Enzim tyrosil-tRNA sintetase dapat meningkatkan aktivitasnya melalui mutagenesis terarah. Peneliti mengganti asam amino treonin pada posisi 51 dengan alanin atau prolin pada enzim tersebut. Hasilnya, mutasi penggantian treonin menjadi prolin menghasilkan enzim dengan efisiensi katalitik tertinggi secara in vitro, sedangkan penggantian menjadi alanin memberikan aktivitas tertinggi secara in vivo.

2. Suatu biokatalisator yang dapat mempercepat laju
reaksi dengan menurunkan energi aktivasi.
Sifat-sifat
enzim
Enzim sebagai katalisator
Enzim itu suatu protein
Enzim itu khusus
Enzim ada yang bisa bekerja bolak-balik
Enzim

3. 1. Suhu
2. pH
3. Konsentrasi Enzim, Substrat dan Kofaktor.
4. Inhibitor
Enzim

4. (1) Tyr + ATP Tyr-A + PPi
(2) Tyr-A + tRNATyr
Tyr-tRNATyr
+ AMP
Tyrosyl-tRNA sintetase
Mengkatalisis reaksi aminosilasi.
Aminosilasi yaitu: pengikatan asam amino yang sesuai ke tRNA terjadi melalui reaksi
kimia
Mengkatalisis reaksi aminosilasi.
Aminosilasi yaitu: pengikatan asam amino yang sesuai ke tRNA terjadi melalui reaksi
kimia

7. PCR

8. Hasil Elektroforesis PCR

9. Enzim Kcat (s-1
) KM (ATP)
(mM)
Kcat/ KM
(s-1
M-1
)
TyrTS 7,6 0,9 8.400
TyrTS (Ala 51) 8,6 0,54 15.900
TyrTS (Pro 51) 12,0 0.058 208.000
Tabel 1. Aktivitas pertukaran pirofosfat dari tirosil-tRNA sintetase
Ket :
Kcat : jumlah maksimum molekul substrat yang dikonversi menjadi produk
KM : kesetimbangan disosiasi kompleks ES menjadi enzim dan substrat
Kcat/ KM : efisiensi katalitik
In Vitro

10. Enzim Kcat (s-1
) KM (ATP)
(mM)
Kcat/ KM
(s-1
M-1
)
TyrTS 4,7 2,8 1.860
TyrTS (Ala 51) 4,0 1,2 3.200
TyrTS (Pro 51) 1,8 0.019 95.800
Tabel 2. Aktivitas aminosasilasi dari tirosil-tRNA sintetase
In Vitro

11. 1. Apa substrat dari enzim tyrosil-TRNA syntetase? Tyr-A (tyrosyl adenylate)
dan t-RNA
2. Bagaimana peneliti memprediksi asam amino pada situs aktif enzim?
Jawab:
Untuk memprediksi asam amino pada situs aktif enzim, peneliti menggunakan
bantuan komputer grafis. Dengan bantuan komputer ini, efek perubahan dari satu
atau lebih residu asam amino pada situs aktif enzim berdasarkan interaksi antara
enzim dan substrat dapat diprediksi. Komputer grafis merupakan cabang dari ilmu
komputer dan berkaitan dengan manipulasi visual content dan proses sintesisnya
secara digital. Sebagai contoh enzim yang mengandung residu asam amino
treonin pada posisi 51 (Thr 51) akan terlihat adanya ikatan hidrogen yang jauh atau
panjang antara hidroksil dari Thr 51 dengan oksigen dari ribosa pada tirosin
adenilat (substrat). Apabila Thr 51 ini digantikan oleh Alanin, maka akan terjadi
penghilangan ikatan hidrogen dan kemungkinan hilangnya ikatan hidrogen ini
akan meningkatkan afinitas enzim.
Pertanyaan-pertanyaan
1
2

12. 2. Bagaimana peneliti menguji prediksi mereka? (Mutagenesis
Oligonukleotida Terarah)
Jawab:
Metode Sanger Memerlukan :
DNA utas tunggal dalam jumlah cukup sebagai template DNA
Primer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang berpasangan dengan template DNA
dan berfungsi sebagai starting point untuk replikasi
DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA, menambahkan nukleotida baru ke
ujung 3 dari template
Sejumlah nukeotida normal
Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel (radioaktif atau dengan pewarna
fluorescent)
Template DNA direplikasi melibatkan nukeotida normal tetapi secara random
dideoxy (DD) nukleotida diambil (dipasangkan).
Penambahan dideoxy nukeotida menyebabkan reaksi berhenti
Hasilnya DNA dengan panjang yang bervariasi , masing-masing berhenti pada
DDnukleotida tertentu yang dilabel.
Karena tiap panjang yang berbeda bergerak dengan kecepatan yang berbeda
selama elektroforesis, maka urutannya dapat ditentukan.
Pertanyaan-pertanyaan
3

13. Pertanyaan-pertanyaan
Tahapan Sekuensing Metode Sanger :
1. Tahapan sekuensing yang pertama adalah menyediakan
dsDNA (double strand DNA)
2. Memotong dsDNA (double strand DNA) menjadi ssDNA
(single strand DNA)

14. Pertanyaan-pertanyaan
3. Mengambil template (cetakan) DNA dari ssDNA hasil potongan dari dsDNA tadi
4. Menyediakan seluruh alat dan bahan untuk sekuensing DNA. Bahan untuk
sekuensing adalah template (cetakan) DNA, primer, dNTP, ddNTP dan enzym
polymerase.

15.  Template DNA berfungsi sebagai cetakan.
 Primer berfungsi sebagai landasan/pijakan yang mengenal situs spesifik pada
DNA template untuk memulai prooses polymerase.
 dNTP (deoksi nukleotida tri phospat) berfungsi sebagai sumber nukleotida pada
proses polymerase sekuensing. dNTP ada 5 jenis, yaitu dATP (deoksi adenin tri
phospat), dGTP (deoksi guanin tri phospat), dUTP (deoksi urasil tri phospat),
dCTP (deoksi citosin tri phospat), dan dTTP (deoksi timin tri phospat).
 ddNTP (dideoksi nukleotida tri phospat) berfungsi untuk
menghentikan/terminasi proses enzim polymerase, sehingga proses
perbanyakan nukleotida terhenti.
 Enzym polymerase berfungsi untuk reaksi polimerisasi atau perbanyakan
nukleotida.
Pertanyaan-pertanyaan

16. 5. Menyiapkan 4 tabung reaksi. Masing-masing tabung reaksi diberikan
ddNTP, yaitu ddGTP, ddCTP, ddATP, dan ddTTP. Masing-masing tabung
reaksi diisi dengan ddNTP yang berbeda. Tabung pertama diisi dengan
ddGTP, tabung kedua diisi dengan ddCTP, tabung ketiga diisi dengan
ddATP, dan tabung keempat diisi dengan ddTTP.
Pertanyaan-pertanyaan

17. 6. Setelah masing-masing tabung diisi dengan ddNTP, kemudian masing-
masing tabung diisi dengan dNTP, sebagai sumber nukleotida pada proses
polimerasi. Yaitu dGTP, dCTP, dATP, dan dTTP.
Pertanyaan-pertanyaan

18. 7. Memasukkan dNTP ke dalam tabung reaksi tadi.
8. Kemudian memasukkan primer ke dalam tabung reaksi. Primer berfungsi
mengenali situs spesifik pada DNA template, juga berfungsi sebagai
landasan/pijakan untuk memulai polimerisasi.
Pertanyaan-pertanyaan

19. 9. Setelah pemberian primer, juga dimasukkan enzim polimerase (taq-
polymerase). Enzim polimerase memulai proses polimerisasi
Pertanyaan-pertanyaan

20. 10. Enzim polymerase terus mengkatalisis pembentukan polinukleotida dari
nukleotida dNTP (deoksi nukleotida tri phospat)
Pertanyaan-pertanyaan

21. 11. Pada saat enzim taq-polymerase mengkatalisis pembentukan ikatan
antara nukleotida, deoksi-nukleotida (ddNTP) hadir berikatan dengan
polimer nukleotida sebelumnya
Pertanyaan-pertanyaan

22. 12. Kehadiran ddNTP (deoksinukleotida) mengakibatkan
terhentinya/terminasi proses polimerase, sehingga dihasilkan rantai
polinukleotida yang berbeda panjangnya
Pertanyaan-pertanyaan

23. a). Berikut ini gambar perbedaan struktur dNTP (deoksinukleotida tri
phospat) dan ddNTP (dideoksinukleotida tri phospat).
b). Keberadaan ddNTP menghalangi terbentuknya ikatan phospodiester
antara satu nukleotida dengan nukleotida berikutnya, sehingga
mengakibatkan terminasi/pengakhiran proses polimerisasi
Pertanyaan-pertanyaan

24. 13. Kehadiran ddNTP menghasilkan beberapa rantai polinukleotida berbeda
Pertanyaan-pertanyaan

25. 14. Kegiatan nomor 9 sampai nomor 13 dilakukan pada semua tabung reaksi
15. Keempat tabung reaksi tersebut dipersiapkan untuk di alirkan pada gel
agarosa
Pertanyaan-pertanyaan

26. 16. Perbedaan panjang polinukleotida tersebut, mengakibatkan perbedaan
letak pada gel agarosa. Polinukleotida yang paling pendek
bermigrasi/pergerakannya apling cepat pada gel agarosa.
Pertanyaan-pertanyaan

27. 17. Hasil pembacaan sekeuensing dari arah 5’ ke 3’ adalah rantai kompemen,
yaitu 5’ AGCCGATCC 3’. Sehingga DNA templatenya adalah 5’ GGATCGGCT
3’
Pertanyaan-pertanyaan

28. 5. Apa yang dapat disimpulkan dari penelitian ini?
Jawab:
Aktivitas enzim dapat ditingkatkan dengan melakukan mutagenesis
terarah. Aktivitas yang maksud diantaranya: Stabilitas termal, meningkat
afinitas, dan fungsi katalitik enzim. Pada jurnal dilakukan mutagenesis
terarah oligonukleotida pada enzim Tyr-TS (Thr51), dimana terjadi
mutagenesis pada Tyr-TS (Thr51) menjadi Tyr-TS (Ala-51) dan Tyr-TS(Pro-
51). Metoda mutagenesis ini dilakukan secara in vitro dan in vivo.
Pertanyaan-pertanyaan
4

29. 5. Mutasi manakah yang dilakukan peneliti yang menghasilkan enzim tyrosil-tRNA
synthetase yang paling baik? Jelaskan jawaban anda?
Jawab:
Enzim TyrTS yang lebih baik tergantung pada kondisi yaitu dimana pada in vitro yg
lebih baik adalah TyrTS (Pro51) sedangkan pada in vivo yaitu pada TyrTS(Ala51). Hal
ini disebabkan karena pada in vitro nilai Km kecil yg baik dan nilai Kcat besar yg baik
dan Kcat/ KM yang memiliki nilai besar yang baik. Dimana, Kcat merupakan jumlah
maksimum molekul substrat yang dikonversi menjadi produk sedangkan KM
merupaka kesetimbangan disosiasi kompleks ES menjadi enzim dan substrat, Kcat/ KM :
efisiensi katalitik
Pada in vivo, yang baik adalah TyrTS(Ala51). Baiknya aktivitas enzim TyrTS(Ala51) ini
tidak dipengaruhi oleh nilai Kcat/Km namun dipengaruhi oleh nilai Kcat, dimana
semakin besar nilai Kcat maka semakin baik aktivitas enzimnya. Hal ini disebabkan
oleh energi (ATP) yang diperlukan berada pada range <2mM. (Range ATP 2-3mM
menandakan enzim tersebut sudah jenuh).
Pertanyaan-pertanyaan
5