2. ISOLASI RNA PADA SEL
PROKARIOTIK
OLEH :
TRI UTAMI
RIA OKTAMI
WIKA PUTRIANA
TITIEN YULIASTI
FERLY TRINOVELDI
SRI WULANDARI
PUSPA AGUSTINA
AHMAD FAHZAL
LAMTIAR

3. PENGERTIAN RNA
RNA merupakan singkatan dari
Ribonukleatid Acid atau Asam
ribonukleat. RNA merupakan substansi
genetik yang berperan sebagai perantara
dalam proses pengkodean protein dari
gen yang terdapat di dalam DNA.

4. STRUKTUR RNA
Hal yang perlu diperhatikan
dala memahami struktur RNA :
Gula Ribosa
Urasil dan Timin
Polinukleotida

5. JENIS RNA
1. mRNA
2. tRNA
3. rRNA
4. RNA Genom

6. ELEKTROFORESIS GEL
Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama
dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah
bahwa DNA, RNA, atau PROTEIN dapat dipisahkan
oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul
tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya
oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul
ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang
ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik
dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut
akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu
kutub listrik sesuai dengan muatannya.

7. Sel Prokariotik
Berdasarkan keadaan intinya, sel dibedakan dalam dua macam, yaitu: sel
prokariotik dan sel eukariotik. Sel prokariotik adalah sel yang belum
mempunyai inti sejati. Ciri-ciri sel prokariotik adalah bahan genetik (DNA) tidak
terstruktur dalam bentuk nucleus, DNA terdapat pada nukleoid yang tidak
diselubungi oleh membran.
Pada sel prokariotik, materi inti (DNA) terdapat dalam nukleoid yang tidak
dibatasi oleh membran inti. Contoh sel prokariotik ialah bakteri, dan gangang
biru yang termasuk Monera.

8. PRINSIP ISOLASI RNA
• Isolasi RNA yang harus diperhatikan adakah aktivitas RNAase
dan struktur RNA yang utas tunggal. RNAase merupakan enzim
yang mempunyai kemampuan untuk mendegradasi RNA.
• Secara umum penanganan isolasi RNA adalah dalam segala
aktivitasnya menggunakan sarung tangan karena RNAase terdapat
dimana-mana dan jumlahnya banyak.
• Untuk memperoleh kualitas tinggi, RNA utuh merupakan hal
utama dan paling penting dalam percobaan biologi molekuler,
termasuk tes perlindungan nukleus, RT-PCR, pemetaan RNA,
translasi in vitro dan konstruksi cDNA. Untuk itu, dilakukan
serangkaian prosedur isolasi RNA sampai tahap pemurnian RNA.

9. Ekstraksi RNA Prokariot (1)
mRNA merupakan materi genetik yang mengkode suatu
protein. Jumlah populasi mRNA akan lebih banyak dibanding
dengan DNA. mRNA prokariot dapat dipisahkan dari DNA
dengan menggunakan oligonukleotida dT. Atau RNA total juga
dapat di isolasi dari sel dengan menambahkan enzim DNase
yang berfungsi untuk mendegradasi DNA.
Kecepatan dalam pemurnian RNA bakteri sangat penting
karena waktu paruh mRNA bakteri pendek dan membutuhkan
waktu yang cepat dalam proses pembekuan. Beberapa bakteri
diisolasi sebelum ditambahkan enzim lytic. Jika tidak
ditambahkan enzim lytic tersebut akan terjadi penundaan
isolasi.
Ekstraksi RNA dari organisme prokariot dilakukan melalui
proses penghancuran dinding selpenghilangan protein dan DNA
dan pengendapan RNA dan pemanenan.

10. Ekstraksi RNA Prokariot (2)
Kotoran akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi.
Kemudian molekul nuleotida (DNA dan RNA) yang telah
dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan
menggunakan phenol. Dalam proses ini sebagian kecil RNA
juga dapat dibersihkan. Sedangkan choloform digunakan
untuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari
larutan.
Enzim DNAase digunakan untuk menghancurkan DNA
sehingga RNA dapat diisolasi secara utuh. Pemurnian atau
purifikasi RNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan
DNA tersebut dengan PCl yang berfungsi memekatkan,
memisahkan RNA dari larutan, dan mengendapkan

11. ISOLASI RNA DENGAN METODE GTC (1)
• Sampel yang berasal dari lapangan harus dicuci bersih dulu
dan ekstrak RNA disimpan dalam freser -80. Ektraksi RNA
dengan menggunakan nitrogen cair atau secara langsung
menggunakan larutan ektraksi. Selalu bekerja didalam es
untuk mencegah degradasi RNA dan mengurangi aktivitas
RNAse. Tahapan isolasi RNA dengan menggunakan GTC
metod. Secara umum metode isolasi RNA menggunakan
metode GTC . GTC adalah satu dari yang paling efektiv untuk
mendenaturasi protein untuk efisisensi denaturasi RNAse
endogenus. Modifikasi GTC menggunakan trizol, satu tahap
RNA isolasi dan RNase kit.

12. ISOLASI RNA DENGAN METODE GTC (2)
Tahapan isolasi metode GTC terdiri dari lisis,
pemisahan, pencucian RNA dan presiptasi dan
pemurnian. Lisis tahapan menjerapan dan
penggangguan sel. Larutan denaturasi pada GTC
mengguakan trizol, lisis buffer. Separasi adalah
tahapan pemisahan substansi hidrofobik dari
subatansi hidrofilik seperti DNA dan RNA dan
dipisahkan RNA dan DNA. Larutan yang digunakan
seperti phenol, chloroform dan isoamil alcohol.
Pencucian RNA dan perispitasi menggunakan NaAc
atau LiCl.

16. Tahapan secara umum:
a.Chloroform ditambahkan untuk memisahkan RNA dengan
pengkotornya
b.RNA dipresipitasi dengan penambahan isopropyl (1x volume) atau 100
perse etanol (2,5 x volume) dan larutan garam (1/10 volem dari 3 M
NaAc pH 5,2).
c.RNA presipitasi adalah sering tidak terlihat sebelum sentrifugasi tetapi
banyak bentuk yang berhubugan gen di bagaian bawah tube.
d.Dicuci dengan etanol (70% EtOH) RNA pelet
e.Pemurnian RNA adalah terlihat endapan yang berwarna putih
diperhatikan terdapat kontaminan protein
f.Pelet dikeringkan selama 5-10’ (dikering anginkan, jangan meggunakan
vacuum dry).
g.Bagamanapun juga Etoh harus dihilangkan
h.Penggunaan RNAse dan diinkubasikan selama 1 hari.
i. Divortek atau ditaping untuk menghomogenkan dengan larutan.
j. RNA quantifikasi dan qualitas pengecekan

17. ISOLASI RNA DENGAN METODE REVERSE TRANSCRIPTASE POLIMERASE CHAIN
REACTION (RT PCR)
 Teknik ini merupakan pengembangan dari teknik PCR yang awal
mulanya ditemukan oleh Karry B. Mullis pada tahun 1985. Metode PCR
adalah suatu metode enzimatis untuk melipatgandakan secara
eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu dengan cara in-vitro.
Teknik RT PCR merupakan suatu pengembangan dari teknik PCR untuk
melakukan analisis terhadap RNA hasil transkripsi yang hanya terdapat
dalam jumlah yang sedikit di dalam sel. Teknik RT PCR yang
dikembangkan sangat spesifik, sehingga dapat digunakan walaupun
jumlah RNA yang akan dianalisis sedikit (Yowono 2006).
 Bahan yang digunakan ialah daun tembakau, nitrogen cair, buffer CTAB, laruran LI,
larutan LiCI, TE, larutan PCI, DEPC, MOPS, primer SOD, primer Oligo (dt), dNTP, ddH2O,
RNA, enzim superskrip Reverse Transkiptase, dan DDT.
 Metode kerja, antara lain :
1. Isolasi RNA Total
.
3 Isolasi gen dengan RT-PCR
2. Kuantifikasi dengan Elektroforesis 4. Pengukuran Kuantitas RNA