lebih mudah dipotong menggunakan mikrotom. Pemotongan dengan mikrotom ini akan menghasilkan lapisan dengan ketebalan 5 mikrometer. Lapisan ini kemudian diletakkan di atas kaca objek untuk diwarnai. Pewarnaan perlu dilakukan karena objek dengan ketebalan 5 mikrometer akan terlihat transparan meskipun di bawah mikroskop. Pewarna yang biasa digunakan adalah hematoxylin dan eosin. Hematoxylin akan memberi warna biru pada nukelus, sementara eosin memberi warna merah muda pada sitoplasma. Masih terdapat berbagai zat warna lain yang biasa digunakan dalam mikroteknik, tergantung pada jaringan yang ingin diamati. Ilmu yang mempelajari pewarnaan jaringan disebut histokimia.

1. P R O G R A M S T U D I D - I I I A N A L I S K E S E H ATA N
SITOHISTOTEKNOLOGI
R I S A WA H Y U N I N G S I H , S . S T. , M S I

2. PENDAHULUAN
• Pembuatan sediaan merupakan suatu hal yang dapat
dikatakan mudah hingga sangat sulit tergantung dari
bagian tubuh yang akan diamati secara mikroskopis.
• Sediaan yang baik adalah suatu sediaan yang mampu
menggambarkan kondisi sel atau jaringan layaknya ketika
sel atau jaringan itu masih di dalam tubuh.
• Sayangnya ketika sel atau jaringan itu terlepas dari tubuh
baik sengaja atau tidak sengaja maka sel atau jaringan itu
akan mengalami kematian hingga kerusakan.

3. PENDAHULUAN
Membuat suatu sediaan yang baik, maka jaringan
yang diambil dari tubuh atau sel yang dibuat dengan
teknik apusan harus segera diawetkan pada suatu
cairan yang disebut dengan teknik fiksasi.
Walaupun pada kasus-kasus apusan, teknik fiksasi
dapat dilakukan dengan mengeringkan di suhu
ruang atau dengan pemanasan.

4. TEKNIK DASAR PEMBUATAN
SEDIAAN SITOLOGIK
• Teknik dasar pembuatan sediaan sitologik pada umumnya
terbagi menjadi beberapa bagian, yaitu teknik manual dan
otomatis (sitospin).
• Teknik manual dalam pembuatan sediaan sitologik adalah
teknik yang dilakukan dengan menggunakan tenaga
manusia dalam menempelkan dan menyebarkan sel di atas
kaca objek.
• Teknik otomatis adalah teknik yang menggunakan
instrumen khusus untuk menempelkan dan menyebarkan
sel ke atas objek gelas

5. METODE SMEAR/OLES
1. Metode Smear/Oles
• Metode oles atau yang sering disebut dengan metode
smear merupakan suatu metode pembuatan sediaan
sitologi dengan jalan mengoles atau membuat lapisan tipis
dari spesimen berbentuk cairan diatas objek gelas yg bersih
dan bebas lemak, untuk selanjutnya kemudian difiksasi,
diwarnai dan ditutup dengan gelas penutup..
• Spesimen yang masuk ke dalam kategori untuk dilakukan
pembuatan sediaan oles antara lain urin, cerebro spinal
fluid (CSF) dan spesimen lainnya yang memiliki viskositas

6. BAHAN DAN PEWARNASEDIAAN
Bahan yang sering dibuat sediaan oles : darah, nanah / jaringan-jaringan
tertentu, sumsum tulang merah, eksudat dari bermacam-macam jaringan
yg meradang.
Contoh pembuatan sediaan oles :
1. Pembuatan sediaan darah tipis
2. Pembuatan sediaan oles dari jaringan
3. Pembuatan sediaan darah tebal
4. Pembuatan sediaan nanah yang tebal (nanah diencerkan dahulu dgn
serum / cairan lain, bila keruh, disentrifugasi, endapan diencerkan lagi,
siap dioleskan)
Beberapa pewarnaan sediaan oless :
Pewarnaan Giemsa, Pewarnaan May Grunwald (larutan eosin-methylen
blue dlm methyl alkohol), Pewarnaan Pappenheim, Pewarnaan Wright.

7. LANGKAH PEMBUATAN SPESIMEN
METODE SMEAR/OLES
1. Perhatikan tampilan dari spesimen cair dan
deskripsikan dalam formulir permintaan.
2. Tuangkan spesimen ke dalam 15-50 ml
(tergantung dari perkiraan jumlah sel
berdasarkan kekeruhan). Tabung sentrifus
diputar selama sepuluh (10) menit dengan
kecepatan berkisar 1.800-2.500 rpm.
3. Saat melakukan sentrifugasi, siapkan dua slide
yang telah diberi label.

8. LANGKAH PEMBUATAN SPESIMEN
METODE SMEAR/OLES
4. Tuang cairan supernatan (posisi yang di atas) kembali ke
wadah spesimen asal. Ketika spesimen memiliki endapan
yang tebal sisakan supernatan kurang lebih 1/3 bagian
dari sedimen atau ketika sedimen sangat tipis bahkan
hampir tidak terlihat maka supernatan diusahakan
terbuang hingga tidak ada tetesan kurang lebih 2-3 detik
5. Homogenkan kembali hasil no 4 dengan mengetukkan
tabung atau dapat menggunakan vortex hingga terlihat
lagi larutan yang bercampur.

9. LANGKAH PEMBUATAN SPESIMEN
METODE SMEAR/OLES
6. Ambil larutan padatabung no 5 dan teteskan satu
atau dua tetes pada sisi objek gelas (kurang lebih
2 cm dari tepi luar)
7. Pada poin 7 dapat dipilih salah satu (a atau b)
a. Lakukan metode "pull-apart" (tarik dan dorong),
hingga sedimen menyebar merata pada permukaan
(Gambar 8.15).
b. Tekan tetesan spesimen dengan kaca objek dan putar
kedua objek hingga menjadi sejajar dan tarik perlahan
dengan arah yang berlawanan atau yang disebut
dengan “sliding smear”

10. LANGKAH PEMBUATAN SPESIMEN
METODE SMEAR/OLES
8. Simpan sisa sedimen di tabung sentrifugal
hingga diagnosisnya terlaporkan.
9. Lanjutkan dengan tahap fiksasi (kering atau
basah) tergantung dari formulir
permintaan

11. GAMBAR TEKNIK PEMBUATAN SEDIAAN
SITOLOGIK METODE OLES /SMEAR

12. GAMBAR METODE SLIDING SMEAR

13. METODE RENTANG
• Metode rentang adalah suatu metode pembuatan sediaan
dengan cara merentangkan suatu jaringan pada
permukaan gelas benda sehingga dapat diamati dengan
mikroskop.
• Bahan yang dibuat jaringan yang tipis, misal : pleura,
mesenterium, peritoneum, pericardium, dsb.
• Dapat diamati tanpa pewarnaan / dengan pewarnaan
Mallory-Acid Fuchsin : Hematoksilin ; Azure II-Eosin.

14. METODE RENTANG
• Pengamatan sediaan rentang dengan cara tidak
warnai menyebabkan sediaan tidak tahan lama,
karena jaringan tidak difiksasi lebih dulu.
• Untuk membuat sediaan rentang yang dapat tahan
lama yang dapat diamati sewaktu-waktu, maka
sediaan tersebut harus difiksasi terlbih dahulu
sebelum diwarnai.

15. LANGKAH PEMBUATAN SPESIMEN
METODE RENTANG
1. Mengambil jaringan subkutan atau mesenterium segar dari
hewan yang dibedah dengan cepat tanpa dicuci terlebih dahulu
2. Merentangkan mesenterium pada gelas benda dengan bantuan
sonde/alat lain sehingga tidak ada bagian yang terlipat maupun
terjadinya udara yang terjebak di antara gelas benda dengan
jaringan
3. Memfiksasi jaringan dengan cara memasukkan gelas benda
yang bersangkutan ke dalam staining jar yang berisi methyl
alkohol selama 5 menit
4. Mencuci dengan alkohol 50% beberapa celupan dan
melanjutkan ke akuades beberapa celupan masing-masing 2
menit

16. LANGKAH PEMBUATAN SPESIMEN
METODE RENTANG
5. Mewarnai jaringan dengan zat warna hematoxilin selama 5
menit/lebih
6. Mencuci dalam staining jar dengan air mengalir sampai terjadi warna
biru cerah
7. Mendehidrasi dengan memasukkan gelas benda yang bersangkutan
beberapa celupan secara berurutan pada staining jar yang berisi
alkohol 30%, 50%, dan 70%
8. Mewarnai jaringan dengan zat warna eosin selama 2-5 menit.
9. Mencuci dengan alkohol 70% beberapa celupan dan melanjutkan
dehidrasi dengan cara memasukkan gelas benda yang bersangkutan
beberapa celupan pada staining jar yang berisi alkohol 80%, 90%, dan
absolut

17. LANGKAH PEMBUATAN SPESIMEN
METODE RENTANG
10. Mendealkoholisasi dengan cara memasukkan gelas benda yang
bersangkutan beberapa celupan pada staining jar yang berisi
campuran alkohol:xilol dengan perbandingan 3:1, 1:1 dan 1:3,
melanjutkan dengan xilol murni I dan II
11. Mengambil gelas benda dari staining jar dengan cepat dan menetesi
dengan kanada balsam, kemudian menutup secara cepat dan hati-
hati
12. Melekatkan label sesuai identitas preparat yang bersangkutan pada
ujung kanan gelas benda dengan posisi memanjang
13. Mengamati preparat di bawah mikroskop dengan perbesaran tinggi.

18. TERIMA KASIH