PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah teknik amplifikasi DNA secara in vitro yang mampu memperbanyak potongan DNA secara eksponensial melalui siklus pemanasan dan pendinginan. Proses utama PCR terdiri atas tahap pemanasan, annealing primer, dan perpanjangan rantai DNA oleh enzim Taq polimerase. Optimasi berbagai parameter seperti konsentrasi enzim, nukleotida, ion Mg, suhu, dan jumlah siklus diperlukan agar PCR berjalan dengan

1. PCR
(Polymerase Chain Reaction)
1. Keunggulan:
 Dapat menganalisis DNA yang sangat
sedikit.
 Spesifik, sederhana
 Dapat menganalisis banyak sample
dengan cepat.
 Mampu mendeteksi kelainan.

2. 1. Kelemahan:
 Optimasi perlu waktu, jika tidak optimum
menyebabkan terjadinya kesalahan
interprestasi.
 Karena sangat sensitive menyebabkan
problem kontaminasi sangat tinggi →
kesalahan.
  Kebersihan, atau tanpa adanya
kontaminasi dituntut sangat tinggi pada saat
bekerja.

3. Agar berhasil dengan baik,Perlu
“ OPTIMASI “
Konsentrasi: Suhu dan Waktu:
• Enzymes • Annealings
• DNTP’s • Dematurasi
• Mg. Ion • Pemanjangan /
• Primer Extension

4. Optimasi Amplifikasi DNA
dengan PCR
Konsentrasi Enzyme
• 1 - 2,5 unit/ 100 µl larutan reaksi
• Namun tergantung dari template target dan primer
• Setiap sample perlu dioptimasi
• Kalau optimasi dianjurkan antara 0.5 – 5 unit/ 100 µl
• [ Innis, et al 1990 ].
• 0.5 unit/ 15 µl larutan reaksi 30 cyclis.
• [ Ruiz et, 1997 ]

5. • Deoksinukleotida Trifosfat
• Stok DNTP’s harus netral ( pH 7.0 )
• Disimpan dengan konsentrasi 10mM, pada suhu -20o C
• Keempat macam DNTP harus sama
• Konsentrasi pada larutan DNTP’s.
• Spesifitas dan ketelitian naik dengan rendahnya
konsentrasi, sebab dengan konsentrasi yang rendah
memperkecil kemungkinan terjadinya salah penempelan
primer. ( ± 20 µM/ 100 larutan Reaksi)
• Namun konsentrasi tersebut juga tergantung DNA yang
diamplifikasi.
• Konsentrasi DNA, diukur dengan spektrofotometri.

6. • Konsentrasi Mg2+
• Optimasi konsentrasi ion Mg ini sangat
penting, sebab konsentrasi ion Mg akan
mempengaruhi penempelan primer, suhu
dissosiasi baik jalin DNA template maupun
produk PCR, spesifitas produk,
pembentukan primer, dimmer, aktifitas
enzim dan ketelitian.
• Konsentrasi sebaiknya antara 0.5 – 2.5
mM.

7. • Konsentrasi Primer
• Konsentrasi primer ini dianjurkan antara 0.1 – 0.5 µM.
• Semakin tinggi konsentrasi primer, menyebabkan
terjadinya:
• salah temple (“misprinning”))
• terjadi penumpukan produk yang tidak diinginkan, dan
• kemungkinan terjadinya “primer-dimer”
• ini semua substrat PCR.
• Oleh Ruiz, et al 1997 diberikan rumus untuk mengirakan
konsentrasi primer
0.067 γ / oD 260 = χ
• γ = volume reaksi dalam µl.
• χ = volume primer yang akan dipakai dalam µl
• oD 260 = optical density λ 260 nm.

8. • Suhu Annealing
• Suhu dan waktu yang diperlukan untuk “primer
Annealing” tergantung dari:
– Komposisi basanya
– Panjangnya
– Konsentrasinya
• Suhu annealing terbaik biasanya 5o C dibawah
Tm nya.
• Biasanya suhu antara 5o – 72o C akan
menghasilkan produk yang bagus.
• Suhu terlalu tinggi menyebabkan penempelan
primer tidak betul dan kesalahan perpanjangan
pada ujung 3’ primer. Sehingga suhu annealing
sangat kritis lebih-lebih pada putaran-putaran
permukaan.

9. a) Pemanjangan Primer
(primer Extention)
• Waktu prmanjangan tergantung dari:
• Panjangnya DNA yang diamplifikasi
• Konsentrasi DNA yang diamplifikasi
• Suhu
• Suhu pemanjangan umumnya 72oC
• Suhu 72o C selama 1 menit cukup untuk
produk dengan panjang 2 Kb.

10. a) Suhu dan Waktu Denaturasi
• Penyebab utama gagalnya reaksi PCR adalah tidak
sempurnanya proses Denaturasi.
 Biasanya, 95o C selama 30 detik atau 97o C selama 15 detik.
 Namun, lebih tinggi mungkin lebih baik, terutama DNA yang
kaya pasangan G-C (Innis, et al., 1990)
 Jika dinaturasi tidak sempurna, mungkin DNA kembali berikatan
ataupun tidak mampu (menerima primer yang akan menempel,
sehingga sensitifitasnya turun  produk turun.
Ini terjadi jika waktu denaturasi terlalu pendek.
 Jika waktu terlalu lama enzyme Taq polimerase akan rusak.
Beberapa protocol menganjurkan denaturasi mula-mula 94o C
selama 1 – 10 menit (Ruiz, et al., 1997)
• Ines et al (1990) menyebutkan waktu paro Taq
Polymerase DNA kadang dari 2 jam – 92.5 0C.
• 40 menit suhu 950C
• 5 menit suhu 97.50C

11. a) Jumlah Putaran
• Jumlah putaran tergantung dari hasil
konsentrasi DNA mula-mula, dengan
catatan semua parameter sudah
dioptimasi.
• Amplifikasi lebih dari 40 putaran akan
menghasilkan produk PCR yang salah.
• Terlalu sedikit putaran akan mendapatkan
produk yang sedikit.

12. Rekomendasi putaran versus
konsentrasi mula-mula:
• Number of target • Number of cycles:
molicules:
3 x 105 25 to 30
1.5 x 104 30 to 35
1 x 103 35 to 40
50 40 to 45

13. PCR
• PCR : Polymerese Chain Reaction
• Ditemukan oleh Kary Mullis 1984
• Memperbanyak potongan DNA
• Bahan :
 DNA
 Primer
 Enzyme “Taq Polimerese”
 4 macam deoxynucleoside triphosphate
 Magnesium ion.
• PCR terdiri atas beberapa proses:
– Pemanasan DNA untuk mendenaturasi DNA ( memisahkan 2
rantai DNA )
– Dinginkan dan “oliganucleotide primer” menera panjang rantai
DNA.
– Terjadi polimerisasi karena adanya primer dan deoxynucleoside
triphosphate serta enzyme.
– Kemudian proses 1) diulang kembali ke tahap 2) dan tahap 3).
• Proses tersebut diulang-ulang sampai 25-30 kali.

14. SKEMA CARA KERJA PCR