Univ. of Tripoli, profile picture
Uploaded byUniv. of Tripoli
PDF, PPTX61,318 views

صبغ والكشف المجهري للبكتيريا

يغطي الوثيقة تقنيات صبغ وكشف الميكروبات باستخدام المجهر، مع تركيز على طرق متنوعة مثل الطريقة الرطبة وطريقة النقطة المعلقة والطريقة البسيطة. كما يتناول كيفية تحضير اللطخة البكتيرية وصبغها، بما في ذلك استخدام صبغة جرام لتصنيف البكتيريا إلى موجبة وسالبة. تتضمن الوثيقة أيضًا شرحًا لتطبيقات هذه الطرق ودقتها في الكشف عن الخلايا البكتيرية.

Embed presentation

Download as PDF, PPTX
‫صبغ والكشف المجهري للبكتيريا‬ ‫‪Microscopy and Staining‬‬ ‫01‬ ‫دكتور يوسف الشريك‬
‫فحص الشرائح تحت المجهر‬ ‫•‬ ‫• الهدف من فحص الشرائح تحت المجهر: -‬ ‫• للكشف عن الميكروبات التي ال تري بالعين المجردة لضآلة حجمها:‬ ‫1. تعتبر خلية البكتيريا من نوع وحيدة الخلية ‪ prokaryotic‬بحيث أنها أصغر‬ ‫من نوع متعددة الخاليا ‪.Eukaryotic‬‬ ‫2. للكشف عن الخاليا البكتيرية تحت المجهر الضوئي بالطرق التالية.-‬ ‫• طريقة ‪Wet mount‬‬ ‫• صبغ اللطخة البكتيرية، وتعتبر هذه الطريقة أكثر استعماال، للكشف عن‬ ‫البكتيرية تحت المجهر، ومن عيوبها يمكن أنها تبين البكتيريا الحية‬ ‫والميتة، ومن أهم مميزاتها يمكن التفريق بها بين أشكال البكتيريا‬ ‫عصوية أو كروية وتنظيماتها (شكل )وغيرها، ويمكن بهذه الطريقة‬ ‫التفريق بين البكتيريا الموجبة، أو السالبة لصبغة الجرام‬ ‫3. للكشف على خاليا البكتيرية تحت المجهر يستعمل عدسة مكبرة مع زيت‬ ‫خاص بالكشف ‪.Oil immersion‬‬
‫النواة غير الحقيقية‬ • pro·kar·y·ote • [proh-kar-ee-oht, -ee-uh t] Show IPA • nounany cellular organism that has no nuclea r membrane, no organelles inthe cytoplasm e xcept ribosomes, and has its genetic material in theform of single continuous strands formi ng coils or loops, characteristicof all organism s in the kingdom Monera, as the bacteria and blue-green algae.
‫النواة الحقيقية‬ • Eukaryote • An organism whose cells contain a nucleus surrounded by me mbrane and whose DNA is bound together by proteins (histo nes)into chromosomes • The cells of eukaryotes also contain anendoplasmic reticulum a nd numerous specialized organelles not present in prokaryotes, especially mitochondria, Golgi bodies, and lysosomes. • The organelles are enclosed in a threepart membrane(called a unit membrane) consisting of a lipid layer sandwichedbetween two protein layers. • All organisms except for bacteria andarchaea are eukaryotes. C ompare prokaryote.
‫هناك طريقتان لتجهيز الكشف عن البكتيرية الحية وهما:-‬ ‫•‬ ‫طريقة الرطبة أو المبتلة ‪.Wet mount‬‬ ‫1.‬ ‫طريقة النقطة المعلقة ‪Hanging drop‬‬ ‫2.‬ ‫• طريقة الرطبة أو المبتلة ‪ Wet mount‬تطبق هذه الطريقة لدراسة شكل وترتيب‬ ‫الخاليا البكتيرية، واختبار قدرة البكتيريا على الحركة، ومن ها الطرق التالية:-‬ ‫1. ينقع التبن في 006 مل من الماء، لمدة أسبوع قبل إجراء التجربة، مع التخلص من‬ ‫الفقاقيع الهوائية.‬ ‫2. يعمل إطار مربع في منتصف الشريحة النظيفة، من الهالم النفطي ، بحيث تكون‬ ‫أبعاده، نفس أبعاد الشريحة الزجاجية الرقيقة.‬ ‫3. توضع قطرة واحدة، من محلول نقع التبن، في منتصف الشريحة الزجاجية الرقيقة.‬
‫تقلب الشريحة الزجاجية، التي تحتوي على اإلطار ، ويلصق‬ ‫4.‬ ‫األخير بغطاء الشريحة الزجاجية الرقيق، المحتوية على قطرة‬ ‫ماء التبن بحذر.‬ ‫تقلب الشريحة بحيث يصبح غطاء الشريحة الزجاجية إلى‬ ‫5.‬ ‫أعلى.‬ ‫توضع الشريحة تحت المجهر، لدراستها، مع تقليل كمية‬ ‫6.‬ ‫الضوء الساقط ،على العدسة العينية.‬ ‫تحديد األحياء الدقيقة، في العينة بعدسة قوتها (01 ‪ ، ) X‬ثم‬ ‫7.‬ ‫بعدسة قوتها (04 ‪ ، ) X‬مع تعديل قوة اإلضاءة، عند كل‬ ‫تغيير العدسة .‬ ‫يالحظ وجود أنواع مختلفة، من األحياء الدقيقة، في عينة‬ ‫8.‬ ‫التبن، مثل: وجود بكتيريا عصوية، أو كروية وغيرها، كما هو‬ ‫موضح في جدول (2 ) و ( 3 ) وشكل (34 ).‬
‫• طريقة النقطة المعلقة الختبار قدرة البكتيريا على الحركة‬ ‫• هدف ومبادئ هذه الطريقة مثل الطريقة الرطبة، ومن أهم‬ ‫مميزاتها التالية:-‬ ‫1. مراقبة حركة البكتيريا في نقطة معلقة داخل تجويف‬ ‫زجاجي مغلق‬ ‫2. نادراً ما يحدث جفاف للشريحة.‬ ‫3. بقاء الخاليا في حالة نشطة لمدة أطول من الطريقة‬ ‫الرطبة.‬ ‫طريقة العمل‬ ‫1. تنظف الشريحة ذات التجويف تنظيفا ً جيداً‬ ‫‪ Depression Slide‬مع غطائها بالماء الساخن‬ ‫والصابون إلزالة المواد الدهنية العالقة بها.‬
‫2. توضع أربعة نقط من الماء أو الفازلين أو الهالم النفطي‬ ‫على كل زاوية من غطاء الشريحة بواسطة ناقل البيئة.‬ ‫3. توضع قطرة من البيئة البكترية في وسط غطاء الشريحة‬ ‫الزجاجية الرقيقة.‬
‫4. توضع الشريحة على غطاء الشريحة الزجاجية الرقيقة ،‬ ‫بحيث يكون التجويف مقابال للقطرة في وسط التجويف،‬ ‫بحيث يكون الغطاء ملتصقا مع الشريحة.‬ ‫5. تقلب الشريحة بسرعة مع الحفاظ على وجود نقطة البيئة‬ ‫البكتيرية في منتصف التجويف.‬
‫6. تفحص النقطة المعلقة تحت المجهر، مستعمال العدسة‬ ‫الصغيرة القوة ، ثم يخفض المكثف قليال، ويقفل الحجاب‬ ‫جزئيا ً لتقليل اإلضاءة للتمكن من رؤية العينة بوضوح.‬ ‫7. تعدل حافة الشريحة لوضع حافة النقطة في وسط مجال‬ ‫المجهري.‬
‫8. تغير العدسة الصغيرة إلى كبيرة القوة، ثم إلى الزيتية، بعد‬ ‫وضع نقطة زيت السيدر، على غطاء الشريحة.‬ ‫9. تفحص حافة العينة، مع تحريك الضابط الدقيق ببطء، مع‬ ‫تعديل اإلضاءة، بواسطة المكثف، حتى ترى البكتيريا‬ ‫بشكل واضح.‬ ‫01.الحظ حركة البكتيريا، عند حافة النقطة المعلقة.‬ ‫11.تدون المالحظات برسم شكل البكتيرية، وطريقة تجميع‬ ‫الخاليا البكتيرية ونوعية حركتها.‬
‫طريقة صبغ البسيطة ‪Simple Stain‬‬ ‫• طريقة تحضير اللطخة البكتيرية‬ ‫• الهدف من تحضير اللطخة:-‬ ‫1. هو تحضير غشاء رقيق متجانس من البكتيريا النامية على‬ ‫شريحة زجاجية، ثم إضافة صباغات معينة لصبغها والكشف‬ ‫عليها تحت المجهر.‬ ‫2. ومن المعروف بأن البكتيريا عديمة اللون، ولتحديد نوعية‬ ‫خالياها، يجب إجراء عملية صبغها بأحد الطريقة التالية:-‬ ‫3. تحضير اللطخة البكتيرية.‬ ‫4. إضافة بعض األصباغ إلى اللطخة لتحديد نوعيتها من ناحية‬ ‫سالبة أو موجبة لصبغة الجرام.‬
‫طريقة تحضير اللطخة البكتيرية‬ ‫تنظف الشريحة الزجاجية جيدا ، بالماء والصابون،‬ ‫1.‬ ‫وتجفف.‬ ‫تمسك الشريحة من إحدى طرفيها؛ وترسم دائرة قطرها‬ ‫2.‬ ‫5.1 سم، على الوجه األسفل من الشريحة.‬ ‫توضع قطرة من الماء على وجه الشريحة المرسوم‬ ‫3.‬ ‫عليها الدائرة بداخلها، لغرض عمل لطخه بكتيرية.‬ ‫تعقم عقدة الحلقية( اللوبي) ، في نهاية اإلبرة الناقلة‬ ‫4.‬ ‫،على لهب موقد بنزن،حتى درجة االحمرار،وتبرد لمدة‬ ‫01 ثواني.‬ ‫تؤخذ كشطة من البيئة البكتيرية، بعقدة اإلبرة المعقمة.‬ ‫5.‬ ‫خلط الكشطة بالماء، داخل الدائرة على سطح.‬ ‫6.‬
‫7. بعد ذلك عقم العقدة المعدنية، مرة أخرى.‬ ‫8. تعمل لطخه بكتيرية من البيئة السائلة، على شريحة‬ ‫أخرى، بحيث يكون حجمها العقدة المعدنية مرتين إلى‬ ‫ثالثة مرات( وفي كل مرة يجب تعقيم العقدة وسلكها)،‬ ‫وتنقل إلى داخل الدائرة، مع توزيعها فيها توزيعا جيدا.‬ ‫9. تعقم الحلقة مرة أخرى.‬ ‫01.تترك اللطخة لتجف، عند درجة حرارة الغرفة، دون نفخ‬ ‫أو إمرار الهواء عليها.‬
‫11.تثبت اللطخة بإمرار الشريحة على اللهب مرتين أو ثالثة‬ ‫مرات.‬ ‫شكل (44) طريقة تحضير اللطخة البكتيرية على شريحة زجاجية من بيئة سائلة وبيئة صلبة‬
‫• صبغ اللطخة البكتيرية:‬ ‫• تعتبر الصباغات ‪ Dyes‬التي تصبغ البكتيريا مواد كيميائية،‬ ‫أما أن تكون حامضية مثل :-‬ ‫1. ‪ Fuchsin Acid‬و ‪ Eosin‬التي تتفاعل مع المكونات‬ ‫القاعدية في الخلية مثل:- سيتوبالزم،‬ ‫2. أو قاعدية مثل سفرانين أو البلورات البنفسجية ‪Crystal‬‬ ‫‪violet‬التي تتفاعل مع مكونات الخلية الحامضية.‬ ‫• يتم تحضير اللطخة كما هو موضح في الشكل(44 )‬
‫1. وضع الشريحة على حامل الصبغ (شكل 54)، أو تمسك بملقاط معدني.‬ ‫شكل(54) كيفية إضافة الصبغة إلى اللطخة البكتيرية‬ ‫2. تغمر اللطخة بأزرق المثيلين، لمدة 03 – 06 ثانية‬ ‫3. تغسل الشريحة بالماء المقطر، بعناية إلزالة الصبغة الزائدة،‬ ‫بواسطة أنبوب قنينة الماء المقطر.‬ ‫4. تجفف اللطخة برفق، بورق ماص للرطوبة، وتترك لتجف.‬
‫فحص اللطخة تحت المجهر‬ ‫•‬ ‫تفحص اللطخة المصبوغة،‬ ‫•‬ ‫تحت المجهر بواسطة عدسة‬ ‫قوتها 01 ‪ ، X‬وبعدها تفحص‬ ‫بالعدسة الزيتية التي قوتها‬ ‫001‪.X‬‬ ‫عند الفحص بالعدسة الشيئية‬ ‫•‬ ‫(الزيتية)؛ يوضع الزيت‬ ‫مباشرة على اللطخة، دون‬ ‫غطاء زجاجي رقيق.‬ ‫تسجل المالحظات مع الرسم أو‬ ‫•‬ ‫التصوير، لكل ما يشاهد تحت‬ ‫المجهر( شكل 64).‬
‫• تجفف الزيت من العدسة الشيئية، بأوراق خاصة بذلك.‬ ‫• يرجع المجهر داخل صندوقه، أو المكان المناسب له.‬ ‫• تنظف الشرائح جيدا، ويتخلص الموجود الزيت من عليها،‬ ‫وتحفظ في الصندوق المخصص لحفظها .‬
‫• صبغ البكتريا بصبغة جرام‬ ‫• اكتشف هذه الطريقة هانس جرام في 4881، عندما الحظ أن‬ ‫البكتيريا تفقد لون الصبغة، عند التخلص من الزائد منها. وتستعمل‬ ‫هذه الطريقة في تشخيص وتصنيف البكتيريا، وتقسيمها إلى‬ ‫مجموعتين، سالبة ، وموجبة لصبغة الجرام. ويرجع الفرق بين‬ ‫الصفتين الموجبة والسالبة، لمكونات الجدار الخلوي البكتيري.‬ ‫• وتعتمد هذه الطريقة على أربعة خطوات هي:-‬ ‫استخدام الصبغة الرئيسية ( ‪ ،)Crystal violet‬لصبغ جميع البكتيريا‬ ‫1.‬ ‫باللون البنفسجي.‬ ‫يستخدم األيودين ‪ ،Iodine‬لزيادة الروابط األيونية بين الصبغة الرئيسية‬ ‫2.‬ ‫والبكتيريا.‬ ‫يستخدم الكحول األثيلي، أو األسيتون كمادة مزيلة للصبغة من بعض‬ ‫3.‬ ‫البكتيريا، بينما تحتفظ البعض منها بلونها.‬ ‫تستخدم مادة السفرانين ‪ ،Safranin‬في صبغ البكتيريا التي فقدت صبغتها‬ ‫4.‬ ‫بالكحول أو األسيتون، باللون األحمر.‬
‫• تسمممى البكتيريمما التممي فقممدت لممون الصممبغة الرئيسممية بكتيريمما‬ ‫سمممالبة لصمممبغة الجمممرام، أمممما التمممي احتفظمممت بلمممون الصمممبغة‬ ‫الرئيسية تعرف باسم بكتيريا الموجبة لصبغة الجرام.‬ ‫• نظرية آلية صبغة الجرام :‬ ‫تعتمد هذه النظرية على النقاط التالية:-‬ ‫•‬ ‫1. تختلف البكتيريا لتقبلها الصبغة الرئيسية والصبغة‬ ‫الثانوية.‬ ‫2. جدار الخلية الموجبة لصبغة الجرام؛ أكثر سمكا‬ ‫من جدار خلية البكتيريا السالبة لصبغة الجرام ،‬ ‫من حيث التركيب الكيميائي.‬
‫• يحتوي جدار البكتيريا الموجبة لصبغة الجرام ،على طبقة‬ ‫ً‬ ‫سميكة من بيبتدوجلوكان ، أكثر سماكة من جدار البكتيريا‬ ‫السالبة لصبغة الجرام أنظر الشكل (74).‬
‫• وبناء على النظرية، يمكن تفسير آلية الصبغة السالبة أو‬ ‫الموجبة لصبغة الجرام كالتالي:-‬ ‫• يحتوي جدار البكتيريا الموجبة لصبغة الجرام، على طبقة‬ ‫سميكة من بيبتيدوجلوكان ( متعدد السكريات مرتبطة مع‬ ‫البيبتيدات)، التي يسبب لها الكحول إزالة وانكماش جدارها،‬ ‫بحيث يخفض من معدل فقد الصبغة الرئيسية، ومن ثم تصبغ‬ ‫باللون األساسي البنفسجي.‬ ‫• يحتوي الغشاء الخارجي، لجدار بكتيريا السالبة لصبغة الجرام،‬ ‫على طبقات محتوية على البروتين، ومتعدد السكريات ودهون‬ ‫مرتبطة بعديد السكريات، وطبقة غير سميكة من‬ ‫بيبتيدوجلوكان، محاطة بغشاء خارجي، ومن تم يقوم الكحول‬ ‫بإزالة، أو إذابة الدهون، مما يزيد من فقد الصبغة األساسية ،‬ ‫ويتلون جدارها بلون الصبغة الثانوية (األحمر).‬
‫• طريقة العمل‬ ‫• يجب تحضير اللطخة البكتيرية من بيئة حديثة عمرها أقل من 42‬ ‫ساعة.‬ ‫– تنظف ثالث شرائح تنظيفا جيداً.‬ ‫– يرسم دائرة على السطح السفلي، على كل شريحة من الشرائح‬ ‫الثالثة ،مع كتابة أسماء البيئات على كل منها.‬ ‫– تحضر لطخة لكل من البيئات، بالطريقة التي سبق شرحها.‬ ‫• طريقة الصبغ وهي كاآلتي:-‬ ‫1. تغمر اللطخة بصبغة ‪ ،Crystal violet‬وتتركها لمدة نصف‬ ‫دقيقة.‬ ‫2. تغسل الشريحة بعناية بالماء المقطر، لمدة 2 ثانية، بطريقة غير‬ ‫المباشرة فوق اللطخة ( عدم تسليط الماء مباشرة على اللطخة).‬
‫بدون تجفيف الشريحة، تغمر اللطخة بمحلول اليود لمدة‬ ‫3.‬ ‫دقيقة.‬ ‫بدون غسيل الشريحة، يضاف 59% كحول إثيلي إلى‬ ‫4.‬ ‫الشريحة، ويترك لينساب على اللطخة، لمدة ما بين‬ ‫01- 02 ثانية، إلى حين توقف خروج كميات كبيرة من‬ ‫الصبغة األساسية (غالبا بعد بضع ثوان)، وتعتمد مدة إزالة‬ ‫الكحول على العوامل كثيرة، أهمها سمك اللطخة، والخبرة‬ ‫العملية في تحضير اللطخة وصبغها.‬ ‫تغسل الشريحة مباشرة بالماء المقطر، لمدة دقيقتين.‬ ‫5.‬ ‫تضاف الصبغة الثانوية السفرانين، وتترك لمدة 02 ثانية.‬ ‫6.‬ ‫تغسل الصبغة الزائدة بالماء المقطر، لمدة 2 ثانية، وتجفف‬ ‫7.‬ ‫بورق نشاف.‬ ‫تترك لتجف.‬ ‫8.‬
‫• تفحص الشريحة بالمجهر تحت العدسات المختلفة، وتسجل‬ ‫المالحظات (الشكل 84).‬
‫• الصبغة السالبة ‪Negative Stain‬‬ ‫• يمكن استخدام الصبغ السالب لمعرفة شكل، وترتيب الخاليا‬ ‫البكتيرية، التي ال تتحمل التثبيت الحراري، الذي يشوه خالياها،‬ ‫ولصبغ السبورات البكتيرية ( الحافظة) ‪.Capsule‬‬ ‫• في حالة إجراء الصبغ السالب، تظهر البكتريا واضحة جدا،‬ ‫بالنسبة للخلفية الملونة التي حولها.‬ ‫• تستعمل األصباغ الحامضية، التي ال تستطيع صبغ مكونات‬ ‫الخلية البكتيرية، ولكنها تصبغ الخلفية حول الخلية فقط، بحيث‬ ‫تصبح الخلفية ملونة ،وفي نفس الوقت ال تتلون الخلية، بحيث‬ ‫تظهر البكتيريا كأجسام شفافة، في محيط معتم.‬
‫خطوات العمل‬ ‫•‬ ‫تستعمل الشرائح النظيفة، والخالية من‬ ‫•‬ ‫المواد الدهنية.‬ ‫توضع قطرة صغيرة من الصبغة‬ ‫•‬ ‫الحامضية، النيكروسين، على إحدى‬ ‫طرفي الشريحة.‬ ‫تؤخذ عينة من المزرعة الصلبة، ملء‬ ‫•‬ ‫العقدة المعدنية ، مع قطرة من صبغة‬ ‫نيكروسين، وتترك لتجف بدون توزيعها.‬ ‫تلمس القطرة بأحد طرفي شريحة أخرى‬ ‫•‬ ‫، وتحرك األخيرة يمينا ً ويساراً، يجب‬ ‫توزع البكتيريا والصبغة،لتغطي اللطخة‬ ‫ً‬ ‫بالتدريج من لون المعتم إلى لون‬ ‫الرمادي (94).‬
‫• تترك اللطخة لتجف عند درجة حرارة الغرفة.‬ ‫• تفحص الشريحة تحت المجهر شكل (05).‬ ‫• تغسل الشرائح، وتخلص من زيت من العدسة الشيئية‬ ‫• تحفظ األدوات في مكانها المناسب بعد تنظيفها جيدا.‬
‫• صبغ الثابت للحامض ‪Acid-fast stain‬‬ ‫‪،Differential stain‬‬ ‫• تستخدم طريقة الصبغ التفريقية‬ ‫في تحديد قدرة الخاليا البكتيرية من جنس‬ ‫‪،Mycobacterium tuberculosis‬والتي تسبب مرض‬ ‫السل، و ‪M. leprae‬التي تسبب مرض الجذام، واللتان‬ ‫لهما القدرة على الحفاظ على الصبغة الرئيسية، عند‬ ‫معالجتها بالكحول األثيلي، وحامض الكبريتيك،‬ ‫• وقد وجد بأن أغلبية البكتيريا تفقد الصبغة الرئيسية، عند‬ ‫عائلتي‬ ‫أعضاء‬ ‫عدا‬ ‫بالكحول،‬ ‫معاملتها‬ ‫‪Mycobacteriaceae‬و ‪ Norcardiaceae‬من الرتبة‬ ‫‪،Actinomycetales‬اللتان تحتوي جدران خالياهم على‬ ‫مادة دهنية تشبه الشمع (‪ ،)Mycotic acid‬والتي ال تقبل‬ ‫جدرانها الصبغ من معظم الصبغات.‬
‫• طريقة العمل‬ ‫• وتعتمد طريقة )‪(Ziehl-Neelsen method‬بغمر اللطخة‬ ‫كاربولفوكسين‬ ‫باسم‬ ‫تعرف‬ ‫بصبغة‬ ‫البكتيرية،‬ ‫‪ ،Carbolfuchsin‬لتسهيل دخول الصبغة في البكتيريا، ويتم‬ ‫بعد ذلك غسل اللطخة بمحلول الحامض – الكحول األثيلي،‬ ‫إلزالة الصبغة من جميع الخاليا، ما عدا المقاومة لفعل ذلك‬ ‫المحلول، وفي نفس الوقت، تستخدم صبغة أزرق المثيلين، بدال‬ ‫من الصبغة األولى .‬ ‫• هذا وقد وجد أن صبغة كاربولفوكسين أكثر ذوبانا ، في حامض‬ ‫الكربوليك( الفينول) من الماء، وتذوب أيضا ً في الدهون أكثر‬ ‫من الحامض – الكحول األثيلي، ويعطي كاربولفوكسين اللون‬ ‫األحمر لمادة الدهن.‬
‫• وتتم خطوات العمل كالتالي:-‬ ‫تحضر اللطخة البكتيرية ، والتي أخذت من بيئات‬ ‫1.‬ ‫‪ Mycobacterium phlei‬و .‪ ، .E. coli‬وتجفف هوائيا ً‬ ‫تضع الشريحة المحتوية على اللطخة، على حامل ‪،Rack‬فوق‬ ‫2.‬ ‫حوض الغسيل.‬ ‫توضع قطعة صغيرة من ورق الترشيح، لتثبيت الشريحة فوق‬ ‫3.‬ ‫الحامل.‬ ‫تضاف كميات كبيرة من صبغة كاربولفوكسين.‬ ‫4.‬ ‫تسخن اللطخة والصبغة على بخار مائي يغلى لمدة 5 دقائق ،‬ ‫5.‬ ‫ويضاف مزيدا من الصبغة، كلما تطلب األمر ذلك، وال يسمح‬ ‫بغليان الصبغة.‬ ‫يتخلص من ورق الترشيح، وتغسل الشريحة جيداً بالماء‬ ‫6.‬ ‫المقطر.‬ ‫ً‬
‫7. يتخلص من الصبغة، بمعالجة اللطخة المصبوغة، بمحلول‬ ‫الحامض – الكحول األثيلي لمدة 51 – 02 ثانية.‬ ‫8. تغسل بالماء المقطر.‬ ‫9. تضاف صبغة أزرق المثيلين، وتترك لمدة نصف دقيقة.‬ ‫01.تغسل الشريحة بالماء المقطر، وتجفف بورق الترشيح.‬ ‫11.تحضر شريحة أخرى، من البيئة البكتيرية الثانية بنفس‬ ‫الطريقة.‬ ‫21.تفحص الشريحتان تحت المجهر، وتدون المالحظات‬ ‫31.البكتيريا التي تصبغ باللون األحمر، موجبة لصبغ البكتيريا‬ ‫الثابت للحامض، أما البكتيريا التي تصبغ بلون األزرق‬ ‫فهي سالبة لصيغ البكتيريا الثابت للحامض.‬
‫• صبغ الكبسوالت ‪Capsule Stain‬‬ ‫• يمكن استخدام الصبغ السالب، لتوضيح الكبسولة ( عندما يكون‬ ‫بيضاويا ً أو دائريا ً) حول الخلية البكتيرية، والذي يلتصق بسطحها،‬ ‫مكونا ً طبقة لزجة، وتعطي طبقة مخاطية في حالة كون الكبسولة‬ ‫غير منتظمة الشكل.‬ ‫• من أهم أساسيات لصبغ الكبسوالت البكتيرية ما يلي:-‬ ‫من الصعب صبغ الكبسوالت البكتيرية، ألنها تتكون من عديد‬ ‫1.‬ ‫السكريات، وعديد البيبتيدات.‬ ‫معظم الكبسوالت ال تذوب في الماء، وال تحمل شحنات كهربائية،‬ ‫2.‬ ‫وبسبب لذلك فإن هذه الصبغات البسيطة ال ترتبط معها.‬ ‫أغلبية طرق الصبغ التي تستعمل في الكشف عن الكبسولة؛ تصبغ‬ ‫3.‬ ‫البكتيريا والوسط المحيط بها، وال تصبغ الكبسولة.‬ ‫ال تعامل اللطخة بالحرارة لتثبيتها، ألن الحرارة تسبب فقدان‬ ‫4.‬ ‫الكبسولة.‬
‫طريقة العمل:‬ ‫•‬ ‫تنظف الشريحة بمطهر وتجفف بالهواء، ثم تمسك ، من أحد‬ ‫•‬ ‫زواياها.‬ ‫‪ ،K. pneumoniae‬بواسطة‬ ‫تؤخذ عينة من بيئة بكتيرية‬ ‫•‬ ‫عقدة الناقل، وتضع على سطح الشريحة لتجهيز اللطخة.‬ ‫تترك اللطخة لتجف بالهواء، بدون استعمال الحرارة.‬ ‫•‬ ‫تغمر اللطخة بصبغة ‪ crystal violet‬لمدة 5 – 01 دقائق.‬ ‫•‬ ‫تغسل اللطخة بلطف بمحلول كبريتات النحاس 4‪ ،CuSO‬للتخلص‬ ‫•‬ ‫من الصبغة ‪ crystal violet‬الزائدة .‬ ‫تجفف محتويات الشريحة.‬ ‫•‬ ‫تفحص الشريحة تحت المجهر، وتالحظ الخاليا لونها بنفسجي،‬ ‫•‬ ‫محاطة بهالة زرقاء باهتة اللون، أو عديمة اللون، ويكون لون‬ ‫الخلفية( األرضية) بنفسجي لذلك أيضا ً (الشكل 25).‬
‫صبغ األبواغ( السبورات) الداخلية‬ ‫•‬ ‫يستخدم الصبغ السبورات ، لتحديد مواقع األبواغ، داخل خلية‬ ‫•‬ ‫البكتيرية، ومن أكثر األنواع المكونة لألبواغ الداخلية هي‬ ‫بكتيريا كلوستيريديوم، والباسيليس، لألسباب التالية:-‬ ‫األبواغ الداخلية غير نشطة، ومقاومة للظروف غير مناسبة‬ ‫•‬ ‫للبكتيريا، سواء من الحرارة أو الكيماويات ، أو أي ظروف بيئة‬ ‫أخرى.‬ ‫األبواغ ليست وسيلة للتكاثر، وتبقى البكتيريا في حالة سكون،‬ ‫•‬ ‫طالما استمرت الظروف غير مواتية.‬ ‫تستخدم األبواغ في عملية تصنيف البكتيريا.‬ ‫•‬ ‫األبواغ غير منفذة لمعظم الصبغات.‬ ‫•‬ ‫تستعمل الحرارة لتثبيت الصباغات.‬ ‫•‬
‫شكل(35) الحظ ‪DNA‬محاط بغالف البوغ. ويظهر البوغ داخل الخلية الخضرية‬ ‫وسوف تفقد الخلية جزء الخضري منها مع مرور الوقت‬
‫• طريقة العمل‬ ‫1. تنظف شريحتان زجاجيتان.‬ ‫2. جهز لطخه من بيئتين بكتيريتين، لباسيليس سابتيلس،‬ ‫عمر أحدها 81 – 42 ساعة، واألخرى 27ساعة،‬ ‫3. تجفف بالهواء، وتثبت بالحرارة.‬ ‫4. توضع قطعة صغيرة من ورق الترشيح على اللطخة،‬ ‫قبل إضافة صبغة أخضر مالكايت، لمنع التبخر الكامل‬ ‫للصبغة، وجفافها قبل تسربها إلى األبواغ، وعليه في‬ ‫جميع األحوال، يساعد التسخين على تمدد غشاء‬ ‫األبواغ ، ويسمح بدخول الصبغة إلى الداخل، وتبقى‬ ‫الصبغة داخل البوغ بالتبريد.‬
‫تغمر اللطخة بصبغة أخضر مالكايت ‪MALACHITE‬‬ ‫•‬ ‫‪.GREEN‬‬ ‫تسخن على البخار لمدة 5 دقائق ، ويضاف مزيد من‬ ‫•‬ ‫الصبغة، كلما أحتاج األمر لذلك.‬ ‫ترمى الورقة في مكان مناسب ، وتغسل اللطخة بالماء‬ ‫•‬ ‫المقطر جيداً.‬ ‫تضاف صبغة السفرانين لمدة نصف دقيقة.‬ ‫•‬ ‫تغسل الشريحة بالماء المقطر وتجفف.‬ ‫•‬ ‫تفحص الشرائح تحت المجهر( شكل 45).‬ ‫•‬
‫• تقارن النتائج مع شرائح الجاهزة، ويالحظ مواقع األبواغ‬ ‫في الخاليا المختلفة شكل(55) .‬ ‫شكل (45) طريقة صبغ السبورات، ومثال على مواقع المختلفة للسبورات كما‬ ‫هو موضحه في الدائرة أسفل الشكل .‬
‫• صبغ أسواط البكتيرية‬ ‫• من أهم أهداف صبغ األسواط ما يلي:-‬ ‫1. مشاهدة األسواط.‬ ‫2. ترتيب األسواط وموقعها.‬ ‫3. تستعمل األسواط للتعرف على أنواع البكتيريا.‬ ‫4. ومن أهم أساسيات صبغ أسواط البكتيرية التالية:-‬ ‫5. تعتبر األسواط رفيعة جدا، وسريعة الكسر، ال يمكن صبغها‬ ‫بالصباغات العادية.‬ ‫6. تحتاج األسواط إلى تقنية وصبغة معينة، لتزيد من قطرها.‬ ‫7. يمكن مالحظة حركة البكتيريا، عن طريقة القطرة المعلقة، أو‬ ‫عن طريق صبغ األسواط،.‬
‫طريقة العمل:‬ ‫•‬ ‫يجب أخذ الحيطة والعناية الفائقة؛ لمنع فقد األسواط ، بتنظيف‬ ‫•‬ ‫الشرائح جيداً، مع تداول البيئة البكتيرية بعناية كبيرة.‬ ‫تؤخذ قطعة من وسط بيئة اآلجار الصلبة ، حيث تنمو البكتيريا،‬ ‫•‬ ‫مع عدم لمس المزرعة باليد.‬ ‫توضع قطعة اآلجار برفق على الشريحة بحيث تكون مواجهة‬ ‫•‬ ‫للنمو، ترفع تلك القطعة وتعاد إلى الطبق.‬ ‫تترك البكتيريا الملتصقة بالشريحة.‬ ‫•‬ ‫تجفف بالهواء، دون استعمال الحرارة.‬ ‫•‬ ‫تغمر الشريحة بحامض التانيك ‪ Tannic acid‬المثبت لمدة‬ ‫•‬ ‫عشر دقائق.‬ ‫تغسل الصبغة برفق بالماء المقطر.‬ ‫•‬
‫تغمر الشريحة بصبغة كاربولفوكسين ‪،Carbolfuchsin‬‬ ‫•‬ ‫لمدة خمسة دقائق.‬ ‫تغسل برفق بالماء المقطر.‬ ‫•‬ ‫تترك اللطخة تجف بالهواء ،وبورق الترشيح.‬ ‫ً‬ ‫•‬ ‫تفحص الشريحة تحت المجهر وتسجل المالحظات(65).‬ ‫•‬
‫• حركة البكتيريا في أوساط النمو شبه صلبة‬ ‫• تستخدم األوساط النمو شبه صلبة، المحتوية على كميات قليلة من‬ ‫مادة اآلجار ويحقن الوسط النمو بالبكتيريا المراد اختبار حركتها،‬ ‫داخل الوسط النمو، بواسطة إبرة حقن(بدون عقدة في نهايتها‬ ‫شكل75) في أنابيب النمو ، وتحضن األنابيب لمدة زمنية معينة،‬ ‫وتؤخذ المالحظات مباشرة بمجرد المالحظة التغيرات التي حصلت‬ ‫في الوسط الغذائي .‬ ‫شكل(75) إبرة الحقن الحظ أنه ال توجد في نهايته حلقة دائرية‬
‫• تسمح التركيزات القليلة من اآلجار في الوسط الغذائي،‬ ‫بتحرك البكتيريا بحركة محدودة من خالل منطقة الطعن،‬ ‫وتحدد الحركة نتيجة حدوث تفرع النمو في منطقة‬ ‫الطعن، ويمكن إضافة صبغة معينــــة مثل أمالح‬ ‫تترازيوليوم)‪ ، Tetrazolium salt (TTC‬لمالحظة تفرع‬ ‫النمو بلون األحمر الفاتح (فجلي اللون).‬ ‫يجب حقن اإلبرة بطريقة مستقيمة، وتسحب بنفس‬ ‫•‬ ‫الطريقة، للحصول على نتائج جيدة (شكل85).‬
‫• اختبار قدرة البكتيريا على الحركة‬ ‫• ‪Motility Determination‬‬ ‫تستخدم طريقة اختبار قدرة البكتيريا على الحركة، للتعرف على‬ ‫•‬ ‫بكتيريا مجهولة النوع ( الجنس)، حيث يجرى لها اختبار على ذلك،‬ ‫ويتم مالحظة مدى حركتها خالل الحقل المجهري، وهناك نوعان من‬ ‫الحركة وهما:‬ ‫– حركة حقيقة فعلية ( الحركة من مكان إلى آخر).‬ ‫– حركة كاذبة على شكل اهتزازات أو ارتجاج (حركة برا ونية).‬ ‫توجد عدة طرق يمكن بها معرفة قدرة البكتيريا على الحركة وهي‬ ‫•‬ ‫كاآلتي:-‬ ‫‪Wet-Mount‬‬ ‫الطريقة الرطبة‬ ‫•‬ ‫‪Hanging Drop‬‬ ‫طريقة النقطة المعلقة‬ ‫•‬ ‫‪Culture Method‬‬ ‫الطريقة المزرعية‬ ‫•‬ ‫لقد سبق شرح طريقة الرطبة أو المبتلة وطريقة النقطة المعلقة‬ ‫•‬
‫• تسمح التركيزات القليلة من اآلجار في الوسط‬ ‫الغذائي، بتحرك البكتيريا بحركة محدودة من خالل‬ ‫منطقة الطعن، وتحدد الحركة نتيجة حدوث تفرع‬ ‫النمو في منطقة الطعن، ويمكن إضافة صبغة‬ ‫معينــــة مثل أمالح تترازيوليوم ‪Tetrazolium‬‬ ‫)‪ ،salt (TTC‬لمالحظة تفرع النمو بلون األحمر‬ ‫الفاتح (فجلي اللون).‬ ‫يجب حقن اإلبرة بطريقة مستقيمة، وتسحب‬ ‫•‬ ‫بنفس الطريقة، للحصول على نتائج جيدة (شكل85).‬
‫• تقنية عزل البكتيريا ‪Isolation Techniques‬‬ ‫• طريقة العزل بتخطيط األطباق ‪Streak Plate Method‬‬ ‫‪of Isolation‬‬ ‫• الهدف من عزل البكتيريا بتخطيط األطباق:-‬ ‫• تستخدم هذه الطريقة للحصول على مستعمرات نقية، من‬ ‫بيئة محتوية على عديد من األنواع األخرى، وذلك لألسباب‬ ‫التالية:-‬ ‫1. تعتبر هذه الطريقة واسعة االنتشار‬ ‫2. تستخدم لخفض أعداد وكثافة األحياء الدقيقة في البيئة،‬ ‫ومن ثم سهولة عزلها من األنواع غير المرغوبة.‬ ‫3. تعتبر كل مستعمرة معزولة مستعمرة نقية ( من المعروف‬ ‫نظريا بأن كل مستعمرة تبدأ بخلية من نوع واحد فقط).‬
‫• طريقة العمل:‬ ‫• طريقة التخطيط المتعامد:‬ ‫1. تصب بيئة اآلجار المغذي في أطباق بيتري، عند‬ ‫درجة 54 ‪º‬م، وتترك لتبرد وتتصلب.‬ ‫2. تغمر عقدة الناقل المعدني المعقم، في بيئة بكترية‬ ‫مختلطة ، أو من معلق المادة المراد العزل منها.‬ ‫3. تخطط مساحة صغيرة على سطح اآلجار، عند حافة‬ ‫طبق بيتري، بلمس السطح بعقدة الناقل المجففة،‬ ‫بدون ضغط حتى ال يخرج سطح اآلجار‬ ‫( المساحة1).‬ ‫4. تعقم حلقة الناقل وتترك لتبرد لمدة 5 ثواني.‬
‫يحرك الطبق مع فتح الغطاء الزجاجي لطبق بيتري ،‬ ‫5.‬ ‫أخرى ، ويرسم على‬ ‫وتعاد عملية التخطيط مرة‬ ‫سطح اآلجار خطوط على شكل حرف ‪ S‬بواسطة الناقل‬ ‫على المساحة 2 بعرض الطب‬ ‫يعقم الناقل مباشرة ويترك ليبرد.‬ ‫6.‬ ‫يخطط سطح اآلجار تخطيطات( 6 – 7 خطوط)، بحيث‬ ‫7.‬ ‫تكون عمودية‬ ‫يعقم الناقل ويترك ليبرد.‬ ‫8.‬ ‫تكرر عملية التخطيط في االتجاه 3 و4. (شكل 95).‬ ‫9.‬
‫• طريقة التخطيط المتشعع ‪Radiant Streak Method‬‬ ‫1. تعقم حلقة الناقل، وتبرد لمدة 5 ثواني.‬ ‫2. ترسم بواسطة الناقل 7 –8 خطوط كما موضح في شكل (06).‬
‫يعقم الناقل مرة أخرى ويترك ليبرد.‬ ‫3.‬ ‫يخطط سطح اآلجار، بحث تكون الخطوط متقاطعة‬ ‫4.‬ ‫مع الخطوط التي سبق تخطيطها في السابق.‬ ‫يعقم الناقل مرة أخرى، ويترك ليبرد.‬ ‫5.‬ ‫توضع األطباق مقلوبة في الحضانة عند درجة‬ ‫6.‬ ‫73‪º‬م ،لمدة 42 – 84 ساعة.‬

More Related Content

PDF
تحضير البيئات البكتيرية 8
byUniv. of Tripoli
 
PDF
تحضير الاوساط الزرعية.pdf
bySinaiWMohammed
 
PDF
الاختبارات الكيموحيوية والمستخدمة
byUniv. of Tripoli
 
PPT
Viruses
byalmshrefah
 
PPSX
Parasitology PPT - طفيليات PPT
byElsayed Bayoumy
 
PPT
الفطريات
byUniversity of Kerbala
 
PPSX
Parasitology4 PPT - 4 طفيليات PPT
byElsayed Bayoumy
 
PPSX
parasitology introduction - علم الطفيليات 1
byElsayed Bayoumy
 
تحضير البيئات البكتيرية 8
byUniv. of Tripoli
 
تحضير الاوساط الزرعية.pdf
bySinaiWMohammed
 
الاختبارات الكيموحيوية والمستخدمة
byUniv. of Tripoli
 
Viruses
byalmshrefah
 
Parasitology PPT - طفيليات PPT
byElsayed Bayoumy
 
الفطريات
byUniversity of Kerbala
 
Parasitology4 PPT - 4 طفيليات PPT
byElsayed Bayoumy
 
parasitology introduction - علم الطفيليات 1
byElsayed Bayoumy
 

What's hot

PDF
صبغ والكشف المجهري للبكتيريا
byUniv. of Tripoli
 
PDF
9النقل و التلقيح ونمو البكتيريا على البيئة
byUniv. of Tripoli
 
PDF
7احل نمو البكتيريا 7
byUniv. of Tripoli
 
DOC
نسخ من معمل البكتيريا الرابع
byyahyakalil83
 
DOC
البكتيريا
byguest98d825
 
PDF
تركيب وصبغ الخلية
byUniv. of Tripoli
 
DOCX
Microbiology ملخص
bySomaiua Abd Alwaniss
 
PDF
Industrial Microorganism (Lecture 3)
byEducation Hub
 
PPTX
Brewing ppt
bylasinajarajana
 
PPTX
Industrial microbiology
byVENKATESH AGRI
 
PPTX
General introduction and applications of bacteriocins
byNaima Qureshi
 
PDF
11الفطريات
byUniv. of Tripoli
 
PPTX
Sauerkraut
byMohit Kohli
 
PPT
Lectures 15-17-Escherichia coli, Shigella, Salmonella
by-
 
PPTX
Staining endospore
bysiva ni
 
PPTX
Cultivation of viruses
byU. P. Veterinary University (DUVASU), Mathura
 
PPT
Microbiology of butter
byRahul Pandya
 
PDF
Cheese fermentation
byAbdul Satar Sirat
 
PPTX
Microbiology of milk
byNagendrababu Kuncham
 
PPTX
Treponema pallidum
byPrbn Shah
 
صبغ والكشف المجهري للبكتيريا
byUniv. of Tripoli
 
9النقل و التلقيح ونمو البكتيريا على البيئة
byUniv. of Tripoli
 
7احل نمو البكتيريا 7
byUniv. of Tripoli
 
نسخ من معمل البكتيريا الرابع
byyahyakalil83
 
البكتيريا
byguest98d825
 
تركيب وصبغ الخلية
byUniv. of Tripoli
 
Microbiology ملخص
bySomaiua Abd Alwaniss
 
Industrial Microorganism (Lecture 3)
byEducation Hub
 
Brewing ppt
bylasinajarajana
 
Industrial microbiology
byVENKATESH AGRI
 
General introduction and applications of bacteriocins
byNaima Qureshi
 
11الفطريات
byUniv. of Tripoli
 
Sauerkraut
byMohit Kohli
 
Lectures 15-17-Escherichia coli, Shigella, Salmonella
by-
 
Staining endospore
bysiva ni
 
Cultivation of viruses
byU. P. Veterinary University (DUVASU), Mathura
 
Microbiology of butter
byRahul Pandya
 
Cheese fermentation
byAbdul Satar Sirat
 
Microbiology of milk
byNagendrababu Kuncham
 
Treponema pallidum
byPrbn Shah
 

Viewers also liked

PDF
تأثير العوامل البيئة على نمو
byUniv. of Tripoli
 
PPTX
أساسيات ميكروبيولوجي الأغذية
byUniv. of Tripoli
 
PDF
مقرر الأحياء الدقيقة عام
byUniv. of Tripoli
 
PDF
سلامة الأغذية وجودتها
byUniv. of Tripoli
 
PDF
مقرر الأحياء الدقيقة عام 2
byUniv. of Tripoli
 
PPTX
دورة مبادئ سلامة الغذاء
byHassan Mustafa
 
PPTX
المحاضرة الثالثة/ سلامة الغذاء
byabdalla mansour University of Benghazi
 
PPTX
Food safety سلامة الغذاء
bySief ismail
 
PPTX
Biochemical test of bacteria
byDr. K. P. Senthilkumar Naidu
 
PPTX
المحاضرة التاسعة/ جودة الغذاء ومراقبة الجودة
byabdalla mansour University of Benghazi
 
PPT
تعاريف وتقييم جودة اللحوم
byUniv. of Tripoli
 
PDF
لنطبق معا نظام الهسب و الآيزو 22000 في مؤسستك بسهولة
byguestb31f27
 
PPTX
المحاضرة الاولى / علم الاغذية
byabdalla mansour University of Benghazi
 
PDF
1تعاريف وتقييم جودة اللحوم
byUniv. of Tripoli
 
PDF
مقرر الأحياء الدقيقة 3
byUniv. of Tripoli
 
PDF
مقرر الأحياء الدقيقة عام فحص العينة 4
byUniv. of Tripoli
 
PPT
2nd, Blood Analysis
byguestbc65a9
 
PPTX
Ismer- kubisme
byRikkeasp
 
PPTX
المجهر
byOmer Bushara
 
PDF
Oregon educator licensure assessments
byUniv. of Tripoli
 
تأثير العوامل البيئة على نمو
byUniv. of Tripoli
 
أساسيات ميكروبيولوجي الأغذية
byUniv. of Tripoli
 
مقرر الأحياء الدقيقة عام
byUniv. of Tripoli
 
سلامة الأغذية وجودتها
byUniv. of Tripoli
 
مقرر الأحياء الدقيقة عام 2
byUniv. of Tripoli
 
دورة مبادئ سلامة الغذاء
byHassan Mustafa
 
المحاضرة الثالثة/ سلامة الغذاء
byabdalla mansour University of Benghazi
 
Food safety سلامة الغذاء
bySief ismail
 
Biochemical test of bacteria
byDr. K. P. Senthilkumar Naidu
 
المحاضرة التاسعة/ جودة الغذاء ومراقبة الجودة
byabdalla mansour University of Benghazi
 
تعاريف وتقييم جودة اللحوم
byUniv. of Tripoli
 
لنطبق معا نظام الهسب و الآيزو 22000 في مؤسستك بسهولة
byguestb31f27
 
المحاضرة الاولى / علم الاغذية
byabdalla mansour University of Benghazi
 
1تعاريف وتقييم جودة اللحوم
byUniv. of Tripoli
 
مقرر الأحياء الدقيقة 3
byUniv. of Tripoli
 
مقرر الأحياء الدقيقة عام فحص العينة 4
byUniv. of Tripoli
 
2nd, Blood Analysis
byguestbc65a9
 
Ismer- kubisme
byRikkeasp
 
المجهر
byOmer Bushara
 
Oregon educator licensure assessments
byUniv. of Tripoli
 

Similar to صبغ والكشف المجهري للبكتيريا

PDF
تركيب وصبغ الخلية
byUniv. of Tripoli
 
PDF
كتاب كيف تدير معمل للتحاليل البيطرية اد حامد عطيه
byhamed attia
 
PDF
الإختبارات العامة للبروتين
byUniv. of Tripoli
 
PPT
رقائق بوليمرية قابلة للتحلل الحيوي
byHanan Ali
 
PDF
Random 121128235820-phpapp01
byAbdelkader عبدالقادر الزين
 
PPTX
4- Bacterial Stainكمنكمنكمنطكمطكنمing.pptx
byAbdallahAlasal1
 
PPTX
biological examination for water analysis.pptx
byMarwaSaleh49
 
PPTX
biological examination for water analysis.pptx
byMarwaSaleh49
 
PPTX
biological examination for water analysis.pptx
byMarwaSaleh49
 
PPTX
microbiological examination for water analysis.pptx
byMarwaSaleh49
 
PPTX
microbiolgical examination for water analysis.pptx
byMarwaSaleh49
 
PDF
بكتريا.pdfgggyyyyyyhhhhgggyyyyyyyyyyyyyyyy
by1mmm212mm
 
PPTX
Food Microbiology reprint from another pPt slides.pptx
byAhmedAbouelwafa7
 
PPTX
2.%20Bacterial%20Cell%20MORPHOLOGY.en.ar.pptx
bymfh736870577
 
PPT
F15.ppt
byAhmedRock2
 
PPT
معمل المياه الصف الثاني عرض مدخل للتجارب
byhcww school
 
PDF
الممارسات الجيدة للمختبرات الميكربيولوجية - عملية الغسيل
byElhassan A. Abdel-Sadek
 
PDF
الممارسات الجيدة للمختبرات الميكربيولوجية - غسيل الاطباق الزجاجية
byElhassan A. Abdel-Sadek
 
PPTX
الحركة والتكاثر في البدائيات
byNaif2060
 
PPTX
5_2018_12_23!10_00_14_PM.pptxjjjkoooojkkooo
byssusera6a60c1
 
تركيب وصبغ الخلية
byUniv. of Tripoli
 
كتاب كيف تدير معمل للتحاليل البيطرية اد حامد عطيه
byhamed attia
 
الإختبارات العامة للبروتين
byUniv. of Tripoli
 
رقائق بوليمرية قابلة للتحلل الحيوي
byHanan Ali
 
Random 121128235820-phpapp01
byAbdelkader عبدالقادر الزين
 
4- Bacterial Stainكمنكمنكمنطكمطكنمing.pptx
byAbdallahAlasal1
 
biological examination for water analysis.pptx
byMarwaSaleh49
 
biological examination for water analysis.pptx
byMarwaSaleh49
 
biological examination for water analysis.pptx
byMarwaSaleh49
 
microbiological examination for water analysis.pptx
byMarwaSaleh49
 
microbiolgical examination for water analysis.pptx
byMarwaSaleh49
 
بكتريا.pdfgggyyyyyyhhhhgggyyyyyyyyyyyyyyyy
by1mmm212mm
 
Food Microbiology reprint from another pPt slides.pptx
byAhmedAbouelwafa7
 
2.%20Bacterial%20Cell%20MORPHOLOGY.en.ar.pptx
bymfh736870577
 
F15.ppt
byAhmedRock2
 
معمل المياه الصف الثاني عرض مدخل للتجارب
byhcww school
 
الممارسات الجيدة للمختبرات الميكربيولوجية - عملية الغسيل
byElhassan A. Abdel-Sadek
 
الممارسات الجيدة للمختبرات الميكربيولوجية - غسيل الاطباق الزجاجية
byElhassan A. Abdel-Sadek
 
الحركة والتكاثر في البدائيات
byNaif2060
 
5_2018_12_23!10_00_14_PM.pptxjjjkoooojkkooo
byssusera6a60c1
 

More from Univ. of Tripoli

PDF
Bloodborne pathogens
byUniv. of Tripoli
 
PDF
Mutation2
byUniv. of Tripoli
 
PDF
The libyan meals guide
byUniv. of Tripoli
 
PDF
Alcohol, drug , Tobacco
byUniv. of Tripoli
 
PDF
How the johnson & johnson vaccine works
byUniv. of Tripoli
 
PDF
How moderna vaccine works
byUniv. of Tripoli
 
PDF
Alanine aminotransferase (alt)
byUniv. of Tripoli
 
PDF
How the pfizer bio n-tech vaccine works
byUniv. of Tripoli
 
PPTX
Dna vs rna
byUniv. of Tripoli
 
PDF
Dna vs rna
byUniv. of Tripoli
 
PDF
The different types of mutations
byUniv. of Tripoli
 
PDF
Contamination of hands1)
byUniv. of Tripoli
 
PDF
Fourth stimulus
byUniv. of Tripoli
 
PDF
How to read a codons chart
byUniv. of Tripoli
 
PDF
Biology of sars co v-2infection
byUniv. of Tripoli
 
PPTX
What are proteins
byUniv. of Tripoli
 
PDF
Corona virus vaccine
byUniv. of Tripoli
 
PDF
Child abuse 1
byUniv. of Tripoli
 
PDF
3 COVID-19 and food safety .pdf
byUniv. of Tripoli
 
PDF
Protein synthsis
byUniv. of Tripoli
 
Bloodborne pathogens
byUniv. of Tripoli
 
Mutation2
byUniv. of Tripoli
 
The libyan meals guide
byUniv. of Tripoli
 
Alcohol, drug , Tobacco
byUniv. of Tripoli
 
How the johnson & johnson vaccine works
byUniv. of Tripoli
 
How moderna vaccine works
byUniv. of Tripoli
 
Alanine aminotransferase (alt)
byUniv. of Tripoli
 
How the pfizer bio n-tech vaccine works
byUniv. of Tripoli
 
Dna vs rna
byUniv. of Tripoli
 
Dna vs rna
byUniv. of Tripoli
 
The different types of mutations
byUniv. of Tripoli
 
Contamination of hands1)
byUniv. of Tripoli
 
Fourth stimulus
byUniv. of Tripoli
 
How to read a codons chart
byUniv. of Tripoli
 
Biology of sars co v-2infection
byUniv. of Tripoli
 
What are proteins
byUniv. of Tripoli
 
Corona virus vaccine
byUniv. of Tripoli
 
Child abuse 1
byUniv. of Tripoli
 
3 COVID-19 and food safety .pdf
byUniv. of Tripoli
 
Protein synthsis
byUniv. of Tripoli
 

Recently uploaded

PDF
التوثيق أساس لبناء نظم معلومات المشروعات - دكتور محمد عزت أمنة
byMuhammad Ezzat Amna
 
PDF
« مسؤوليات الموظف » الدرس5.pdf مسلك الادارة التربوية
byMEDBIFORN
 
PDF
كتاب دورة استخدام الحاسب في الأعمال المكتبية.pdf
bymaa998li
 
PDF
قراءة تعمقية في جوابات اماساءل التبانيات.pdf
byأنور غني الموسوي
 
PDF
ملخص درس الأسماء الخمسة
byموقع تعلم التربوي
 
PDF
حقيبة تدريبية الابتكار وريادة الأعمال الاجتماعية.pdf
byHakapetk حقيبتك
 
PDF
حقيبة تدريبية تصميم خطة عمل ناجحة في السوق السعودي.pdf
byHakapetk حقيبتك
 
PPTX
فاضل_المبارك_رحلة_في_عالم_الابداعيي.pptx
byssuserc02d5b
 
PPTX
اللغة العربية للصف الاول قراءة وطني قطر⁩.pptx
bysamglory712
 
PPTX
مكون مادة التاريخ الفرض الثاني السادس - -.pptx
byFayssalBcharri
 
التوثيق أساس لبناء نظم معلومات المشروعات - دكتور محمد عزت أمنة
byMuhammad Ezzat Amna
 
« مسؤوليات الموظف » الدرس5.pdf مسلك الادارة التربوية
byMEDBIFORN
 
كتاب دورة استخدام الحاسب في الأعمال المكتبية.pdf
bymaa998li
 
قراءة تعمقية في جوابات اماساءل التبانيات.pdf
byأنور غني الموسوي
 
ملخص درس الأسماء الخمسة
byموقع تعلم التربوي
 
حقيبة تدريبية الابتكار وريادة الأعمال الاجتماعية.pdf
byHakapetk حقيبتك
 
حقيبة تدريبية تصميم خطة عمل ناجحة في السوق السعودي.pdf
byHakapetk حقيبتك
 
فاضل_المبارك_رحلة_في_عالم_الابداعيي.pptx
byssuserc02d5b
 
اللغة العربية للصف الاول قراءة وطني قطر⁩.pptx
bysamglory712
 
مكون مادة التاريخ الفرض الثاني السادس - -.pptx
byFayssalBcharri
 

صبغ والكشف المجهري للبكتيريا

  • 1.
    ‫صبغ والكشف المجهريللبكتيريا‬ ‫‪Microscopy and Staining‬‬ ‫01‬ ‫دكتور يوسف الشريك‬
  • 2.
    ‫فحص الشرائح تحتالمجهر‬ ‫•‬ ‫• الهدف من فحص الشرائح تحت المجهر: -‬ ‫• للكشف عن الميكروبات التي ال تري بالعين المجردة لضآلة حجمها:‬ ‫1. تعتبر خلية البكتيريا من نوع وحيدة الخلية ‪ prokaryotic‬بحيث أنها أصغر‬ ‫من نوع متعددة الخاليا ‪.Eukaryotic‬‬ ‫2. للكشف عن الخاليا البكتيرية تحت المجهر الضوئي بالطرق التالية.-‬ ‫• طريقة ‪Wet mount‬‬ ‫• صبغ اللطخة البكتيرية، وتعتبر هذه الطريقة أكثر استعماال، للكشف عن‬ ‫البكتيرية تحت المجهر، ومن عيوبها يمكن أنها تبين البكتيريا الحية‬ ‫والميتة، ومن أهم مميزاتها يمكن التفريق بها بين أشكال البكتيريا‬ ‫عصوية أو كروية وتنظيماتها (شكل )وغيرها، ويمكن بهذه الطريقة‬ ‫التفريق بين البكتيريا الموجبة، أو السالبة لصبغة الجرام‬ ‫3. للكشف على خاليا البكتيرية تحت المجهر يستعمل عدسة مكبرة مع زيت‬ ‫خاص بالكشف ‪.Oil immersion‬‬
  • 3.
    ‫النواة غير الحقيقية‬ •pro·kar·y·ote • [proh-kar-ee-oht, -ee-uh t] Show IPA • nounany cellular organism that has no nuclea r membrane, no organelles inthe cytoplasm e xcept ribosomes, and has its genetic material in theform of single continuous strands formi ng coils or loops, characteristicof all organism s in the kingdom Monera, as the bacteria and blue-green algae.
  • 4.
    ‫النواة الحقيقية‬ • Eukaryote •An organism whose cells contain a nucleus surrounded by me mbrane and whose DNA is bound together by proteins (histo nes)into chromosomes • The cells of eukaryotes also contain anendoplasmic reticulum a nd numerous specialized organelles not present in prokaryotes, especially mitochondria, Golgi bodies, and lysosomes. • The organelles are enclosed in a threepart membrane(called a unit membrane) consisting of a lipid layer sandwichedbetween two protein layers. • All organisms except for bacteria andarchaea are eukaryotes. C ompare prokaryote.
  • 5.
    ‫هناك طريقتان لتجهيزالكشف عن البكتيرية الحية وهما:-‬ ‫•‬ ‫طريقة الرطبة أو المبتلة ‪.Wet mount‬‬ ‫1.‬ ‫طريقة النقطة المعلقة ‪Hanging drop‬‬ ‫2.‬ ‫• طريقة الرطبة أو المبتلة ‪ Wet mount‬تطبق هذه الطريقة لدراسة شكل وترتيب‬ ‫الخاليا البكتيرية، واختبار قدرة البكتيريا على الحركة، ومن ها الطرق التالية:-‬ ‫1. ينقع التبن في 006 مل من الماء، لمدة أسبوع قبل إجراء التجربة، مع التخلص من‬ ‫الفقاقيع الهوائية.‬ ‫2. يعمل إطار مربع في منتصف الشريحة النظيفة، من الهالم النفطي ، بحيث تكون‬ ‫أبعاده، نفس أبعاد الشريحة الزجاجية الرقيقة.‬ ‫3. توضع قطرة واحدة، من محلول نقع التبن، في منتصف الشريحة الزجاجية الرقيقة.‬
  • 6.
    ‫تقلب الشريحة الزجاجية،التي تحتوي على اإلطار ، ويلصق‬ ‫4.‬ ‫األخير بغطاء الشريحة الزجاجية الرقيق، المحتوية على قطرة‬ ‫ماء التبن بحذر.‬ ‫تقلب الشريحة بحيث يصبح غطاء الشريحة الزجاجية إلى‬ ‫5.‬ ‫أعلى.‬ ‫توضع الشريحة تحت المجهر، لدراستها، مع تقليل كمية‬ ‫6.‬ ‫الضوء الساقط ،على العدسة العينية.‬ ‫تحديد األحياء الدقيقة، في العينة بعدسة قوتها (01 ‪ ، ) X‬ثم‬ ‫7.‬ ‫بعدسة قوتها (04 ‪ ، ) X‬مع تعديل قوة اإلضاءة، عند كل‬ ‫تغيير العدسة .‬ ‫يالحظ وجود أنواع مختلفة، من األحياء الدقيقة، في عينة‬ ‫8.‬ ‫التبن، مثل: وجود بكتيريا عصوية، أو كروية وغيرها، كما هو‬ ‫موضح في جدول (2 ) و ( 3 ) وشكل (34 ).‬
  • 10.
    ‫• طريقة النقطةالمعلقة الختبار قدرة البكتيريا على الحركة‬ ‫• هدف ومبادئ هذه الطريقة مثل الطريقة الرطبة، ومن أهم‬ ‫مميزاتها التالية:-‬ ‫1. مراقبة حركة البكتيريا في نقطة معلقة داخل تجويف‬ ‫زجاجي مغلق‬ ‫2. نادراً ما يحدث جفاف للشريحة.‬ ‫3. بقاء الخاليا في حالة نشطة لمدة أطول من الطريقة‬ ‫الرطبة.‬ ‫طريقة العمل‬ ‫1. تنظف الشريحة ذات التجويف تنظيفا ً جيداً‬ ‫‪ Depression Slide‬مع غطائها بالماء الساخن‬ ‫والصابون إلزالة المواد الدهنية العالقة بها.‬
  • 11.
    ‫2. توضع أربعةنقط من الماء أو الفازلين أو الهالم النفطي‬ ‫على كل زاوية من غطاء الشريحة بواسطة ناقل البيئة.‬ ‫3. توضع قطرة من البيئة البكترية في وسط غطاء الشريحة‬ ‫الزجاجية الرقيقة.‬
  • 12.
    ‫4. توضع الشريحةعلى غطاء الشريحة الزجاجية الرقيقة ،‬ ‫بحيث يكون التجويف مقابال للقطرة في وسط التجويف،‬ ‫بحيث يكون الغطاء ملتصقا مع الشريحة.‬ ‫5. تقلب الشريحة بسرعة مع الحفاظ على وجود نقطة البيئة‬ ‫البكتيرية في منتصف التجويف.‬
  • 13.
    ‫6. تفحص النقطةالمعلقة تحت المجهر، مستعمال العدسة‬ ‫الصغيرة القوة ، ثم يخفض المكثف قليال، ويقفل الحجاب‬ ‫جزئيا ً لتقليل اإلضاءة للتمكن من رؤية العينة بوضوح.‬ ‫7. تعدل حافة الشريحة لوضع حافة النقطة في وسط مجال‬ ‫المجهري.‬
  • 14.
    ‫8. تغير العدسةالصغيرة إلى كبيرة القوة، ثم إلى الزيتية، بعد‬ ‫وضع نقطة زيت السيدر، على غطاء الشريحة.‬ ‫9. تفحص حافة العينة، مع تحريك الضابط الدقيق ببطء، مع‬ ‫تعديل اإلضاءة، بواسطة المكثف، حتى ترى البكتيريا‬ ‫بشكل واضح.‬ ‫01.الحظ حركة البكتيريا، عند حافة النقطة المعلقة.‬ ‫11.تدون المالحظات برسم شكل البكتيرية، وطريقة تجميع‬ ‫الخاليا البكتيرية ونوعية حركتها.‬
  • 15.
    ‫طريقة صبغ البسيطة‪Simple Stain‬‬ ‫• طريقة تحضير اللطخة البكتيرية‬ ‫• الهدف من تحضير اللطخة:-‬ ‫1. هو تحضير غشاء رقيق متجانس من البكتيريا النامية على‬ ‫شريحة زجاجية، ثم إضافة صباغات معينة لصبغها والكشف‬ ‫عليها تحت المجهر.‬ ‫2. ومن المعروف بأن البكتيريا عديمة اللون، ولتحديد نوعية‬ ‫خالياها، يجب إجراء عملية صبغها بأحد الطريقة التالية:-‬ ‫3. تحضير اللطخة البكتيرية.‬ ‫4. إضافة بعض األصباغ إلى اللطخة لتحديد نوعيتها من ناحية‬ ‫سالبة أو موجبة لصبغة الجرام.‬
  • 16.
    ‫طريقة تحضير اللطخةالبكتيرية‬ ‫تنظف الشريحة الزجاجية جيدا ، بالماء والصابون،‬ ‫1.‬ ‫وتجفف.‬ ‫تمسك الشريحة من إحدى طرفيها؛ وترسم دائرة قطرها‬ ‫2.‬ ‫5.1 سم، على الوجه األسفل من الشريحة.‬ ‫توضع قطرة من الماء على وجه الشريحة المرسوم‬ ‫3.‬ ‫عليها الدائرة بداخلها، لغرض عمل لطخه بكتيرية.‬ ‫تعقم عقدة الحلقية( اللوبي) ، في نهاية اإلبرة الناقلة‬ ‫4.‬ ‫،على لهب موقد بنزن،حتى درجة االحمرار،وتبرد لمدة‬ ‫01 ثواني.‬ ‫تؤخذ كشطة من البيئة البكتيرية، بعقدة اإلبرة المعقمة.‬ ‫5.‬ ‫خلط الكشطة بالماء، داخل الدائرة على سطح.‬ ‫6.‬
  • 17.
    ‫7. بعد ذلكعقم العقدة المعدنية، مرة أخرى.‬ ‫8. تعمل لطخه بكتيرية من البيئة السائلة، على شريحة‬ ‫أخرى، بحيث يكون حجمها العقدة المعدنية مرتين إلى‬ ‫ثالثة مرات( وفي كل مرة يجب تعقيم العقدة وسلكها)،‬ ‫وتنقل إلى داخل الدائرة، مع توزيعها فيها توزيعا جيدا.‬ ‫9. تعقم الحلقة مرة أخرى.‬ ‫01.تترك اللطخة لتجف، عند درجة حرارة الغرفة، دون نفخ‬ ‫أو إمرار الهواء عليها.‬
  • 18.
    ‫11.تثبت اللطخة بإمرارالشريحة على اللهب مرتين أو ثالثة‬ ‫مرات.‬ ‫شكل (44) طريقة تحضير اللطخة البكتيرية على شريحة زجاجية من بيئة سائلة وبيئة صلبة‬
  • 19.
    ‫• صبغ اللطخةالبكتيرية:‬ ‫• تعتبر الصباغات ‪ Dyes‬التي تصبغ البكتيريا مواد كيميائية،‬ ‫أما أن تكون حامضية مثل :-‬ ‫1. ‪ Fuchsin Acid‬و ‪ Eosin‬التي تتفاعل مع المكونات‬ ‫القاعدية في الخلية مثل:- سيتوبالزم،‬ ‫2. أو قاعدية مثل سفرانين أو البلورات البنفسجية ‪Crystal‬‬ ‫‪violet‬التي تتفاعل مع مكونات الخلية الحامضية.‬ ‫• يتم تحضير اللطخة كما هو موضح في الشكل(44 )‬
  • 20.
    ‫1. وضع الشريحةعلى حامل الصبغ (شكل 54)، أو تمسك بملقاط معدني.‬ ‫شكل(54) كيفية إضافة الصبغة إلى اللطخة البكتيرية‬ ‫2. تغمر اللطخة بأزرق المثيلين، لمدة 03 – 06 ثانية‬ ‫3. تغسل الشريحة بالماء المقطر، بعناية إلزالة الصبغة الزائدة،‬ ‫بواسطة أنبوب قنينة الماء المقطر.‬ ‫4. تجفف اللطخة برفق، بورق ماص للرطوبة، وتترك لتجف.‬
  • 21.
    ‫فحص اللطخة تحتالمجهر‬ ‫•‬ ‫تفحص اللطخة المصبوغة،‬ ‫•‬ ‫تحت المجهر بواسطة عدسة‬ ‫قوتها 01 ‪ ، X‬وبعدها تفحص‬ ‫بالعدسة الزيتية التي قوتها‬ ‫001‪.X‬‬ ‫عند الفحص بالعدسة الشيئية‬ ‫•‬ ‫(الزيتية)؛ يوضع الزيت‬ ‫مباشرة على اللطخة، دون‬ ‫غطاء زجاجي رقيق.‬ ‫تسجل المالحظات مع الرسم أو‬ ‫•‬ ‫التصوير، لكل ما يشاهد تحت‬ ‫المجهر( شكل 64).‬
  • 22.
    ‫• تجفف الزيتمن العدسة الشيئية، بأوراق خاصة بذلك.‬ ‫• يرجع المجهر داخل صندوقه، أو المكان المناسب له.‬ ‫• تنظف الشرائح جيدا، ويتخلص الموجود الزيت من عليها،‬ ‫وتحفظ في الصندوق المخصص لحفظها .‬
  • 23.
    ‫• صبغ البكتريابصبغة جرام‬ ‫• اكتشف هذه الطريقة هانس جرام في 4881، عندما الحظ أن‬ ‫البكتيريا تفقد لون الصبغة، عند التخلص من الزائد منها. وتستعمل‬ ‫هذه الطريقة في تشخيص وتصنيف البكتيريا، وتقسيمها إلى‬ ‫مجموعتين، سالبة ، وموجبة لصبغة الجرام. ويرجع الفرق بين‬ ‫الصفتين الموجبة والسالبة، لمكونات الجدار الخلوي البكتيري.‬ ‫• وتعتمد هذه الطريقة على أربعة خطوات هي:-‬ ‫استخدام الصبغة الرئيسية ( ‪ ،)Crystal violet‬لصبغ جميع البكتيريا‬ ‫1.‬ ‫باللون البنفسجي.‬ ‫يستخدم األيودين ‪ ،Iodine‬لزيادة الروابط األيونية بين الصبغة الرئيسية‬ ‫2.‬ ‫والبكتيريا.‬ ‫يستخدم الكحول األثيلي، أو األسيتون كمادة مزيلة للصبغة من بعض‬ ‫3.‬ ‫البكتيريا، بينما تحتفظ البعض منها بلونها.‬ ‫تستخدم مادة السفرانين ‪ ،Safranin‬في صبغ البكتيريا التي فقدت صبغتها‬ ‫4.‬ ‫بالكحول أو األسيتون، باللون األحمر.‬
  • 24.
    ‫• تسمممى البكتيريمماالتممي فقممدت لممون الصممبغة الرئيسممية بكتيريمما‬ ‫سمممالبة لصمممبغة الجمممرام، أمممما التمممي احتفظمممت بلمممون الصمممبغة‬ ‫الرئيسية تعرف باسم بكتيريا الموجبة لصبغة الجرام.‬ ‫• نظرية آلية صبغة الجرام :‬ ‫تعتمد هذه النظرية على النقاط التالية:-‬ ‫•‬ ‫1. تختلف البكتيريا لتقبلها الصبغة الرئيسية والصبغة‬ ‫الثانوية.‬ ‫2. جدار الخلية الموجبة لصبغة الجرام؛ أكثر سمكا‬ ‫من جدار خلية البكتيريا السالبة لصبغة الجرام ،‬ ‫من حيث التركيب الكيميائي.‬
  • 25.
    ‫• يحتوي جدارالبكتيريا الموجبة لصبغة الجرام ،على طبقة‬ ‫ً‬ ‫سميكة من بيبتدوجلوكان ، أكثر سماكة من جدار البكتيريا‬ ‫السالبة لصبغة الجرام أنظر الشكل (74).‬
  • 26.
    ‫• وبناء علىالنظرية، يمكن تفسير آلية الصبغة السالبة أو‬ ‫الموجبة لصبغة الجرام كالتالي:-‬ ‫• يحتوي جدار البكتيريا الموجبة لصبغة الجرام، على طبقة‬ ‫سميكة من بيبتيدوجلوكان ( متعدد السكريات مرتبطة مع‬ ‫البيبتيدات)، التي يسبب لها الكحول إزالة وانكماش جدارها،‬ ‫بحيث يخفض من معدل فقد الصبغة الرئيسية، ومن ثم تصبغ‬ ‫باللون األساسي البنفسجي.‬ ‫• يحتوي الغشاء الخارجي، لجدار بكتيريا السالبة لصبغة الجرام،‬ ‫على طبقات محتوية على البروتين، ومتعدد السكريات ودهون‬ ‫مرتبطة بعديد السكريات، وطبقة غير سميكة من‬ ‫بيبتيدوجلوكان، محاطة بغشاء خارجي، ومن تم يقوم الكحول‬ ‫بإزالة، أو إذابة الدهون، مما يزيد من فقد الصبغة األساسية ،‬ ‫ويتلون جدارها بلون الصبغة الثانوية (األحمر).‬
  • 27.
    ‫• طريقة العمل‬ ‫•يجب تحضير اللطخة البكتيرية من بيئة حديثة عمرها أقل من 42‬ ‫ساعة.‬ ‫– تنظف ثالث شرائح تنظيفا جيداً.‬ ‫– يرسم دائرة على السطح السفلي، على كل شريحة من الشرائح‬ ‫الثالثة ،مع كتابة أسماء البيئات على كل منها.‬ ‫– تحضر لطخة لكل من البيئات، بالطريقة التي سبق شرحها.‬ ‫• طريقة الصبغ وهي كاآلتي:-‬ ‫1. تغمر اللطخة بصبغة ‪ ،Crystal violet‬وتتركها لمدة نصف‬ ‫دقيقة.‬ ‫2. تغسل الشريحة بعناية بالماء المقطر، لمدة 2 ثانية، بطريقة غير‬ ‫المباشرة فوق اللطخة ( عدم تسليط الماء مباشرة على اللطخة).‬
  • 28.
    ‫بدون تجفيف الشريحة،تغمر اللطخة بمحلول اليود لمدة‬ ‫3.‬ ‫دقيقة.‬ ‫بدون غسيل الشريحة، يضاف 59% كحول إثيلي إلى‬ ‫4.‬ ‫الشريحة، ويترك لينساب على اللطخة، لمدة ما بين‬ ‫01- 02 ثانية، إلى حين توقف خروج كميات كبيرة من‬ ‫الصبغة األساسية (غالبا بعد بضع ثوان)، وتعتمد مدة إزالة‬ ‫الكحول على العوامل كثيرة، أهمها سمك اللطخة، والخبرة‬ ‫العملية في تحضير اللطخة وصبغها.‬ ‫تغسل الشريحة مباشرة بالماء المقطر، لمدة دقيقتين.‬ ‫5.‬ ‫تضاف الصبغة الثانوية السفرانين، وتترك لمدة 02 ثانية.‬ ‫6.‬ ‫تغسل الصبغة الزائدة بالماء المقطر، لمدة 2 ثانية، وتجفف‬ ‫7.‬ ‫بورق نشاف.‬ ‫تترك لتجف.‬ ‫8.‬
  • 29.
    ‫• تفحص الشريحةبالمجهر تحت العدسات المختلفة، وتسجل‬ ‫المالحظات (الشكل 84).‬
  • 30.
    ‫• الصبغة السالبة‪Negative Stain‬‬ ‫• يمكن استخدام الصبغ السالب لمعرفة شكل، وترتيب الخاليا‬ ‫البكتيرية، التي ال تتحمل التثبيت الحراري، الذي يشوه خالياها،‬ ‫ولصبغ السبورات البكتيرية ( الحافظة) ‪.Capsule‬‬ ‫• في حالة إجراء الصبغ السالب، تظهر البكتريا واضحة جدا،‬ ‫بالنسبة للخلفية الملونة التي حولها.‬ ‫• تستعمل األصباغ الحامضية، التي ال تستطيع صبغ مكونات‬ ‫الخلية البكتيرية، ولكنها تصبغ الخلفية حول الخلية فقط، بحيث‬ ‫تصبح الخلفية ملونة ،وفي نفس الوقت ال تتلون الخلية، بحيث‬ ‫تظهر البكتيريا كأجسام شفافة، في محيط معتم.‬
  • 31.
    ‫خطوات العمل‬ ‫•‬ ‫تستعمل الشرائح النظيفة، والخالية من‬ ‫•‬ ‫المواد الدهنية.‬ ‫توضع قطرة صغيرة من الصبغة‬ ‫•‬ ‫الحامضية، النيكروسين، على إحدى‬ ‫طرفي الشريحة.‬ ‫تؤخذ عينة من المزرعة الصلبة، ملء‬ ‫•‬ ‫العقدة المعدنية ، مع قطرة من صبغة‬ ‫نيكروسين، وتترك لتجف بدون توزيعها.‬ ‫تلمس القطرة بأحد طرفي شريحة أخرى‬ ‫•‬ ‫، وتحرك األخيرة يمينا ً ويساراً، يجب‬ ‫توزع البكتيريا والصبغة،لتغطي اللطخة‬ ‫ً‬ ‫بالتدريج من لون المعتم إلى لون‬ ‫الرمادي (94).‬
  • 32.
    ‫• تترك اللطخةلتجف عند درجة حرارة الغرفة.‬ ‫• تفحص الشريحة تحت المجهر شكل (05).‬ ‫• تغسل الشرائح، وتخلص من زيت من العدسة الشيئية‬ ‫• تحفظ األدوات في مكانها المناسب بعد تنظيفها جيدا.‬
  • 33.
    ‫• صبغ الثابتللحامض ‪Acid-fast stain‬‬ ‫‪،Differential stain‬‬ ‫• تستخدم طريقة الصبغ التفريقية‬ ‫في تحديد قدرة الخاليا البكتيرية من جنس‬ ‫‪،Mycobacterium tuberculosis‬والتي تسبب مرض‬ ‫السل، و ‪M. leprae‬التي تسبب مرض الجذام، واللتان‬ ‫لهما القدرة على الحفاظ على الصبغة الرئيسية، عند‬ ‫معالجتها بالكحول األثيلي، وحامض الكبريتيك،‬ ‫• وقد وجد بأن أغلبية البكتيريا تفقد الصبغة الرئيسية، عند‬ ‫عائلتي‬ ‫أعضاء‬ ‫عدا‬ ‫بالكحول،‬ ‫معاملتها‬ ‫‪Mycobacteriaceae‬و ‪ Norcardiaceae‬من الرتبة‬ ‫‪،Actinomycetales‬اللتان تحتوي جدران خالياهم على‬ ‫مادة دهنية تشبه الشمع (‪ ،)Mycotic acid‬والتي ال تقبل‬ ‫جدرانها الصبغ من معظم الصبغات.‬
  • 34.
    ‫• طريقة العمل‬ ‫•وتعتمد طريقة )‪(Ziehl-Neelsen method‬بغمر اللطخة‬ ‫كاربولفوكسين‬ ‫باسم‬ ‫تعرف‬ ‫بصبغة‬ ‫البكتيرية،‬ ‫‪ ،Carbolfuchsin‬لتسهيل دخول الصبغة في البكتيريا، ويتم‬ ‫بعد ذلك غسل اللطخة بمحلول الحامض – الكحول األثيلي،‬ ‫إلزالة الصبغة من جميع الخاليا، ما عدا المقاومة لفعل ذلك‬ ‫المحلول، وفي نفس الوقت، تستخدم صبغة أزرق المثيلين، بدال‬ ‫من الصبغة األولى .‬ ‫• هذا وقد وجد أن صبغة كاربولفوكسين أكثر ذوبانا ، في حامض‬ ‫الكربوليك( الفينول) من الماء، وتذوب أيضا ً في الدهون أكثر‬ ‫من الحامض – الكحول األثيلي، ويعطي كاربولفوكسين اللون‬ ‫األحمر لمادة الدهن.‬
  • 35.
    ‫• وتتم خطواتالعمل كالتالي:-‬ ‫تحضر اللطخة البكتيرية ، والتي أخذت من بيئات‬ ‫1.‬ ‫‪ Mycobacterium phlei‬و .‪ ، .E. coli‬وتجفف هوائيا ً‬ ‫تضع الشريحة المحتوية على اللطخة، على حامل ‪،Rack‬فوق‬ ‫2.‬ ‫حوض الغسيل.‬ ‫توضع قطعة صغيرة من ورق الترشيح، لتثبيت الشريحة فوق‬ ‫3.‬ ‫الحامل.‬ ‫تضاف كميات كبيرة من صبغة كاربولفوكسين.‬ ‫4.‬ ‫تسخن اللطخة والصبغة على بخار مائي يغلى لمدة 5 دقائق ،‬ ‫5.‬ ‫ويضاف مزيدا من الصبغة، كلما تطلب األمر ذلك، وال يسمح‬ ‫بغليان الصبغة.‬ ‫يتخلص من ورق الترشيح، وتغسل الشريحة جيداً بالماء‬ ‫6.‬ ‫المقطر.‬ ‫ً‬
  • 36.
    ‫7. يتخلص منالصبغة، بمعالجة اللطخة المصبوغة، بمحلول‬ ‫الحامض – الكحول األثيلي لمدة 51 – 02 ثانية.‬ ‫8. تغسل بالماء المقطر.‬ ‫9. تضاف صبغة أزرق المثيلين، وتترك لمدة نصف دقيقة.‬ ‫01.تغسل الشريحة بالماء المقطر، وتجفف بورق الترشيح.‬ ‫11.تحضر شريحة أخرى، من البيئة البكتيرية الثانية بنفس‬ ‫الطريقة.‬ ‫21.تفحص الشريحتان تحت المجهر، وتدون المالحظات‬ ‫31.البكتيريا التي تصبغ باللون األحمر، موجبة لصبغ البكتيريا‬ ‫الثابت للحامض، أما البكتيريا التي تصبغ بلون األزرق‬ ‫فهي سالبة لصيغ البكتيريا الثابت للحامض.‬
  • 38.
    ‫• صبغ الكبسوالت‪Capsule Stain‬‬ ‫• يمكن استخدام الصبغ السالب، لتوضيح الكبسولة ( عندما يكون‬ ‫بيضاويا ً أو دائريا ً) حول الخلية البكتيرية، والذي يلتصق بسطحها،‬ ‫مكونا ً طبقة لزجة، وتعطي طبقة مخاطية في حالة كون الكبسولة‬ ‫غير منتظمة الشكل.‬ ‫• من أهم أساسيات لصبغ الكبسوالت البكتيرية ما يلي:-‬ ‫من الصعب صبغ الكبسوالت البكتيرية، ألنها تتكون من عديد‬ ‫1.‬ ‫السكريات، وعديد البيبتيدات.‬ ‫معظم الكبسوالت ال تذوب في الماء، وال تحمل شحنات كهربائية،‬ ‫2.‬ ‫وبسبب لذلك فإن هذه الصبغات البسيطة ال ترتبط معها.‬ ‫أغلبية طرق الصبغ التي تستعمل في الكشف عن الكبسولة؛ تصبغ‬ ‫3.‬ ‫البكتيريا والوسط المحيط بها، وال تصبغ الكبسولة.‬ ‫ال تعامل اللطخة بالحرارة لتثبيتها، ألن الحرارة تسبب فقدان‬ ‫4.‬ ‫الكبسولة.‬
  • 39.
    ‫طريقة العمل:‬ ‫•‬ ‫تنظف الشريحة بمطهر وتجفف بالهواء، ثم تمسك ، من أحد‬ ‫•‬ ‫زواياها.‬ ‫‪ ،K. pneumoniae‬بواسطة‬ ‫تؤخذ عينة من بيئة بكتيرية‬ ‫•‬ ‫عقدة الناقل، وتضع على سطح الشريحة لتجهيز اللطخة.‬ ‫تترك اللطخة لتجف بالهواء، بدون استعمال الحرارة.‬ ‫•‬ ‫تغمر اللطخة بصبغة ‪ crystal violet‬لمدة 5 – 01 دقائق.‬ ‫•‬ ‫تغسل اللطخة بلطف بمحلول كبريتات النحاس 4‪ ،CuSO‬للتخلص‬ ‫•‬ ‫من الصبغة ‪ crystal violet‬الزائدة .‬ ‫تجفف محتويات الشريحة.‬ ‫•‬ ‫تفحص الشريحة تحت المجهر، وتالحظ الخاليا لونها بنفسجي،‬ ‫•‬ ‫محاطة بهالة زرقاء باهتة اللون، أو عديمة اللون، ويكون لون‬ ‫الخلفية( األرضية) بنفسجي لذلك أيضا ً (الشكل 25).‬
  • 41.
    ‫صبغ األبواغ( السبورات)الداخلية‬ ‫•‬ ‫يستخدم الصبغ السبورات ، لتحديد مواقع األبواغ، داخل خلية‬ ‫•‬ ‫البكتيرية، ومن أكثر األنواع المكونة لألبواغ الداخلية هي‬ ‫بكتيريا كلوستيريديوم، والباسيليس، لألسباب التالية:-‬ ‫األبواغ الداخلية غير نشطة، ومقاومة للظروف غير مناسبة‬ ‫•‬ ‫للبكتيريا، سواء من الحرارة أو الكيماويات ، أو أي ظروف بيئة‬ ‫أخرى.‬ ‫األبواغ ليست وسيلة للتكاثر، وتبقى البكتيريا في حالة سكون،‬ ‫•‬ ‫طالما استمرت الظروف غير مواتية.‬ ‫تستخدم األبواغ في عملية تصنيف البكتيريا.‬ ‫•‬ ‫األبواغ غير منفذة لمعظم الصبغات.‬ ‫•‬ ‫تستعمل الحرارة لتثبيت الصباغات.‬ ‫•‬
  • 42.
    ‫شكل(35) الحظ ‪DNA‬محاطبغالف البوغ. ويظهر البوغ داخل الخلية الخضرية‬ ‫وسوف تفقد الخلية جزء الخضري منها مع مرور الوقت‬
  • 43.
    ‫• طريقة العمل‬ ‫1. تنظف شريحتان زجاجيتان.‬ ‫2. جهز لطخه من بيئتين بكتيريتين، لباسيليس سابتيلس،‬ ‫عمر أحدها 81 – 42 ساعة، واألخرى 27ساعة،‬ ‫3. تجفف بالهواء، وتثبت بالحرارة.‬ ‫4. توضع قطعة صغيرة من ورق الترشيح على اللطخة،‬ ‫قبل إضافة صبغة أخضر مالكايت، لمنع التبخر الكامل‬ ‫للصبغة، وجفافها قبل تسربها إلى األبواغ، وعليه في‬ ‫جميع األحوال، يساعد التسخين على تمدد غشاء‬ ‫األبواغ ، ويسمح بدخول الصبغة إلى الداخل، وتبقى‬ ‫الصبغة داخل البوغ بالتبريد.‬
  • 44.
    ‫تغمر اللطخة بصبغةأخضر مالكايت ‪MALACHITE‬‬ ‫•‬ ‫‪.GREEN‬‬ ‫تسخن على البخار لمدة 5 دقائق ، ويضاف مزيد من‬ ‫•‬ ‫الصبغة، كلما أحتاج األمر لذلك.‬ ‫ترمى الورقة في مكان مناسب ، وتغسل اللطخة بالماء‬ ‫•‬ ‫المقطر جيداً.‬ ‫تضاف صبغة السفرانين لمدة نصف دقيقة.‬ ‫•‬ ‫تغسل الشريحة بالماء المقطر وتجفف.‬ ‫•‬ ‫تفحص الشرائح تحت المجهر( شكل 45).‬ ‫•‬
  • 46.
    ‫• تقارن النتائجمع شرائح الجاهزة، ويالحظ مواقع األبواغ‬ ‫في الخاليا المختلفة شكل(55) .‬ ‫شكل (45) طريقة صبغ السبورات، ومثال على مواقع المختلفة للسبورات كما‬ ‫هو موضحه في الدائرة أسفل الشكل .‬
  • 48.
    ‫• صبغ أسواطالبكتيرية‬ ‫• من أهم أهداف صبغ األسواط ما يلي:-‬ ‫1. مشاهدة األسواط.‬ ‫2. ترتيب األسواط وموقعها.‬ ‫3. تستعمل األسواط للتعرف على أنواع البكتيريا.‬ ‫4. ومن أهم أساسيات صبغ أسواط البكتيرية التالية:-‬ ‫5. تعتبر األسواط رفيعة جدا، وسريعة الكسر، ال يمكن صبغها‬ ‫بالصباغات العادية.‬ ‫6. تحتاج األسواط إلى تقنية وصبغة معينة، لتزيد من قطرها.‬ ‫7. يمكن مالحظة حركة البكتيريا، عن طريقة القطرة المعلقة، أو‬ ‫عن طريق صبغ األسواط،.‬
  • 49.
    ‫طريقة العمل:‬ ‫•‬ ‫يجب أخذ الحيطة والعناية الفائقة؛ لمنع فقد األسواط ، بتنظيف‬ ‫•‬ ‫الشرائح جيداً، مع تداول البيئة البكتيرية بعناية كبيرة.‬ ‫تؤخذ قطعة من وسط بيئة اآلجار الصلبة ، حيث تنمو البكتيريا،‬ ‫•‬ ‫مع عدم لمس المزرعة باليد.‬ ‫توضع قطعة اآلجار برفق على الشريحة بحيث تكون مواجهة‬ ‫•‬ ‫للنمو، ترفع تلك القطعة وتعاد إلى الطبق.‬ ‫تترك البكتيريا الملتصقة بالشريحة.‬ ‫•‬ ‫تجفف بالهواء، دون استعمال الحرارة.‬ ‫•‬ ‫تغمر الشريحة بحامض التانيك ‪ Tannic acid‬المثبت لمدة‬ ‫•‬ ‫عشر دقائق.‬ ‫تغسل الصبغة برفق بالماء المقطر.‬ ‫•‬
  • 50.
    ‫تغمر الشريحة بصبغةكاربولفوكسين ‪،Carbolfuchsin‬‬ ‫•‬ ‫لمدة خمسة دقائق.‬ ‫تغسل برفق بالماء المقطر.‬ ‫•‬ ‫تترك اللطخة تجف بالهواء ،وبورق الترشيح.‬ ‫ً‬ ‫•‬ ‫تفحص الشريحة تحت المجهر وتسجل المالحظات(65).‬ ‫•‬
  • 51.
    ‫• حركة البكتيريافي أوساط النمو شبه صلبة‬ ‫• تستخدم األوساط النمو شبه صلبة، المحتوية على كميات قليلة من‬ ‫مادة اآلجار ويحقن الوسط النمو بالبكتيريا المراد اختبار حركتها،‬ ‫داخل الوسط النمو، بواسطة إبرة حقن(بدون عقدة في نهايتها‬ ‫شكل75) في أنابيب النمو ، وتحضن األنابيب لمدة زمنية معينة،‬ ‫وتؤخذ المالحظات مباشرة بمجرد المالحظة التغيرات التي حصلت‬ ‫في الوسط الغذائي .‬ ‫شكل(75) إبرة الحقن الحظ أنه ال توجد في نهايته حلقة دائرية‬
  • 52.
    ‫• تسمح التركيزاتالقليلة من اآلجار في الوسط الغذائي،‬ ‫بتحرك البكتيريا بحركة محدودة من خالل منطقة الطعن،‬ ‫وتحدد الحركة نتيجة حدوث تفرع النمو في منطقة‬ ‫الطعن، ويمكن إضافة صبغة معينــــة مثل أمالح‬ ‫تترازيوليوم)‪ ، Tetrazolium salt (TTC‬لمالحظة تفرع‬ ‫النمو بلون األحمر الفاتح (فجلي اللون).‬ ‫يجب حقن اإلبرة بطريقة مستقيمة، وتسحب بنفس‬ ‫•‬ ‫الطريقة، للحصول على نتائج جيدة (شكل85).‬
  • 54.
    ‫• اختبار قدرةالبكتيريا على الحركة‬ ‫• ‪Motility Determination‬‬ ‫تستخدم طريقة اختبار قدرة البكتيريا على الحركة، للتعرف على‬ ‫•‬ ‫بكتيريا مجهولة النوع ( الجنس)، حيث يجرى لها اختبار على ذلك،‬ ‫ويتم مالحظة مدى حركتها خالل الحقل المجهري، وهناك نوعان من‬ ‫الحركة وهما:‬ ‫– حركة حقيقة فعلية ( الحركة من مكان إلى آخر).‬ ‫– حركة كاذبة على شكل اهتزازات أو ارتجاج (حركة برا ونية).‬ ‫توجد عدة طرق يمكن بها معرفة قدرة البكتيريا على الحركة وهي‬ ‫•‬ ‫كاآلتي:-‬ ‫‪Wet-Mount‬‬ ‫الطريقة الرطبة‬ ‫•‬ ‫‪Hanging Drop‬‬ ‫طريقة النقطة المعلقة‬ ‫•‬ ‫‪Culture Method‬‬ ‫الطريقة المزرعية‬ ‫•‬ ‫لقد سبق شرح طريقة الرطبة أو المبتلة وطريقة النقطة المعلقة‬ ‫•‬
  • 55.
    ‫• تسمح التركيزاتالقليلة من اآلجار في الوسط‬ ‫الغذائي، بتحرك البكتيريا بحركة محدودة من خالل‬ ‫منطقة الطعن، وتحدد الحركة نتيجة حدوث تفرع‬ ‫النمو في منطقة الطعن، ويمكن إضافة صبغة‬ ‫معينــــة مثل أمالح تترازيوليوم ‪Tetrazolium‬‬ ‫)‪ ،salt (TTC‬لمالحظة تفرع النمو بلون األحمر‬ ‫الفاتح (فجلي اللون).‬ ‫يجب حقن اإلبرة بطريقة مستقيمة، وتسحب‬ ‫•‬ ‫بنفس الطريقة، للحصول على نتائج جيدة (شكل85).‬
  • 56.
    ‫• تقنية عزلالبكتيريا ‪Isolation Techniques‬‬ ‫• طريقة العزل بتخطيط األطباق ‪Streak Plate Method‬‬ ‫‪of Isolation‬‬ ‫• الهدف من عزل البكتيريا بتخطيط األطباق:-‬ ‫• تستخدم هذه الطريقة للحصول على مستعمرات نقية، من‬ ‫بيئة محتوية على عديد من األنواع األخرى، وذلك لألسباب‬ ‫التالية:-‬ ‫1. تعتبر هذه الطريقة واسعة االنتشار‬ ‫2. تستخدم لخفض أعداد وكثافة األحياء الدقيقة في البيئة،‬ ‫ومن ثم سهولة عزلها من األنواع غير المرغوبة.‬ ‫3. تعتبر كل مستعمرة معزولة مستعمرة نقية ( من المعروف‬ ‫نظريا بأن كل مستعمرة تبدأ بخلية من نوع واحد فقط).‬
  • 57.
    ‫• طريقة العمل:‬ ‫• طريقة التخطيط المتعامد:‬ ‫1. تصب بيئة اآلجار المغذي في أطباق بيتري، عند‬ ‫درجة 54 ‪º‬م، وتترك لتبرد وتتصلب.‬ ‫2. تغمر عقدة الناقل المعدني المعقم، في بيئة بكترية‬ ‫مختلطة ، أو من معلق المادة المراد العزل منها.‬ ‫3. تخطط مساحة صغيرة على سطح اآلجار، عند حافة‬ ‫طبق بيتري، بلمس السطح بعقدة الناقل المجففة،‬ ‫بدون ضغط حتى ال يخرج سطح اآلجار‬ ‫( المساحة1).‬ ‫4. تعقم حلقة الناقل وتترك لتبرد لمدة 5 ثواني.‬
  • 58.
    ‫يحرك الطبق معفتح الغطاء الزجاجي لطبق بيتري ،‬ ‫5.‬ ‫أخرى ، ويرسم على‬ ‫وتعاد عملية التخطيط مرة‬ ‫سطح اآلجار خطوط على شكل حرف ‪ S‬بواسطة الناقل‬ ‫على المساحة 2 بعرض الطب‬ ‫يعقم الناقل مباشرة ويترك ليبرد.‬ ‫6.‬ ‫يخطط سطح اآلجار تخطيطات( 6 – 7 خطوط)، بحيث‬ ‫7.‬ ‫تكون عمودية‬ ‫يعقم الناقل ويترك ليبرد.‬ ‫8.‬ ‫تكرر عملية التخطيط في االتجاه 3 و4. (شكل 95).‬ ‫9.‬
  • 60.
    ‫• طريقة التخطيطالمتشعع ‪Radiant Streak Method‬‬ ‫1. تعقم حلقة الناقل، وتبرد لمدة 5 ثواني.‬ ‫2. ترسم بواسطة الناقل 7 –8 خطوط كما موضح في شكل (06).‬
  • 61.
    ‫يعقم الناقل مرةأخرى ويترك ليبرد.‬ ‫3.‬ ‫يخطط سطح اآلجار، بحث تكون الخطوط متقاطعة‬ ‫4.‬ ‫مع الخطوط التي سبق تخطيطها في السابق.‬ ‫يعقم الناقل مرة أخرى، ويترك ليبرد.‬ ‫5.‬ ‫توضع األطباق مقلوبة في الحضانة عند درجة‬ ‫6.‬ ‫73‪º‬م ،لمدة 42 – 84 ساعة.‬