Rekombinasi DNA

1. DNA REKOMBINAN

2. TEKNOLOGI REKOMBINASI DNA
• Rekombinasi DNA
Membangun (mengkonstruksi) DNA melalui
penggabungan fargmen-fragmen DNA, dalam susunan
yang memungkinkan DNA baru tersebut terekspresi
Rekombinasi DNA berkaitan erat dengan
Kloning DNA, transformasi DNA, sekuensing DNA,
ekspresi gen, dan rekayasa genetik organisme.
Tujuannya untuk produksi senyawa yang bernilai,
melalui bioproses, rekayasa protein, pemuliaan 
transgenik, terapi gen
Prinsip dasarnya: potong sambung DNA pada situs
tertentu/restriktif.

3. TEKNOLOGI REKOMBINASI DNA
Komponen2 kunci yang harus terpenuhi:
1. Situs pemotong (restriction site), dan posisi yang tepat
pada DNA yang akan direkombinasikan
2. Enzim restriksi (endonuclease): untuk memotong DNA
3. Enzim ligase: untuk menyambung fragmen DNA
4. Enzim fosfatase: untuk menghilangkan gugus fosfat,
mengurangi self ligation.
5. Enzim kinase: untuk meningkatkan efisiensi enzim
ligase

6.  Enzim restriksi: berasal dari sistem imunitas bakteri
 Fungsi enzim restriksi:
Memotong utas DNA pada suatu sekuens nukleotida tertentu,
disebut restriction site
Setiap enzim restriksi memiliki restriction site tersendiri, dibaca
pada arah 5’3’. Umumnya restriction site terdiri atas 4-8 basa.
Contoh: restriction site enzim EcoRI yaitu GAATTC.
 Enzim restriksi menghasilkan:
Fragmen-fragmen DNA
Hasil potongan enzim restriksi ada 2 tipe: sticky end (ujung
runcing/lengket), dan blunt end (ujung tumpul)
Fragmen-fragmen DNA dapat disambung kembal, dengan
bantuan enzim ligase

12. Kloning Gen
Dari bahasa Yunani → klon = ranting
Kloning gen menghasilkan kumpulan turunan individu, tanpa
melalui perkawinan. Kumpulan tersebut berupa replika.
sebagian, atau seluruh makromolekul (contoh: DNA atau
antibodi)
Suatu individu yang tumbuh dari satu sel somatik induknya,
dana memiliki identitas genetik sama dengan induknya.
Klon = Koleksi molekul/sel yang semua identitasnya sama
dengan molekul atau sel penurunnya
Memproduksi sejumlah besar DNA, atau sel yang identik,
dari satu molekul atau sel tetua

13. Kloning DNA
Merupakan metode untuk memurnikan, atau
mengidentifikasi, dan memperbanyak potongan
DNA tertentu (klon) yang dikehendaki, dari
campuran potongan-potongan DNA yang
kompleks.

14. Kloning Gen
Ketika keseluruhan DNA
suatu organisme diekstraksi,
akan diperoleh seluruh gen
yang dimiliki organisme
tersebut.
Pada kloning gen, hanya gen
tertentu (gen target) yang
diisolasi, dimurnikan, dan
diperbanyak (diklon)

15. Tujuan kloning gen
Menentukan urutan basa nukleotida penyusun
suatu gen.
Menganalisis/mengidentifikasi urutan basa
nukleotida pengendali suatu gen.
Mempelajari fungsi RNA/protein/enzim yang
disandi oleh suatu gen.
Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada
kecacatan gen, yang mengakibatkan penyakit
bawaan.
Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu,
misalnya memproduksi insulin, ketahanan
terhadap hama, dll.

16. Sumber DNA untuk diklon
Sumber-sumber DNA dapat berasal dari:
 DNA krmosom
 cDNA (complementary DNA) yang
disintesis menggunakan mRNA sebagai
cetakan (template)
 DNA yang dihasilkan dari perbanyakan
menggunakan PCR

17. Bahan untuk mengklon
Enzim restriksi (endonuclease)
Enzim DNA ligase
Vektor
Inang (host)
Metoda untuk memasukkan DNA ke
dalam sel inang

18. Vektor untuk mengklon
 Diperlukan wahana (vehicle) untuk
memasukkan fragmen DNA ke dalam sel
inang, agar tersimpan dan diperbanyak di
dalam sel tersebut.
 Vektor untuk kloning, dapat berupa plasmid,
atau bakteriofage.

20. 1. Memiliki origin of replication (ORI) dari inang
yang dituju → memungkinkan replikasi secara
independen terhadap genom inang.
2. Memiliki penanda selektif → memudahkan
seleksi sel pembawa plasmid tersisipi DNA asing.
Misal: berupa ketahanan terhadap antibiotic,
penapisan biru-putih.
3. Mudah diisolasi dari sel inang.
Vektor berupa plasmid

21. Vektor berupa plasmid
Keunggulan:
Kecil, mudah pengerjaannya
Strategi seleksi mudah
Berguna untuk mengklon potongan DNA
ukuran kecil (< 10kbp)
Kelemahan:
Kurang bermanfaat untuk mengklon
potongan DNA ukuran besar (> 10kbp)

22. Memilih Vektor
Pertimbangan:
Ukuran DNA yang disisipkan
Ukuran vektor
Situs enzim restriksi yang
tersedia
Jumlah salinan (copy number)
Efisiensi kloning
Kemampuan untuk menapis
DNA sisipan
Rencana penelitian
selanjutnya

23. TAHAPAN KLONING GEN
Tahapan pokok kloning gen :
1 Identifikasi keberadaan gen pada sumber.
2. Isolasi dari gen lainnya
3. Rekombinasi, subcloning, atau ligasi dengan DNA
vektor (plasmid)
4. Transformasi ke E. coli.
5. Seleksi
6. Uji konfirmasi DNA rekombinan

24. KLONING
GEN