Histoteknologi Dasar

2. Histoteknik adalah metoda membuat sajian
histologi dari spesimen tertentu melalui suatu
rangkaian proses hingga menjadi sajian yang
siap untuk dianalisis.
Sumber Jaringan:
1.Manusia
2.Hewan

3. 1. Pengawetan (Fixation);
2. Dehidrasi (Dehydration);
3. Pembeningan (Clearing);
4. Pembenaman (Infiltration/Impregnation/Embedding);
5. Pengecoran (Blocking/Casting);
6. Pengirisan Jaringan (Sectioning);
7. Pewarnaan (Staining);
8. Perekatan (Mounting);
9. Pelabelan (Labelling)

4. Efek fiksasi terhadap jaringan yang diproses:
1. Menghambat proses pembusukan dan autolisis
2. Pengawetan jaringan
3. Pengerasan jaringan
4. Pemadatan koloid
5. Differensiasi optik
6. Pengaruh terhadap pewarnaan
Cara melakukan fiksasi:
1. Supravital/intravital;
2. Merendam dalam larutan fiksatif.

5. Hal-hal yang harus diperhatikan dalam fiksasi
jaringan histologi adalah:
1.Tebal irisan.
2.Volume larutan pengawet.
3.Jenis larutan pengawet.

6.  Formaldehyde
 Formaldehyde (Formalin), Paraformaldehyde, Glutaraldehyde,
 Picrates
 Picric Acid → Bouin’s Solution
 Mercurials
 Helly ‘s Fluid (Zenker Formol)
 Oxidizing Agents
 Osmium tetroxide
 Alcohol
 Methanol, Alcohol (etanol)
 Potassium Dichromate
 Muller

7.  FORMALIN
 MULLER
 BOUIN
 CARNOY
 ZENKER FORMAL (CAIRAN HELLY)
 ETANOL
 ASAM ASETAT-ALKOHOL-FORMALIN (TELLYESNICZKY)
 dll

8.  Yg digunakan adalah bentuk monomer: dibuat dengan
menetralkan/alkalis larutan
 Mengakibatkan crosslink protein
 Formal saline, formal calcium, 10% neutral buffered
formalin, buffer formalin sukrosa
 Kelebihan dan kekurangan

10.  Mengandung asam pikrat, meledak kalau
kering
 Mudah dikenali saat pemotongan → warna
kuning
 Mempunyai daya penetrasi yang cepat dan
merata
 Jaringan mengalami pengerutan

12.  Mengandung merkuri klorida
 Daya fiksasinya cepat dan kuat, tetapi kecepatan
penetrasinya berkurang setelah meresap sejauh
beberapa milimeter pertama dan potongan
jaringan yang melebihi ketebalan 5 mm pada
umumnya cenderung untuk menjadi keras (rapuh),
overfixed di bagian pinggir sementara di bagian
tengah menjadi lunak karena underfixed
 Fiksatif ini sangat baik untuk fiksasi sumsum tulang
dan limpa, mitochondria.

14.  Cytological fixatives
 Etanol 95%
 Digunakan untuk Pap test, swab
 Mempertahankan antigenisitas → cocok IHC

15.  mengawetkan substansia Nissl dan
glikogen
 daya penetrasi yang cepat
 Fiksasi ini sering digunakan apabila suatu
diagnosis perlu ditegakkan dengan cepat,
misalnya untuk diagnosis kanker pada saat
pembedahan. Fiksasi umumnya selesai
setelah 1-2 jam,sedangkan potongan kecil
selesai difiksasi dalam 15 menit.
 efek pengerutan: kuat

17. Pasca fiksasi, jaringan yang keras mendapat perlakuan
khusus
•Tulang: dekalsifikasi → formic acid 8%
•Kulit: teknik lendrum
• Cuci dengan air kran mengalir/alkohol 90%
• Fenol 4% dalam akuades (v/v) selama 1 -3 hari

18.  Tahapan dehidrasi
 Cara I
 Alkohol 70% 3 hari ( 3x ganti)
 Alkohol 95% 3 hari ( 3x ganti)
 Alkohol 100% 3 hari ( 3x ganti)
 Cara II
 Alkohol 70%, 80%, 90%, masing-masing 1 hari;
 Alkohol 95% 2 hari ( 2x ganti);
 Alkohol 100 % 2 hari ( 2x ganti).
 Sukrosa 20% (untuk cryostat): Sukrosa 20% selama 2 hari;
 Metanol: jarang digunakan tetapi dapat digunakan seperti
etanol;
 Aseton : 3 x 20 menit.

19.  Bahan yang digunakan :
 Cedar wood oil;
 Chloroform;
 Benzene/benzol;
 Benzyl benzoat;
 Methyl benzoat;
 Xylene/xylol;
 Toluene

20.  Keuntungan
 Sifat clearing-nya paling baik.
 Tak mengeraskan jaringan
 Jaringan yang halus sangat baik.
 Kadang digunakan untuk jaringan keras (kulit dan
jaringan ikat padat)
 Dapat disimpan dalam waktu lama (berbulan-
bulan)

21.  Keuntungan :
 Paling sering dipakai
 Bersifat toleran (dapat disimpan semalaman tanpa
menjadi keras)
 Kerugian
 Titik akhir tak dapat dilihat dengan mata
 Saat menjadi bening dan transparan tak jelas
 Cara mengatasi : waktu pembeningan diperpanjang
 Lebih mahal dari xylene dan benzene tetapi lebih
murah dari cedar wood oil.

22.  Metoda :
 Benzyl benzoat I selama 24 jam hingga
jaringan tenggelam. Jaringan menjadi bening
dan transparan.
 Benzyl benzoat II selama 2-3 jam.
 Benzol-Paraffin selama ½ - 1 jam. Campuran
benzol dan paraffin cair dengan
perbandingan sama.
 Masukkan ke dalam paraffin cair.

23.  Metode :
 Methyl benzoat I sampai jaringan
tenggelam.
Daya penetrasi lebih cepat dari benzol
benzoat;
Jaringan mudah rapuh.
 Methyl benzoat II selama 1-2 jam.
 Benzol-Paraffin. Campuran benzol dan
paraffin dengan perbandingan sama.
 Masukkan ke dalam paraffin cair.

24.  Keuntungan
 Waktu clearing cepat : ½ - 1 jam.
 Benzene lebih lambat dari xylene tetapi kerapuhan jaringan
lebih berkurang dibanding xylene
 Kerugian
 Karsinogenik
 Metode
 Direndam dalam xylol 2 kali @ 1 menit hingga bening dan
transparan
 Volume 50 – 1000 kali volume jaringan
 Setelah itu masukkan ke dalam paraffin cair

25.  Sama dgn xylene tetapi lebih lambat
 Menimbulkan sedikit pengerasan dan distorsi
jaringan
 Mudah menguap

26.  Impregnasi adalah proses pengeluaran cairan
pembening (clearing agent) dari jaringan dan
menggantikannya dengan paraffin.
 Dilakukan dengan menggunakan paraffin oven
 Clearing agent yang tersisa dapat mengkristal
dalam jaringan sehingga saat dipotong dengan
mikrotom jaringan akan robek.
 Teknik Pembenaman
 Paraffin/ paraplast I selama 2 jam;
 Paraffin/ paraplast II selama 1 jam;
 Paraffin/ paraplast III selama 2 jam.
 Setelah pembenaman, proses dilanjutkan dengan
pengecoran (blocking).

27.  Alat Cetak :
 Besi potongan berbentuk L (Leuckhart)
 Susun 2 buah potongan besi si atas lembaran logam sehingga
membentuk ruang kubus;
 Tuangkan sedikit paraffin cair di bagian pinggir agar tidak bocor;
 Letakkan jaringan sesuai dengan keinginan saat jaringan diiris;
 Tuangkan paraffin secukupnya agar menutupi jaringan seluruhnya;
 Hindarkan terbentuknya air bubble.
 Histoplate dari plastik (casette) dan piringan logam (mold).
 Spatula untuk melekatkan blok paraffin.
 Beri label identitas jaringan saat blocking.

28. Persiapan:
- Microtome knive vs Microtome blade (disposable)
Letakkan pisau pada mikrotom dengan sudut tertentu.
Rekatkan blok paraffin yang akan dipotong pada holder dengan
menggunakan spatula atau scalpel blade yang panas. Letakkan holder
berikut blok preparat pada tempatnya di mikrotom.
- Siapkan coated slides:
Albumin (putih telur);
Gelatin;
SuperFrost™
Poly-L-Lysine
- Waterbath berisi air hangat 55o
C;
- Sengkelit.

30. Teknik Pemotongan
 ketebalan + 5 – 10 µm (disesuaikan kebutuhan)
 Atur jarak preparat yang dipegang oleh holder ke arah
pisau sedekat mungkin;
 Gerakkan rotor (putaran) pada mikrotom secara ritmis,
 Buang pita-pita paraffin awal yang tanpa jaringan;
 Setelah potongan mengenai jaringan, potong blok
preparat secara hati-hati;
 pindahkan secara hati-hati dengan sengkelit ke atas air di
dalam waterbath yang diatur pada suhu 55o
C;
 Setelah pita paraffin terkembang dengan baik, tempelkan
paraffin ke kaca objek;
 Simpan kaca objek berisi potongan paraffin dan jaringan
sampai saatnya untuk diwarnai.

33.  Unsur yang akan didemonstrasikan
 Pigmen pengganggu
 Mis: melanin → bleaching
 Fixing fluid/fixatives
 Muller fluid → jaringan dicuci dgn air mengalir selama 24
jam
 Zenker → lugol’s iodine → larutan hypo

34.  Hematoxylin & Eosin (Rutin)
 Khusus
 PAS, PTAH, Impregnasi perak
 Sudan → lipid
 Sitologik
 Pap test
 Blood smear
 Swab mucosa
 Imunohistokimia

36.  Paling banyak digunakan → rutin
 HE dapat menunjukkan sebagian besar
struktur histologi
 Demonstrasi nuklei adalah penting
 Variasi dalam hasil

37.  Hematein (oxidized hematoxylin) adalah zat warna
 Nucleus mengandung RNA dan DNA (bersifat asam)
 Hematoxylin mewarnai nuclei
 Afinitas hematein thd nuclei adalah jelek bila tanpa mordant.
 Mordant adalah penghubung haematoxyllin dan DNA
 Logam: Al, Fe, tungsten, molybdenum, lead
 Tipe mordant mempengaruhi tipe jaringan yang terwarnai dan hasil
akhir pewarnaan
 Klasifikasi didasarkan jenis mordant yg digunakan
 Al; Iron; Tungsten haematoxyllin, etc & tanpa mordant

38.  Natural ripening vs artificial ripening
 Artificial ripening: penggunaan mordant (Al, Fe, atau
Pb)
 Warna pertama adalah merah gelap, menjadi biru
(blueing) bila diperlakukan dgn alkali lemah (air kran
atau lithium carbonate)
 Methods are
 regressive
 Progressive causing pale nuclei or colour cytoplasm
 Counterstain (IHC)

39. • Penggunaan
– Pewarnaan Nuclei
– Struktur selain nuclei
• Jenis formula hematoxylin untuk pewarnaan
nuclei
1. Dellafield (1885)
2. Ehrlich (1886)
3. Heidenhains (1896)
4. Harris (1900)
5. Mayer (1903)
6. Weigert (1904)
7. Carazzi (1911)
8. Cole (1943)

40.  Connective tissue
 Mallory phosphotungstic acid haematoxyllin
 Elastic fibers
 Verhoeff’s method
 Myelin
 Kultschitzky
 Loyez
 Spielmeyer
 Weigert
 Copper and lead
 Mallory
 Parker
 Mucin
 Mayer’s mucihematein

41.  Formula Hematoxylin Mayer
 Haematoxylin kristal 1 gr
 Akuades 1000 ml
 Sodium Iodate 0,2 gr
 Ammonium/potassium alum 50 gr
 Citric acid 1 gr
 Chloral hydrate 50 gr
 Cara pembuatan Hematoxylin Mayer
 Larutkan ammonium/potassium alum di dalam akuades.
 Tambahkan hematoxylin dan campurkan secara baik (aduk).
 Tambahkan sodium iodate, citric acid dan chloralhydrate.
 Campur dan aduk hingga seluruhnya tercampur dengan baik.
 Biarkan semalam dan saring dengan kertas saring besoknya.

42.  Zat warna xanthene
 Ikatan Van der Waals
 Paling cocok dikombinasikan dgn alum haematoxyllin
 Memiliki nilai kemampuan differensiasi sendiri untuk
membedakan antara sitoplasma dari tipe sel dan serabut
jaringan ikat yang berbeda
 Differensiasi terjadi selama dehidrasi oleh alkohol
 Jenis eosin
 Eosin Y (yellowish), water soluble
 Eosin B (Bluish)
 Ethyl Eosin (eosin S, eosin alkohol absolut)

43.  water soluble
 Paling banyak digunakan
 Zat warna asam sehingga berikatan dgn protein (basa)
 Dapat berpenetrasi pada struktur padat dan bersifat
metakromatik
 Terdapat dalam 2 bentuk
 Monomer: merah
 Dimer : oranye-merah
 Hasil pewarnaan
 Sitoplasma: merah
 Eritrosit : oranye-merah
 Nukleus piknotik: ungu
 Nucleolus: merah

44.  Formula Eosin
 Eosin-alkohol Stok 1%
 Eosin y ws 1 gr
 Distilled water 20 ml
 Larutkan dan tambahkan alkohol 95% 80 ml
 Working Eosin Solution
 Eosin-alkohol stok 1 bagian
 Alkohol 80% 3 bagian
 Dibuat sesaat sebelum digunakan dan tambahkan asam
asetat glasial 0,5 ml untuk setiap 100 ml larutan dan
aduk dengan baik.

45.  Deparafinisasi dengan xylol (2 x 2 menit);
 Hidrasi dengan alkohol 100% (2x2 menit) – 95% (2 menit) – 90%(2 menit) –
80% (2 menit) – 70% (2 menit) – air kran (3 menit);
 Jaringan yang difiksasi dengan larutan yang mengandung merkuri klorida
mengandung presipitat merkuri yang berwarna hitam. Deposit merkuri
dapat dihilangkan sebelum pewarnaan. Irisan diinkubasi dalam larutan
iodine 0,5% dalam etanol 70% selama 5 – 10 menit. Irisan dibilas dengan air
lalu diinkubasi dalam sodium thiosulphate 5% selama 5 menit dan dicuci
dengan air kran mengalir.
 Inkubasi dalam larutan hematoxylin Mayer selama beberapa menit;
 Cuci dalam air mengalir selama 15-20 menit;
 Observasi di bawah mikroskop, Counterstaining dengan eosin working
solution selama beberapa menit. Dehidrasi dalam serial alkohol dengan
gradasi meningkat
 Inkubasi dalam xylol 2x2 menit.
 mounting dengan entelan™/balsam kanada.
 labelling

48.  Mengurangi warna biru hematoxyllin (to
differentiate nuclear staining)
 0.25 % acid rinse
 Akuades 975 ml
 HCl 25 ml
 HCl 1% dalam alkohol 70% (v/v)

49.  Air kran (yang alkalis)
 Jakarta: pH air kran adalah 7.8
 Lithium carbonate
 Lithium carbonate……………….... 0,5 gr
 Akuades……………………………… 1000 ml
 Campurkan dengan baik.

50. Terima kasih