1. LAPORAN PRAKTIKUM
MIKROTEKNIK TUMBUHAN
PERCOBAAN I
PEMBUATAN PREPARAT MELINTANG DENGAN METODE PARAFIN
NAMA : MUHAMMAD ABDUL
NIM : H411 14 510
KELOMPOK : VII (TUJUH)
ASISTEN : SARTIKA SARI
HARI/TANGGAL : JUMAT/26FEBRUARI 2016
LABORATORIUM BOTANI JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2016
2. BAB I
PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Meneliti suatu organisme, baik dari tingkatan sel, jaringan, organ dan
sebagainya memerlukan cara tertentu untuk mempermudah penelitian tersebut.
Hewan dan tumbuhan dapat diteliti dengan terlebih dahulu membuat preparat
dengan berbagai metode yang telah ditemukan, metode tersebut yang paling
umum adalah mikroteknik.
Mikroteknik semakin berkembang dewasa ini, banyak metode yang
digunakan untuk pembuatan sediaan tergantung bahan yang akan digunakan. sel
hewan yang kebanyakan digunakan untuk pembuatan sediaan dengan metode
smear ataupun embedding dan seringkali pula dengan metodewhole mount.
Sedangkan sel tumbuhan kebanyakandibuat dengan menggunakan metode yang
lebih ringan daripada sel hewan karenastruktur sel hewan dan sel tumbuhan yang
berbeda. Metode yang paling umumdigunakan untuk melihat jaringan dan sel
tumbuhan adalah metode parafin denganbahan utamanya adalah blok parafin
(Sedjo, 2004).
Salah satu metode yang digunakan dalam pembuatan preparat tumbuhan
adalah metode parafin. Metode parafin merupakan cara pembuatan preparat
permanen dengan menggunakan para fin sebagai media embedding dengan tebal
irisan kurang lebih mencapai 6 µm-8 µm. Alat yang digunakan untuk dapat
mencapai hasil irisan 6 µm-8 µm adalah mikrotom Untuk mengamati dan melihat
preparat secara melintang dari akar jagung Zea mays dengan menggunakan
metode parafin, maka dilakukanlah percobaan ini.
3. I.2 Tujuan Praktikum
Tujuan dilakukannya percobaan ini adalah untuk mengamati dan melihat
preparat secara melintang dari akar jagung Zea mays dengan menggunakan
metode parafin.
I.3 Waktu dan Tempat Praktikum
Percobaan ini dilakukan pada hari Jumat, 26 Februari 2016 pukul 14:00-
18:00 WITA di Laboratorium Botani, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, Makassar.
4. BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Metode parafin adalah suatu metode pembuatan preparat dengan
melakukan penanaman jaringan di dalam blok parafin untuk menghasilkan
preparat jaringan hewan ataupun tumbuhan yang tipis. Preparat parafin ini
dilakukan penyelubungan karena jaringan merupakan bahan yang lunak.
Pembuatan sediaan dengan pemotongan jaringan menggunakan parafin dan
mikrotom sebagai alat pemotongnya. Dilakukan infiltrasi agar parafin yang masuk
berfungsi sebagai penyangga jaringan saat diiris dengan mikrotom, lalu
diembedding (proses penanaman) yaitu merendam jaringan ke dalam parafin cair,
dan parafin akan masuk ke seluruh bagian jaringan, proses pemotongan dengan
mikrotom, penempelan pada kaca objek, pewarnaan dengan haematoksilin (pada
umumnya bahan ini yang sering digunakan untuk jaringan hewan) sedangkan
jaringan tumbuhan seringkali menggunakan safranin ataupun fast green. Setelah
diwarnai lalu dimounting, dan diberi label nama (Nugroho, 2006).
Gambar 1.MikrotomPutar. Sumber: www.aliexpress.com
5. Metode parafin termasuk metode irisan yang merupakan metode rutin atau
standar. Metode ini sekarang banyak digunakan, karena hampir semua jaringan
dapat dipotong dengan baik bila menggunakan metode ini. Kebaikan-kebaikan
jaringan ini adalah irisan menjadi lebih tipis dibandingkan metode beku atau
metode seloidin. Dengan menggunakan metode beku, tebal irisan rata-rata diatas
10 mikron, tetapi dengan metode parafin irisan dapat mencapai tebal 6 mikron.
Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah, bila menggunakan
metode ini. Prosesnya jauh lebih cepat dibandingkan dengan metode seloidin,
kejelekannya adalah jaringan menjadi keras, mengkerut dan mudah patah.
Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakan bila menggunakan metode ini.
Sebagian enzim-enzim akan larut di dalam metode ini (Sugiharto, 1989).
Pembuaatan preparat jaringan tumbuhan yang dilakukan dengan metode
parafin melalui beberapa tahapan, yaitu (Widjajanto, 2001):
a. Pengambilan jaringan (Diseksi/Collecting)
Diseksi merupakan proses pengambilan jaringan atau bagian jaringan dari
sumber alami baik berupa tumbuhan ataupun hewan yang akan digunakan sebagai
bahan dasar dalam mikroteknik. Pada jaringan hewan setelah dilakukan
pengambilan diperlukan proses pencucian (washing). Pencucian (washing) adalah
suatu tahap yang membedakan metode paraffin hewan dengan tumbuhan.
Pencucian ini perlu dilakukan karena jaringan yang diambil pada hewan sering
kali dalam keadaan kotor oleh darah atau kotoran seperti pada organ pencernaan.
Selain itu jaringan hewan lebih cepat mengalami dehidrasi yang merusak jaringan,
sehingga perlu secepat mungkin dimasukan ke dalam larutan fisiologis sebagai
fiksasi sementara. Pencucian pada pembuatan preparat hewan menggunakan
larutan garam fisiologis.
6. b. Fiksasi (Fixation)
Fiksasi adalah usaha yang dapat mempertahankan elemen-elemen sel atau
jaringan agar tetap berada pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan bentuk
maupun ukuran.Media yang digunakan untuk fiksasi disebut dengan fiksatif.
Fiksatif terdiri dari unsur-unsur kimia yang dibuat dalam bentuk larutan atau gas
yang berfungsi agar Jaringan tidak membusuk, dan dapat mempertahankan
struktur jaringan.
c. Dehidrasi (dehydration)
Dehidrasi adalah proses penarikan air dari dalam jaringan dengan
menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dehidrasi bertujuan untuk
mengeluarkan air dari dalam jaringan yang telah difiksasi. Proses dehidrasi
merupakan serangkaian proses dengan cara memasukan sample ke dalam larutan
dehidrasi secara berseri dari konsentrasi rendah sampai konsentrasi tinggi dengan
mengurai konsentrasi air.
Dehidran yang paling umum digunakan pada mikroteknik dengan metode
paraffin adalah alkohol. Jenis dehidran lain adalah dioksan, N-butyl alcohol,
aniline oil dan bergamot oil. Alkohol merupakan dehidran yang umum digunakan,
karena relatif lebih murah dan mudah diperoleh, tapi mampu menghasilkan hasil
yang baik, bahkan untuk jenis-jenis jaringan-jaringan lunak seperti otak, sumsum
tulang belakang, dan embrio. Dalam penggunaan alkohol dipakai serial dengan
konsentrasi yang berbeda, dimulai dari konsentrasi rendah ke konsentrasi tinggi.
Lama perendaman tergantung untuk masing-masing konsetrasi berkisar 1-6 jam.
Alkohol 70% sebagai stoping point, jaringan di malamkan.
Proses dehidrasi dalam berbagai konsentrasi alkohol dilakukan setingkat
demi setingkat. Tujuannya adalah untuk menjaga agar tidak terjadi perubahan
7. secara tiba-tiba dalam terhadap sel jaringan, sehingga perubahan struktur sel yang
terjadi sekecil mungkin. Apabila proses dehidrasi ini tidak sempurna berarti masih
ada molekul air dari dalam jaringan. Ketidaksempurnaan proses dehidrasi ini
dapat diketahui dengan jelas setelah jaringan dimasukan ke dalam zat penjernih,
dimana jaringan tidak menjadi transparan walaupun jaringan telah lama dalam
larutan penjernih. Jika terjadi hal yang demikian, maka jaringan harus
dikembalikan ke dehidran.
d. Penjernihan (Clearing)
Clearing merupakan proses harus segera dilakukan setelah dehidrasi.
Tujuan dari penjernihan ini adalah menggantikan tempat alkohol sementara dalam
jaringan yang telah mengalami proses dehidrasi dengan suatu solven atau medium
penjernih sebelum proses penanaman dalam parafin. Medium penjernih ini akan
menjernihkan atau mentranparankan jaringan agar kemudian dapat terwarnai
dengan baik dan memperlihatkan warna sesuai dengan warna pewarnanya.
e. Infiltrasi (Infiltration)
Infiltrasi adalah suatu usaha menyusupkan media penanaman
(embeddingmedia) ke dalam jaringan dengan jalan menggantikan kedudukan
dehidran dan bahan penjernih (clearing agents). Media penanaman yang
digunakan dalam infiltrasi ini adalah paraffin. Proses infiltrasi ini umumnya
dilakukan di dalam oven yang suhunya dapat diatur sesuai titik leleh jenis parafin
yang digunakan. Pada jaringan hewan bisa langsung digunakan parafin keras
dengan titik leleh 56°C-58°C. Dalam proses infiltrasi sebaiknya jaringan jangsn
langsung dimasukan ke dalam parafin murni, tetapi sebelum parafin murni
jaringan dimasukkan terlebih dahulu ke dalam campuran bahan penjernih dan
parafin murni dengan perbandingkan yang sama. Waktu yang diperlukan jaringan
8. campuran ini terlalu lama cukup berkisar antara 10-30 menit saja tergantung besar
kecilnya jaringan. Tujuan dari semua ini adalah untuk menghindari jaringan dsri
prubahan lingkungan yang sangat mendadak. Perubahan-perubahan yang
mendadak ini dapat menimbulkan kerusakan pada jaringan itu sendiri, seperti
jaringan menjadi sangat mengkerut.
Setelah dalam campuran parafin dan bahan penjernih, jaringan baru
dipindahkan ke parafin murni sebanyak tiga kali ganti yang masing-masingnya
berkisar antara 30-60 menit. Usahakan jaringan jangan terlalu lama ditinggalkan
dalam oven.Tujuan dari tahap infiltrasi ini adalah untuk mengisi jaringan dengan
parafin sebagi pengikat jaringan agar tetap memiliki bentuk dan struktur yang
sama seperti hidup.
f. Penanaman (Embedding)
Embedding atau penanaman merupakan proses memasukan atau
penanaman jaringan ke dalam balok-balik parafin (cetakan) sehingga
memudahkan proses penyayatan dengan bantuan mikrotom. Tujuan dari tahap ini
adalah untuk membuat balok parafin yang berisi jaringan yang akan dibuat
preparat permanen.
Parafin yang digunakan untuk menanam jaringan harus memiliki titik leleh
yang sama dengan parafin yang digunakn waktu infiltrasi. Parafin ketiga yang
dipakai pada infiltrasi dapat digunakan langsung untuk penanaman dengan syarat
memang sudah bersih dari bahan penjernih.
g. Penyayatan (Sectioning)
Proses penyayatan adalah pembuatan sayatan atau pita dari balok parafin
yang telah terbentuk dengan menggunakan mikrotom, yang bertujuan untuk
membuat sayatan jaringan dan dapat dilihat jelas dari dalam mikroskop.
9. Pembuatan irisan dengan metode parafin memiliki beberapa keuntungan,
diantaranya adalah yaitu proses embedding lebih cepat dan lebih simpel.
h. Penempelan dan Afiksasi (Afixing)
Afixing adalah proses pelekatan atau penempatan sayatan jaringan pada
kaca objek dengan bantuan media pelekat tertentu, dapatberupaparafinpadat yang
dicairkanlaludimasukkankedalam box ukurantertentudandibiarkanmemadat.
Tujuan penempelan ini adalah untuk menempelkan pita parafin yang sudah berisi
sayatan jaringan pada kaca objek.
i. Deparafinasi dan Pewarnaan (Staining)
Deparafinasi adalah suatu tahap menjelang proses pewarnaan dengan
menggunakan xilol untuk membersihkan paraffin dari jaringan dan kaca objek.
Pengerjaan deparafinasi aserial atau berkelanjutan dengan pengerjaan pewarnaan.
Tujuan dari tahap ini untuk membersihkan jaringan dan kaca objek dari parafin.
Pewarnaan merupakan suatu tahap dalam mikroteknik untuk memperjelas
berbagai elemen jaringan, terutama sel-selnya, sehingga dapat dibedakan dan
ditelaah dengan mikroskop tanpa pewarnaan, jaringan akan transparan sehingga
sulit untuk diamati.
j. Penutupan dan Labelling
Langkah terakhir adalah menyimpan sayatan dalam canada balsem serta
menutupnya dengan kaca penutup. Penempatan kaca penutup hendaklah
dilakukan dengan rapi dengan cara menempatkan suatu sisi kaca tersebut samping
sayatan kemudian dengan hati-hati sisi dihadapannya diturunkan dengan jarum.
10. BAB III
METODE PERCOBAAN
III.1 Alat Percobaan
Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini yaitu mistar, silet, pipet tetes,
gelas ukur, erlenmeyer, object glass, dan tabung reaksi.
III.2 Bahan Percobaan
Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini yaitu akar jagung Zea
mays, aquadest, xylol, alkohol 96%, 90%, 80%, 70 %, formalin, parafin wax,
parafin cair, asam asetat glasial, box kecil dan tissue.
III.3 Cara Kerja
Cara kerja pada percobaan ini yaitu :
I. Pembuatan Larutan FAA
1. Asam asetat Glasial = 5 ml
2. Formalin = 5 ml
3. Alkohol = 96 %
II. Pengenceran Alkohol Bertingkat
1. Rumus : V1xM1 = V2x M2
2. Dilakukan pengenceran alkohol 90% yang diencerkan dari alkohol 96%
dengan volume aquadest yang digunakan yaitu 6,25 ml dan volume
alkohol yaitu 93,75 ml.
3. Dilakukan pengenceran alkohol 80% yang dimana diencerkan pula dari
alkohol 96% dengan volume aquadest yang digunakan 16,67 ml dan
volume alkohol yaitu 83,33 ml.
11. 4. Dilakukan lagi pengencaran alkohol 70% yang dimana diencerkan pula
dari alkohol 96% dengan volume aquadest yang digunakan 27,09 ml dan
volume alkohol yaitu 72,91 ml.
III. Pembuatan Preparat Permanen
1. Fiksasi FAA selama 30 menit, fiksasi ini bertujuan untuk mengawetkan
semua struktur sel sehingga sedapat mungkin berada dalam keadaan sama
atau hampir sama dengan pada waktu masih hidup.
2. Direndam dengan aquadestt selama 30 detik.
3. Dilakukan dehidrasi dengan alkohol bertingkat 70%, 80%, 90%, dan 96%
masing-masing 10 menit. Dehidrasi ini bertujuan untuk menarik air keluar
dari jaringan dan akan digantikan dengan alkohol.
4. Dealkoholisasi dengan menggunakan alkohol-xylol perbandingan 3:1, 1:1,
1:3 masing-masing 10 menit. Dealkoholisasi ini bertujuan untuk menarik
alkohol keluar dari jaringan dan digantikan dengan xylol.
5. Dilakukan penjernihan dengan menggunakan xylol murni. Penjernihan ini
dilakukan 2x yaitu xylol murni I 10 menit dan xylol murni II 10 menit.
Penjernihan ini dilakukan untuk menarik sisa alkohol yang masih terdapat
dalam jaringan.
6. Infiltrasi terbagi atas infiltrasi I dan II. Infiltrasi I dilakukan dengan
menggunakan xylol-parafin dengan perbandingan 1:9 kemudian dilakukan
infiltrasi II yaitu dengan menggunakan parafin murni selama 5 menit.
Infiltrasi ini bertujuan untuk mengganti campuran xylol-parafin dengan
parafin murni.
7. Setelah itu dilakukan penanaman(embedding) menggunakan parafin yang
padat.
12. 3
4
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
IV.1 Hasil
IV.1.1 Gambar Penampang Melintang Batang Jagung Zea mays
1
2
Keterangan :
1. Epidermis (lapisan luar)
2. Korteks (jaringan dasar)
3. Floem (pembuluh tapis)
4. Xilem (pembuluh kayu)
IV.2 Pembahasan
Pada percobaan ini menggunakan jaringan batang tanaman Jagung Zea
mays yang dipotong melintang dengan panjang 2mm, kemudian dilakukan fiksasi
dengan menggunakan larutan FAA (Formaldehyde Acetic-acid Alkohol96%),
selama 30 menit, tujuan dari fiksasi adalah mempertahankan struktur sel dan
menghentikn proses metabolisme sel.
Setelah melakukan fiksasi selanjutnya dilakukan tahap pencucian untuk
menghilangkan larutan FAA dari dalam jaringan. Setelah dilakukan pencucian
13. selanjutnya dilakukan tahap alkoholisasi atau dehidrasi, tahap ini bertujuan untuk
menghilangkan kandungan air dari jaringan Zea mays, dehidrasi dilakukan dengan
menggunakan alkohol bertingkat dengan konsentrasi mulai dari 70%, 80%, 90%,
dan 96% masing-masing selama 5 menit, alkohol bertingkat digunakan agar
kandungan air di dalam jaringan dapat keluar sedikit demi sedikit, dan juga agar
sel-sel pada jaringan tidak mengalami lisis.
Tahap selanjutnya setelah dehidrasi adalah dealkoholisasi, dealkoholisasi
merupakan tahap pengeluaran air ari dalam jaringan. Pada tahap dealkoholisasi
menggunkan alkohol dan xylol dengan perbandingan alkohol : xylolyaitu 1:3, 1:1,
dan 3:1 dengan rentang waktu setiap 5 menit, hal ini dilakukan agar alkohol dapat
dikeluarkan secara maksimal dari dalam jaringan, sehingga larutan xylol yang
dapat masuk ke dalam jaringan, dan terikat dengan parafin.
Setelah dilakukan dealkoholisasi, tahap selanjutnya adalah penjernihan,
penjernihan bertujuan untuk mengeluarkan sisa-sisa alkohol yang mungkin masih
ada di didalam jaringan, penjernihan dilakukan dengan menggunakan xylol I dan
xylol II secara bertahap selama 5 menit.
Langkah selanjutnya adalah infiltrasi, pada tahap ini infiltrasi dilakukan
sebanyak 2 kali. Pada infiltrasi I digunakan xylol dan parafin dengan
perbandingan 1 : 9, dan infiltrasi II dilakukan perendaman dengan menggunakan
parafin murni selama 30 menit. Setelah proses infiltrasi dilakukan, selanjutnya
dilakukan penanaman jaringan pada parafin yang telah memadat dengan cara
meletakkan jaringan pada permukaan parafin padat dan kemudian meneteskan
parafin cair pada permukaan jaringan, hingga seluruh jaringan tertutupi oleh
parafin cair.Setelah proses penanaman selesai selanjutnya adalah tahap pengirisan
dengan menggunakan mikrotom hingga tahap labelling, namun pada percobaan
14. kali ini tidak dilakukan pemotongan karena mikrotom rusak. Sehingga pada
praktikum pembuatan preparat melintang dengan metode parafin terhadap
jaringan batang tanaman Jagung Zea mays tidak dapat dibuat preparat permanen
karena keterbatasan alat.
15. BAB V
PENUTUP
V.1 Kesimpulan
Dari hasil percobaan ini dapat diketahui tahap-tahap pembuatan preparat
jaringan batang Jagung Zea mays dengan metode parafin meskipun tidak dapat
dihasilkan preparat permanen karena keterbatasan alat yang diunakan. Tahap-
tahap pembuatan preparat jaringan batang Jagung Zea mays dengan metode
parafin adalah melumpuhkan, fiksasi, dehidrasi, dealkoholisasi, penjernihan,
infiltrasi, penanaman (embadding), ukuran mikrotom, penempelan pita,
pewarnaan, penutupan dan labelling.
V.2 Saran
Saran yang saya berikan sebaiknya mikrotom yang ada di Laboratorium
diadakan demi kelancaran praktikum.
16. DAFTAR PUSTAKA
Joe, 2012, Picture Mikrotom, www.aliexpress.com, diaksespadatanggal 28
februari 2016, pukul 20:47 WITA.
Nugroho, H. L., 2006,Struktur dan Perkembangan Tumbuhan, PenebarSwadaya,
Depok.
Ramdan, 2010, Penampang melintang jagung, http://bioliciousedu.blogspot.com,
diakses pada tanggal 04 maret 2016, pukul 06:07 WITA.
Setjo, S., 2004, Anatomi Tumbuhan, Universitas Negeri Malang, Malang.
Sugiharto, 1989,Mikroteknik, Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat
Jenderal Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Ilmu Hayat Institut
Pertanian Bogor, Bogor.
Widjajanto dan Susetyoadi S., 2001, Mikroteknik Tumbuhan, Universitas Negeri
Malang, Malang.
