PCR

2,532 views

Published on

PPT ini merupakan salah satu materi kuliah BIOTEKNOLOGI yang ditulis oleh Trianik Widyaningrum, M.Si. (dosen Pendidikan Biologi Universitas Ahmad Dahlan Yogyakarta).

Butuh lebih banyak materi biologi..???
http://belajar-di-rumah.blogspot.com/

Published in: Education
0 Comments
4 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total views
2,532
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
3
Actions
Shares
0
Downloads
0
Comments
0
Likes
4
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

PCR

  1. 1. PCR (Polymerase Chain Reaction)1. Keunggulan: Dapat menganalisis DNA yang sangat sedikit. Spesifik, sederhana Dapat menganalisis banyak sample dengan cepat. Mampu mendeteksi kelainan.
  2. 2. 1. Kelemahan: Optimasi perlu waktu, jika tidak optimum menyebabkan terjadinya kesalahan interprestasi. Karena sangat sensitive menyebabkan problem kontaminasi sangat tinggi → kesalahan.  Kebersihan, atau tanpa adanya kontaminasi dituntut sangat tinggi pada saat bekerja.
  3. 3. Agar berhasil dengan baik,Perlu“ OPTIMASI “Konsentrasi: Suhu dan Waktu:• Enzymes • Annealings• DNTP’s • Dematurasi• Mg. Ion • Pemanjangan /• Primer Extension
  4. 4. Optimasi Amplifikasi DNAdengan PCRKonsentrasi Enzyme• 1 - 2,5 unit/ 100 µl larutan reaksi• Namun tergantung dari template target dan primer• Setiap sample perlu dioptimasi• Kalau optimasi dianjurkan antara 0.5 – 5 unit/ 100 µl• [ Innis, et al 1990 ].• 0.5 unit/ 15 µl larutan reaksi 30 cyclis.• [ Ruiz et, 1997 ]
  5. 5. • Deoksinukleotida Trifosfat• Stok DNTP’s harus netral ( pH 7.0 )• Disimpan dengan konsentrasi 10mM, pada suhu -20o C• Keempat macam DNTP harus sama• Konsentrasi pada larutan DNTP’s.• Spesifitas dan ketelitian naik dengan rendahnya konsentrasi, sebab dengan konsentrasi yang rendah memperkecil kemungkinan terjadinya salah penempelan primer. ( ± 20 µM/ 100 larutan Reaksi)• Namun konsentrasi tersebut juga tergantung DNA yang diamplifikasi.• Konsentrasi DNA, diukur dengan spektrofotometri.
  6. 6. • Konsentrasi Mg2+• Optimasi konsentrasi ion Mg ini sangat penting, sebab konsentrasi ion Mg akan mempengaruhi penempelan primer, suhu dissosiasi baik jalin DNA template maupun produk PCR, spesifitas produk, pembentukan primer, dimmer, aktifitas enzim dan ketelitian.• Konsentrasi sebaiknya antara 0.5 – 2.5 mM.
  7. 7. • Konsentrasi Primer• Konsentrasi primer ini dianjurkan antara 0.1 – 0.5 µM.• Semakin tinggi konsentrasi primer, menyebabkan terjadinya:• salah temple (“misprinning”))• terjadi penumpukan produk yang tidak diinginkan, dan• kemungkinan terjadinya “primer-dimer”• ini semua substrat PCR.• Oleh Ruiz, et al 1997 diberikan rumus untuk mengirakan konsentrasi primer 0.067 γ / oD 260 = χ• γ = volume reaksi dalam µl.• χ = volume primer yang akan dipakai dalam µl• oD 260 = optical density λ 260 nm.
  8. 8. • Suhu Annealing• Suhu dan waktu yang diperlukan untuk “primer Annealing” tergantung dari: – Komposisi basanya – Panjangnya – Konsentrasinya• Suhu annealing terbaik biasanya 5o C dibawah Tm nya.• Biasanya suhu antara 5o – 72o C akan menghasilkan produk yang bagus.• Suhu terlalu tinggi menyebabkan penempelan primer tidak betul dan kesalahan perpanjangan pada ujung 3’ primer. Sehingga suhu annealing sangat kritis lebih-lebih pada putaran-putaran permukaan.
  9. 9. a) Pemanjangan Primer (primer Extention)• Waktu prmanjangan tergantung dari:• Panjangnya DNA yang diamplifikasi• Konsentrasi DNA yang diamplifikasi• Suhu• Suhu pemanjangan umumnya 72oC• Suhu 72o C selama 1 menit cukup untuk produk dengan panjang 2 Kb.
  10. 10. a) Suhu dan Waktu Denaturasi• Penyebab utama gagalnya reaksi PCR adalah tidak sempurnanya proses Denaturasi.  Biasanya, 95o C selama 30 detik atau 97o C selama 15 detik.  Namun, lebih tinggi mungkin lebih baik, terutama DNA yang kaya pasangan G-C (Innis, et al., 1990)  Jika dinaturasi tidak sempurna, mungkin DNA kembali berikatan ataupun tidak mampu (menerima primer yang akan menempel, sehingga sensitifitasnya turun  produk turun. Ini terjadi jika waktu denaturasi terlalu pendek.  Jika waktu terlalu lama enzyme Taq polimerase akan rusak. Beberapa protocol menganjurkan denaturasi mula-mula 94o C selama 1 – 10 menit (Ruiz, et al., 1997)• Ines et al (1990) menyebutkan waktu paro Taq Polymerase DNA kadang dari 2 jam – 92.5 0C.• 40 menit suhu 950C• 5 menit suhu 97.50C
  11. 11. a) Jumlah Putaran• Jumlah putaran tergantung dari hasil konsentrasi DNA mula-mula, dengan catatan semua parameter sudah dioptimasi.• Amplifikasi lebih dari 40 putaran akan menghasilkan produk PCR yang salah.• Terlalu sedikit putaran akan mendapatkan produk yang sedikit.
  12. 12. Rekomendasi putaran versuskonsentrasi mula-mula:• Number of target • Number of cycles: molicules: 3 x 105 25 to 30 1.5 x 104 30 to 35 1 x 103 35 to 40 50 40 to 45
  13. 13. PCR• PCR : Polymerese Chain Reaction• Ditemukan oleh Kary Mullis 1984• Memperbanyak potongan DNA• Bahan :  DNA  Primer  Enzyme “Taq Polimerese”  4 macam deoxynucleoside triphosphate  Magnesium ion.• PCR terdiri atas beberapa proses: – Pemanasan DNA untuk mendenaturasi DNA ( memisahkan 2 rantai DNA ) – Dinginkan dan “oliganucleotide primer” menera panjang rantai DNA. – Terjadi polimerisasi karena adanya primer dan deoxynucleoside triphosphate serta enzyme. – Kemudian proses 1) diulang kembali ke tahap 2) dan tahap 3).• Proses tersebut diulang-ulang sampai 25-30 kali.
  14. 14. SKEMA CARA KERJA PCR

×