Nucleic Acid Techniques adalah teknik atau metode yang digunakan dalam analisis asam nukleat. Assignment for IDK course.

1. NUCLEIC ACIDTECHNIQUES
KelompokVII
Reference:
Rifai, N., Andrea R. H., dan CarlT.W. 2018. Principles and Applications of
Molecular Diagnostics. Cambridge, AS: Elsevier.

2. • Nucleic AcidTechniques adalah teknik atau metode yang digunakan dalam analisis
asam nukleat.
• Terdiri dari 4 tahapan:
1. Preparation
2. Amplification
3. Detection, Analysis,Quantification
4. Discrimination
• PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah metode in vitro untuk membuat salinan
fragmen DNA dan merupakan metode paling populer dalam diagnosis molekul.
Termasuk dalam tahapan memperjelas (amplification) sampel.

3. Preparation
1. Nucleic Acid Fragmentation
2. BisulfiteTreatment for Methylation Analysis
Amplification
1. PCR
2. AdditionalTarget Amplification Methods
3. Signal and Probe Amplification Methods
4. Endpoint Quantification in Amplification Assays

4. Detection
1. Nucleic Acid Probes
2. Electrochemical Detection
Discrimination
1. Electrophoresis
2. Alternatives (including HPLC, mass spectrometry, and pyrosequencing)
3. Hybridization Assays

5. Prinsip dan Cara Kerja PCR
• PCR membuat banyak salinan dari segmen DNA tertentu. Dengan menggunakan
PCR, satu salinan (atau lebih) dari sekuens DNA secara eksponensial diperkuat
untuk menghasilkan ribuan hingga jutaan salinan lebih banyak dari segmen DNA
tertentu.
• Untuk itu, PCR membutuhkan:
1. DNA Polimerase tahan panas (thermostable)
2. Deoksinukleotida dari masing-masing basa (dNTPs)
3. Untai DNA, termasuk sekuens yang akan disalin
4. Oligonukleotida sebagai primer

6. Prinsip dan Cara Kerja PCR
• Terdiri dari 3 tahapan dalam menyalin segmen DNA:
1. Denaturation
2. Annealing
3. Extension
• Pada tahap awal, dupleks (polinukleotida untai ganda) dipanaskan pada suhu
tinggi (~94°C) hingga menjadi untai tunggal (denaturaion).
• Setelah dingin, ditambahkan primer (sekuens DNA pendek, yang berfungsi
sebagai titik awal kerja DNA polimerase) secara berlebih untuk menguatkan
(annealing) sekuens dan memungkinkan DNA polimerase bekerja (~55°C)
• DNA Polimerase bekerja (~72°C) memulai sintesis menuju ujung ‘3 (extension)

7. PCR tubes

8. Amplifikasi DNA
Rapid polymerase chain reaction improves product specificity

9. A visual demonstration of polymerase chain reaction (PCR) kinetics

10. Skema PCR

12. • Setelah 20 hingga 40 siklus, produk terakumulasi lebih dari 1 juta kali lipat.
• Setelah proses ini (amplification), produk dapat dideteksi dengan berbagai metode
(detection)
• Elektroforesis gel dengan pewarnaan ethidium bromide adalah metode klasik
yang memisahkan produk berdasarkan ukuran (discrimination) dan mungkin cukup
untuk banyak aplikasi
• Cara lainnya adalah dengan label fluoresensi seperti pada Sanger dideoxy-
termination sequencing

13. Aplikasi NucleicAcidTecnhique
• Dilakukan oleh
Santoso,T. J., dkk. 2013. AplikasiTeknik Polymerase Chain Reaction (PCR) Menggunakan
Primer Degenerate dan SpesifikGen AV1 Untuk Mendeteksi Begomovirus PadaTomat
(Lycopersicon esculentum Mill). J. Hort. Indonesia 4(3):140-149. Desember 2013.
• Mendeteksi begomovirus yang menginfeksi tanaman tomat menggunakan teknik
PCR dengan primer degenerate dan spesifik
• Instrumen yang digunakan adalah PCR (PCT-100, MJ Research Inc. USA)

14. PCR
(PCT-100, MJ Research Inc. USA)

15. Elektroforesis fragmen DNA produk amplifikasi PCR (discrimination technique)

16. TERIMA KASIH